Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Płodność ptaków zależy od ich zdolności do przechowywania wystarczającej ilości żywotnych plemników przez dłuższy okres czasu w kanalikach spichrzeniowych plemników (SST). Dokładny mechanizm, za pomocą którego plemniki wchodzą, przebywają i opuszczają SST, pozostaje kontrowersyjny. Plemniki kur sharkasi wykazywały dużą tendencję do aglutynacji, tworząc ruchome nitkowate wiązki zawierające wiele komórek. Ze względu na trudności w obserwowaniu ruchliwości i zachowania plemników w nieprzezroczystym jajowodzie, użyliśmy urządzenia mikroprzepływowego o przekroju poprzecznym mikrokanalika podobnym do plemników, aby zbadać aglutynację i ruchliwość plemników. W tym badaniu omówiono, w jaki sposób powstają wiązki plemników, jak się poruszają i ich możliwą rolę w wydłużaniu rezydencji plemników w SST. Badaliśmy prędkość plemników i zachowanie reologiczne, gdy przepływ płynu był generowany w kanale mikroprzepływowym przez ciśnienie hydrostatyczne (szybkość przepływu = 33 µm/s). Plemniki mają tendencję do pływania pod prąd (pozytywna reologia), a prędkość wiązki plemników jest znacznie zmniejszona w porównaniu do pojedynczych plemników. Zaobserwowano, że wiązki plemników poruszają się spiralnie i zwiększają swoją długość i grubość w miarę rekrutacji większej liczby pojedynczych plemników. Zaobserwowano, że wiązki plemników zbliżały się do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych i przylegały do ​​nich, aby uniknąć porwania przez prędkość przepływu płynu > 33 µm/s. Zaobserwowano, że wiązki plemników zbliżały się do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych i przylegały do ​​nich, aby uniknąć porwania przez prędkość przepływu płynu > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам micрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Zaobserwowano, że pęczki plemników zbliżają się i przylegają do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych, aby uniknąć ich zmycia przy szybkości przepływu płynu >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过.33 µm/s Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам micрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Zaobserwowano, że wiązka plemników zbliża się do ścianek bocznych kanału mikroprzepływowego i przylega do nich, aby uniknąć porwania przez przepływ płynu z prędkością >33 µm/s.Skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa ujawniła, że ​​wiązki plemników były podtrzymywane przez obfity gęsty materiał. Uzyskane dane wykazują wyjątkową ruchliwość plemników kur Sharkazi, a także zdolność plemników do aglutynacji i tworzenia ruchomych wiązek, co przyczynia się do lepszego zrozumienia długoterminowego przechowywania plemników w SMT.
Aby doszło do zapłodnienia u ludzi i większości zwierząt, plemniki i komórki jajowe muszą dotrzeć do miejsca zapłodnienia we właściwym czasie. Dlatego też kopulacja musi nastąpić przed owulacją lub w jej trakcie. Z drugiej strony niektóre ssaki, takie jak psy, a także gatunki niebędące ssakami, takie jak owady, ryby, gady i ptaki, przechowują plemniki w swoich narządach rozrodczych przez dłuższy okres czasu, aż ich komórki jajowe będą gotowe do zapłodnienia (zapłodnienie asynchroniczne 1 ). Ptaki są w stanie utrzymać żywotność plemników zdolnych do zapłodnienia komórek jajowych przez 2-10 tygodni2.
Jest to unikalna cecha, która odróżnia ptaki od innych zwierząt, ponieważ zapewnia wysokie prawdopodobieństwo zapłodnienia po pojedynczej inseminacji przez kilka tygodni bez jednoczesnego krycia i owulacji. Główny narząd do przechowywania plemników, zwany kanalikiem do przechowywania plemników (SST), znajduje się w wewnętrznych fałdach błony śluzowej na połączeniu maciczno-pochwowym. Do tej pory mechanizmy, za pomocą których plemniki wchodzą, przebywają i wychodzą z banku plemników, nie są w pełni poznane. Na podstawie wcześniejszych badań wysunięto wiele hipotez, ale żadna z nich nie została potwierdzona.
Forman4 wysunął hipotezę, że plemniki utrzymują swoją rezydencję w jamie SST poprzez ciągły ruch oscylacyjny w kierunku przeciwnym do przepływu płynu przez kanały białkowe zlokalizowane na komórkach nabłonkowych SST (reologia). ATP ulega wyczerpaniu z powodu stałej aktywności wici potrzebnej do utrzymania plemników w świetle SST, a ruchliwość ostatecznie spada, dopóki plemniki nie zostaną wyniesione z banku plemników przez przepływ płynu i nie rozpoczną nowej podróży w dół jajowodu wstępującego, aby zapłodnić plemniki. Jajo (Forman4). Ten model przechowywania plemników jest poparty wykryciem przez immunocytochemię akwaporyn 2, 3 i 9 obecnych w komórkach nabłonkowych SST. Do tej pory brakuje badań nad reologią nasienia kurcząt i jej rolą w przechowywaniu SST, selekcji plemników pochwy i konkurencji plemników. U kur plemniki wchodzą do pochwy po naturalnym kryciu, ale ponad 80% plemników jest wyrzucanych z pochwy wkrótce po kryciu. Sugeruje to, że pochwa jest głównym miejscem selekcji plemników u ptaków. Ponadto donoszono, że mniej niż 1% plemników zapłodnionych w pochwie trafia do SST2. W przypadku sztucznej inseminacji piskląt w pochwie liczba plemników docierających do SST ma tendencję do wzrostu 24 godzin po inseminacji. Jak dotąd mechanizm selekcji plemników podczas tego procesu jest niejasny, a ruchliwość plemników może odgrywać ważną rolę w wychwycie plemników przez SST. Ze względu na grube i nieprzezroczyste ściany jajowodów trudno jest bezpośrednio monitorować ruchliwość plemników w jajowodach ptaków. Dlatego też brakuje nam podstawowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób plemniki przechodzą do SST po zapłodnieniu.
Reologia została niedawno uznana za ważny czynnik kontrolujący transport plemników w narządach płciowych ssaków. Opierając się na zdolności ruchliwych plemników do migracji w przeciwprądzie, Zaferani i in.8 zastosowali mikroprzepływowy system Corra do biernej izolacji ruchliwych plemników z próbek nasienia. Ten rodzaj sortowania nasienia jest niezbędny do leczenia niepłodności medycznej i badań klinicznych i jest preferowany w stosunku do tradycyjnych metod, które są czasochłonne i pracochłonne i mogą naruszyć morfologię plemników i integralność strukturalną. Jednak do tej pory nie przeprowadzono żadnych badań dotyczących wpływu wydzielin z narządów płciowych kurcząt na ruchliwość plemników.
Niezależnie od mechanizmu, który utrzymuje plemniki przechowywane w SST, wielu badaczy zaobserwowało, że plemniki rezydujące aglutynują głowa w głowę w SST kur 9, 10, przepiórek 2 i indyków 11, tworząc zlepione wiązki plemników. Autorzy sugerują, że istnieje związek między tą aglutynacją a długotrwałym przechowywaniem plemników w SST.
Tingari i Lake12 zgłosili silny związek między plemnikami w gruczole przyjmującym plemniki u kurcząt i zakwestionowali, czy plemniki ptaków aglutynują się w ten sam sposób, co plemniki ssaków. Uważają, że głębokie połączenia między plemnikami w nasieniowodach mogą być spowodowane stresem spowodowanym obecnością dużej liczby plemników w małej przestrzeni.
Podczas oceny zachowania plemników na świeżych wiszących szkiełkach mikroskopowych można zaobserwować przejściowe oznaki aglutynacji, zwłaszcza na krawędziach kropelek nasienia. Jednak aglutynacja była często zakłócana przez działanie obrotowe związane z ciągłym ruchem, co wyjaśnia przejściową naturę tego zjawiska. Naukowcy zauważyli również, że po dodaniu rozcieńczalnika do nasienia pojawiały się wydłużone „nitkowate” agregaty komórek.
Wczesne próby naśladowania plemnika polegały na usunięciu cienkiego drutu z wiszącej kropli, co skutkowało wystającym z kropli nasienia wydłużonym pęcherzykiem przypominającym plemnik. Plemniki natychmiast ustawiły się równolegle w pęcherzyku, ale cała jednostka szybko zniknęła z powodu ograniczenia 3D. Dlatego też, aby zbadać aglutynację plemników, konieczne jest obserwowanie ruchliwości i zachowania plemników bezpośrednio w izolowanych kanalikach spichrzowych plemników, co jest trudne do osiągnięcia. Dlatego konieczne jest opracowanie instrumentu, który naśladuje plemniki, aby wesprzeć badania ruchliwości plemników i zachowania aglutynacyjnego. Brillard i in.13 podali, że średnia długość kanalików spichrzowych plemników u dorosłych kurcząt wynosi 400–600 µm, ale niektóre SST mogą mieć długość nawet 2000 µm. Mero i Ogasawara14 podzielili gruczoły nasienne na powiększone i niepowiększone kanaliki magazynujące plemniki, z których oba miały taką samą długość (~500 µm) i szerokość szyjki (~38 µm), ale średnia średnica światła kanalików wynosiła odpowiednio 56,6 i 56,6 µm. . , odpowiednio 11,2 µm. W bieżącym badaniu użyliśmy urządzenia mikroprzepływowego o rozmiarze kanału 200 µm × 20 µm (szer. × wys.), którego przekrój poprzeczny jest nieco zbliżony do przekroju wzmocnionego SST. Ponadto zbadaliśmy ruchliwość plemników i zachowanie aglutynacji w przepływającym płynie, co jest zgodne z hipotezą Foremana, że ​​płyn wytwarzany przez komórki nabłonkowe SST utrzymuje plemniki w świetle w kierunku przeciwprądowym (reologicznym).
Celem tego badania było pokonanie problemów związanych z obserwacją ruchliwości plemników w jajowodzie i uniknięcie trudności związanych z badaniem reologii i zachowania plemników w dynamicznym środowisku. Zastosowano urządzenie mikroprzepływowe, które wytwarza ciśnienie hydrostatyczne, aby symulować ruchliwość plemników w narządach płciowych kurczaka.
Gdy kropla rozcieńczonej próbki plemników (1:40) została wprowadzona do urządzenia mikrokanalikowego, można było zidentyfikować dwa rodzaje ruchliwości plemników (izolowane plemniki i związane plemniki). Ponadto plemniki miały tendencję do pływania pod prąd (pozytywna reologia; wideo 1, 2). Chociaż prędkość ruchu wiązek plemników była niższa niż prędkość ruchu plemników samotnych (p < 0,001), zwiększył się odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2). Chociaż prędkość ruchu wiązek plemników była niższa niż prędkość ruchu plemników samotnych (p < 0,001), zwiększył się odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Mimo że wiązki plemników miały niższą prędkość niż pojedyncze plemniki (p < 0,001), zwiększyły one odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度(p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Chociaż prędkość przemieszczania się wiązek plemników była niższa niż pojedynczych plemników (p < 0,001), zwiększyły one odsetek plemników o dodatniej reologii (p < 0,001; Tabela 2).Szacuje się, że dodatnia reologia pojedynczych plemników i kępek wynosi odpowiednio około 53% i 85%.
