Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Niekontrolowane krwawienie jest jedną z głównych przyczyn śmierci. Osiągnięcie szybkiej hemostazy zapewnia przeżycie osoby jako pierwszej pomocy podczas walki, wypadków drogowych i operacji ograniczania zgonów. Nanoporowate, wzmocnione włóknami rusztowanie kompozytowe (NFRCS) pochodzące z prostej hemostatycznej kompozycji filmotwórczej (HFFC) jako faza ciągła może wywołać i wzmocnić hemostazę. Rozwój NFRCS opiera się na konstrukcji skrzydła ważki. Struktura skrzydła ważki składa się z poprzecznych i podłużnych skrzydeł, a błony skrzydeł są połączone ze sobą w celu zachowania integralności mikrostruktury. HFFC równomiernie pokrywa powierzchnię włókna warstwą o grubości nanometrów i łączy losowo rozłożoną grubość bawełny (Ct) (faza rozproszona), tworząc strukturę nanoporowatą. Połączenie faz ciągłej i rozproszonej zmniejsza koszt produktu dziesięciokrotnie w porównaniu z produktami dostępnymi w handlu. Zmodyfikowane NFRCS (tampony lub opaski na nadgarstek) mogą być stosowane w różnych zastosowaniach biomedycznych. Badania in vivo wykazały, że opracowany Cp NFRCS wyzwala i wzmacnia proces krzepnięcia w miejscu aplikacji. NFRCS może modulować mikrośrodowisko i działać na poziomie komórkowym dzięki swojej nanoporowatej strukturze, co skutkuje lepszym gojeniem się ran w modelu rany wyciętej.
Niekontrolowane krwawienie podczas walki, w trakcie operacji i w sytuacjach nagłych może stanowić poważne zagrożenie dla życia rannego1. Stany te dodatkowo prowadzą do ogólnego wzrostu obwodowego oporu naczyniowego, co prowadzi do wstrząsu krwotocznego. Odpowiednie środki kontroli krwawienia podczas i po operacji są uważane za potencjalnie zagrażające życiu2,3. Uszkodzenie dużych naczyń prowadzi do masywnej utraty krwi, co skutkuje śmiertelnością ≤ 50% w walce i 31% podczas operacji1. Masywna utrata krwi prowadzi do zmniejszenia objętości ciała, co zmniejsza rzut serca. Wzrost całkowitego obwodowego oporu naczyniowego i postępujące upośledzenie mikrokrążenia prowadzą do niedotlenienia narządów podtrzymujących życie. Wstrząs krwotoczny może wystąpić, jeśli stan ten utrzymuje się bez skutecznej interwencji1,4,5. Inne powikłania obejmują postęp hipotermii i kwasicy metabolicznej, a także zaburzenia krzepnięcia, które utrudniają proces krzepnięcia. Ciężki wstrząs krwotoczny wiąże się z wyższym ryzykiem zgonu6,7,8. W przypadku wstrząsu III stopnia (postępującego) transfuzja krwi jest niezbędna dla przeżycia pacjenta podczas śródoperacyjnej i pooperacyjnej zachorowalności i śmiertelności. Aby przezwyciężyć wszystkie powyższe sytuacje zagrażające życiu, opracowaliśmy nanoporowate rusztowanie kompozytowe wzmocnione włóknami (NFRCS), które wykorzystuje minimalne stężenie polimeru (0,5%) przy użyciu kombinacji rozpuszczalnych w wodzie polimerów hemostatycznych.
Dzięki zastosowaniu wzmocnienia włóknem można opracować produkty ekonomiczne. Losowo ułożone włókna przypominają strukturę skrzydła ważki, zrównoważone poziomymi i pionowymi paskami na skrzydłach. Poprzeczne i podłużne żyły skrzydła komunikują się z błoną skrzydła (rys. 1). NFRCS składa się ze wzmocnionego Ct jako systemu rusztowania o lepszej wytrzymałości fizycznej i mechanicznej (rys. 1). Ze względu na przystępność cenową i kunszt wykonania chirurdzy wolą używać wskaźników nici bawełnianych (Ct) podczas operacji i opatrunków. W związku z tym, biorąc pod uwagę jego liczne korzyści, w tym zawartość > 90% celulozy krystalicznej (poprawiającej działanie hemostatyczne), Ct zastosowano jako układ szkieletowy NFRCS9,10. W związku z tym, biorąc pod uwagę jego liczne korzyści, w tym zawartość > 90% celulozy krystalicznej (poprawiającej działanie hemostatyczne), Ct zastosowano jako układ szkieletowy NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. W związku z tym, biorąc pod uwagę liczne korzyści, w tym zawartość celulozy krystalicznej >90% (biorącej udział w zwiększonej aktywności hemostatycznej), Ct został wykorzystany jako szkielet NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%W związku z tym, biorąc pod uwagę liczne zalety, w tym zawartość ponad 90% celulozy krystalicznej (pomagającej zwiększyć aktywność hemostatyczną), Ct zastosowano jako rusztowanie dla NFRCS9,10.Ct został pokryty powierzchniowo (obserwowano tworzenie się nano-grubej warstwy) i połączony z hemostatyczną kompozycją tworzącą warstwę (HFFC). HFFC działa jak matrigel, utrzymując losowo rozmieszczone Ct razem. Opracowany projekt przenosi naprężenia w obrębie fazy rozproszonej (włókna wzmacniające). Trudno jest uzyskać nanoporowate struktury o dobrej wytrzymałości mechanicznej przy użyciu minimalnych stężeń polimeru. Ponadto nie jest łatwo dostosować różne formy do różnych zastosowań biomedycznych.
Rysunek przedstawia diagram projektu NFRCS opartego na strukturze skrzydła ważki (A). Ten obraz przedstawia porównawczą analogię struktury skrzydła ważki (przecinające się i podłużne żyły skrzydła są ze sobą połączone) oraz mikrofotografię przekroju poprzecznego Cp NFRCS (B). Schematyczna reprezentacja NFRCS.
NFRC opracowano przy użyciu HFFC jako fazy ciągłej, aby rozwiązać powyższe ograniczenia. HFFC składa się z różnych tworzących film polimerów hemostatycznych, w tym chitozanu (jako głównego polimeru hemostatycznego) z metylocelulozą (MC), hydroksypropylometylocelulozą (HPMC 50 cp) i alkoholem poliwinylowym (PVA)) (125 kDa) jako polimerem nośnym, który wspomaga tworzenie się skrzepu. tworzenie. Dodanie poliwinylopirolidyny K30 (PVP K30) poprawiło zdolność NFRCS do absorpcji wilgoci. Dodano glikol polietylenowy 400 (PEG 400), aby poprawić usieciowanie polimeru w wiązanych mieszankach polimerowych. Trzy różne kompozycje hemostatyczne HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), a mianowicie chitozan z MC (Cm), chitozan z HPMC (Ch) i chitozan z PVA (Cp), zastosowano do Ct. Różne badania in vitro i in vivo potwierdziły hemostatyczną i gojącą rany aktywność NFRCS. Materiały kompozytowe oferowane przez NFRCS mogą być używane do dostosowywania różnych form rusztowań do konkretnych potrzeb.
Ponadto NFRCS można zmodyfikować jako bandaż lub rolkę, aby pokryć cały obszar urazu kończyn dolnych i innych części ciała. Specjalnie w przypadku urazów kończyn bojowych, zaprojektowany projekt NFRCS można zmienić na połowę ramienia lub całą nogę (Rysunek uzupełniający S11). NFRCS można wykonać w formie opaski na nadgarstek z klejem tkankowym, która może być używana do zatrzymywania krwawienia z poważnych samobójczych urazów nadgarstka. Naszym głównym celem jest opracowanie NFRCS z jak najmniejszą ilością polimeru, który można dostarczyć dużej populacji (poniżej granicy ubóstwa) i który można umieścić w apteczce pierwszej pomocy. Prosty, wydajny i ekonomiczny w konstrukcji, NFRCS przynosi korzyści lokalnym społecznościom i może mieć globalny wpływ.
Chitozan (masa cząsteczkowa 80 kDa) i amarant zakupiono w firmie Merck, Indie. Hydroksypropylometyloceluloza 50 Cp, glikol polietylenowy 400 i metyloceluloza zakupiono w firmie Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Alkohol poliwinylowy (masa cząsteczkowa 125 kDa) (zhydrolizowany w 87-90%) zakupiono w firmie National Chemicals, Gujarat. Poliwinylopirolidyna K30 zakupiono w firmie Molychem, Mumbai, jałowe waciki zakupiono w firmie Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, z wodą Milli Q (system oczyszczania wody Direct-Q3, Merck, Indie) jako nośnikiem.
NFRCS opracowano przy użyciu metody liofilizacji11,12. Wszystkie kompozycje HFFC (Tabela 1) przygotowano przy użyciu mieszadła mechanicznego. Przygotuj 0,5% roztwór chitozanu przy użyciu 1% kwasu octowego w wodzie, mieszając ciągle przy 800 obr./min na mieszadle mechanicznym. Dokładną wagę załadowanego polimeru podaną w Tabeli 1 dodano do roztworu chitozanu i mieszano do uzyskania klarownego roztworu polimeru. Do powstałej mieszanki dodano PVP K30 i PEG 400 w ilościach podanych w Tabeli 1 i kontynuowano mieszanie do uzyskania klarownego lepkiego roztworu polimeru. Powstałą kąpiel roztworu polimeru poddano działaniu ultradźwięków przez 60 minut, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza z mieszanki polimerowej. Jak pokazano na Rysunku uzupełniającym S1(b), Ct równomiernie rozprowadzono w każdym dołku płytki 6-dołkowej (formy) uzupełnionej 5 ml HFFC.
Płytkę sześciodołkową poddano działaniu ultradźwięków przez 60 min, aby uzyskać równomierne zwilżenie i rozprowadzenie HFFC w sieci Ct. Następnie zamrożono płytkę sześciodołkową w temperaturze -20°C na 8–12 godzin. Płytki zamrożone liofilizowano przez 48 godzin, aby uzyskać różne formulacje NFRCS. Tę samą procedurę stosuje się do wytwarzania różnych kształtów i struktur, takich jak tampony lub tampony cylindryczne, lub dowolny inny kształt do różnych zastosowań.
Dokładnie zważony chitozan (80 kDa) (3%) rozpuszcza się w 1% kwasie octowym za pomocą mieszadła magnetycznego. Do powstałego roztworu chitozanu dodano 1% PEG 400 i mieszano przez 30 minut. Powstały roztwór wlano do kwadratowego lub prostokątnego pojemnika i zamrożono w temperaturze -80°C na 12 godzin. Zamrożone próbki liofilizowano przez 48 godzin, aby uzyskać porowaty Cs13.
Opracowany NFRCS poddano eksperymentom z wykorzystaniem spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonia), aby potwierdzić zgodność chemiczną chitozanu z innymi polimerami14,15. Widma FTIR (szerokość zakresu widmowego od 400 do 4000 cm-1) wszystkich badanych próbek uzyskano wykonując 32 skany.
Szybkość wchłaniania krwi (BAR) dla wszystkich formulacji oceniano przy użyciu metody opisanej przez Chen i in. 16 z niewielkimi modyfikacjami. Opracowane NFRK wszystkich kompozycji suszono w piecu próżniowym w temperaturze 105°C przez noc w celu usunięcia resztkowego rozpuszczalnika. 30 mg NFRCS (początkowa masa próbki – W0) i 30 mg Ct (kontrola pozytywna) umieszczono w oddzielnych naczyniach zawierających premiks 3,8% cytrynianu sodu. W ustalonych odstępach czasu, tj. 5, 10, 20, 30, 40 i 60 sekund, NFRCS usuwano, a ich powierzchnie oczyszczano z niewchłoniętej krwi, umieszczając próbki na Ct na 30 sekund. Ostateczna masa krwi wchłoniętej przez NFRCS 16 była brana pod uwagę (W1) w każdym punkcie czasowym. Oblicz procent BAR, używając następującego wzoru:
Czas krzepnięcia krwi (BCT) został określony zgodnie z doniesieniami Wang i in. 17 . Czas potrzebny do skrzepnięcia pełnej krwi (krew szczura wstępnie zmieszana z 3,8% cytrynianem sodu) w obecności NFRCS został obliczony jako BCT próbki testowej. Różne składniki NFRCS (30 mg) umieszczono w 10 ml fiolkach z zakrętką i inkubowano w temperaturze 37°C. Do fiolki dodano krew (0,5 ml) i 0,3 ml 0,2 M CaCl2 w celu aktywacji krzepnięcia krwi. Na koniec odwracano fiolkę co 15 sekund (do 180°), aż utworzy się stały skrzep. BCT próbki oszacowano na podstawie liczby przewróceń fiolek17,18. Na podstawie BCT wybrano dwa optymalne składy z NFRCS Cm, Ch i Cp do dalszych badań charakteryzacyjnych.
BCT kompozycji Ch NFRCS i Cp NFRCS określono, stosując metodę opisaną przez Li i in. 19. Umieść 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (kontrola pozytywna) w oddzielnych szalkach Petriego (37 °C). Krew zawierającą 3,8% cytrynianu sodu zmieszano z 0,2 M CaCl2 w stosunku objętościowym 10:1, aby rozpocząć proces krzepnięcia krwi. 20 µl mieszanki krwi szczura o stężeniu 0,2 M CaCl2 nałożono na powierzchnię próbki i umieszczono w pustej szalce Petriego. Kontrolę stanowiła krew wlana do pustych szalek Petriego bez Ct. W stałych odstępach czasu 0, 3 i 5 minut zatrzymaj krzepnięcie, dodając 10 ml dejonizowanej (DI) wody do próbki zawierającej szalkę, nie naruszając skrzepu. Niezakrzepłe erytrocyty (erytrocyty) ulegają hemolizie w obecności dejonizowanej wody i uwalniają hemoglobinę. Hemoglobinę w różnych punktach czasowych (HA(t)) mierzono przy 540 nm (λmax hemoglobina) za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Jako standard odniesienia przyjęto absorpcję absolutną hemoglobiny (AH(0)) w ciągu 0 min 20 µl krwi w 10 ml dejonizowanej wody. Względne wychwytywanie hemoglobiny (RHA) przez skrzepniętą krew obliczono ze stosunku HA(t)/HA(0) przy użyciu tej samej partii krwi.
Za pomocą analizatora tekstury (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) określono właściwości adhezyjne NFRK do uszkodzonej tkanki. Przyciśnij cylindryczne naczynie z otwartym dnem do wewnętrznej strony skóry wieprzowej (bez warstwy tłuszczu). Próbki (Ch NFRCS i Cp NFRCS) nałożono za pomocą kaniuli do cylindrycznych form, aby uzyskać przyczepność do skóry świni. Po 3-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej (RT) (25° C.) siłę adhezji NFRCS rejestrowano ze stałą szybkością 0,5 mm/s.
Główną cechą uszczelniaczy chirurgicznych jest zwiększenie krzepnięcia krwi przy jednoczesnym zmniejszeniu jej utraty. Bezstratne krzepnięcie w NFRCS oceniano przy użyciu wcześniej opublikowanej metody z niewielkimi modyfikacjami 19 . Przygotuj probówkę mikrowirówkową (2 ml) (średnica wewnętrzna 10 mm) z otworem 8 × 5 mm2 po jednej stronie probówki wirówkowej (reprezentującej otwartą ranę). NFRCS służy do zamknięcia otworu, a taśma służy do uszczelnienia zewnętrznych krawędzi. Dodaj 20 µl 0,2 M CaCl2 do probówki mikrowirówkowej zawierającej 3,8% premiks cytrynianu sodu. Po 10 minutach probówki mikrowirówkowe wyjęto z naczyń i określono wzrost masy naczyń spowodowany wypływem krwi z NFRK (n = 3). Utrata krwi Ch NFRCS i Cp NFRCS porównano z Cs.
Mokrą integralność NFRCS określono na podstawie metody opisanej przez Mishrę i Chaudhary21 z niewielkimi modyfikacjami. Umieść NFRCS w 100 ml kolbie Erlenmeyera z 50 ml wody i mieszaj przez 60 s, nie tworząc górnej części. Przeprowadź kontrolę wizualną i ustal priorytety próbek pod kątem integralności fizycznej na podstawie pobranej próbki.
Siłę wiązania HFFC do Ct badano przy użyciu wcześniej opublikowanych metod z niewielkimi modyfikacjami. Integralność powłoki powierzchniowej oceniano poprzez wystawienie NFRK na działanie fal akustycznych (bodziec zewnętrzny) w obecności wody milliQ (Ct). Opracowane NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS umieszczono w zlewce wypełnionej wodą i poddano działaniu ultradźwięków przez odpowiednio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 minut. Po wysuszeniu, różnica procentowa między początkową i końcową masą NFRCS została użyta do obliczenia procentowej utraty materiału (HFFC). In vitro BCT dodatkowo potwierdziło siłę wiązania lub utratę materiałów powierzchniowych. Wydajność wiązania HFFC do Ct zapewnia krzepnięcie krwi i elastyczną powłokę na powierzchni Ct22.
Jednorodność opracowanego NFRCS określono metodą BCT próbek (30 mg) pobranych z losowo wybranych ogólnych lokalizacji NFRCS. Postępuj zgodnie z wcześniej wspomnianą procedurą BCT, aby określić zgodność z NFRCS. Bliskość wszystkich pięciu próbek zapewnia równomierne pokrycie powierzchni i osadzanie HFFC w siatce Ct.
Nominalny obszar kontaktu z krwią (NBCA) został określony zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, z pewnymi modyfikacjami. Koagulacja krwi poprzez zaciśnięcie 20 µl krwi pomiędzy dwiema powierzchniami Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. Po 1 godzinie dwie części stentu zostały rozdzielone i ręcznie zmierzono obszar skrzepu. Średnia wartość z trzech powtórzeń została uznana za NBCA NFRCS19.
Analiza Dynamic Vapor Sorption (DVS) została użyta do oceny skuteczności NFRCS w absorbowaniu wody ze środowiska zewnętrznego lub z miejsca urazu odpowiedzialnego za zainicjowanie koagulacji. DVS ocenia lub rejestruje pobieranie i utratę pary w próbce grawimetrycznie przy użyciu ultraczułej wagi o rozdzielczości masy ±0,1 µg. Częściowe ciśnienie pary (wilgotność względna) jest generowane przez elektroniczny regulator przepływu masy wokół próbki poprzez mieszanie nasyconych i suchych gazów nośnych. Zgodnie z wytycznymi Farmakopei Europejskiej, na podstawie procentowego poboru wilgoci przez próbki, próbki podzielono na 4 kategorie (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w – lekko higroskopijne, 2–15% – umiarkowanie higroskopijne i > 15% – bardzo higroskopijne)23. Zgodnie z wytycznymi Farmakopei Europejskiej, na podstawie procentowego pochłonięcia wilgoci przez próbki, próbki podzielono na 4 kategorie (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w – lekko higroskopijne, 2–15% – umiarkowanie higroskopijne i > 15% – bardzo higroskopijne)23.Zgodnie z zaleceniami Farmakopei Europejskiej, w zależności od stopnia absorpcji wilgoci przez próbki, podzielono je na 4 kategorie (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w słabo higroskopijne, 2–15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % umiarkowanie higroskopijny i > 15% bardzo higroskopijny)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-非吸湿性, 0,2-2% w/w 轻微吸湿性, 2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （(0-0,012% W/w 吸湿 性, 、 、 0,2-2% W/w 轻微 2-15% 适度 吸湿 ，> 15% 非常吸湿）23.Zgodnie z zaleceniami Farmakopei Europejskiej próbki dzieli się na 4 klasy w zależności od procentowej zawartości wilgoci wchłoniętej przez próbkę (0-0,012% wag. – niehigroskopijne, 0,2-2% wag. – słabo higroskopijne, 2-15% wag.).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % umiarkowanie higroskopijny, > 15% bardzo higroskopijny) 23.Wydajność higroskopijna NFCS X NFCS i TsN NFCS została określona na analizatorze DVS TA TGA Q5000 SA. Podczas tego procesu uzyskano czas pracy, wilgotność względną (RH) i masę próbki w czasie rzeczywistym w temperaturze 25°C24. Zawartość wilgoci oblicza się za pomocą dokładnej analizy masy NFRCS przy użyciu następującego równania:
MC to wilgotność NFRCS. m1 – sucha masa NLPZ. m2 to masa NFRCS w czasie rzeczywistym przy danej wilgotności względnej.
Całkowitą powierzchnię oszacowano przy użyciu eksperymentu adsorpcji azotu z ciekłym azotem po opróżnieniu próbek w temperaturze 25 °C przez 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Całkowitą powierzchnię oszacowano przy użyciu eksperymentu adsorpcji azotu z ciekłym azotem po opróżnieniu próbek w temperaturze 25 °C przez 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Całkowitą powierzchnię oszacowano przy użyciu eksperymentu adsorpcji azotu z ciekłym azotem po opróżnieniu próbek w temperaturze 25°C przez 10 h (< 7 × 10–3 Torr).Temperatura 25°C w temperaturze 10°C (< 7 × 10-3 Torr) w temperaturze pokojowej.Temperatura 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 torp). Całkowitą powierzchnię oszacowano za pomocą eksperymentów adsorpcji azotu przy użyciu ciekłego azotu po opróżnieniu próbek na 10 godzin w temperaturze 25°C (< 7 x 10-3 torr).Całkowitą powierzchnię, objętość porów i rozmiar porów NFRCS wyznaczono za pomocą urządzenia Quantachrome firmy NOVA 1000e, Austria, przy użyciu oprogramowania RS 232.
Przygotuj 5% RBCs (sól fizjologiczna jako rozcieńczalnik) z pełnej krwi. Następnie przenieś alikwot HFFC (0,25 ml) na płytkę 96-dołkową i 5% masy RBC (0,1 ml). Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37°C przez 40 minut. Mieszaninę czerwonych krwinek i surowicy uznano za kontrolę pozytywną, a mieszaninę soli fizjologicznej i czerwonych krwinek za kontrolę negatywną. Hemaglutynację określono zgodnie ze skalą Stajitzky'ego. Proponowane skale są następujące: + + + + gęste ziarniste agregaty; + + + gładkie dolne podkładki z zakrzywionymi krawędziami; + + gładkie dolne podkładki z poszarpanymi krawędziami; + wąskie czerwone pierścienie wokół krawędzi gładkich podkładek; – (negatywny) dyskretny czerwony przycisk 12 w środku dolnego dołka.
Hemokompatybilność NFRCS badano zgodnie z metodą Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Metodę grawimetryczną opisaną przez Singh i in. Wprowadzono drobne modyfikacje w celu oceny tworzenia się skrzepu w obecności lub na powierzchni NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS inkubowano w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po 24 godzinach usunięto PBS, a NFRCS potraktowano 2 ml krwi zawierającej 3,8% cytrynianu sodu. Na powierzchnię NFRCS dodano 0,04 ml 0,1 M CaCl2 do inkubowanych próbek. Po 45 minutach dodano 5 ml wody destylowanej w celu zatrzymania koagulacji. Skrzepniętą krew na powierzchni NFRK potraktowano 36-38% roztworem formaldehydu. Skrzepy utrwalone formaldehydem wysuszono i zważono. Procent zakrzepicy oszacowano, obliczając wagę szkła bez krwi i próbki (kontrola ujemna) oraz szkła z krwią (kontrola dodatnia).
Jako wstępne potwierdzenie próbki zostały zwizualizowane pod mikroskopem optycznym, aby zrozumieć zdolność powłoki powierzchniowej HFFC, połączonych ze sobą Ct i sieci Ct do tworzenia porów. Cienkie sekcje Ch i Cp z NFRCS zostały przycięte ostrzem skalpela. Otrzymana sekcja została umieszczona na szkiełku przedmiotowym, przykryta szkiełkiem nakrywkowym, a krawędzie zostały utrwalone klejem. Przygotowane szkiełka zostały obejrzane pod mikroskopem optycznym, a zdjęcia zostały wykonane przy różnych powiększeniach.
Depozyt polimeru w sieciach Ct uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, w oparciu o metodę opisaną przez Rice'a i in.29. Kompozycję HFFC użytą do formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarantem), a NFRCS (Ch i Cp) przygotowano zgodnie z metodą opisaną wcześniej. Kompozycję HFFC użytą do formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarantem), a NFRCS (Ch i Cp) przygotowano zgodnie z metodą opisaną wcześniej.Kompozycję HFFC użytą do formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarantem), a NFRCS (Ch i Cp) uzyskano zgodnie z wcześniej opisaną metodą.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料(苋菜)混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料(苋菜)混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).Kompozycję HFFC użytą w formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarant) i otrzymano NFRCS (Ch i Cp), jak wspomniano wcześniej.Z uzyskanych próbek wycięto cienkie sekcje NFRK, umieszczono je na szkiełkach przedmiotowych i przykryto szkiełkami nakrywkowymi. Obserwować przygotowane szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając zielonego filtra (310–380 nm). Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 4x, aby zrozumieć zależności Ct i nadmiar osadzania polimeru w sieci Ct.
Topografię powierzchni NFRCS Ch i Cp określono przy użyciu mikroskopu sił atomowych (AFM) z ultraostrym wspornikiem TESP w trybie gwintowania: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajwan. Chropowatość powierzchni określono metodą średniej kwadratowej (RMS) przy użyciu oprogramowania (Scanning Probe Image Processor). Różne lokalizacje NFRCS wyrenderowano na obrazach 3D, aby sprawdzić jednorodność powierzchni. Odchylenie standardowe wyniku dla danego obszaru zdefiniowano jako chropowatość powierzchni. Równanie RMS zostało użyte do ilościowego określenia chropowatości powierzchni NFRCS31.
Badania oparte na FESEM przeprowadzono przy użyciu FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, aby zrozumieć morfologię powierzchni Ch NFRCS i Cp NFRCS, które wykazały lepszą BCT niż Cm NFRCS. Badanie FESEM przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną przez Zhao i in. 32 z niewielkimi modyfikacjami. NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS i Cp NFRCS wstępnie zmieszano z 20 µl 3,8% cytrynianu sodu wstępnie zmieszanego z krwią szczura. Do próbek poddanych obróbce krwi dodano 20 µl 0,2 M CaCl2 w celu zainicjowania koagulacji, a próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ponadto nadmiar erytrocytów usunięto z powierzchni NFRCS poprzez przepłukanie solą fizjologiczną.
Następne próbki traktowano 0,1% glutaraldehydem, a następnie suszono w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 37°C w celu usunięcia wilgoci. Wysuszone próbki powlekano i analizowano32. Inne obrazy uzyskane podczas analizy to tworzenie się skrzepu na powierzchni poszczególnych włókien bawełny, osadzanie polimeru pomiędzy Ct, morfologia erytrocytów (kształt), integralność skrzepu i morfologia erytrocytów w obecności NFRCS. Nieleczone obszary NFRCS oraz obszary NFRCS traktowane Ch i Cp inkubowane z krwią skanowano pod kątem jonów pierwiastkowych (sodu, potasu, azotu, wapnia, magnezu, cynku, miedzi i selenu)33. Porównaj procentowe zawartości jonów pierwiastkowych w próbkach traktowanych i nietraktowanych, aby zrozumieć akumulację jonów pierwiastkowych podczas tworzenia skrzepu i jego jednorodność.
Grubość powłoki powierzchniowej Cp HFFC na powierzchni Ct określono za pomocą FESEM. Przekroje poprzeczne Cp NFRCS wycięto z ramy i pokryto powłoką rozpyłową. Otrzymane próbki powłoki rozpyłowej obserwowano za pomocą FESEM, a grubość powłoki powierzchniowej mierzono 34 , 35 , 36 .
Mikrotomografia rentgenowska zapewnia obrazowanie 3D o wysokiej rozdzielczości i umożliwia badanie wewnętrznego układu strukturalnego NFRK. Mikrotomografia rentgenowska wykorzystuje wiązkę promieni rentgenowskich przechodzącą przez próbkę w celu zarejestrowania lokalnego liniowego współczynnika tłumienia promieni rentgenowskich w próbce, co pomaga uzyskać informacje morfologiczne. Wewnętrzna lokalizacja Ct w Cp NFRCS i Cp NFRCS poddanych działaniu krwi została zbadana za pomocą mikrotomografii, aby zrozumieć wydajność absorpcji i krzepnięcie krwi w obecności NFRCS37,38,39. Struktury 3D próbek Cp NFRCS poddanych działaniu krwi i niepoddanych działaniu krwi zostały zrekonstruowane za pomocą mikrotomografii (V|tome|x S240, Phoenix, Niemcy). Za pomocą oprogramowania VG STUDIO-MAX w wersji 2.2 wykonano kilka zdjęć rentgenowskich pod różnymi kątami (najlepiej w zakresie 360°), aby opracować obrazy 3D dla NFRCS. Zebrane dane projekcyjne zrekonstruowano do postaci trójwymiarowych obrazów objętościowych przy użyciu prostego oprogramowania 3D ScanIP Academic.
Ponadto, aby zrozumieć rozkład skrzepu, do NFRCS dodano 20 µl wstępnie zmieszanej krwi cytrynianowej i 20 µl 0,2 M CaCl2, aby zainicjować krzepnięcie krwi. Przygotowane próbki pozostawiono do stwardnienia. Powierzchnię NFRK potraktowano 0,5% glutaraldehydem i wysuszono w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 30–40°C przez 30 min. Skrzep krwi utworzony na NFRCS zeskanowano, zrekonstruowano i zwizualizowano obraz 3D skrzepu krwi.
Testy antybakteryjne przeprowadzono na Cp NFRCS (najlepiej w porównaniu do Ch NFRCS) przy użyciu wcześniej opisanej metody z niewielkimi modyfikacjami. Aktywność antybakteryjną Cp NFRCS i Cp HFFC określono przy użyciu trzech różnych mikroorganizmów testowych [S.aureus (bakterie Gram-dodatnie), E.coli (bakterie Gram-ujemne) i białe Candida (C.albicans)] rosnące na agarze w szalkach Petriego w inkubatorze. Jednorodnie zaszczepić 50 ml rozcieńczonej zawiesiny hodowli bakteryjnej o stężeniu 105-106 CFU ml-1 na podłoże agarowe. Wlać podłoże do szalki Petriego i pozostawić do zestalenia. Na powierzchni płytki agarowej wykonano dołki, aby wypełnić je HFFC (3 dołki dla HFFC i 1 dla kontroli negatywnej). Dodać 200 µl HFFC do 3 dołków i 200 µl pH 7,4 PBS do 4 dołka. Po drugiej stronie szalki Petriego umieść 12 mm krążek Cp NFRCS na zestalonym agarze i zwilż PBS (pH 7,4). Tabletki cyprofloksacyny, ampicyliny i flukonazolu są uważane za standardy odniesienia dla Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Zmierz strefę zahamowania ręcznie i zrób cyfrowy obraz strefy zahamowania.
Po zatwierdzeniu przez instytucję etyki badanie przeprowadzono w Kasturba Medical College of Education and Research w Manipal, Karnataka, w południowych Indiach. Protokół eksperymentalny in vitro TEG został sprawdzony i zatwierdzony przez Institutional Ethics Committee of Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Badanych rekrutowano spośród ochotników-dawców krwi (w wieku od 18 do 55 lat) ze szpitalnego banku krwi. Ponadto od ochotników uzyskano formularz świadomej zgody na pobranie próbek krwi. Do zbadania wpływu formulacji Cp HFFC na pełną krew wstępnie zmieszaną z cytrynianem sodu użyto natywnego TEG (N-TEG). N-TEG jest powszechnie uznawany za czynnik odgrywający rolę w resuscytacji przyłóżkowej, co stwarza problemy dla lekarzy ze względu na potencjalne klinicznie istotne opóźnienie w wynikach (rutynowe testy krzepnięcia). Analizę N-TEG przeprowadzono przy użyciu pełnej krwi. Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę i szczegółowy wywiad medyczny. Badanie nie obejmowało uczestników z powikłaniami hemostatycznymi lub zakrzepowymi, takimi jak ciąża/połóg lub choroba wątroby. Osoby przyjmujące leki wpływające na kaskadę krzepnięcia również zostały wyłączone z badania. Podstawowe badania laboratoryjne (hemoglobina, czas protrombinowy, aktywowana tromboplastyna i liczba płytek krwi) zostały wykonane u wszystkich uczestników zgodnie ze standardowymi procedurami. N-TEG określa lepkosprężystość skrzepu krwi, początkową strukturę skrzepu, interakcję cząstek, wzmocnienie skrzepu i lizę skrzepu. Analiza N-TEG dostarcza danych graficznych i liczbowych na temat zbiorczych efektów kilku elementów komórkowych i osocza. Analiza N-TEG została przeprowadzona na dwóch różnych objętościach Cp HFFC (10 µl i 50 µl). W rezultacie 1 ml pełnej krwi z kwasem cytrynowym dodano do 10 μl Cp HFFC. Dodać 1 ml (Cp HFFC + krew cytrynianowa), 340 µl mieszanej krwi do 20 µl 0,2 M CaCl2 zawierającej naczynie TEG. Następnie naczynia TEG załadowano do TEG® 5000, US w celu zmierzenia R, K, kąta alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% próbek krwi w obecności Cp HFFC41.
Protokół badania in vivo został sprawdzony i zatwierdzony przez Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Wszystkie badania in vivo NFRCS (2 × 2 cm2) przeprowadzono na samicach szczurów Wistar (ważących od 200 do 250 g). Wszystkie zwierzęta aklimatyzowano w temperaturze 24–26°C, zwierzęta miały swobodny dostęp do standardowej karmy i wody ad libitum. Wszystkie zwierzęta podzielono losowo na różne grupy, każda grupa składała się z trzech zwierząt. Wszystkie badania przeprowadzono zgodnie z Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 . Przed badaniem zwierzęta znieczulono dootrzewnowo (ip) mieszaniną 20-50 mg ketaminy (na 1 kg masy ciała) i 2-10 mg ksylazyny (na 1 kg masy ciała). Po badaniu objętość krwawienia obliczono, oceniając różnicę między początkową i końcową masą próbek, a średnią wartość uzyskaną z trzech testów przyjęto jako objętość krwawienia próbki.
Model amputacji ogona szczura został wdrożony w celu zrozumienia potencjału NFRCS do modulacji krwawienia w urazach, walce lub wypadkach drogowych (model urazu). Odetnij 50% ogona ostrzem skalpela i umieść w powietrzu na 15 s, aby zapewnić normalne krwawienie. Ponadto próbki testowe umieszczono na ogonie szczura, wywierając nacisk (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS). Krwawienie i PCT zgłoszono dla próbek testowych (n = 3)17,45.
Skuteczność kontroli ciśnienia NFRCS w walce badano na modelu tętnicy udowej powierzchniowej. Tętnica udowa jest odsłonięta, nakłuta trokarem 24G i krwawi w ciągu 15 sekund. Po zaobserwowaniu niekontrolowanego krwawienia próbka testowa jest umieszczana w miejscu nakłucia z zastosowaniem nacisku. Natychmiast po nałożeniu próbki testowej rejestrowano czas krzepnięcia i obserwowano skuteczność hemostazy przez kolejne 5 minut. Tę samą procedurę powtórzono z Cs i Ct46.
Dowling i in. 47 zaproponowali model uszkodzenia wątroby w celu oceny potencjału hemostatycznego materiałów hemostatycznych w kontekście krwawienia śródoperacyjnego. BCT rejestrowano dla próbek Ct (kontrola ujemna), struktury Cs (kontrola dodatnia), próbek Ch NFRCS i próbek Cp NFRCS. Nadwątrobowa żyła główna szczura została odsłonięta poprzez wykonanie laparotomii medianowej. Następnie wycięto nożyczkami dystalną część lewego płata. Wykonaj nacięcie wątroby ostrzem skalpela i pozwól jej krwawić przez kilka sekund. Dokładnie zważone próbki testowe Ch NFRCS i Cp NFRCS umieszczono na uszkodzonej powierzchni bez żadnego dodatniego nacisku i rejestrowano BCT. Następnie grupa kontrolna (Ct) zastosowała nacisk, a następnie Cs 30 s47 bez naruszania urazu.
Przeprowadzono testy gojenia ran in vivo przy użyciu modelu rany wyciętej, aby ocenić właściwości gojenia ran opracowanych polimerowych NFRCS. Modele ran wyciętych wybrano i wykonano zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami z niewielkimi modyfikacjami19,32,48. Wszystkie zwierzęta znieczulono zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą dziurkacza do biopsji (12 mm) wykonano okrągłe głębokie nacięcie w skórze pleców. Przygotowane miejsca rany opatrzono za pomocą Cs (kontrola pozytywna), Ct (uznając, że waciki przeszkadzają w gojeniu), Ch NFRCS i Cp NFRCS (grupa eksperymentalna) oraz kontroli negatywnej bez żadnego leczenia. Każdego dnia badania mierzono powierzchnię rany u wszystkich szczurów. Za pomocą aparatu cyfrowego zrób zdjęcie powierzchni rany i załóż nowy opatrunek. Procent zamknięcia rany mierzono za pomocą następującego wzoru:
Na podstawie procentowego stopnia zamknięcia rany w 12. dniu badania wycięto skórę szczurów z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) i zbadano ją za pomocą barwienia H&E oraz barwienia trichromowego Massona. Na podstawie procentowego stopnia zamknięcia rany w 12. dniu badania wycięto skórę szczurów z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) i zbadano ją za pomocą barwienia H&E oraz barwienia trichromowego Massona.Na podstawie stopnia zamknięcia rany w 12. dniu badania wycięto skórę szczurów z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) i zbadano ją poprzez barwienie hematoksyliną-eozyną oraz trichromem Massona.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Szczury z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) poddano barwieniu hematoksyliną i eozyną oraz barwieniu metodą Massona trichrome na podstawie procentowego zamknięcia rany w 12. dniu badania.Wdrożona procedura barwienia została przeprowadzona zgodnie z wcześniej opisanymi metodami49,50. Krótko mówiąc, po utrwaleniu w 10% formalinie próbki odwodniono przy użyciu serii stopniowanych alkoholi. Użyj mikrotomu, aby uzyskać cienkie skrawki (5 µm grubości) wyciętej tkanki. Cienkie seryjne skrawki kontroli i Cp NFRCS poddano działaniu hematoksyliny i eozyny, aby zbadać zmiany histopatologiczne. Barwienie trichromem Massona zostało użyte do wykrycia tworzenia się włókienek kolagenowych. Uzyskane wyniki były badane w sposób ślepy przez patologów.
Stabilność próbek Cp NFRCS badano w temperaturze pokojowej (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) przez 12 miesięcy51. Cp NFRCS (przebarwienia powierzchni i wzrost drobnoustrojów) poddano kontroli wizualnej i testom odporności na zużycie fałdowe oraz BCT zgodnie z powyższymi metodami opisanymi w części Materiały i metody.
Skalowalność i odtwarzalność Cp NFRCS zbadano poprzez przygotowanie Cp NFRCS o rozmiarze 15×15 cm2. Ponadto, próbki 30 mg (n = 5) wycięto z różnych frakcji Cp NFRCS, a BCT badanych próbek oceniono tak, jak opisano wcześniej w sekcji Metody.
Próbowaliśmy opracować różne kształty i struktury przy użyciu kompozycji Cp NFRCS do różnych zastosowań biomedycznych. Takie kształty lub konfiguracje obejmują stożkowe wymazówki do krwawień z nosa, zabiegów stomatologicznych i cylindryczne wymazówki do krwawienia z pochwy.
Wszystkie zestawy danych wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe i przeanalizowano je metodą ANOVA przy użyciu programu Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, Kalifornia, USA), a następnie za pomocą testu wielokrotnych porównań Bonferroniego (*p<0,05).
Wszystkie procedury przeprowadzane w badaniach na ludziach były zgodne ze standardami Instytutu i Narodowej Rady ds. Badań Naukowych, a także Deklaracją Helsińską z 1964 r. i jej późniejszymi poprawkami lub podobnymi standardami etycznymi. Wszyscy uczestnicy zostali poinformowani o cechach badania i jego dobrowolnym charakterze. Dane uczestników pozostają poufne po zebraniu. Protokół eksperymentalny in vitro TEG został sprawdzony i zatwierdzony przez Institutional Ethics Committee of Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Wolontariusze podpisali świadomą zgodę na pobranie próbek krwi.
Wszystkie procedury przeprowadzane w badaniach na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wydziału Lekarskiego Kastuba, Instytutu Szkolnictwa Wyższego Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Wszystkie zaprojektowane eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Kontroli i Nadzoru Eksperymentów na Zwierzętach (CPCSEA). Wszyscy autorzy stosują się do wytycznych ARRIVE.
Widma FTIR wszystkich NFRCS zostały przeanalizowane i porównane z widmem chitozanu pokazanym na rysunku 2A. Charakterystyczne piki widmowe chitozanu (zarejestrowane) przy 3437 cm-1 (rozciąganie OH i NH, nakładanie się), 2945 i 2897 cm-1 (rozciąganie CH), 1660 cm-1 (odkształcenie NH2), 1589 cm-1 (zginanie N–H), 1157 cm-1 (rozciąganie mostka O-), 1067 cm-1 (rozciąganie C–O, hydroksyl drugorzędowy), 993 cm-1 (rozciąganie CO, Bo-OH) 52,53,54. W tabeli uzupełniającej S1 przedstawiono wartości widma absorpcyjnego FTIR NFRCS dla chitozanu (reporter), czystego chitozanu, Cm, Ch i Cp. Widma FTIR wszystkich NFRCS (Cm, Ch i Cp) wykazały te same charakterystyczne pasma absorpcji, co czysty chitozan, bez żadnych istotnych zmian (rys. 2A). Wyniki FTIR potwierdziły brak oddziaływań chemicznych lub fizycznych między polimerami użytymi do opracowania NFRCS, co wskazuje, że użyte polimery są obojętne.
Charakterystyka in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. (A) przedstawia połączone widma FTIR składów chitozanu i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS poddanych kompresji. (B) a) Szybkość wychwytu NFRCS Cm, Ch, Cp i Cg (n = 3) przez pełną krew; Próbki Ct wykazały wyższy BAR, ponieważ wacik ma wyższą wydajność absorpcji; b) Krew po absorpcji krwi Ilustracja wchłoniętej próbki. Graficzna reprezentacja BCT próbki testowej C (Cp NFRCS miała najlepszą BCT (15 s, n = 3)). Dane w grupach C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± SD, a paski błędów oznaczają SD, ***p < 0,0001. Dane w grupach C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± SD, a paski błędów oznaczają SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E i G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют standardowy klucz, ***p <0,0001. Dane w C, D, E i G przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, a paski błędów oznaczają odchylenie standardowe, ***p<0,0001. C, D, E 和G 中的数据显示为平均值± SD, 误差线代表SD,***p < 0,0001. C, D, E 和G 中的数据显示为平均值± SD, 误差线代表SD,***p < 0,0001. Данные в C, D, E i G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют standartnoе отклонение, ***str <0,0001. Dane w C, D, E i G przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, paski błędów reprezentują odchylenie standardowe, ***p<0,0001.