Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Płodność ptaków zależy od ich zdolności do przechowywania wystarczającej ilości żywotnych plemników przez dłuższy czas w kanalikach do przechowywania nasienia (SST).Dokładny mechanizm, dzięki któremu plemniki wchodzą, przebywają i opuszczają SST, pozostaje kontrowersyjny.Plemniki kur sharkasi wykazywały dużą skłonność do aglutynacji, tworząc ruchliwe nitkowate wiązki zawierające wiele komórek.Ze względu na trudność obserwowania ruchliwości i zachowania plemników w nieprzezroczystym jajowodzie, do badania aglutynacji i ruchliwości plemników użyliśmy urządzenia mikroprzepływowego o przekroju poprzecznym mikrokanalika podobnym do przekroju plemników.W tym badaniu omówiono, w jaki sposób tworzą się wiązki plemników, jak się poruszają i ich możliwą rolę w wydłużaniu pobytu plemników w SST.Zbadaliśmy prędkość plemników i zachowanie reologiczne, gdy przepływ płynu był generowany w kanale mikroprzepływowym przez ciśnienie hydrostatyczne (natężenie przepływu = 33 µm/s).Plemniki mają tendencję do płynięcia pod prąd (reologia dodatnia), a prędkość wiązki plemników jest znacznie mniejsza w porównaniu z pojedynczymi plemnikami.Zaobserwowano, że wiązki plemników poruszają się spiralnie i zwiększają długość i grubość w miarę rekrutacji większej liczby pojedynczych plemników. Zaobserwowano, że wiązki plemników zbliżają się i przylegają do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych, aby uniknąć zamiatania z prędkością przepływu płynu > 33 µm/s. Zaobserwowano, że wiązki plemników zbliżają się i przylegają do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych, aby uniknąć zamiatania z prędkością przepływu płynu > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных ка налов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Zaobserwowano, że wiązki plemników zbliżają się i przylegają do bocznych ścian kanałów mikroprzepływowych, aby uniknąć ich zmiatania przy szybkościach przepływu płynu >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上,以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过.Prędkość 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного кан ала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Zaobserwowano, że wiązki plemników zbliżają się i przylegają do bocznych ścian kanału mikroprzepływowego, aby uniknąć porwania przez przepływ płynu o prędkości >33 µm/s.Skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa ujawniła, że ​​wiązki plemników były podtrzymywane przez obfity gęsty materiał.Uzyskane dane wskazują na wyjątkową ruchliwość plemników kurczaka Sharkazi, a także zdolność plemników do aglutynacji i tworzenia ruchomych wiązek, co przyczynia się do lepszego zrozumienia długoterminowego przechowywania plemników w SMT.
Aby osiągnąć zapłodnienie u ludzi i większości zwierząt, plemniki i komórki jajowe muszą dotrzeć do miejsca zapłodnienia we właściwym czasie.Dlatego krycie musi nastąpić przed lub w czasie owulacji.Z drugiej strony niektóre ssaki, takie jak psy, a także gatunki inne niż ssaki, takie jak owady, ryby, gady i ptaki, przechowują nasienie w swoich narządach rozrodczych przez dłuższy czas, aż ich jaja będą gotowe do zapłodnienia (zapłodnienie asynchroniczne 1 ).Ptaki są w stanie utrzymać żywotność plemników zdolnych do zapłodnienia jaj przez 2-10 tygodni2.
Jest to unikalna cecha odróżniająca ptaki od innych zwierząt, gdyż zapewnia wysokie prawdopodobieństwo zapłodnienia po pojedynczej inseminacji przez kilka tygodni bez jednoczesnego krycia i owulacji.Główny narząd magazynujący plemniki, zwany kanalikiem magazynującym plemniki (SST), znajduje się w wewnętrznych fałdach błony śluzowej w miejscu połączenia maciczno-pochwowego.Do tej pory mechanizmy, dzięki którym plemniki wchodzą, przebywają i opuszczają bank nasienia, nie są w pełni poznane.Na podstawie wcześniejszych badań wysunięto wiele hipotez, ale żadna z nich nie została potwierdzona.
Forman4 postawił hipotezę, że plemniki utrzymują swój pobyt w jamie SST poprzez ciągły ruch oscylacyjny w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu płynu przez kanały białkowe zlokalizowane na komórkach nabłonka SST (reologia).ATP jest wyczerpane z powodu stałej aktywności wici potrzebnej do utrzymania plemników w świetle SST, a ruchliwość ostatecznie spada, dopóki plemniki nie zostaną przeniesione z banku nasienia przez przepływ płynu i nie rozpoczną nowej podróży w dół wstępującego jajowodu w celu zapłodnienia plemników.Jajko (Forman4).Za tym modelem przechowywania plemników przemawia immunocytochemiczna detekcja akwaporyn 2, 3 i 9 obecnych w komórkach nabłonka SST.Do tej pory brakuje badań nad reologią nasienia kurcząt i jej rolą w przechowywaniu SST, selekcji plemników dopochwowych i współzawodnictwie plemników.U kurczaków plemniki dostają się do pochwy po naturalnym kryciu, ale ponad 80% plemników jest wyrzucanych z pochwy wkrótce po kryciu.Sugeruje to, że pochwa jest głównym miejscem selekcji plemników u ptaków.Ponadto zgłaszano, że mniej niż 1% plemników zapłodnionych w pochwie trafia do SST2.W sztucznym zapłodnieniu piskląt dopochwowo liczba plemników docierających do SST ma tendencję do wzrostu po 24 godzinach od inseminacji.Jak dotąd mechanizm selekcji plemników podczas tego procesu jest niejasny, a ruchliwość plemników może odgrywać ważną rolę w pobieraniu plemników SST.Ze względu na grube i nieprzejrzyste ściany jajowodów trudno jest bezpośrednio monitorować ruchliwość plemników w jajowodach ptaków.Dlatego brakuje nam podstawowej wiedzy o tym, jak plemniki przechodzą do SST po zapłodnieniu.
Reologia została niedawno uznana za ważny czynnik kontrolujący transport plemników w genitaliach ssaków.Opierając się na zdolności ruchliwych plemników do migracji przeciwprądowej, Zaferani i wsp. 8 wykorzystali system mikroprzepływowy corra do pasywnej izolacji ruchliwych plemników z próbek nasienia.Ten rodzaj sortowania nasienia ma zasadnicze znaczenie dla medycznego leczenia niepłodności i badań klinicznych i jest preferowany w stosunku do tradycyjnych metod, które są czasochłonne i pracochłonne i mogą zagrozić morfologii plemników i integralności strukturalnej.Jednak do tej pory nie przeprowadzono badań nad wpływem wydzielin z narządów płciowych kurcząt na ruchliwość plemników.
Niezależnie od mechanizmu, który utrzymuje plemniki przechowywane w SST, wielu badaczy zaobserwowało, że plemniki rezydentne aglutynują łeb w łeb w SST kurcząt 9, 10, przepiórek 2 i indyków 11, tworząc zlepione wiązki plemników.Autorzy sugerują, że istnieje związek między tą aglutynacją a długotrwałym przechowywaniem plemników w SST.
Tingari i Lake12 donieśli o silnym związku między plemnikami w gruczole przyjmującym plemniki kurcząt i zakwestionowali, czy plemniki ptasie aglutynują w taki sam sposób jak plemniki ssaków.Uważają, że głębokie połączenia między plemnikami w nasieniowodach mogą wynikać ze stresu spowodowanego obecnością dużej liczby plemników na małej przestrzeni.
Oceniając zachowanie się plemników na świeżych wiszących szkiełkach, można zauważyć przejściowe oznaki aglutynacji, zwłaszcza na brzegach kropelek nasienia.Jednak aglutynacja była często zakłócana przez działanie rotacyjne związane z ciągłym ruchem, co tłumaczy przejściowy charakter tego zjawiska.Naukowcy zauważyli również, że po dodaniu rozcieńczalnika do nasienia pojawiły się wydłużone, „niciowate” skupiska komórek.
Wczesne próby naśladowania plemnika podejmowano poprzez usunięcie cienkiego drutu z wiszącej kropli, co skutkowało wydłużeniem przypominającego plemnik pęcherzyka wystającego z kropli nasienia.Plemniki natychmiast ułożyły się równolegle w pęcherzyku, ale cała jednostka szybko zniknęła z powodu ograniczeń 3D.Dlatego do badania aglutynacji plemników konieczna jest obserwacja ruchliwości i zachowania plemników bezpośrednio w izolowanych kanalikach magazynujących plemniki, co jest trudne do osiągnięcia.Dlatego konieczne jest opracowanie instrumentu, który naśladuje plemniki, aby wesprzeć badania ruchliwości plemników i zachowania aglutynacyjnego.Brillard i wsp.13 podali, że średnia długość kanalików magazynujących nasienie u dorosłych piskląt wynosi 400–600 µm, ale niektóre SST mogą mieć nawet 2000 µm.Mero i Ogasawara14 podzielili gruczoły nasienne na powiększone i niepowiększone kanaliki magazynujące plemniki, z których oba miały taką samą długość (~500 µm) i szerokość szyjki (~38 µm), ale średnia średnica kanalików wynosiła 56,6 i 56,6 µm..odpowiednio 11,2 μm.W obecnym badaniu wykorzystaliśmy urządzenie mikroprzepływowe o rozmiarze kanału 200 µm × 20 µm (szer. × wys.), którego przekrój jest nieco zbliżony do przekroju wzmocnionego SST.Ponadto zbadaliśmy ruchliwość plemników i zachowanie aglutynacji w przepływającym płynie, co jest zgodne z hipotezą Foremana, że ​​płyn wytwarzany przez komórki nabłonkowe SST utrzymuje plemniki w świetle w kierunku przeciwprądowym (reologicznym).
Celem pracy było przezwyciężenie problemów związanych z obserwacją ruchliwości plemników w jajowodzie oraz uniknięcie trudności związanych z badaniem reologii i zachowania się plemników w środowisku dynamicznym.Zastosowano urządzenie mikroprzepływowe, które wytwarza ciśnienie hydrostatyczne w celu symulacji ruchliwości plemników w genitaliach kurczaka.
Gdy kropla rozcieńczonej próbki nasienia (1:40) została załadowana do urządzenia mikrokanalikowego, można było zidentyfikować dwa rodzaje ruchliwości plemników (plemniki izolowane i plemniki związane).Ponadto plemniki miały tendencję do pływania pod prąd (dodatnia reologia; wideo 1, 2). Chociaż wiązki plemników miały mniejszą prędkość niż plemniki samotne (p < 0,001), zwiększały odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2). Chociaż wiązki plemników miały mniejszą prędkość niż plemniki samotne (p < 0,001), zwiększały odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увели чивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Chociaż wiązki plemników miały mniejszą prędkość niż pojedyncze plemniki (p < 0,001), zwiększały odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001) ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; tab. 2). Chociaż prędkość wiązek plemników była mniejsza niż pojedynczych plemników (p < 0,001), zwiększyły one odsetek plemników o dodatniej reologii (p < 0,001; Tabela 2).Dodatnią reologię pojedynczych plemników i kępek ocenia się odpowiednio na około 53% i 85%.
Zaobserwowano, że plemniki kurcząt sharkasi bezpośrednio po wytrysku tworzą liniowe wiązki, składające się z kilkudziesięciu osobników.Pęczki te zwiększają swoją długość i grubość w czasie i mogą pozostawać in vitro przez kilka godzin przed rozproszeniem (wideo 3).Te nitkowate wiązki mają kształt plemników echidna, które tworzą się na końcu najądrza.Stwierdzono, że nasienie kur Sharkashi ma wysoką tendencję do aglutynacji i tworzenia siateczkowatej wiązki w czasie krótszym niż jedna minuta po pobraniu.Wiązki te są dynamiczne i mogą przyklejać się do pobliskich ścian lub obiektów statycznych.Chociaż wiązki plemników zmniejszają prędkość plemników, jasne jest, że makroskopowo zwiększają one ich liniowość.Długość wiązek różni się w zależności od liczby plemników zebranych w wiązkach.Wyodrębniono dwie części wiązki: część początkową zawierającą wolną główkę plemnika aglutynowanego oraz część końcową zawierającą wieczko i cały dalszy koniec plemnika.Za pomocą szybkiej kamery (950 kl./s) w początkowej części pęczka obserwowano wolne główki zlepionych plemników, odpowiedzialne za ruch pęczka na skutek ruchu oscylacyjnego, wciągając pozostałe do pęczka ruchem spiralnym (wideo 4).Jednak w długich kępkach zaobserwowano, że niektóre wolne główki plemników przylegały do ​​ciała, a końcowa część kępki działa jak łopatki pomagające napędzać kępkę.
Podczas powolnego przepływu płynu wiązki plemników poruszają się równolegle do siebie, jednak zaczynają się nakładać i przyklejać do wszystkiego, co jest nieruchome, aby nie zostać zmyte przez przepływ prądu wraz ze wzrostem prędkości przepływu.Wiązki tworzą się, gdy garstka plemników zbliża się do siebie, zaczynają poruszać się synchronicznie i owijać się wokół siebie, a następnie przyklejają się do lepkiej substancji.Ryciny 1 i 2 pokazują, w jaki sposób plemniki zbliżają się do siebie, tworząc połączenie, gdy ogonki owijają się wokół siebie.
Naukowcy zastosowali ciśnienie hydrostatyczne, aby wytworzyć przepływ płynu w mikrokanale w celu zbadania reologii plemników.Zastosowano mikrokanał o rozmiarze 200 µm × 20 µm (szer. × wys.) i długości 3, 6 µm.Użyj mikrokanalików między pojemnikami ze strzykawkami zamocowanymi na końcach.Zastosowano barwniki spożywcze, aby kanały były bardziej widoczne.
Przymocuj kable połączeniowe i akcesoria do ściany.Film został nagrany za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.Przy każdym obrazie prezentowane są obrazy z mikroskopii z kontrastem fazowym i mapowania.(A) Połączenie między dwoma strumieniami stawia opór przepływowi z powodu ruchu spiralnego (czerwona strzałka).(B) Połączenie między wiązką rur a ścianą kanału (strzałki czerwone), jednocześnie są one połączone z dwoma innymi wiązkami (strzałki żółte).(C) Wiązki plemników w kanale mikroprzepływowym zaczynają się ze sobą łączyć (czerwone strzałki), tworząc siatkę wiązek plemników.(D) Tworzenie sieci wiązek plemników.
Gdy kroplę rozcieńczonego nasienia załadowano do urządzenia mikroprzepływowego i wytworzył się przepływ, zaobserwowano, że wiązka plemników porusza się w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu.Wiązki ściśle przylegają do ścianek mikrokanalików, a wolne głowy w początkowej części wiązek ściśle do nich przylegają (wideo 5).Przyklejają się również do wszelkich nieruchomych cząstek na swojej drodze, takich jak gruz, aby oprzeć się porwaniu przez prąd.Z biegiem czasu te kępki stają się długimi włóknami, zatrzymując inne pojedyncze plemniki i krótsze kępki (wideo 6).Gdy przepływ zaczyna zwalniać, długie linie plemników zaczynają tworzyć sieć linii plemników (wideo 7; ryc. 2).
Przy dużej prędkości przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy nici są zwiększane w celu złapania wielu pojedynczych plemników tworzących pęczki lepiej przeciwstawiające się sile dryfującej przepływu. Przy dużej prędkości przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy nici są zwiększane w celu złapania wielu pojedynczych plemników tworzących pęczki lepiej przeciwstawiające się sile dryfującej przepływu. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются п оймать множество отdelьных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе zdjęcie. Przy dużych prędkościach przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy pasm zwiększają się, gdy próbują złapać wiele pojedynczych plemników tworzących wiązki, które są w stanie lepiej oprzeć się sile dryfującej przepływu.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить мно жество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Przy dużych prędkościach przepływu (V > 33 µm/s) spiralny ruch włókien wzrasta, próbując uchwycić wiele pojedynczych plemników tworzących wiązki, aby lepiej opierać się siłom dryfu przepływu.Próbowali również przymocować mikrokanaliki do ścian bocznych.
Wiązki plemników zidentyfikowano jako skupiska główek plemników i zwiniętych ogonków za pomocą mikroskopii świetlnej (LM).Wiązki plemników z różnymi agregatami zostały również zidentyfikowane jako skręcone główki i agregaty wici, wiele zrośniętych ogonków plemników, główki plemników przymocowane do ogonka oraz główki plemników z wygiętymi jądrami jako wielokrotne zrośnięte jądra.transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM).Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) wykazała, że ​​wiązki plemników były skupiskami główek plemników w osłonkach, a agregaty plemników wykazywały przyczepioną sieć owiniętych ogonków.
Morfologię i ultrastrukturę plemników, tworzenie się wiązek plemników badano za pomocą mikroskopii świetlnej (półprzekrój), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), rozmazy plemników barwiono oranżem akrydynowym i badano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.
Barwienie rozmazu plemników oranżem akrydynowym (ryc. 3B) wykazało, że główki plemników były sklejone i pokryte materiałem wydzielniczym, co doprowadziło do powstania dużych kępek (ryc. 3D).Wiązki plemników składały się z agregatów plemników z siecią przyczepionych ogonków (ryc. 4A-C).Wiązki plemników składają się z sklejonych ze sobą ogonków wielu plemników (ryc. 4D).Sekrety (ryc. 4E, F) pokrywały główki wiązek plemników.
Tworzenie wiązki plemników Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i rozmazów plemników barwionych oranżem akrydynowym wykazano, że główki plemników sklejają się.(A) Wczesne formowanie się kępki plemników rozpoczyna się od plemnika (białe kółko) i trzech plemników (żółte kółko), przy czym spirala zaczyna się od ogonka i kończy na główce.(B) Mikrofotografia rozmazu plemników zabarwionego oranżem akrydynowym przedstawiająca przylegające główki plemników (strzałki).Wyładowanie obejmuje głowę (głowy).Powiększenie × 1000. (C) Rozwój dużej wiązki przenoszonej przez przepływ w kanale mikroprzepływowym (przy użyciu kamery o dużej prędkości przy 950 fps).(D) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego oranżem akrydynowym pokazująca duże kępki (strzałki).Powiększenie: ×200.
Skaningowa mikrografia elektronowa wiązki plemników i rozmazu plemników barwionego oranżem akrydynowym.(A, B, D, E) są cyfrowymi kolorowymi mikrografiami elektronowymi plemników, a C i F są mikrografiami rozmazów plemników barwionych oranżem akrydynowym, pokazującymi przyczepianie się wielu plemników owijających sieć ogonową.(AC) Agregaty plemników są pokazane jako sieć przyczepionych ogonków (strzałki).(D) Adhezja kilku plemników (z substancją klejącą, różowy kontur, strzałka) owijających się wokół witki.(E i F) Agregaty główek plemników (wskaźniki) pokryte materiałem adhezyjnym (wskaźniki).Plemniki tworzyły wiązki z kilkoma strukturami przypominającymi wiry (F).(C) ×400 i (F) ×200 powiększeń.
Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej odkryliśmy, że wiązki plemników miały przyczepione ogonki (ryc. 6A, C), główki przymocowane do ogonków (ryc. 6B) lub główki przymocowane do ogonków (ryc. 6D).Główki plemników w wiązce są zakrzywione, prezentując w przekroju dwa regiony jądrowe (ryc. 6D).W wiązce nacięć plemniki miały skręconą główkę z dwoma regionami jądrowymi i wieloma regionami wiciowymi (ryc. 5A).
Cyfrowa kolorowa mikrografia elektronowa przedstawiająca łączące się ogonki w wiązce plemników i materiał aglutynujący łączący główki plemników.(A) Dołączony ogon dużej liczby plemników.Zwróć uwagę, jak ogon wygląda zarówno w rzucie pionowym (strzałka), jak i poziomym (strzałka).(B) Główka (strzałka) plemnika jest połączona z ogonkiem (strzałka).(C) Przyczepionych jest kilka ogonków plemników (strzałki).(D) Materiał aglutynacyjny (AS, niebieski) łączy cztery główki plemników (fioletowy).
Skaningową mikroskopię elektronową zastosowano do wykrywania główek plemników w wiązkach plemników pokrytych wydzielinami lub błonami (ryc. 6B), co wskazuje, że wiązki plemników były zakotwiczone w materiale pozakomórkowym.Aglutynowany materiał zatężono w główce plemnika (zespół przypominający głowę meduzy; ryc. 5B) i ekspandowano dystalnie, dając genialny żółty wygląd pod mikroskopem fluorescencyjnym po wybarwieniu oranżem akrydynowym (ryc. 6C).Substancja ta jest wyraźnie widoczna pod mikroskopem skaningowym i jest uważana za środek wiążący.Półcienkie skrawki (ryc. 5C) i rozmazy plemników zabarwione oranżem akrydynowym wykazały wiązki plemników zawierające gęsto upakowane główki i zwinięte ogonki (ryc. 5D).
Różne mikrofotografie przedstawiające agregację główek plemników i złożonych ogonków przy użyciu różnych metod.(A) Cyfrowa mikrofotografia elektronowa z transmisją barwną w przekroju poprzecznym wiązki plemników przedstawiająca zwiniętą główkę plemnika z dwuczęściowym jądrem (niebieski) i kilkoma częściami wiciowymi (zielony).(B) Cyfrowa kolorowa mikrofotografia elektronowa przedstawiająca skupisko przypominających meduzy główek plemników (strzałki), które wydają się być zakryte.(C) Półcienki przekrój przedstawiający skupione główki plemników (strzałki) i zwinięte ogonki (strzałki).(D) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego oranżem akrydynowym ukazująca agregaty główek plemników (strzałki) i zwiniętych przylegających ogonków (strzałki).Zauważ, że lepka substancja (S) pokrywa główkę plemnika.(D) × powiększenie 1000.
Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (ryc. 7A) zauważono również, że główki plemników były skręcone, a jądra miały kształt spiralny, co potwierdzają rozmazy plemników barwione oranżem akrydynowym i badane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 7B).
(A) Cyfrowa elektronowa mikrografia z transmisją barwną i (B) Rozmaz plemników barwiony oranżem akrydynowym, przedstawiający zwinięte główki oraz przyczepy główek i witek plemników (strzałki).(B) × powiększenie 1000.
Interesującym odkryciem jest to, że plemniki Sharkazi agregują, tworząc ruchome nitkowate wiązki.Właściwości tych wiązek pozwalają nam zrozumieć ich możliwą rolę w absorpcji i przechowywaniu plemników w SST.
Po kryciu plemniki dostają się do pochwy i przechodzą intensywny proces selekcji, w wyniku czego tylko ograniczona liczba plemników dostaje się do SST15,16.Do tej pory mechanizmy, za pomocą których plemniki wchodzą i wychodzą z SST, są niejasne.U drobiu plemniki są przechowywane w SST przez dłuższy okres od 2 do 10 tygodni, w zależności od gatunku6.Kontrowersje budzi stan nasienia podczas przechowywania w SST.Czy są w ruchu czy w spoczynku?Innymi słowy, w jaki sposób plemniki utrzymują swoją pozycję w SST tak długo?
Forman4 zasugerował, że przebywanie i wyrzucanie SST można wytłumaczyć ruchliwością plemników.Autorzy wysuwają hipotezę, że plemniki utrzymują swoją pozycję, pływając pod prąd płynu wytwarzanego przez nabłonek SST i że plemniki są wyrzucane z SST, gdy ich prędkość spada poniżej punktu, w którym zaczynają się cofać z powodu braku energii.Zaniboni5 potwierdził obecność akwaporyn 2, 3 i 9 w wierzchołkowej części komórek nabłonka SST, co może pośrednio wspierać model przechowywania plemników Foremana.W obecnym badaniu odkryliśmy, że prawie połowa plemników Sharkashiego wykazuje dodatnią reologię w przepływającym płynie, a zlepione wiązki plemników zwiększają liczbę plemników wykazujących dodatnią reologię, chociaż aglutynacja spowalnia je.Nie do końca wiadomo, w jaki sposób plemniki przemieszczają się jajowodem ptaka do miejsca zapłodnienia.U ssaków płyn pęcherzykowy chemoatakuje plemniki.Uważa się jednak, że chemoatraktanty kierują plemniki na duże odległości7.Dlatego za transport plemników odpowiedzialne są inne mechanizmy.Zdolność plemników do orientacji i przepływu w stosunku do płynu jajowodowego uwolnionego po kryciu została uznana za główny czynnik w kierowaniu plemników u myszy.Parker 17 zasugerował, że plemniki przechodzą przez jajowody, płynąc pod prąd rzęsek u ptaków i gadów.Chociaż nie wykazano tego eksperymentalnie na ptakach, Adolphi18 jako pierwszy stwierdził, że plemniki ptasie dają pozytywne wyniki, gdy tworzy się cienką warstwę płynu między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem za pomocą paska bibuły filtracyjnej.Reologia.Hino i Yanagimachi [19] umieścili mysi kompleks jajowo-jajowodowo-maciczny w pierścieniu perfuzyjnym i wstrzyknęli 1 µl atramentu do cieśni, aby zobrazować przepływ płynu w jajowodach.Zauważyli bardzo aktywny ruch skurczu i rozkurczu w jajowodzie, w którym wszystkie kulki atramentu miarowo poruszały się w kierunku brodawki jajowodu.Autorzy podkreślają znaczenie przepływu płynu jajowodowego z dolnych do górnych jajowodów dla podniesienia plemników i zapłodnienia.Brillard20 poinformował, że u kurcząt i indyków plemniki migrują aktywnym ruchem od wejścia do pochwy, gdzie są przechowywane, do połączenia maciczno-pochwowego, gdzie są przechowywane.Jednak ten ruch nie jest wymagany między połączeniem maciczno-pochwowym a lejkiem, ponieważ plemniki są transportowane przez bierne przemieszczanie.Znając te wcześniejsze zalecenia oraz wyniki uzyskane w bieżącym badaniu, można przypuszczać, że zdolność plemników do przemieszczania się pod prąd (reologia) jest jedną z właściwości, na których opiera się proces selekcji.To determinuje przejście plemników przez pochwę i ich wejście do CCT w celu przechowywania.Jak zasugerował Forman4, może to również ułatwić proces wchodzenia plemników do SST i jego siedliska na pewien czas, a następnie wychodzenia, gdy ich prędkość zaczyna zwalniać.
Z drugiej strony Matsuzaki i Sasanami 21 zasugerowali, że plemniki ptasie przechodzą zmiany ruchliwości ze stanu spoczynku do ruchliwości w męskich i żeńskich drogach rozrodczych.Zaproponowano hamowanie rezydentnej ruchliwości plemników w SST, aby wyjaśnić długi czas przechowywania plemników, a następnie odmłodzenie po opuszczeniu SST.W warunkach niedotlenienia Matsuzaki i in.1 zgłosiło wysoką produkcję i uwalnianie mleczanu w SST, co może prowadzić do zahamowania ruchliwości plemników.W tym przypadku znaczenie reologii plemników znajduje odzwierciedlenie w selekcji i wchłanianiu plemników, a nie w ich przechowywaniu.
Wzorzec aglutynacji plemników jest uważany za wiarygodne wyjaśnienie długiego okresu przechowywania nasienia w SST, ponieważ jest to powszechny wzorzec zatrzymywania nasienia u drobiu2,22,23.Baksta i in.2 zaobserwowali, że większość plemników przylegała do siebie, tworząc skupiska pęczków, a pojedyncze plemniki rzadko znajdowano w CCM przepiórek.Z drugiej strony Wen i in.24 obserwowali więcej rozproszonych plemników i mniej kępek plemników w świetle SST u kurcząt.Na podstawie tych obserwacji można przypuszczać, że skłonność do aglutynacji plemników różni się między ptakami oraz między plemnikami w tym samym ejakulacie.Ponadto Van Krey i in.9 zasugerowali, że losowa dysocjacja zlepionych plemników jest odpowiedzialna za stopniową penetrację plemników do światła jajowodu.Zgodnie z tą hipotezą plemniki o niższej zdolności aglutynacji powinny zostać wydalone z SST w pierwszej kolejności.W tym kontekście zdolność plemników do aglutynacji może być czynnikiem wpływającym na wynik współzawodnictwa plemników ptaków brudnych.Ponadto im dłużej aglutynowany plemnik ulega dysocjacji, tym dłużej utrzymuje się płodność.
Chociaż agregację plemników i agregację w wiązki zaobserwowano w kilku badaniach2,22,24, nie zostały one szczegółowo opisane ze względu na złożoność ich kinematycznej obserwacji w SST.Podjęto kilka prób zbadania aglutynacji plemników in vitro.Zaobserwowano rozległą, ale przejściową agregację, gdy cienki drut został usunięty z wiszącej kropli nasion.Prowadzi to do tego, że wydłużona bańka wystaje z kropli, imitując gruczoł nasienny.Ze względu na ograniczenia 3D i krótkie czasy schnięcia kroplowego cały blok szybko popadł w ruinę9.W obecnym badaniu, używając kurczaków Sharkashi i chipów mikroprzepływowych, byliśmy w stanie opisać, w jaki sposób tworzą się te kępki i jak się poruszają.Wiązki plemników powstały natychmiast po pobraniu nasienia i stwierdzono, że poruszają się spiralnie, wykazując dodatnią reologię, gdy są obecne w strumieniu.Ponadto zaobserwowano, że podczas obserwacji makroskopowej wiązki plemników zwiększają liniowość ruchliwości w porównaniu z izolowanymi plemnikami.Sugeruje to, że aglutynacja plemników może wystąpić przed penetracją SST i że produkcja plemników nie jest ograniczona do małego obszaru z powodu stresu, jak sugerowano wcześniej (Tingari i Lake12).Podczas formowania się kępek plemniki pływają synchronicznie, aż utworzą połączenie, następnie ich ogonki owijają się wokół siebie, a główka plemnika pozostaje wolna, ale ogonek i dystalna część plemnika sklejają się lepką substancją.Dlatego za ruch odpowiada wolna głowa więzadła, ciągnąc resztę więzadła.Skaningowa mikroskopia elektronowa wiązek plemników wykazała przyczepione główki plemników pokryte dużą ilością lepkiego materiału, co sugeruje, że główki plemników były przyczepione w wiązkach spoczynku, co mogło nastąpić po dotarciu do miejsca przechowywania (SST).
Kiedy rozmaz plemników jest zabarwiony oranżem akrydynowym, pod mikroskopem fluorescencyjnym można zobaczyć zewnątrzkomórkowy materiał adhezyjny wokół plemników.Substancja ta pozwala wiązkom plemników przylegać i przylegać do wszelkich otaczających powierzchni lub cząstek, dzięki czemu nie dryfują one z otaczającym przepływem.Nasze obserwacje wskazują zatem na rolę adhezji plemników w postaci ruchomych wiązek.Ich zdolność do pływania pod prąd i przyklejania się do pobliskich powierzchni pozwala plemnikom dłużej przebywać w SST.
Rothschild25 użył aparatu do hemocytometrii do zbadania unoszącego się rozmieszczenia bydlęcego nasienia w kropli zawiesiny, wykonując fotomikrografie przez aparat z pionową i poziomą osią optyczną mikroskopu.Wyniki wykazały, że plemniki były przyciągane do powierzchni komory.Autorzy sugerują, że mogą występować interakcje hydrodynamiczne między plemnikiem a powierzchnią.Biorąc to pod uwagę, wraz ze zdolnością nasienia piskląt rasy Sharkashi do tworzenia lepkich kępek, może wzrosnąć prawdopodobieństwo, że nasienie przylgnie do ściany SST i będzie przechowywane przez długi czas.
Bccetti i Afzeliu26 donieśli, że glikokaliks plemników jest niezbędny do rozpoznania i aglutynacji gamet.Forman10 zaobserwował, że hydroliza wiązań α-glikozydowych w otoczkach glikoproteina-glikolipid przez traktowanie ptasiego nasienia neuraminidazą skutkowała zmniejszeniem płodności bez wpływu na ruchliwość plemników.Autorzy sugerują, że wpływ neuraminidazy na glikokaliks upośledza sekwestrację plemników na połączeniu maciczno-pochwowym, zmniejszając w ten sposób płodność.Ich obserwacje nie mogą ignorować możliwości, że leczenie neuraminidazą może zmniejszać rozpoznawanie plemników i oocytów.Forman i Engel10 stwierdzili, że płodność była zmniejszona, gdy kury były inseminowane dopochwowo nasieniem traktowanym neuraminidazą.Jednak IVF z nasieniem traktowanym neuraminidazą nie wpłynęło na płodność w porównaniu z kurczętami kontrolnymi.Autorzy doszli do wniosku, że zmiany w otoczce glikoproteinowo-glikolipidowej wokół błony plemników zmniejszają zdolność plemników do zapłodnienia poprzez upośledzenie sekwestracji plemników na połączeniu maciczno-pochwowym, co z kolei zwiększa utratę plemników ze względu na szybkość połączenia maciczno-pochwowego, ale nie wpływa na rozpoznawanie plemników i komórek jajowych.
U indyków Bakst i Bauchan 11 znaleźli małe pęcherzyki i fragmenty błony w świetle SST i zaobserwowali, że niektóre z tych granulek połączyły się z błoną plemnika.Autorzy sugerują, że zależności te mogą przyczynić się do długotrwałego przechowywania plemników w SST.Naukowcy nie określili jednak źródła tych cząstek, czy są one wydzielane przez komórki nabłonkowe CCT, wytwarzane i wydzielane przez męski układ rozrodczy, czy też wytwarzane przez same plemniki.Ponadto cząstki te są odpowiedzialne za aglutynację.Grützner i wsp. 27 donieśli, że komórki nabłonka najądrza wytwarzają i wydzielają specyficzne białko, które jest wymagane do tworzenia jednoporowych dróg nasiennych.Autorzy donoszą również, że dyspersja tych wiązek zależy od interakcji białek najądrza.Nixon i wsp. 28 stwierdzili, że przydatki wydzielają białko, kwaśną osteonektynę bogatą w cysteinę;SPARC bierze udział w tworzeniu kępek plemników u kolczatek i dziobaków.Rozpraszanie tych wiązek wiąże się z utratą tego białka.
W obecnym badaniu analiza ultrastrukturalna za pomocą mikroskopii elektronowej wykazała, że ​​plemniki przylegały do ​​dużej ilości gęstego materiału.Uważa się, że substancje te są odpowiedzialne za aglutynację, która skrapla się między i wokół przylegających głów, ale w niższych stężeniach w obszarze ogona.Przypuszczamy, że ta substancja aglutynująca jest wydalana z męskiego układu rozrodczego (najądrza lub nasieniowodu) wraz z nasieniem, ponieważ często obserwujemy oddzielanie się nasienia od limfy i plazmy nasienia podczas wytrysku.Donoszono, że gdy plemniki ptasie przechodzą przez najądrza i nasieniowody, przechodzą zmiany związane z dojrzewaniem, które wspierają ich zdolność do wiązania białek i pozyskiwania glikoprotein związanych z lematem osocza.Trwałość tych białek na rezydentnych błonach plemników w SST sugeruje, że białka te mogą wpływać na uzyskanie stabilności błony plemników 30 i determinować ich płodność 31 .Ahammad i wsp.32 donieśli, że plemniki pozyskane z różnych części męskiego układu rozrodczego (od jąder do nasieniowodu) wykazywały progresywny wzrost żywotności w warunkach przechowywania w płynie, niezależnie od temperatury przechowywania, a żywotność u kurcząt wzrasta również w jajowodach po sztucznej inseminacji.
Kępki nasienia kurczaka Sharkashi mają inne cechy i funkcje niż inne gatunki, takie jak kolczatki, dziobaki, myszy leśne, jelenie i świnki morskie.U kurcząt sharkasi tworzenie się wiązek plemników zmniejszało ich prędkość pływania w porównaniu z pojedynczymi plemnikami.Jednak wiązki te zwiększyły odsetek plemników reologicznie dodatnich i zwiększyły zdolność plemników do samostabilizacji w dynamicznym środowisku.Zatem nasze wyniki potwierdzają poprzednią sugestię, że aglutynacja plemników w SST jest związana z długotrwałym przechowywaniem plemników.Stawiamy również hipotezę, że skłonność plemników do tworzenia kępek może kontrolować tempo utraty plemników w SST, co może zmienić wynik rywalizacji plemników.Zgodnie z tym założeniem plemniki o niskiej zdolności aglutynacji jako pierwsze uwalniają SST, podczas gdy plemniki o wysokiej zdolności aglutynacji produkują większość potomstwa.Tworzenie wiązek plemników o pojedynczych porach jest korzystne i wpływa na stosunek rodzic-dziecko, ale wykorzystuje inny mechanizm.U kolczatek i dziobaków plemniki są ułożone równolegle do siebie, aby zwiększyć prędkość wiązki.Wiązki kolczatek poruszają się około trzy razy szybciej niż pojedyncze plemniki.Uważa się, że tworzenie się takich kępek plemników u kolczatek jest ewolucyjną adaptacją mającą na celu utrzymanie dominacji, ponieważ samice są rozwiązłe i zwykle kojarzą się z kilkoma samcami.Dlatego plemniki z różnych ejakulatów zaciekle konkurują o zapłodnienie komórki jajowej.
Aglutynowane plemniki kurcząt sharkasi są łatwe do wizualizacji za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, co jest uważane za korzystne, ponieważ umożliwia łatwe badanie zachowania plemników in vitro.Mechanizm, dzięki któremu tworzenie się kępek plemników sprzyja rozmnażaniu się kurczaków sharkasi, różni się również od mechanizmu obserwowanego u niektórych ssaków łożyskowych reprezentujących kooperatywne zachowania plemników, takich jak myszy leśne, gdzie niektóre plemniki docierają do jaj, pomagając innym spokrewnionym osobnikom dotrzeć do jaj i je uszkodzić.udowodnić sobie.zachowanie altruistyczne.Samozapłodnienie 34. Inny przykład kooperatywnego zachowania plemników stwierdzono u myszy jeleniowatych, gdzie plemniki były w stanie identyfikować i łączyć się z plemnikami najbardziej spokrewnionymi genetycznie oraz tworzyć współpracujące grupy, aby zwiększyć ich szybkość w porównaniu z plemnikami niespokrewnionymi35.
Wyniki uzyskane w niniejszej pracy nie zaprzeczają teorii Fomana o długotrwałym przechowywaniu plemników w SWS.Naukowcy donoszą, że plemniki nadal poruszają się w przepływie komórek nabłonkowych wyściełających SST przez dłuższy czas, a po pewnym czasie zapasy energii plemników ulegają wyczerpaniu, co powoduje spadek prędkości, co umożliwia wydalanie substancji o małej masie cząsteczkowej.energia plemników z wypływem płynu ze światła SST Jama jajowodu.W obecnym badaniu zaobserwowaliśmy, że połowa pojedynczych plemników wykazywała zdolność pływania pod prąd płynących płynów, a ich adhezja w wiązce zwiększała ich zdolność do wykazywania dodatniej reologii.Ponadto nasze dane są zgodne z danymi Matsuzaki i in.1, który poinformował, że zwiększone wydzielanie mleczanu w SST może hamować ruchliwość plemników rezydentnych.Jednak nasze wyniki opisują tworzenie ruchomych więzadeł plemników i ich zachowanie reologiczne w obecności dynamicznego środowiska w mikrokanale, próbując wyjaśnić ich zachowanie w SST.Przyszłe badania mogą skupić się na określeniu składu chemicznego i pochodzenia czynnika aglutynującego, co niewątpliwie pomoże naukowcom w opracowaniu nowych sposobów przechowywania płynnego nasienia i wydłużenia czasu trwania płodności.
W badaniu wybrano piętnastu 30-tygodniowych samców sharkasi z gołą szyją (homozygota dominująca; Na Na) jako dawców nasienia.Ptaki były hodowane w Farmie Badawczej Drobiu Wydziału Rolniczego Uniwersytetu Ashit, Gubernatorstwo Ashit, Egipt.Ptaki trzymano w pojedynczych klatkach (30 x 40 x 40 cm), poddawano programowi oświetlenia (16 godzin światła i 8 godzin ciemności) i żywiono dietą zawierającą 160 g białka surowego, 2800 kcal energii metabolicznej, 35 g wapnia każda.5 gramów przyswajalnego fosforu na kilogram diety.
Według danych 36, 37 nasienie od samców pobrano poprzez masaż brzucha.Łącznie pobrano 45 próbek nasienia od 15 mężczyzn w ciągu 3 dni.Nasienie (n = 15/dzień) natychmiast rozcieńczono 1:1 (obj.:obj.) Belsville Poultry Semen Diluent, który zawiera difosforan potasu (1,27 g), jednowodny glutaminian sodu (0,867 g), fruktozę (0,5 d) bezwodny sód.octan (0,43 g), tris(hydroksymetylo)aminometan (0,195 g), cytrynian potasu jednowodny (0,064 g), monofosforan potasu (0,065 g), chlorek magnezu (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarność 333 mOsm/kg38.Rozcieńczone próbki nasienia najpierw badano pod mikroskopem świetlnym, aby zapewnić dobrą jakość nasienia (wilgotność), a następnie przechowywano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C do użycia w ciągu pół godziny po pobraniu.
Kinematyka i reologia plemników jest opisana za pomocą systemu urządzeń mikroprzepływowych.Próbki nasienia dalej rozcieńczono do 1:40 w Beltsville Avian Semen Diluent, załadowano do urządzenia mikroprzepływowego (patrz poniżej), a parametry kinetyczne określono za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA), opracowanego wcześniej do charakteryzacji mikroprzepływowej.nad ruchliwością plemników w mediach płynnych (Wydział Inżynierii Mechanicznej, Wydział Inżynierii, Uniwersytet Assiut, Egipt).Wtyczkę można pobrać pod adresem: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Zmierzono prędkość na krzywej (VCL, μm/s), prędkość liniową (VSL, μm/s) i średnią prędkość trajektorii (VAP, μm/s).Filmy plemników rejestrowano przy użyciu odwróconego mikroskopu z kontrastem fazowym Optika XDS-3 (z obiektywem 40x) podłączonego do kamery Tucson ISH1000 przy 30 fps przez 3 s.Użyj oprogramowania CASA, aby zbadać co najmniej trzy obszary i 500 trajektorii plemników na próbkę.Nagrane wideo zostało przetworzone przy użyciu domowej roboty CASA.Definicja ruchliwości we wtyczce CASA opiera się na szybkości pływania plemników w porównaniu z szybkością przepływu i nie obejmuje innych parametrów, takich jak ruch na boki, ponieważ stwierdzono, że jest to bardziej niezawodne w przypadku przepływu płynów.Ruch reologiczny opisuje się jako ruch plemników w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu płynu.Plemniki o właściwościach reologicznych podzielono przez liczbę ruchliwych plemników;plemniki, które były w spoczynku i plemniki poruszające się konwekcyjnie zostały wykluczone z liczenia.
Wszystkie użyte chemikalia otrzymano z Elgomhoria Pharmaceuticals (Kair, Egipt), o ile nie zaznaczono inaczej.Urządzenie zostało wyprodukowane zgodnie z opisem El-sherry i in.40 z pewnymi modyfikacjami.Materiały użyte do wytworzenia mikrokanałów obejmowały płytki szklane (Howard Glass, Worcester, MA), negatywną maskę SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkohol dwuacetonowy (Sigma Aldrich, Steinheim, Niemcy) i poliaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanały są wytwarzane przy użyciu miękkiej litografii.Najpierw na drukarce o wysokiej rozdzielczości (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) wydrukowano przezroczystą maskę ochronną na twarz z pożądanym projektem mikrokanalików.Mastery zostały wykonane przy użyciu płyt szklanych jako podłoża.Płytki oczyszczono w acetonie, izopropanolu i wodzie dejonizowanej, a następnie pokryto warstwą 20 µm SU8-25 przez powlekanie wirowe (3000 obrotów na minutę, 1 min).Warstwy SU-8 następnie delikatnie wysuszono (65°C, 2 min i 95°C, 10 min) i wystawiono na działanie promieniowania UV przez 50 s.Piec po ekspozycji w 65°C i 95°C przez 1 min i 4 min w celu usieciowania odsłoniętych warstw SU-8, a następnie wywołać w alkoholu dwuacetonowym przez 6,5 min.Upiecz gofry na twardo (200°C przez 15 min), aby dodatkowo zestalić warstwę SU-8.
PDMS przygotowano przez zmieszanie monomeru i utwardzacza w stosunku wagowym 10:1, następnie odgazowano w eksykatorze próżniowym i wylano na ramę główną SU-8.PDMS utwardzano w piecu (120°C, 30 min), a następnie wycięto kanały, oddzielono od wzorca i perforowano, aby umożliwić przymocowanie rurek na wlocie i wylocie mikrokanalika.Na koniec mikrokanały PDMS zostały trwale przymocowane do szkiełek mikroskopowych za pomocą przenośnego procesora koronowego (Electro-Technic Products, Chicago, IL), jak opisano w innym miejscu.Mikrokanał zastosowany w tym badaniu ma wymiary 200 µm × 20 µm (szer. × wys.) i ma 3,6 cm długości.
Przepływ płynu indukowany ciśnieniem hydrostatycznym wewnątrz mikrokanalika uzyskuje się poprzez utrzymywanie poziomu płynu w zbiorniku wlotowym powyżej różnicy wysokości Δh39 w zbiorniku wylotowym (rys. 1).
gdzie f jest współczynnikiem tarcia, zdefiniowanym jako f = C/Re dla przepływu laminarnego w kanale prostokątnym, gdzie C jest stałą zależną od proporcji kanału, L jest długością mikrokanału, Vav jest średnią prędkością wewnątrz mikrokanału, Dh jest średnicą hydrauliczną kanału, g – przyspieszeniem ziemskim.Korzystając z tego równania, średnią prędkość kanału można obliczyć za pomocą następującego równania: