Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Niekontrolowane krwawienie jest jedną z głównych przyczyn śmierci.Osiągnięcie szybkiej hemostazy zapewnia przeżycie podmiotu jako pierwsza pomoc podczas walki, wypadków drogowych i operacji zmniejszania liczby zgonów.Nanoporowate rusztowanie kompozytowe wzmocnione włóknem (NFRCS) pochodzące z prostej hemostatycznej kompozycji błonotwórczej (HFFC) jako faza ciągła może wyzwalać i wzmacniać hemostazę.Rozwój NFRCS opiera się na projekcie skrzydła ważki.Struktura skrzydła ważki składa się ze skrzydeł poprzecznych i podłużnych, a membrany skrzydeł są ze sobą połączone, aby zachować integralność mikrostruktury.HFFC równomiernie pokrywa powierzchnię włókna warstwą o grubości nanometra i łączy losowo rozłożoną grubość bawełny (Ct) (faza rozproszona), tworząc nanoporowatą strukturę.Połączenie fazy ciągłej i rozproszonej obniża koszt produktu dziesięciokrotnie w porównaniu z produktami dostępnymi na rynku.Zmodyfikowane NFRCS (tampony lub opaski na rękę) mogą być używane w różnych zastosowaniach biomedycznych.Badania in vivo wykazały, że opracowany Cp NFRCS wyzwala i wzmacnia proces krzepnięcia w miejscu aplikacji.NFRCS może modulować mikrośrodowisko i działać na poziomie komórkowym dzięki swojej nanoporowatej strukturze, co skutkuje lepszym gojeniem się rany w modelu rany po cięciu.
Nieopanowane krwawienie podczas walki, w sytuacjach śródoperacyjnych i nagłych może stanowić poważne zagrożenie dla życia rannych1.Te stany dodatkowo prowadzą do ogólnego wzrostu obwodowego oporu naczyniowego, co prowadzi do wstrząsu krwotocznego.Odpowiednie środki zatamowania krwawienia w trakcie i po operacji są uważane za potencjalnie zagrażające życiu2,3.Uszkodzenie dużych naczyń prowadzi do masywnej utraty krwi, co skutkuje śmiertelnością ≤ 50% w walce i 31% podczas operacji1.Masywna utrata krwi prowadzi do zmniejszenia objętości ciała, co powoduje zmniejszenie pojemności minutowej serca.Wzrost całkowitego obwodowego oporu naczyniowego i postępujące upośledzenie mikrokrążenia prowadzi do niedotlenienia narządów podtrzymujących życie.Wstrząs krwotoczny może wystąpić, jeśli stan utrzymuje się bez skutecznej interwencji1,4,5.Inne powikłania to postęp hipotermii i kwasicy metabolicznej, a także zaburzenia krzepnięcia, które utrudniają proces krzepnięcia.Ciężki wstrząs krwotoczny wiąże się z większym ryzykiem zgonu6,7,8.We wstrząsie III stopnia (postępującym) transfuzja krwi jest niezbędna do przeżycia pacjenta podczas śródoperacyjnej i pooperacyjnej chorobowości i śmiertelności.Aby przezwyciężyć wszystkie powyższe sytuacje zagrażające życiu, opracowaliśmy nanoporowate rusztowanie kompozytowe wzmocnione włóknami (NFRCS), które wykorzystuje minimalne stężenie polimeru (0,5%) przy użyciu kombinacji rozpuszczalnych w wodzie polimerów hemostatycznych.
Dzięki zastosowaniu wzmocnienia włóknistego można opracować opłacalne produkty.Losowo ułożone włókna przypominają strukturę skrzydła ważki, równoważoną poziomymi i pionowymi paskami na skrzydłach.Żyły poprzeczne i podłużne skrzydła komunikują się z błoną skrzydłową (ryc. 1).NFRCS składa się ze wzmocnionego Ct jako systemu rusztowania o lepszej wytrzymałości fizycznej i mechanicznej (rysunek 1).Ze względu na przystępną cenę i kunszt wykonania chirurdzy wolą używać mierników nici bawełnianych (Ct) podczas operacji i opatrunków. W związku z tym, biorąc pod uwagę jego liczne korzyści, w tym > 90% krystalicznej celulozy (uczestniczy we wzmocnieniu aktywności hemostatycznej), Ct zastosowano jako układ szkieletowy NFRCS9,10. W związku z tym, biorąc pod uwagę jego liczne korzyści, w tym > 90% krystalicznej celulozy (uczestniczy we wzmocnieniu aktywności hemostatycznej), Ct zastosowano jako układ szkieletowy NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в tom числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвуе т в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Dlatego, biorąc pod uwagę jego liczne korzyści, w tym >90% celulozy krystalicznej (zaangażowanej w zwiększoną aktywność hemostatyczną), Ct zastosowano jako układ szkieletowy NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Dlatego, biorąc pod uwagę jego wiele zalet, w tym ponad 90% celulozy krystalicznej (pomaga zwiększyć aktywność hemostatyczną), Ct zastosowano jako rusztowanie dla NFRCS9,10.Ct pokryto powierzchniowo (zaobserwowano tworzenie nano-grubej warstwy) i połączono z hemostatyczną kompozycją błonotwórczą (HFFC).HFFC działa jak matrigel, trzymając razem losowo rozmieszczone Ct.Opracowana konstrukcja przenosi naprężenia w fazie rozproszonej (włókna wzmacniające).Trudno jest uzyskać struktury nanoporowate o dobrej wytrzymałości mechanicznej przy minimalnych stężeniach polimeru.Ponadto dostosowanie różnych form do różnych zastosowań biomedycznych nie jest łatwe.
Rysunek przedstawia schemat projektu NFRCS opartego na strukturze skrzydła ważki (A).To zdjęcie przedstawia porównawczą analogię struktury skrzydła ważki (przecinające się i podłużne żyły skrzydła są ze sobą połączone) oraz fotomikrografię przekroju poprzecznego Cp NFRCS (B).Schematyczne przedstawienie NFRCS.
NFRC zostały opracowane przy użyciu HFFC jako fazy ciągłej w celu rozwiązania powyższych ograniczeń.HFFC składa się z różnych błonotwórczych polimerów hemostatycznych, w tym chitozanu (jako głównego polimeru hemostatycznego) z metylocelulozą (MC), hydroksypropylometylocelulozą (HPMC 50 cp) i alkoholem poliwinylowym (PVA)) (125 kDa) jako polimerem pomocniczym, który sprzyja tworzeniu się skrzepliny.tworzenie.Dodatek poliwinylopirolidyny K30 (PVP K30) poprawił zdolność pochłaniania wilgoci przez NFRCS.Dodano glikol polietylenowy 400 (PEG 400) w celu poprawy sieciowania polimeru w związanych mieszankach polimerowych.Na Ct nałożono trzy różne kompozycje hemostatyczne HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), a mianowicie chitozan z MC (Cm), chitozan z HPMC (Ch) i chitozan z PVA (Cp).Różne badania charakteryzacyjne in vitro i in vivo potwierdziły działanie hemostatyczne i gojenie ran NFRCS.Materiały kompozytowe oferowane przez NFRCS pozwalają na dostosowanie różnych form rusztowań do konkretnych potrzeb.
Dodatkowo NFRCS można zmodyfikować jako bandaż lub rolkę do pokrycia całego obszaru urazu kończyn dolnych i innych części ciała.Specjalnie w przypadku urazów kończyn bojowych, zaprojektowany projekt NFRCS można zmienić na pół ramienia lub całą nogę (rysunek dodatkowy S11).NFRCS można przekształcić w opaskę na nadgarstek za pomocą kleju tkankowego, którego można użyć do zatrzymania krwawienia z ciężkich samobójczych urazów nadgarstka.Naszym głównym celem jest opracowanie NFRCS z jak najmniejszą ilością polimeru, który można dostarczyć dużej populacji (poniżej granicy ubóstwa) i który można umieścić w apteczce pierwszej pomocy.Prosty, wydajny i ekonomiczny projekt NFRCS przynosi korzyści lokalnym społecznościom i może mieć globalny wpływ.
Chitozan (masa cząsteczkowa 80 kDa) i amarantus zakupiono w firmie Merck, Indie.Hydroksypropylometylocelulozę 50 Cp, glikol polietylenowy 400 i metylocelulozę zakupiono od Loba Chemie Pvt.LLC, Bombaj.Alkohol poliwinylowy (ciężar cząsteczkowy 125 kDa) (zhydrolizowany w 87-90%) zakupiono od National Chemicals, Gujarat.Poliwinylopirolidynę K30 zakupiono od Molychem, Mumbai, sterylne waciki zakupiono od Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, z wodą Milli Q (system oczyszczania wody Direct-Q3, Merck, Indie) jako nośnikiem.
NFRCS opracowano metodą liofilizacji11,12.Wszystkie kompozycje HFFC (Tabela 1) przygotowano stosując mieszadło mechaniczne.Przygotować 0,5% roztwór chitozanu używając 1% kwasu octowego w wodzie, ciągle mieszając na mieszadle mechanicznym z prędkością 800 obrotów na minutę.Do roztworu chitozanu dodano dokładną masę załadowanego polimeru wskazaną w tabeli 1 i mieszano aż do uzyskania klarownego roztworu polimeru.Do otrzymanej mieszaniny dodano PVP K30 i PEG 400 w ilościach wskazanych w Tabeli 1 i mieszanie kontynuowano aż do uzyskania klarownego lepkiego roztworu polimeru.Otrzymaną kąpiel z roztworu polimeru poddawano działaniu ultradźwięków przez 60 minut w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza z mieszaniny polimerów.Jak pokazano na rysunku dodatkowym S1 (b), Ct był równomiernie rozłożony w każdym dołku 6-dołkowej płytki (formy) uzupełnionej 5 ml HFFC.
Sześciostudzienkową płytkę poddawano działaniu ultradźwięków przez 60 minut w celu uzyskania równomiernego zwilżania i dystrybucji HFFC w sieci Ct.Następnie zamroź sześciodołkową płytkę w -20°C na 8-12 godzin.Zamrożone płytki liofilizowano przez 48 godzin w celu uzyskania różnych preparatów NFRCS.Tę samą procedurę stosuje się do wytwarzania różnych kształtów i struktur, takich jak tampony lub tampony cylindryczne, lub dowolnych innych kształtach do różnych zastosowań.
Dokładnie odważony chitozan (80 kDa) (3%) rozpuszcza się w 1% kwasie octowym za pomocą mieszadła magnetycznego.Do otrzymanego roztworu chitozanu dodano 1% PEG 400 i mieszano przez 30 minut.Powstały roztwór wlać do kwadratowego lub prostokątnego pojemnika i zamrozić w temperaturze -80°C przez 12 godzin.Zamrożone próbki liofilizowano przez 48 godzin w celu uzyskania porowatego Cs13.
Opracowany NFRCS został poddany eksperymentom z wykorzystaniem spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonia) w celu potwierdzenia chemicznej zgodności chitozanu z innymi polimerami14,15.Widma FTIR (szerokość zakresu spektralnego od 400 do 4000 cm-1) wszystkich badanych próbek uzyskano wykonując 32 skany.
Szybkość wchłaniania krwi (BAR) dla wszystkich preparatów oceniano stosując metodę opisaną przez Chen i in.16 z niewielkimi modyfikacjami.Rozwinięte NFRK wszystkich kompozycji suszono w suszarce próżniowej w temperaturze 105°C przez noc w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.30 mg NFRC (początkowa masa próbki – W0) i 30 mg Ct (kontrola pozytywna) umieszczono w oddzielnych szalkach zawierających premiks 3,8% cytrynianu sodu.W określonych odstępach czasu, tj. 5, 10, 20, 30, 40 i 60 sekund, NFRCS usuwano, a ich powierzchnie oczyszczano z niewchłoniętej krwi przez umieszczanie próbek w Ct na 30 sekund.W każdym punkcie czasowym brano pod uwagę końcową masę krwi wchłoniętej przez NFRCS 16 (W1).Oblicz procent BAR, korzystając z następującego wzoru:
Czas krzepnięcia krwi (BCT) określono zgodnie z doniesieniami Wanga i in.17 .Czas wymagany do skrzepnięcia krwi pełnej (krew szczura wstępnie zmieszana z 3,8% cytrynianem sodu) w obecności NFRCS obliczono jako BCT badanej próbki.Różne składniki NFRCS (30 mg) umieszczono w 10 ml zakręcanych fiolkach i inkubowano w 37°C.Do fiolki dodano krew (0,5 ml) i 0,3 ml 0,2 M CaCl2 w celu aktywacji krzepnięcia krwi.Na koniec odwracaj fiolkę co 15 sekund (do 180°), aż utworzy się twardy skrzep.BCT próbki szacuje się na podstawie liczby odwróconych vails17,18.Na podstawie BCT wybrano dwa optymalne składy z NFRCS Cm, Ch i Cp do dalszych badań charakteryzacyjnych.
BCT kompozycji Ch NFRCS i Cp NFRCS określono stosując metodę opisaną przez Li i in.19 .Umieścić 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (kontrola pozytywna) na oddzielnych płytkach Petriego (37°C).Krew zawierającą 3,8% cytrynianu sodu zmieszano z 0,2 M CaCl2 w stosunku objętościowym 10:1 w celu rozpoczęcia procesu krzepnięcia krwi.20 µl 0,2 M mieszaniny krwi szczura CaCl2 naniesiono na powierzchnię próbki i umieszczono na pustej szalce Petriego.Kontrolę stanowiła krew wylana na puste szalki Petriego bez Ct.W ustalonych odstępach 0, 3 i 5 minut zatrzymać krzepnięcie, dodając 10 ml wody dejonizowanej (DI) do próbki zawierającej szalkę bez naruszania skrzepu.Nieskoagulowane erytrocyty (erytrocyty) ulegają hemolizie w obecności wody dejonizowanej i uwalniają hemoglobinę.Hemoglobinę w różnych punktach czasowych (HA(t)) mierzono przy 540 nm (λmax hemoglobina) przy użyciu spektrofotometru UV-Vis.Bezwzględną absorpcję hemoglobiny (AH(0)) w 0 min 20 µl krwi w 10 ml dejonizowanej wody przyjęto jako wzorzec odniesienia.Względny wychwyt hemoglobiny (RHA) skrzepniętej krwi obliczono ze stosunku HA(t)/HA(0) stosując tę ​​samą partię krwi.
Za pomocą analizatora tekstury (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) określono właściwości adhezyjne NFRK do uszkodzonej tkanki.Dociśnij cylindryczne naczynie z otwartym dnem do wewnętrznej strony skóry wieprzowej (bez warstwy tłuszczu).Próbki (Ch NFRCS i Cp NFRCS) nanoszono przez kaniulę do cylindrycznych form w celu uzyskania adhezji do skóry świni.Po 3 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej (RT) (25°C), rejestrowano siłę przyczepności NFRCS ze stałą szybkością 0,5 mm/sek.
Główną cechą uszczelniaczy chirurgicznych jest zwiększenie krzepliwości krwi przy jednoczesnym zmniejszeniu utraty krwi.Bezstratną koagulację w NFRCS oceniano przy użyciu wcześniej opublikowanej metody z niewielkimi modyfikacjami 19 .Wykonać probówkę do mikrowirówki (2 ml) (średnica wewnętrzna 10 mm) z otworem 8 × 5 mm2 po jednej stronie probówki (reprezentującej otwartą ranę).NFRCS służy do zamknięcia otworu, a taśma służy do uszczelnienia zewnętrznych krawędzi.Dodać 20 µl 0,2 M CaCl2 do probówki do mikrowirówki zawierającej przedmieszkę 3,8% cytrynianu sodu.Po 10 minutach probówki mikrowirówkowe wyjmowano z szalek i określano przyrost masy szalek na skutek odpływu krwi z NFRK (n = 3).Utratę krwi Ch NFRCS i Cp NFRCS porównano z Cs.
Mokrą integralność NFRCS określono na podstawie metody opisanej przez Mishrę i Chaudhary21 z niewielkimi modyfikacjami.Umieścić NFRCS w 100 ml kolbie Erlenmeyera z 50 ml wody i mieszać przez 60 s bez formowania wierzchołka.Kontrola wzrokowa i ustalanie priorytetów próbek pod kątem integralności fizycznej w oparciu o pobranie.
Siłę wiązania HFFC do Ct badano przy użyciu wcześniej opublikowanych metod z niewielkimi modyfikacjami.Integralność powłoki powierzchniowej oceniano przez wystawienie NFRK na działanie fal akustycznych (bodziec zewnętrzny) w obecności wody milliQ (Ct).Opracowane NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS umieszczono w zlewce wypełnionej wodą i poddano działaniu ultradźwięków odpowiednio przez 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 minut.Po wysuszeniu różnicę procentową między początkową i końcową masą NFRC zastosowano do obliczenia procentowej utraty materiału (HFFC).In vitro BCT dodatkowo potwierdziło siłę wiązania lub utratę materiałów powierzchniowych.Skuteczność wiązania HFFC z Ct zapewnia koagulację krwi i elastyczną powłokę na powierzchni Ct22.
Jednorodność rozwiniętych NFRCS określono za pomocą BCT próbek (30 mg) pobranych z losowo wybranych ogólnych lokalizacji NFRC.Postępuj zgodnie ze wspomnianą wcześniej procedurą BCT, aby określić zgodność z NFRCS.Bliskość wszystkich pięciu próbek zapewnia równomierne pokrycie powierzchni i osadzanie HFFC w siatce Ct.
Nominalny obszar kontaktu z krwią (NBCA) określono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami z pewnymi modyfikacjami.Skoaguluj krew, zaciskając 20 µl krwi między dwiema powierzchniami Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.Po 1 godzinie oddzielono dwie części stentu i ręcznie zmierzono powierzchnię skrzepu.Za średnią wartość trzech powtórzeń uznano NBCA NFRC19.
Analiza dynamicznej sorpcji pary (DVS) została wykorzystana do oceny skuteczności NFRCS w absorpcji wody ze środowiska zewnętrznego lub z miejsca urazu odpowiedzialnego za zainicjowanie krzepnięcia.DVS ocenia lub rejestruje pobór i utratę oparów w próbce metodą grawimetryczną przy użyciu ultraczułej wagi o rozdzielczości ±0,1 µg.Częściowa prężność pary (wilgotność względna) jest generowana przez elektroniczny kontroler przepływu masowego wokół próbki poprzez mieszanie nasyconych i suchych gazów nośnych. Zgodnie z wytycznymi Farmakopei Europejskiej, na podstawie procentowej absorpcji wilgoci przez próbki, próbki podzielono na 4 kategorie (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w słabo higroskopijne, 2–15% umiarkowanie higroskopijne i > 15% bardzo higroskopijne)23. Zgodnie z wytycznymi Farmakopei Europejskiej, na podstawie procentowej absorpcji wilgoci przez próbki, próbki podzielono na 4 kategorie (0–0,012% wag.− niehigroskopijne, 0,2–2% wag. słabo higroskopijne, 2–15% umiarkowanie higroskopijne i > 15% bardzo higroskopijne)23.Zgodnie z zaleceniami Farmakopei Europejskiej, w zależności od procentowej absorpcji wilgoci przez próbki, próbki podzielono na 4 kategorie (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w lekko higroskopijne, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % umiarkowanie higroskopijny i > 15% bardzo higroskopijny)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-非吸湿性, 0,2-2% w /w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% wag./wag.Zgodnie z zaleceniami Farmakopei Europejskiej próbki dzieli się na 4 klasy w zależności od procentowej zawartości wilgoci wchłoniętej przez próbkę (0-0,012% wag. – niehigroskopijne, 0,2-2% wag. słabo higroskopijne, 2-15% wag.).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % umiarkowanie higroskopijny, > 15% bardzo higroskopijny) 23.Wydajność higroskopijną NFCS X NFCS i TsN NFCS określono na analizatorze DVS TA TGA Q5000 SA.Podczas tego procesu uzyskano czas pracy, wilgotność względną (RH) i masę próbki w czasie rzeczywistym w temperaturze 25°C24.Zawartość wilgoci jest obliczana za pomocą dokładnej analizy masy NFRCS przy użyciu następującego równania:
MC to wilgotność NFRCS.m1 – sucha masa NLPZ.m2 to masa NFRCS w czasie rzeczywistym przy danej wilgotności względnej.
Całkowite pole powierzchni oszacowano za pomocą eksperymentu adsorpcji azotu z ciekłym azotem po opróżnieniu próbek w temperaturze 25 ° C przez 10 godzin (<7 × 10–3 Torr). Całkowite pole powierzchni oszacowano za pomocą eksperymentu adsorpcji azotu z ciekłym azotem po opróżnieniu próbek w temperaturze 25 ° C przez 10 godzin (<7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азоtom посл е опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Całkowite pole powierzchni oszacowano za pomocą eksperymentu adsorpcji azotu z ciekłym azotem po opróżnieniu próbek w temperaturze 25 ° C przez 10 godzin (<7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。➢ 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азото м после опорожнения образцов в течение 10 godzin przed 25°C (< 7 × 10-3 tорр). Całkowite pole powierzchni oszacowano za pomocą eksperymentów adsorpcji azotu z ciekłym azotem po opróżnianiu próbek przez 10 godzin w temperaturze 25°C (< 7 x 10-3 torr).Całkowite pole powierzchni, objętość porów i wielkość porów NFRCS określono za pomocą Quantachrome firmy NOVA 1000e, Austria, stosując oprogramowanie RS 232.
Przygotuj 5% krwinek czerwonych (sól fizjologiczna jako rozcieńczalnik) z krwi pełnej.Następnie przenieść porcję HFFC (0,25 ml) do 96-dołkowej płytki i 5% masy RBC (0,1 ml).Inkubować mieszaninę w temperaturze 37°C przez 40 minut.Mieszaninę krwinek czerwonych i surowicy uznano za kontrolę pozytywną, a mieszaninę soli fizjologicznej i krwinek czerwonych za kontrolę negatywną.Hemaglutynację określono według skali Stajitzky'ego.Proponowane skale to: + + + + gęste kruszywa ziarniste;+ + + gładkie podkładki dolne z zakrzywionymi krawędziami;+ + gładkie dolne klocki z postrzępionymi brzegami;+ wąskie czerwone pierścienie wokół krawędzi gładkich podkładek;– (ujemny) dyskretny czerwony przycisk 12 na środku dolnego zagłębienia.
Hemokompatybilność NFRCS badano zgodnie z metodą Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Metoda grawimetryczna opisana przez Singha i in.Wprowadzono niewielkie modyfikacje w celu oceny tworzenia się skrzepliny w obecności lub na powierzchni NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS inkubowano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 24 godziny w temperaturze 37°C.Po 24 godzinach usunięto PBS i potraktowano NFRCS 2 ml krwi zawierającej 3,8% cytrynianu sodu.Na powierzchnię NFRCS dodać 0,04 ml 0,1 M CaCl2 do inkubowanych próbek.Po 45 minutach dodano 5 ml wody destylowanej w celu zatrzymania koagulacji.Skrzepłą krew na powierzchni NFRK potraktowano 36-38% roztworem formaldehydu.Skrzepy utrwalone formaldehydem wysuszono i zważono.Procent zakrzepicy oszacowano przez obliczenie masy szklanki bez krwi i próbki (kontrola ujemna) oraz szklanki z krwią (kontrola pozytywna).
Jako wstępne potwierdzenie próbki zwizualizowano pod mikroskopem optycznym, aby zrozumieć zdolność powłoki powierzchniowej HFFC, połączonych Ct i sieci Ct do tworzenia porów.Cienkie skrawki Ch i Cp z NFRCS przycięto ostrzem skalpela.Powstały skrawek umieszczono na szkiełku podstawowym, przykryto szkiełkiem nakrywkowym, a brzegi utrwalono klejem.Przygotowane preparaty oglądano pod mikroskopem optycznym i wykonywano zdjęcia przy różnych powiększeniach.
Osadzanie się polimeru w sieciach Ct wizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w oparciu o metodę opisaną przez Rice et al.29. Kompozycję HFFC stosowaną w preparacie zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarant) i przygotowano NFRCS (Ch & Cp) zgodnie ze sposobem wspomnianym wcześniej. Kompozycję HFFC stosowaną w preparacie zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarant) i przygotowano NFRCS (Ch & Cp) zgodnie ze sposobem wspomnianym wcześniej.Kompozycję HFFC stosowaną do formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarant) i otrzymano NFRCS (Ch i Cp) zgodnie z wcześniej wspomnianą metodą.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）.Kompozycję HFFC stosowaną w preparacie zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (Amaranth) i otrzymano NFRCS (Ch i Cp), jak wspomniano wcześniej.Z otrzymanych próbek wycięto cienkie skrawki NFRK, umieszczono na szkiełkach i przykryto szkiełkami nakrywkowymi.Obserwować przygotowane szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu zielonego filtra (310-380 nm).Obrazy wykonano przy 4-krotnym powiększeniu, aby zrozumieć zależności Ct i nadmierne osadzanie się polimeru w sieci Ct.
Topografię powierzchni NFRCS Ch i Cp określono za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) z ultra ostrym wspornikiem TESP w trybie stukania: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajwan.Chropowatość powierzchni określono metodą pierwiastka średniej kwadratowej (RMS) przy użyciu oprogramowania (Scanning Probe Image Processor).Różne lokalizacje NFRCS zostały wyrenderowane na obrazach 3D w celu sprawdzenia jednorodności powierzchni.Odchylenie standardowe oceny dla danego obszaru określa się jako chropowatość powierzchni.Równanie RMS zastosowano do ilościowego określenia chropowatości powierzchni NFRC31.
Badania oparte na FESEM przeprowadzono przy użyciu FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, aby zrozumieć morfologię powierzchni Ch NFRCS i Cp NFRCS, które wykazały lepsze BCT niż Cm NFRCS.Badanie FESEM przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną przez Zhao i in.32 z niewielkimi modyfikacjami.NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS i Cp NFRCS wstępnie zmieszano z 20 ul 3,8% cytrynianu sodu wstępnie zmieszanego z krwią szczura.Do traktowanych krwi próbek dodano 20 μl 0,2 M CaCl2 w celu zainicjowania koagulacji i próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Ponadto nadmiar erytrocytów usunięto z powierzchni NFRCS przez przepłukanie solą fizjologiczną.
Kolejne próbki potraktowano 0,1% aldehydem glutarowym, a następnie wysuszono w suszarce z gorącym powietrzem w temperaturze 37°C w celu usunięcia wilgoci.Wysuszone próbki powleczono i poddano analizie 32 .Inne obrazy uzyskane podczas analizy obejmowały tworzenie się skrzepów na powierzchni poszczególnych włókien bawełny, osadzanie polimeru pomiędzy Ct, morfologię (kształt) erytrocytów, integralność skrzepu i morfologię erytrocytów w obecności NFRCS.Nietraktowane obszary NFRCS oraz obszary NFRCS traktowane Ch i Cp inkubowane z krwią skanowano pod kątem jonów pierwiastków (sodu, potasu, azotu, wapnia, magnezu, cynku, miedzi i selenu)33.Porównaj zawartość procentową jonów pierwiastków w próbkach poddanych działaniu i nietraktowanych, aby zrozumieć akumulację jonów pierwiastków podczas tworzenia skrzepu i homogeniczności skrzepu.
Grubość powłoki powierzchniowej Cp HFFC na powierzchni Ct określono za pomocą FESEM.Przekroje poprzeczne Cp NFRCS wycięto z ramy i pokryto napylaniem katodowym.Otrzymane próbki powłoki przez napylanie katodowe obserwowano metodą FESEM i mierzono grubość powłoki powierzchniowej 34, 35, 36.
Rentgenowska mikro-TK zapewnia nieniszczące obrazowanie 3D o wysokiej rozdzielczości i umożliwia badanie wewnętrznego układu strukturalnego NFRK.Mikro-CT wykorzystuje wiązkę promieniowania rentgenowskiego przechodzącą przez próbkę do zarejestrowania lokalnego liniowego współczynnika tłumienia promieni rentgenowskich w próbce, co pomaga uzyskać informacje morfologiczne.Wewnętrzna lokalizacja Ct w Cp NFRCS i traktowanym krwią Cp NFRCS została zbadana za pomocą mikro-CT w celu zrozumienia wydajności wchłaniania i krzepnięcia krwi w obecności NFRCS37,38,39.Struktury 3D potraktowanych krwią i nietraktowanych próbek Cp NFRCS zrekonstruowano za pomocą mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Niemcy).Korzystając z oprogramowania VG STUDIO-MAX w wersji 2.2, wykonano kilka zdjęć rentgenowskich pod różnymi kątami (najlepiej w zakresie 360°) w celu opracowania obrazów 3D dla NFRCS.Zebrane dane projekcyjne zostały zrekonstruowane na obrazy wolumetryczne 3D przy użyciu odpowiedniego prostego oprogramowania 3D ScanIP Academic.
Ponadto, aby zrozumieć rozkład skrzepu, do NFRCS dodano 20 µl wstępnie zmieszanej krwi cytrynianowej i 20 µl 0,2 M CaCl2 w celu zainicjowania krzepnięcia krwi.Przygotowane próbki pozostawia się do utwardzenia.Powierzchnię NFRK traktowano 0,5% aldehydem glutarowym i suszono w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 30–40 ° C przez 30 minut.Skrzep krwi utworzony na NFRCS zeskanowano, zrekonstruowano i wizualizowano obraz 3D skrzepu krwi.
Testy antybakteryjne przeprowadzono na Cp NFRCS (najlepiej w porównaniu z Ch NFRCS) stosując wcześniej opisaną metodę z niewielkimi modyfikacjami.Aktywność przeciwbakteryjną Cp NFRCS i Cp HFFC określono przy użyciu trzech różnych mikroorganizmów testowych [S.aureus (bakterie Gram-dodatnie), E.coli (bakterie Gram-ujemne) i biały Candida (C.albicans)] rosnących na agarze na płytkach Petriego w inkubatorze.Równomiernie posiać 50 ml rozcieńczonej zawiesiny kultur bakteryjnych w stężeniu 105-106 CFU ml-1 na podłoże agarowe.Wlej pożywkę do szalki Petriego i pozwól jej zestalić się.Na powierzchni płytki agarowej wykonano studzienki w celu wypełnienia HFFC (3 studzienki dla HFFC i 1 dla kontroli negatywnej).Dodać 200 ul HFFC do 3 studzienek i 200 ul pH 7,4 PBS do czwartej studzienki.Po drugiej stronie szalki Petriego umieść krążek Cp NFRCS 12 mm na zestalonym agarze i zwilż PBS (pH 7,4).Cyprofloksacyna, ampicylina i flukonazol w tabletkach są uważane za wzorce referencyjne dla Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans.Zmierz strefę zahamowania ręcznie i wykonaj cyfrowe zdjęcie strefy zahamowania.
Po uzyskaniu instytucjonalnej aprobaty etycznej badanie przeprowadzono w Kasturba Medical College of Education and Research w Manipal, Karnataka, w południowych Indiach.Protokół eksperymentalny TEG in vitro został zweryfikowany i zatwierdzony przez Institutional Ethics Committee of Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Pacjenci byli rekrutowani spośród ochotniczych dawców krwi (w wieku od 18 do 55 lat) ze szpitalnego banku krwi.Ponadto od ochotników uzyskano formularz świadomej zgody na pobranie próbek krwi.Natywny TEG (N-TEG) ​​wykorzystano do badania wpływu preparatu Cp HFFC na krew pełną wstępnie zmieszaną z cytrynianem sodu.N-TEG jest powszechnie uznawany ze względu na swoją rolę w resuscytacji w miejscu opieki, co stwarza problemy dla klinicystów ze względu na możliwość istotnego klinicznie opóźnienia w wynikach (rutynowe testy krzepnięcia).Analiza N-TEG została przeprowadzona przy użyciu krwi pełnej.Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę i szczegółową historię medyczną.Badanie nie obejmowało uczestników z powikłaniami hemostatycznymi lub zakrzepowymi, takimi jak ciąża/poród lub choroba wątroby.Z badania wykluczono także osoby przyjmujące leki wpływające na kaskadę krzepnięcia.U wszystkich uczestników wykonano podstawowe badania laboratoryjne (hemoglobina, czas protrombinowy, aktywowana tromboplastyna i liczba płytek krwi) zgodnie ze standardowymi procedurami.N-TEG określa lepkosprężystość skrzepu krwi, początkową strukturę skrzepu, interakcje międzycząsteczkowe, wzmocnienie skrzepu i lizę skrzepu.Analiza N-TEG dostarcza danych graficznych i liczbowych na temat łącznego wpływu kilku pierwiastków komórkowych i osocza.Analizę N-TEG przeprowadzono na dwóch różnych objętościach Cp HFFC (10 µl i 50 µl).W rezultacie do 10 μl Cp HFFC dodano 1 ml pełnej krwi z kwasem cytrynowym.Dodaj 1 ml (Cp HFFC + krew z cytrynianem), 340 µl zmieszanej krwi do 20 µl 0,2 M CaCl2 zawierającego szalkę TEG.Następnie płytki TEG załadowano do TEG® 5000, US, aby zmierzyć R, K, kąt alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% próbek krwi w obecności Cp HFFC41.
Protokół badania in vivo został zweryfikowany i zatwierdzony przez Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Komitetu Kontroli i Nadzoru Doświadczeń na Zwierzętach (CPCSEA).Wszystkie badania NFRCS in vivo (2 x 2 cm2) przeprowadzono na samicach szczurów Wistar (o wadze 200 do 250 g).Wszystkie zwierzęta aklimatyzowano w temperaturze 24-26°C, zwierzęta miały swobodny dostęp do standardowej karmy i wody ad libitum.Wszystkie zwierzęta losowo podzielono na różne grupy, każda grupa składała się z trzech zwierząt.Wszystkie badania przeprowadzono zgodnie z Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Przed badaniem zwierzęta znieczulono przez podanie dootrzewnowe (ip) mieszaniny 20-50 mg ketaminy (na 1 kg masy ciała) i 2-10 mg ksylazyny (na 1 kg masy ciała).Po badaniu obliczono objętość krwawienia, oceniając różnicę między początkową i końcową masą próbek, a jako objętość krwawienia próbki przyjęto średnią wartość uzyskaną z trzech testów.
Wdrożono model amputacji ogona szczura, aby zrozumieć potencjał NFRCS do modulowania krwawienia w urazie, walce lub wypadku drogowym (model urazu).Odetnij 50% ogona ostrzem skalpela i umieść w powietrzu na 15 s, aby zapewnić normalne krwawienie.Ponadto badane próbki umieszczono na ogonie szczura poprzez zastosowanie nacisku (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS).Krwawienie i PCT odnotowano dla próbek testowych (n = 3)17,45.
Skuteczność kontroli ciśnienia NFRCS w walce badano na modelu tętnicy udowej powierzchownej.Tętnicę udową odsłonięto, nakłuto trokarem 24G i wykrwawiono w ciągu 15 sekund.Po zaobserwowaniu niekontrolowanego krwawienia próbkę do badań umieszcza się w miejscu nakłucia i uciska.Bezpośrednio po nałożeniu badanej próbki rejestrowano czas krzepnięcia i przez kolejne 5 minut obserwowano skuteczność hemostazy.Tę samą procedurę powtórzono z Cs i Ct46.
Dowling i in.47 zaproponowali model uszkodzenia wątroby do oceny potencjału hemostatycznego materiałów hemostatycznych w kontekście krwawienia śródoperacyjnego.BCT rejestrowano dla próbek Ct (kontrola ujemna), zrębu Cs (kontrola pozytywna), próbek Ch NFRCS i próbek Cp NFRCS.Nadwątrobową żyłę główną szczura odsłonięto przez wykonanie środkowej laparotomii.Następnie nożyczkami wycięto dalszą część lewego płata.Wykonaj nacięcie w wątrobie ostrzem skalpela i pozwól mu krwawić przez kilka sekund.Dokładnie odważone próbki testowe Ch NFRCS i Cp NFRCS umieszczono na uszkodzonej powierzchni bez żadnego nadciśnienia i zarejestrowano BCT.Grupa kontrolna (Ct) następnie wywierała nacisk, a następnie Cs 30 s47 bez przerwania urazu.
Testy gojenia ran in vivo przeprowadzono przy użyciu modelu rany po wycięciu, aby ocenić właściwości gojenia ran opracowanych NFRC na bazie polimerów.Modele ran powycinanych wybrano i wykonano według wcześniej opublikowanych metod z niewielkimi modyfikacjami19,32,48.Wszystkie zwierzęta znieczulono jak opisano wcześniej.Za pomocą stempla biopsyjnego (12 mm) wykonaj okrągłe głębokie nacięcie w skórze pleców.Przygotowane miejsca rany opatrzono Cs (kontrola pozytywna), Ct (uznając, że waciki przeszkadzają w gojeniu), Ch NFRCS i Cp NFRCS (grupa eksperymentalna) i kontrolą ujemną bez żadnego leczenia.Każdego dnia badania mierzono powierzchnię rany u wszystkich szczurów.Za pomocą aparatu cyfrowego zrób zdjęcie obszaru rany i załóż nowy opatrunek.Procent zamknięcia rany mierzono za pomocą następującego wzoru:
W oparciu o procent zamknięcia rany w 12. dniu badania, skórę szczurów z najlepszej grupy wycięto ((Cp NFRCS) i grupa kontrolna) i zbadano za pomocą barwienia H&E i barwienia trichromem Massona. W oparciu o procent zamknięcia rany w 12. dniu badania, skórę szczurów z najlepszej grupy wycięto ((Cp NFRCS) i grupa kontrolna) i zbadano za pomocą barwienia H&E i barwienia trichromem Massona.W oparciu o procent zamknięcia rany w 12 dniu badania, skórę szczurów z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupa kontrolna) wycięto i zbadano przez wybarwienie hematoksyliną-eozyną i trichromem Massona.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Szczury w najlepszej grupie ((Cp NFRCS) i grupy kontrolne) wycięto w celu barwienia hematoksyliną-eozyną i barwienia trichromem Massona w oparciu o procentowe zamknięcie rany w 12 dniu badania.Wdrożoną procedurę barwienia przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi metodami49,50.W skrócie, po utrwaleniu w 10% formalinie, próbki odwodniono stosując szereg stopniowanych alkoholi.Za pomocą mikrotomu uzyskać cienkie skrawki (o grubości 5 µm) wyciętej tkanki.Cienkie seryjne skrawki kontroli i Cp NFRCS traktowano hematoksyliną i eozyną w celu zbadania zmian histopatologicznych.Barwienie trichromowe Massona zastosowano do wykrywania powstawania włókienek kolagenowych.Uzyskane wyniki zostały ślepo zbadane przez patologów.
Stabilność próbek Cp NFRCS badano w temperaturze pokojowej (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) przez 12 miesięcy51.Cp NFRCS (odbarwienie powierzchni i wzrost drobnoustrojów) sprawdzono wizualnie i przetestowano pod kątem odporności na zużycie fałdowe i BCT zgodnie z powyższymi metodami opisanymi w sekcji Materiały i metody.
Skalowalność i odtwarzalność Cp NFRCS zbadano przygotowując Cp NFRCS o wielkości 15 x 15 cm2.Ponadto próbki 30 mg ( n = 5) wycięto z różnych frakcji Cp NFRCS i oceniono BCT badanych próbek, jak opisano wcześniej w sekcji Metody.
Próbowaliśmy opracować różne kształty i struktury przy użyciu kompozycji Cp NFRCS do różnych zastosowań biomedycznych.Takie kształty lub konfiguracje obejmują stożkowe tampony do krwawień z nosa, zabiegów dentystycznych i cylindryczne tampony do krwawienia z pochwy.
Wszystkie zestawy danych wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe i przeanalizowano metodą ANOVA przy użyciu Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA), a następnie przeprowadzono test wielokrotnych porównań Bonferroniego (* p <0, 05).
Wszystkie procedury przeprowadzone w badaniach na ludziach były zgodne ze standardami Instytutu i National Research Council oraz Deklaracją Helsińską z 1964 r. z późniejszymi poprawkami lub podobnymi normami etycznymi.Wszyscy uczestnicy zostali poinformowani o cechach badania i jego dobrowolnym charakterze.Po zebraniu dane uczestników pozostają poufne.Protokół eksperymentalny TEG in vitro został zweryfikowany i zatwierdzony przez Institutional Ethics Committee of Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Wolontariusze podpisali świadomą zgodę na pobranie próbek krwi.
Wszystkie procedury przeprowadzone w badaniach na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wydziału Lekarskiego Kastuba, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Wszystkie zaplanowane doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komitetu Kontroli i Nadzoru Doświadczeń na Zwierzętach (CPCSEA).Wszyscy autorzy przestrzegają wytycznych ARRIVE.
Widma FTIR wszystkich NFRCS analizowano i porównywano z widmem chitozanu pokazanym na Figurze 2A.Charakterystyczne piki widmowe chitozanu (zarejestrowane) przy 3437 cm-1 (rozciąganie OH i NH, zachodzenie na siebie), 2945 i 2897 cm-1 (rozciąganie CH), 1660 cm-1 (szczep NH2), 1589 cm-1 (zginanie N–H), 1157 cm-1 (rozciąganie mostka O-), 1067 cm-1 (rozciąganie C–O, drugorzędowy hydroksyl), 99 3 cm-1 (rozciągliwy CO, Bo-OH) 52.53.54.Tabela uzupełniająca S1 pokazuje wartości widma absorpcji FTIR NFRCS dla chitozanu (reporter), czystego chitozanu, Cm, Ch i Cp.Widma FTIR wszystkich NFRCS (Cm, Ch i Cp) wykazały te same charakterystyczne pasma absorpcji jak czysty chitozan bez żadnych znaczących zmian (ryc. 2A).Wyniki FTIR potwierdziły brak interakcji chemicznych lub fizycznych między polimerami użytymi do opracowania NFRCS, co wskazuje, że użyte polimery są obojętne.
Charakterystyka in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.(A) przedstawia połączone widma FTIR kompozycji chitozanu i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS po kompresji.(B) a) Szybkość wychwytu NFRC Cm, Ch, Cp i Cg pełnej krwi (n = 3);Próbki Ct wykazały wyższy BAR, ponieważ wacik ma wyższą wydajność absorpcji;b) Krew po absorpcji krwi Ilustracja wchłoniętej próbki.Graficzne przedstawienie BCT próbki testowej C (Cp NFRCS miało najlepsze BCT (15 s, n = 3)). Dane w C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± SD, a słupki błędów przedstawiają SD, *** p <0, 0001. Dane w C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± SD, a słupki błędów przedstawiają SD, *** p <0, 0001. Данные в C, D, E i G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное от klon, ***p <0,0001. Dane w C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe, *** p <0, 0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют стандар тное отклонение, ***p <0,0001. Dane w C, D, E i G są pokazane jako średnia ± odchylenie standardowe, słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe, *** p <0, 0001.