Zaobserwowano, że plemniki kur sharkasi natychmiast po ejakulacji tworzą liniowe wiązki składające się z kilkudziesięciu osobników. Te kępki zwiększają długość i grubość z czasem i mogą pozostać in vitro przez kilka godzin przed rozproszeniem (wideo 3). Te nitkowate wiązki mają kształt plemników kolczatki, które tworzą się na końcu najądrza. Stwierdzono, że nasienie kury sharkashi ma dużą tendencję do aglutynacji i tworzenia siateczkowatej wiązki w czasie krótszym niż jedna minuta po pobraniu. Te wiązki są dynamiczne i mogą przyklejać się do wszelkich pobliskich ścian lub statycznych obiektów. Chociaż wiązki plemników zmniejszają prędkość komórek plemnikowych, jest jasne, że makroskopowo zwiększają ich liniowość. Długość wiązek zmienia się w zależności od liczby plemników zebranych w wiązkach. Wyizolowano dwie części wiązki: część początkową, obejmującą wolną główkę zlepionego plemnika, oraz część końcową, obejmującą ogon i cały dystalny koniec plemnika. Za pomocą kamery szybkoobrotowej (950 fps) zaobserwowano wolne główki zlepionych plemników w początkowej części wiązki, odpowiedzialne za ruch wiązki ze względu na ich ruch oscylacyjny, wciągając pozostałe do wiązki ruchem śrubowym (wideo 4). Jednak w długich kępkach zaobserwowano, że niektóre wolne główki plemników przywierają do ciała, a końcowa część kępki działa jak łopatki, pomagając w napędzaniu kępki.
Podczas powolnego przepływu płynu, wiązki plemników poruszają się równolegle do siebie, jednak zaczynają na siebie nachodzić i przyklejać się do wszystkiego, co jest nieruchome, aby nie zostać zmyte przez prąd, gdy prędkość przepływu wzrasta. Wiązki tworzą się, gdy garść plemników zbliża się do siebie, zaczynają się poruszać synchronicznie i owijać się wokół siebie, a następnie przyklejają się do lepkiej substancji. Rysunki 1 i 2 pokazują, jak plemniki zbliżają się do siebie, tworząc połączenie, gdy ogonki owijają się wokół siebie.
Naukowcy zastosowali ciśnienie hydrostatyczne, aby wytworzyć przepływ płynu w mikrokanale, aby zbadać reologię plemników. Użyto mikrokanału o rozmiarze 200 µm × 20 µm (szer. × wys.) i długości 3,6 µm. Użyli mikrokanałów między pojemnikami ze strzykawkami zamontowanymi na końcach. Aby kanały były bardziej widoczne, użyto barwnika spożywczego.
Przymocuj kable połączeniowe i akcesoria do ściany. Film został nagrany za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego. Na każdym zdjęciu przedstawiono mikroskopię fazowo-kontrastową i obrazy mapujące. (A) Połączenie między dwoma strumieniami stawia opór przepływowi z powodu ruchu śrubowego (czerwona strzałka). (B) Połączenie między wiązką rurek a ścianą kanału (czerwone strzałki), w tym samym czasie są one połączone z dwoma innymi wiązkami (żółte strzałki). (C) Wiązki plemników w kanale mikroprzepływowym zaczynają się łączyć ze sobą (czerwone strzałki), tworząc siatkę wiązek plemników. (D) Tworzenie sieci wiązek plemników.
Gdy kropla rozcieńczonego nasienia została załadowana do urządzenia mikroprzepływowego i wytworzono przepływ, zaobserwowano, że strumień nasienia poruszał się w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu. Pęczki ściśle przylegały do ​​ścianek mikrokanalików, a wolne główki w początkowej części wiązek ściśle przylegały do ​​nich (wideo 5). Przyklejają się również do wszelkich nieruchomych cząstek na swojej drodze, takich jak zanieczyszczenia, aby oprzeć się zmyciu przez prąd. Z czasem te kępki stają się długimi włóknami, które zatrzymują inne pojedyncze plemniki i krótsze kępki (wideo 6). Gdy przepływ zaczyna zwalniać, długie linie plemników zaczynają tworzyć sieć linii plemników (wideo 7; rysunek 2).
Przy dużej prędkości przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy nici ulegają nasileniu, ponieważ w celu wychwycenia wielu pojedynczych wiązek plemników, które lepiej opierają się sile unoszenia się przepływu, dochodzi do zwiększenia siły unoszenia się nici. Przy dużej prędkości przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy nici ulegają nasileniu, ponieważ w celu wychwycenia wielu pojedynczych wiązek plemników, które lepiej opierają się sile unoszenia się przepływu, dochodzi do zwiększenia siły unoszenia się nici. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Przy dużych natężeniach przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy włókien zwiększają się, gdyż próbują one wychwycić wiele pojedynczych plemników i utworzyć wiązki, które są w stanie lepiej oprzeć się sile unoszenia podczas przepływu.在高流速(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Przy dużych natężeniach przepływu (V > 33 µm/s) zwiększa się spiralny ruch włókien, co ma na celu wychwycenie dużej liczby pojedynczych plemników tworzących wiązki, co pozwala im lepiej opierać się siłom unoszenia podczas przepływu.Próbowali również przymocować mikrokanaliki do ścian bocznych.
Wiązki plemników zidentyfikowano jako skupiska główek plemników i zwiniętych witek za pomocą mikroskopii świetlnej (LM). Wiązki plemników z różnymi agregatami zidentyfikowano również jako skręcone główki i agregaty wici, wiele zrośniętych witek plemników, główki plemników przytwierdzone do witki oraz główki plemników z wygiętymi jądrami jako wiele zrośniętych jąder. mikroskopia elektronowa transmisyjna (TEM). Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) wykazała, że ​​wiązki plemników były osłoniętymi agregatami główek plemników, a agregaty plemników wykazywały przyłączoną sieć owiniętych witek.
Morfologię i ultrastrukturę plemników oraz tworzenie wiązek plemników badano za pomocą mikroskopii świetlnej (połowa przekroju), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), rozmazy plemników barwiono oranżem akrydynowym i badano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.
Barwienie rozmazu nasienia akrydyną pomarańczową (ryc. 3B) wykazało, że główki plemników były sklejone ze sobą i pokryte materiałem wydzielniczym, co doprowadziło do powstania dużych kępek (ryc. 3D). Pęczki plemników składały się z agregatów plemników z siecią przyczepionych ogonków (ryc. 4A-C). Pęczki plemników składają się z ogonków wielu plemników sklejonych ze sobą (ryc. 4D). Sekrety (ryc. 4E,F) pokrywały główki wiązek plemników.
Tworzenie wiązki plemników Za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym i rozmazów plemników barwionych akrydyną pomarańczą wykazano, że główki plemników sklejają się ze sobą. (A) Wczesne formowanie się kępki plemników rozpoczyna się od plemnika (białe kółko) i trzech plemników (żółte kółko), przy czym spirala zaczyna się od ogonka i kończy na główce. (B) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego akrydyną pomarańczą, ukazująca przylegające główki plemników (strzałki). Wydzielina pokrywa główkę(i). Powiększenie × 1000. (C) Rozwój dużej wiązki transportowanej przez przepływ w kanale mikroprzepływowym (za pomocą kamery szybkoobrotowej przy 950 fps). (D) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego akrydyną pomarańczą, ukazująca duże kępki (strzałki). Powiększenie: ×200.
Mikrofotografia elektronowa wiązki plemników i rozmazu plemników barwionego akrydyną. (A, B, D, E) to cyfrowe kolorowe mikroskopy elektronowe plemników, a C i F to mikrofotografie rozmazów plemników barwionych akrydyną, pokazujące przywieranie wielu plemników owijających błonę ogonową. (AC) Agregaty plemników są pokazane jako sieć przyłączonych ogonków (strzałki). (D) Przyleganie kilku plemników (z substancją klejącą, różowym konturem, strzałką) owijających się wokół ogonka. (E i F) Agregaty główek plemników (wskaźniki) pokryte materiałem klejącym (wskaźniki). Plemniki utworzyły wiązki z kilkoma strukturami przypominającymi wir (F). (C) Powiększenia ×400 i (F) ×200.
Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej odkryliśmy, że wiązki plemników mają przyczepione ogonki (ryc. 6A, C), główki przyczepione do ogonków (ryc. 6B) lub główki przyczepione do ogonków (ryc. 6D). Główki plemników w wiązce są zakrzywione, prezentując w przekroju dwa obszary jądrowe (ryc. 6D). W wiązce nacięcia plemniki miały skręconą główkę z dwoma obszarami jądrowymi i wieloma obszarami wici (ryc. 5A).
Cyfrowa kolorowa mikroskopia elektronowa pokazująca łączące się ogonki w wiązce plemników i materiał aglutynujący łączący główki plemników. (A) Przyczepiony ogonek dużej liczby plemników. Zwróć uwagę, jak ogonek wygląda w projekcjach pionowych (strzałka) i poziomych (strzałka). (B) Główka (strzałka) plemnika jest połączona z ogonkiem (strzałka). (C) Przyczepionych jest kilka ogonków plemników (strzałki). (D) Materiał aglutynujący (AS, niebieski) łączy cztery główki plemników (fioletowy).
Mikroskopia elektronowa skaningowa została użyta do wykrycia główek plemników w wiązkach plemników pokrytych wydzielinami lub błonami (ryc. 6B), co wskazuje, że wiązki plemników były zakotwiczone przez materiał pozakomórkowy. Aglutynowany materiał został skoncentrowany w główce plemnika (zespół przypominający głowę meduzy; ryc. 5B) i rozszerzył się dystalnie, dając jaskrawożółty wygląd pod mikroskopem fluorescencyjnym po zabarwieniu akrydyną pomarańczową (ryc. 6C). Substancja ta jest wyraźnie widoczna pod mikroskopem skaningowym i jest uważana za spoiwo. Półcienkie przekroje (ryc. 5C) i rozmazy plemników barwione akrydyną pomarańczową wykazały wiązki plemników zawierające gęsto upakowane główki i zwinięte ogonki (ryc. 5D).
Różne fotomikrofotografie pokazujące agregację główek plemników i złożonych witek przy użyciu różnych metod. (A) Cyfrowe kolorowe zdjęcie mikroskopowe transmisyjne wiązki plemników pokazujące zwiniętą główkę plemnika z dwuczęściowym jądrem (niebieski) i kilkoma częściami wici (zielony). (B) Cyfrowe kolorowe zdjęcie mikroskopowe skaningowe pokazujące skupisko główek plemników przypominających meduzy (strzałki), które wydają się być przykryte. (C) Półcienki przekrój pokazujący zagregowane główki plemników (strzałki) i zwinięte witki (strzałki). (D) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego akrydyną pomarańczową pokazująca agregaty główek plemników (strzałki) i zwinięte przylegające witki (strzałki). Należy zauważyć, że lepka substancja (S) pokrywa główkę plemnika. (D) Powiększenie × 1000.
Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (ryc. 7A) zauważono również, że główki plemników były skręcone, a jądra miały kształt spiralny, co potwierdziły rozmazy plemników barwione oranżem akrydynowym i badane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 7B).
(A) Cyfrowa kolorowa transmisyjna mikroskopia elektronowa i (B) Rozmaz plemników barwiony akrydyną pomarańczową, ukazujący zwinięte główki oraz przyczep główek i witek plemników (strzałki). (B) Powiększenie × 1000.
Ciekawym odkryciem jest to, że plemniki Sharkaziego łączą się, tworząc ruchome nitkowate wiązki. Właściwości tych wiązek pozwalają nam zrozumieć ich możliwą rolę w absorpcji i przechowywaniu plemników w SST.
Po kopulacji plemniki przedostają się do pochwy i przechodzą intensywny proces selekcji, w wyniku którego tylko ograniczona liczba plemników przedostaje się do SST15,16. Do tej pory mechanizmy, za pomocą których plemniki przedostają się do SST i wychodzą z niego, są niejasne. U drobiu plemniki są przechowywane w SST przez dłuższy okres od 2 do 10 tygodni, w zależności od gatunku6. Nadal trwają kontrowersje dotyczące stanu nasienia podczas przechowywania w SST. Czy są w ruchu, czy w spoczynku? Innymi słowy, w jaki sposób plemniki utrzymują swoją pozycję w SST przez tak długi czas?
Forman4 zasugerował, że pobyt i wyrzut SST można wyjaśnić w kategoriach ruchliwości plemników. Autorzy wysuwają hipotezę, że plemniki utrzymują swoją pozycję, płynąc wbrew przepływowi płynu wytwarzanemu przez nabłonek SST i że plemniki są wyrzucane z SST, gdy ich prędkość spada poniżej punktu, w którym zaczynają się cofać z powodu braku energii. Zaniboni5 potwierdził obecność akwaporyn 2, 3 i 9 w części wierzchołkowej komórek nabłonka SST, co może pośrednio wspierać model magazynowania plemników Foremana. W bieżącym badaniu odkryliśmy, że prawie połowa plemników Sharkashiego wykazuje dodatnią reologię w przepływającym płynie, a aglutynowane wiązki plemników zwiększają liczbę plemników wykazujących dodatnią reologię, chociaż aglutynacja je spowalnia. Sposób, w jaki plemniki przemieszczają się jajowodem ptaka do miejsca zapłodnienia, nie jest w pełni zrozumiały. U ssaków płyn pęcherzykowy chemoatraktuje plemniki. Uważa się jednak, że chemoatraktanty kierują plemniki na duże odległości7. Dlatego za transport plemników odpowiadają inne mechanizmy. Zdolność plemników do orientowania się i przepływu wbrew płynowi jajowodu uwalnianemu po kopulacji jest głównym czynnikiem w kierowaniu plemników u myszy. Parker17 zasugerował, że plemniki przechodzą przez jajowody, płynąc wbrew prądowi rzęskowemu u ptaków i gadów. Chociaż nie zostało to eksperymentalnie wykazane u ptaków, Adolphi18 jako pierwszy odkrył, że plemniki ptaków dają pozytywne wyniki, gdy cienka warstwa płynu między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem jest utworzona za pomocą paska bibuły filtracyjnej. Reologia. Hino i Yanagimachi [19] umieścili kompleks jajnik-jajowód-macica myszy w pierścieniu perfuzyjnym i wstrzyknęli 1 µl tuszu do cieśni, aby uwidocznić przepływ płynu w jajowodach. Zauważyli bardzo aktywny ruch skurczu i rozkurczu w jajowodzie, w którym wszystkie kulki atramentu stale przesuwały się w kierunku bańki jajowodu. Autorzy podkreślają znaczenie przepływu płynu jajowodowego z dolnych do górnych jajowodów dla uniesienia plemników i zapłodnienia. Brillard20 doniósł, że u kur i indyków plemniki migrują poprzez aktywny ruch od wejścia pochwy, gdzie są przechowywane, do połączenia maciczno-pochwowego, gdzie są przechowywane. Jednak ten ruch nie jest wymagany pomiędzy połączeniem maciczno-pochwowym a lejkiem, ponieważ plemniki są transportowane poprzez bierne przemieszczenie. Znając te wcześniejsze zalecenia i wyniki uzyskane w bieżącym badaniu, można założyć, że zdolność plemników do przemieszczania się w górę rzeki (reologia) jest jedną z właściwości, na których opiera się proces selekcji. To determinuje przejście plemników przez pochwę i ich wejście do CCT w celu przechowywania. Jak zasugerował Forman4, może to również ułatwić plemnikom wnikanie do SST i ich siedliska na pewien czas, a następnie wychodzenie z niego, gdy ich prędkość zaczyna spadać.
Z drugiej strony Matsuzaki i Sasanami 21 zasugerowali, że plemniki ptaków przechodzą zmiany ruchliwości ze stanu uśpienia do ruchu w męskich i żeńskich drogach rozrodczych. Zaproponowano, że zahamowanie ruchliwości plemników rezydentnych w SST wyjaśnia długi czas przechowywania plemników, a następnie ich odmłodzenie po opuszczeniu SST. W warunkach niedotlenienia Matsuzaki i in. 1 zgłosili wysoką produkcję i uwalnianie mleczanu w SST, co może prowadzić do zahamowania ruchliwości plemników rezydentnych. W tym przypadku znaczenie reologii plemników odzwierciedla się w wyborze i wchłanianiu plemników, a nie w ich przechowywaniu.
Wzór aglutynacji plemników jest uważany za prawdopodobne wyjaśnienie długiego okresu przechowywania plemników w SST, ponieważ jest to powszechny wzór retencji plemników u drobiu2,22,23. Bakst i in. 2 zaobserwowali, że większość plemników przylegała do siebie, tworząc agregaty wiązkowe, a pojedyncze plemniki rzadko znajdowano w CCM przepiórek. Z drugiej strony Wen i in. 24 zaobserwowali bardziej rozproszone plemniki i mniej kępek plemników w świetle SST u kur. Na podstawie tych obserwacji można założyć, że skłonność do aglutynacji plemników różni się między ptakami i między plemnikami w tym samym ejakulacie. Ponadto Van Krey i in. 9 zasugerowali, że losowa dysocjacja aglutynowanych plemników jest odpowiedzialna za stopniową penetrację plemników do światła jajowodu. Zgodnie z tą hipotezą, plemniki o niższej zdolności aglutynacji powinny być wydalane z SST w pierwszej kolejności. W tym kontekście zdolność plemników do aglutynacji może być czynnikiem wpływającym na wynik konkurencji plemników u brudnych ptaków. Ponadto, im dłużej aglutynowane plemniki dysocjują, tym dłużej utrzymuje się płodność.
Chociaż agregacja plemników i ich agregacja w wiązki były obserwowane w kilku badaniach2,22,24, nie zostały opisane szczegółowo ze względu na złożoność ich kinematycznej obserwacji w SST. Podjęto kilka prób zbadania aglutynacji plemników in vitro. Obserwowano rozległą, ale przejściową agregację, gdy cienki drut został usunięty z wiszącej kropli nasienia. Prowadzi to do tego, że wydłużony pęcherzyk wystaje z kropli, imitując gruczoł nasienny. Ze względu na ograniczenia 3D i krótki czas suszenia kroplowego cały blok szybko popadł w ruinę9. W bieżącym badaniu, wykorzystując kurczaki Sharkashi i mikroprzepływowe chipy, byliśmy w stanie opisać, jak powstają te kępki i jak się poruszają. Wiązki plemników tworzyły się natychmiast po pobraniu nasienia i stwierdzono, że poruszały się spiralnie, wykazując dodatnią reologię, gdy były obecne w przepływie. Ponadto, gdy obserwowano makroskopowo, zaobserwowano, że wiązki plemników zwiększają liniowość ruchliwości w porównaniu z izolowanymi plemnikami. Sugeruje to, że aglutynacja plemników może wystąpić przed penetracją SST i że produkcja plemników nie jest ograniczona do małego obszaru z powodu stresu, jak sugerowano wcześniej (Tingari i Lake12). Podczas formowania kępki plemniki pływają synchronicznie, aż utworzą połączenie, następnie ich witki owijają się wokół siebie, a główka plemnika pozostaje wolna, ale witka i dalsza część plemnika sklejają się lepką substancją. Dlatego wolna główka więzadła odpowiada za ruch, ciągnąc resztę więzadła. Skaningowa mikroskopia elektronowa wiązek plemników wykazała przyczepione główki plemników pokryte dużą ilością lepkiego materiału, co sugeruje, że główki plemników były przyczepione w spoczynkowych wiązkach, co mogło nastąpić po dotarciu do miejsca przechowywania (SST).
Gdy rozmaz plemników zostanie zabarwiony akrydyną pomarańczową, pod mikroskopem fluorescencyjnym można zobaczyć pozakomórkowy materiał klejący wokół plemników. Substancja ta umożliwia wiązkom plemników przyleganie i przywieranie do wszelkich otaczających powierzchni lub cząstek, dzięki czemu nie dryfują one wraz z otaczającym przepływem. Tak więc nasze obserwacje pokazują rolę przylegania plemników w postaci ruchomych wiązek. Ich zdolność do pływania pod prąd i przywierania do pobliskich powierzchni pozwala plemnikom pozostać dłużej w SST.
Rothschild25 użył kamery hemocytometrycznej do zbadania unoszącego się rozmieszczenia nasienia bydła w kropli zawiesiny, wykonując fotomikrografie przez kamerę z pionową i poziomą osią optyczną mikroskopu. Wyniki wykazały, że plemniki zostały przyciągnięte do powierzchni komory. Autorzy sugerują, że mogą istnieć oddziaływania hydrodynamiczne między plemnikami a powierzchnią. Biorąc to pod uwagę, wraz ze zdolnością nasienia kurcząt Sharkashi do tworzenia lepkich kępek, może to zwiększyć prawdopodobieństwo, że nasienie przylgnie do ściany SST i będzie przechowywane przez długi czas.
Bccetti i Afzeliu26 podali, że glikokaliks plemników jest niezbędny do rozpoznawania i aglutynacji gamet. Forman10 zaobserwował, że hydroliza wiązań α-glikozydowych w powłokach glikoproteinowo-glikolipidowych poprzez traktowanie nasienia ptaków neuraminidazą skutkowała zmniejszeniem płodności bez wpływu na ruchliwość plemników. Autorzy sugerują, że wpływ neuraminidazy na glikokaliks upośledza sekwestrację plemników w połączeniu maciczno-pochwowym, tym samym zmniejszając płodność. Ich obserwacje nie mogą ignorować możliwości, że leczenie neuraminidazą może zmniejszyć rozpoznawanie plemników i oocytów. Forman i Engel10 odkryli, że płodność była zmniejszona, gdy kury były inseminowane dopochwowo nasieniem traktowanym neuraminidazą. Jednak zapłodnienie metodą in vitro z nasieniem traktowanym neuraminidazą nie miało wpływu na płodność w porównaniu z kurami kontrolnymi. Autorzy doszli do wniosku, że zmiany w otoczce glikoproteinowo-glikolipidowej otaczającej błonę plemnika zmniejszają zdolność plemników do zapłodnienia poprzez upośledzenie sekwestracji plemników na połączeniu maciczno-pochwowym, co z kolei zwiększa utratę plemników ze względu na szybkość połączenia maciczno-pochwowego, ale nie wpływa na rozpoznawanie plemników i komórek jajowych.
U indyków Bakst i Bauchan 11 znaleźli małe pęcherzyki i fragmenty błony w świetle SST i zaobserwowali, że niektóre z tych granulek połączyły się z błoną plemnika. Autorzy sugerują, że te relacje mogą przyczyniać się do długotrwałego przechowywania plemników w SST. Jednak naukowcy nie określili źródła tych cząstek, czy są one wydzielane przez komórki nabłonkowe CCT, produkowane i wydzielane przez męski układ rozrodczy, czy też wytwarzane przez same plemniki. Ponadto cząstki te są odpowiedzialne za aglutynację. Grützner i wsp. 27 donieśli, że komórki nabłonkowe najądrza wytwarzają i wydzielają specyficzne białko, które jest wymagane do tworzenia jednoporowych dróg nasiennych. Autorzy donoszą również, że rozproszenie tych wiązek zależy od interakcji białek najądrza. Nixon i wsp. 28 odkryli, że przydatki wydzielają białko, kwaśną osteonektynę bogatą w cysteinę; SPARC bierze udział w tworzeniu kępek plemników u kolczatek krótkodziobych i dziobaków. Rozproszenie tych wiązek wiąże się z utratą tego białka.
W niniejszym badaniu analiza ultrastrukturalna z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej wykazała, że ​​plemniki przylegały do ​​dużej ilości gęstego materiału. Uważa się, że substancje te są odpowiedzialne za aglutynację, która kondensuje się pomiędzy i wokół przylegających główek, ale w niższych stężeniach w okolicy ogona. Zakładamy, że ta substancja aglutynująca jest wydalana z męskiego układu rozrodczego (najądrza lub nasieniowodu) wraz z nasieniem, ponieważ często obserwujemy, że nasienie oddziela się od limfy i osocza nasiennego podczas ejakulacji. Donoszono, że gdy plemniki ptaków przechodzą przez najądrza i nasieniowody, przechodzą zmiany związane z dojrzewaniem, które wspierają ich zdolność do wiązania białek i nabywania glikoprotein związanych z lematem plazmowym. Trwałość tych białek na błonach plemników rezydentnych w SST sugeruje, że białka te mogą wpływać na nabywanie stabilności błony plemników 30 i determinować ich płodność 31 . Ahammad i wsp.32 podali, że plemniki pobrane z różnych części męskiego układu rozrodczego (od jąder do dystalnego odcinka nasieniowodu) wykazywały postępujący wzrost żywotności w warunkach przechowywania w stanie płynnym, niezależnie od temperatury przechowywania, a żywotność u kurcząt wzrastała również w jajowodach po sztucznej inseminacji.
Kępki plemników kur Sharkashi mają inne cechy i funkcje niż inne gatunki, takie jak kolczatki, dziobaki, myszy leśne, szczury jelenie i świnki morskie. U kur Sharkasi tworzenie wiązek plemników zmniejszyło ich prędkość pływania w porównaniu do pojedynczych plemników. Jednak te wiązki zwiększyły odsetek plemników reologicznie dodatnich i zwiększyły zdolność plemników do stabilizacji w dynamicznym środowisku. Tak więc nasze wyniki potwierdzają poprzednią sugestię, że aglutynacja plemników w SST jest związana z długotrwałym przechowywaniem plemników. Stawiamy również hipotezę, że skłonność plemników do tworzenia kępek może kontrolować tempo utraty plemników w SST, co może zmienić wynik konkurencji plemników. Zgodnie z tym założeniem plemniki o niskiej zdolności aglutynacji uwalniają SST jako pierwsze, podczas gdy plemniki o wysokiej zdolności aglutynacji produkują większość potomstwa. Tworzenie się pojedynczych wiązek plemników jest korzystne i wpływa na stosunek rodzic-dziecko, ale wykorzystuje inny mechanizm. U kolczatek i dziobaków plemniki są ułożone równolegle do siebie, aby zwiększyć prędkość wiązki do przodu. Wiązki kolczatek poruszają się około trzy razy szybciej niż pojedyncze plemniki. Uważa się, że tworzenie się takich kępek plemników u kolczatek jest ewolucyjną adaptacją mającą na celu utrzymanie dominacji, ponieważ samice są rozwiązłe i zwykle łączą się z kilkoma samcami. Dlatego plemniki z różnych ejakulatów zaciekle konkurują o zapłodnienie komórki jajowej.
Aglutynowane plemniki kur sharkasi są łatwe do uwidocznienia za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, co jest uważane za korzystne, ponieważ pozwala na łatwe badanie zachowania plemników in vitro. Mechanizm, dzięki któremu tworzenie kępek plemników wspomaga reprodukcję u kur sharkasi, różni się również od mechanizmu obserwowanego u niektórych ssaków łożyskowych, reprezentujących kooperacyjne zachowanie plemników, takich jak myszy leśne, gdzie niektóre plemniki docierają do jaj, pomagając innym spokrewnionym osobnikom dotrzeć do jaj i je uszkodzić. aby udowodnić swoją wartość. zachowanie altruistyczne. Samozapłodnienie 34. Inny przykład kooperacyjnego zachowania plemników został znaleziony u myszy jeleniowatych, gdzie plemniki były w stanie identyfikować się i łączyć z najbardziej spokrewnionymi genetycznie plemnikami i tworzyć grupy kooperacyjne, aby zwiększyć swoją prędkość w porównaniu do plemników niespokrewnionych35.
Wyniki uzyskane w tym badaniu nie przeczą teorii Fomana dotyczącej długoterminowego przechowywania plemników w SWS. Naukowcy donoszą, że plemniki nadal poruszają się w strumieniu komórek nabłonkowych wyściełających SST przez dłuższy okres czasu, a po pewnym czasie zapasy energii plemników ulegają wyczerpaniu, co powoduje spadek prędkości, co umożliwia wydalanie substancji o małej masie cząsteczkowej. energii plemników z przepływem płynu ze światła SST Jamy jajowodu. W bieżącym badaniu zaobserwowaliśmy, że połowa pojedynczych plemników wykazywała zdolność do pływania wbrew przepływającym płynom, a ich przyczepność w wiązce zwiększała ich zdolność do wykazywania dodatniej reologii. Ponadto nasze dane są zgodne z danymi Matsuzaki i in. 1, którzy donieśli, że zwiększone wydzielanie mleczanu w SST może hamować ruchliwość rezydentnych plemników. Jednak nasze wyniki opisują powstawanie ruchomych więzadeł plemników i ich zachowanie reologiczne w obecności dynamicznego środowiska w mikrokanaliku, próbując wyjaśnić ich zachowanie w SST. Przyszłe badania mogą skupić się na określeniu składu chemicznego i pochodzenia czynnika aglutynującego, co niewątpliwie pomoże badaczom opracować nowe sposoby przechowywania płynnego nasienia i wydłużyć czas trwania płodności.
Piętnaście 30-tygodniowych samców sharkasi z gołą szyją (homozygotyczny dominujący; Na Na) wybrano jako dawców nasienia w badaniu. Ptaki hodowano w Research Poultry Farm na Wydziale Rolnictwa Uniwersytetu Ashit, gubernatorstwo Ashit, Egipt. Ptaki trzymano w indywidualnych klatkach (30 x 40 x 40 cm), poddawano programowi świetlnemu (16 godzin światła i 8 godzin ciemności) i karmiono dietą zawierającą 160 g surowego białka, 2800 kcal energii przyswajalnej, 35 g wapnia każdy. 5 gramów dostępnego fosforu na kilogram diety.
Zgodnie z danymi 36, 37, nasienie pobrano od samców poprzez masaż brzucha. Łącznie pobrano 45 próbek nasienia od 15 mężczyzn w ciągu 3 dni. Nasienie (n = 15/dzień) zostało natychmiast rozcieńczone w stosunku 1:1 (v:v) za pomocą rozcieńczalnika do nasienia Belsville Poultry, który zawiera difosforan potasu (1,27 g), monohydrat glutaminianu monosodowego (0,867 g), fruktozę (0,5 d), bezwodny octan sodu (0,43 g), tris(hydroksymetylo)aminometan (0,195 g), monohydrat cytrynianu potasu (0,064 g), monofosforan potasu (0,065 g), chlorek magnezu (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarność 333 mOsm/kg38. Rozcieńczone próbki nasienia najpierw badano pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że nasienie jest dobrej jakości (wilgotność), a następnie przechowywano je w łaźni wodnej w temperaturze 37°C do momentu wykorzystania w ciągu pół godziny od pobrania.
Kinematyka i reologia plemników zostały opisane przy użyciu systemu urządzeń mikroprzepływowych. Próbki nasienia zostały dodatkowo rozcieńczone do 1:40 w Beltsville Avian Semen Diluent, załadowane do urządzenia mikroprzepływowego (patrz poniżej), a parametry kinetyczne zostały określone przy użyciu systemu Computerized Semen Analysis (CASA) opracowanego wcześniej do charakteryzacji mikroprzepływowej. na temat ruchliwości plemników w środowisku ciekłym (Wydział Inżynierii Mechanicznej, Wydział Inżynierii, Uniwersytet Assiut, Egipt). Wtyczkę można pobrać ze strony: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Zmierzono prędkość krzywej (VCL, μm/s), prędkość liniową (VSL, μm/s) i średnią prędkość trajektorii (VAP, μm/s). Filmy plemników zostały nagrane przy użyciu odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego Optika XDS-3 (z obiektywem 40x) podłączonego do kamery Tucson ISH1000 przy 30 fps przez 3 s. Użyj oprogramowania CASA, aby zbadać co najmniej trzy obszary i 500 trajektorii plemników na próbkę. Nagrane wideo zostało przetworzone przy użyciu domowej roboty CASA. Definicja ruchliwości we wtyczce CASA opiera się na prędkości pływania plemników w porównaniu do szybkości przepływu i nie obejmuje innych parametrów, takich jak ruch z boku na bok, ponieważ stwierdzono, że jest to bardziej niezawodne w przepływie płynu. Ruch reologiczny jest opisany jako ruch plemników w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu płynu. Plemniki o właściwościach reologicznych podzielono przez liczbę ruchliwych plemników; plemniki w stanie spoczynku i plemniki poruszające się konwekcyjnie wykluczono z liczenia.
Wszystkie użyte substancje chemiczne uzyskano z Elgomhoria Pharmaceuticals (Kair, Egipt), chyba że zaznaczono inaczej. Urządzenie zostało wyprodukowane zgodnie z opisem El-sherry i in. 40 z pewnymi modyfikacjami. Materiały użyte do wytworzenia mikrokanalików obejmowały szklane płytki (Howard Glass, Worcester, MA), negatywową powłokę SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkohol diacetonowy (Sigma Aldrich, Steinheim, Niemcy) i poliaceton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanaliki są wytwarzane przy użyciu miękkiej litografii. Najpierw wydrukowano przezroczystą ochronną maskę na twarz z pożądanym wzorem mikrokanalików na drukarce o wysokiej rozdzielczości (Prismatic, Kair, Egipt i Pacific Arts and Design, Markham, ON). Wzorce wykonano przy użyciu szklanych płyt jako podłoża. Płytki oczyszczono w acetonie, izopropanolu i wodzie dejonizowanej, a następnie pokryto warstwą SU8-25 o grubości 20 µm metodą wirowania (3000 obr./min, 1 min). Warstwy SU-8 delikatnie wysuszono (65°C, 2 min i 95°C, 10 min) i wystawiono na działanie promieniowania UV przez 50 s. Po wystawieniu na działanie światła wypieczono w temperaturze 65°C i 95°C przez 1 min i 4 min w celu usieciowania odsłoniętych warstw SU-8, a następnie wywoływano w alkoholu diacetonowym przez 6,5 min. Wypiecz wafle na twardo (200°C przez 15 min), aby dodatkowo zestalić warstwę SU-8.
PDMS przygotowano przez zmieszanie monomeru i utwardzacza w stosunku wagowym 10:1, a następnie odgazowano w eksykatorze próżniowym i wylano na ramę główną SU-8. PDMS utwardzono w piecu (120°C, 30 min), następnie wycięto kanały, oddzielono od matrycy i perforowano, aby umożliwić przymocowanie rurek do wlotu i wylotu mikrokanalika. Na koniec mikrokanaliki PDMS na stałe przymocowano do szkiełek mikroskopowych za pomocą przenośnego procesora koronowego (Electro-Technic Products, Chicago, IL), jak opisano gdzie indziej. Mikrokanaliki użyte w tym badaniu mają wymiary 200 µm × 20 µm (szer. × wys.) i 3,6 cm długości.
Przepływ cieczy wywołany ciśnieniem hydrostatycznym wewnątrz mikrokanalika uzyskuje się dzięki utrzymywaniu poziomu cieczy w zbiorniku wlotowym powyżej różnicy wysokości Δh39 w zbiorniku wylotowym (rys. 1).
gdzie f jest współczynnikiem tarcia, zdefiniowanym jako f = C/Re dla przepływu laminarnego w kanale prostokątnym, gdzie C jest stałą zależną od współczynnika kształtu kanału, L jest długością mikrokanału, Vav jest średnią prędkością wewnątrz mikrokanału, Dh jest średnicą hydrauliczną kanału, g – przyspieszeniem grawitacyjnym. Używając tego równania, średnią prędkość kanału można obliczyć za pomocą następującego równania: