Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić stałe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScript.
Niedawno opracowano wolną od chemikaliów platformę antybakteryjną opartą na nanotechnologii wykorzystującej sztuczne nanostruktury wodne (EWNS). EWNS mają wysoki ładunek powierzchniowy i są bogate w reaktywne formy tlenu (ROS), które mogą oddziaływać z wieloma mikroorganizmami i je inaktywować, w tym patogenami przenoszonymi przez żywność. Tutaj pokazano, że ich właściwości podczas syntezy można dostroić i zoptymalizować, aby jeszcze bardziej zwiększyć ich potencjał antybakteryjny. Platforma laboratoryjna EWNS została zaprojektowana w celu dostrojenia właściwości EWNS poprzez zmianę parametrów syntezy. Charakterystykę właściwości EWNS (ładunek, rozmiar i zawartość ROS) przeprowadzono przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych. Ponadto mikroorganizmy spożywcze, takie jak Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum i Saccharomyces cerevisiae, zaszczepiono na powierzchni ekologicznych pomidorów winogronowych w celu oceny ich potencjału inaktywacji mikrobiologicznej. Wyniki przedstawione w niniejszym dokumencie pokazują, że właściwości EWNS można precyzyjnie dostroić podczas syntezy, co skutkuje wykładniczym wzrostem wydajności inaktywacji. W szczególności ładunek powierzchniowy wzrósł czterokrotnie, a zawartość ROS wzrosła. Szybkość usuwania drobnoustrojów była zależna od drobnoustrojów i wahała się od 1,0 do 3,8 log po 45 minutach ekspozycji na dawkę aerozolu 40 000 #/cm3 EWNS.
Zanieczyszczenie mikrobiologiczne jest główną przyczyną chorób przenoszonych drogą pokarmową, spowodowanych spożyciem patogenów lub ich toksyn. Choroby przenoszone drogą pokarmową odpowiadają za około 76 milionów zachorowań, 325 000 hospitalizacji i 5000 zgonów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych1. Ponadto Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) szacuje, że zwiększone spożycie świeżych produktów odpowiada za 48 procent wszystkich chorób przenoszonych drogą pokarmową zgłaszanych w Stanach Zjednoczonych2. Koszty chorób i zgonów spowodowanych patogenami przenoszonymi drogą pokarmową w Stanach Zjednoczonych są bardzo wysokie, szacowane przez Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) na ponad 15,6 miliarda dolarów rocznie3.
Obecnie chemiczne4, radiacyjne5 i termiczne6 interwencje przeciwdrobnoustrojowe w celu zapewnienia bezpieczeństwa żywności są wdrażane głównie w ograniczonych krytycznych punktach kontroli (CCP) w łańcuchu produkcyjnym (zwykle po zbiorach i/lub podczas pakowania), a nie w sposób ciągły, w taki sposób, że świeże produkty są narażone na zanieczyszczenie krzyżowe7. Interwencje przeciwdrobnoustrojowe są potrzebne w celu lepszej kontroli chorób przenoszonych przez żywność i psucia się żywności i mają potencjał do stosowania w całym kontinuum od gospodarstwa do stołu. Mniejszy wpływ i koszt.
Niedawno opracowano nanotechnologiczną, wolną od chemikaliów platformę antybakteryjną do inaktywacji bakterii na powierzchniach i w powietrzu przy użyciu sztucznych nanostruktur wodnych (EWNS). Do syntezy EVNS zastosowano dwa równoległe procesy: elektrospray i jonizację wody (rys. 1a). Wykazano wcześniej, że EWNS mają unikalny zestaw właściwości fizycznych i biologicznych8,9,10. EWNS ma średnio 10 elektronów na strukturę i średni rozmiar nanometra 25 nm (rys. 1b,c)8,9,10. Ponadto rezonans spinowy elektronów (ESR) wykazał, że EWNS zawierają dużą ilość reaktywnych form tlenu (ROS), głównie rodników hydroksylowych (OH•) i ponadtlenkowych (O2-) (rys. 1c)8. EWNS pozostawały w powietrzu przez długi czas i mogły zderzać się z mikrobami zawieszonymi w powietrzu i obecnymi na powierzchniach, dostarczając ładunek ROS i powodując inaktywację mikrobów (rys. 1d). Wcześniejsze badania wykazały również, że EWNS może oddziaływać i inaktywować różne bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie o znaczeniu dla zdrowia publicznego, w tym prątki gruźlicy, na powierzchniach i w powietrzu8,9. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​inaktywacja była spowodowana przez zaburzenie błony komórkowej. Ponadto badania ostrej inhalacji wykazały, że wysokie dawki EWNS nie powodują uszkodzenia płuc ani stanu zapalnego8.
(a) Elektrospray występuje, gdy pomiędzy kapilarą zawierającą ciecz a elektrodą przeciwną zostanie przyłożone wysokie napięcie. (b) Zastosowanie wysokiego napięcia powoduje dwa różne zjawiska: (i) elektrospray wody i (ii) generowanie reaktywnych form tlenu (jonów) uwięzionych w EWNS. (c) Unikalna struktura EWNS. (d) EWNS są bardzo mobilne ze względu na swoją nanostrukturę i mogą oddziaływać z patogenami unoszącymi się w powietrzu.
Niedawno wykazano również zdolność platformy antybakteryjnej EWNS do inaktywacji mikroorganizmów przenoszonych przez żywność na powierzchni świeżej żywności. Wykazano również, że ładunek powierzchniowy EWNS można stosować w połączeniu z polem elektrycznym w celu ukierunkowanego dostarczania. Co ważniejsze, obiecujący początkowy wynik około 1,4 log redukcji aktywności organicznych pomidorów przeciwko różnym mikroorganizmom spożywczym, takim jak E. coli i Listeria, zaobserwowano w ciągu 90 minut od narażenia na EWNS przy stężeniu około 50 000#/cm311. Ponadto wstępne testy oceny organoleptycznej nie wykazały żadnego efektu organoleptycznego w porównaniu z pomidorem kontrolnym. Chociaż te wstępne wyniki inaktywacji obiecują bezpieczeństwo żywności nawet przy bardzo niskich dawkach EWNS wynoszących 50 000#/cm3. Zobacz, jasne jest, że wyższy potencjał inaktywacji byłby bardziej korzystny dla dalszego zmniejszenia ryzyka infekcji i zepsucia.
Tutaj skupimy nasze badania na rozwoju platformy generacji EWNS, aby dostroić parametry syntezy i zoptymalizować właściwości fizykochemiczne EWNS w celu zwiększenia ich potencjału antybakteryjnego. W szczególności optymalizacja skupiła się na zwiększeniu ich ładunku powierzchniowego (w celu poprawy ukierunkowanego dostarczania) i zawartości ROS (w celu poprawy wydajności inaktywacji). Charakterystyka zoptymalizowanych właściwości fizykochemicznych (rozmiar, ładunek i zawartość ROS) przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych i przy użyciu powszechnych mikroorganizmów spożywczych, takich jak E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae i M. parafortuitum.
EVNS został zsyntetyzowany przez równoczesne elektrosprayowanie i jonizację wody o wysokiej czystości (18 MΩ cm–1). Elektryczny atomizer 12 jest zwykle używany do atomizacji cieczy i syntetycznych polimerów oraz cząstek ceramicznych 13 i włókien 14 o kontrolowanej wielkości.
Jak szczegółowo opisano w poprzednich publikacjach 8, 9, 10, 11, w typowym eksperymencie wysokie napięcie jest przyłożone między metalową kapilarę a uziemioną przeciwelektrodę. Podczas tego procesu zachodzą dwa różne zjawiska: 1) elektrospray i 2) jonizacja wody. Silne pole elektryczne między dwiema elektrodami powoduje gromadzenie się ładunków ujemnych na powierzchni skroplonej wody, co skutkuje tworzeniem się stożków Taylora. W rezultacie powstają silnie naładowane krople wody, które nadal rozpadają się na mniejsze cząsteczki, zgodnie z teorią Rayleigha16. Jednocześnie silne pole elektryczne powoduje, że niektóre cząsteczki wody rozszczepiają się i odbierają elektrony (jonizacja), generując w ten sposób dużą ilość reaktywnych form tlenu (ROS)17. Jednocześnie wygenerowane pakiety ROS18 zostały zamknięte w EWNS (rys. 1c).
Na rys. 2a przedstawiono system generacji EWNS opracowany i użyty w syntezie EWNS w tym badaniu. Oczyszczoną wodę przechowywaną w zamkniętej butelce podawano przez rurkę teflonową (średnica wewnętrzna 2 mm) do igły ze stali nierdzewnej 30G (metalowa kapilara). Jak pokazano na rys. 2b, przepływ wody jest kontrolowany przez ciśnienie powietrza wewnątrz butelki. Igła jest przymocowana do konsoli teflonowej, którą można ręcznie regulować w określonej odległości od przeciwelektrody. Przeciwelektroda to polerowany aluminiowy dysk z otworem pośrodku do pobierania próbek. Poniżej przeciwelektrody znajduje się aluminiowy lejek do pobierania próbek, który jest podłączony do reszty eksperymentalnej konfiguracji za pomocą portu pobierania próbek (rys. 2b). Wszystkie komponenty próbnika są uziemione elektrycznie, aby uniknąć gromadzenia się ładunku, który mógłby pogorszyć pobieranie próbek cząstek.
(a) Inżynieryjny system generowania nanostruktury wody (EWNS). (b) Przekrój próbnika i jednostki elektrosprayu pokazujący najważniejsze parametry. (c) Eksperymentalna instalacja do inaktywacji bakterii.
Opisany powyżej system generacji EWNS jest w stanie zmieniać kluczowe parametry operacyjne, aby ułatwić dokładne dostrojenie właściwości EWNS. Dostosuj przyłożone napięcie (V), odległość między igłą a przeciwelektrodą (L) i przepływ wody (φ) przez kapilarę, aby dokładnie dostroić charakterystyki EWNS. Symbole [V (kV), L (cm)] są używane do oznaczania różnych kombinacji. Dostosuj przepływ wody, aby uzyskać stabilny stożek Taylora określonego zestawu [V, L]. Na potrzeby tego badania aperturę przeciwelektrody (D) ustawiono na 0,5 cala (1,29 cm).
Ze względu na ograniczoną geometrię i asymetrię, natężenia pola elektrycznego nie można obliczyć na podstawie pierwszych zasad. Zamiast tego do obliczenia pola elektrycznego użyto oprogramowania QuickField™ (Svendborg, Dania)19. Pole elektryczne nie jest jednorodne, więc wartość pola elektrycznego na czubku kapilary została użyta jako wartość odniesienia dla różnych konfiguracji.
Podczas badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, stabilności stożka Taylora, stabilności produkcji EWNS i powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w tabeli uzupełniającej S1.
Wyjście systemu generacji EWNS było bezpośrednio podłączone do Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) w celu pomiaru stężenia liczby cząstek i było używane z elektrometrem aerozolowym Faradaya (TSI, model 3068B, Shoreview, USA). MN) w celu pomiaru przepływów aerozolu, jak opisano w naszej poprzedniej publikacji9. Zarówno SMPS, jak i elektrometr aerozolowy pobierały próbki przy przepływie 0,5 l/min (całkowity przepływ próbki 1 l/min). Stężenia cząstek i strumienie aerozolu mierzono przez 120 s. Powtórz pomiar 30 razy. Całkowity ładunek aerozolu oblicza się na podstawie bieżących pomiarów, a średni ładunek EWNS szacuje się na podstawie całkowitej liczby pobranych próbek cząstek EWNS. Średni koszt EWNS można obliczyć, korzystając z równania (1):
gdzie IEl to zmierzony prąd, NSMPS to stężenie liczbowe zmierzone za pomocą SMPS, a φEl to natężenie przepływu do elektrometru.
Ponieważ wilgotność względna (RH) wpływa na ładunek powierzchniowy, przez cały czas trwania eksperymentu utrzymywano stałą temperaturę i wilgotność względną (RH) na poziomie odpowiednio 21°C i 45%.
Mikroskopia sił atomowych (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornia) i sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonia) zostały użyte do pomiaru rozmiaru i czasu życia EWNS. Częstotliwość skanowania AFM wynosi 1 Hz, a obszar skanowania to 5 µm×5 µm z 256 liniami skanowania. Wszystkie obrazy zostały poddane wyrównaniu obrazu pierwszego rzędu przy użyciu oprogramowania Asylum (maska ​​o zakresie 100 nm i progu 100 pm).
Usuń lejek do pobierania próbek i umieść powierzchnię miki w odległości 2,0 cm od elektrody przeciwnej na średni czas 120 s, aby uniknąć koalescencji cząstek i tworzenia się nieregularnych kropel na powierzchni miki. EWNS został nałożony bezpośrednio na świeżo przecięte powierzchnie miki (Ted Pella, Redding, Kalifornia). Bezpośrednio po rozpylaniu powierzchnia miki została zwizualizowana za pomocą AFM. Kąt styku powierzchni świeżo przeciętej niezmodyfikowanej miki jest bliski 0°, więc EWNS rozprzestrzenia się po powierzchni miki w kształcie kopuły20. Średnicę (a) i wysokość (h) dyfuzyjnych kropel mierzono bezpośrednio z topografii AFM i użyto do obliczenia kopulastej objętości dyfuzyjnej EWNS za pomocą naszej wcześniej sprawdzonej metody8. Zakładając, że pokładowy EVNS ma taką samą objętość, równoważną średnicę można obliczyć z równania (2):
Zgodnie z naszą wcześniej opracowaną metodą, pułapka spinowa rezonansu spinowego elektronów (ESR) została użyta do wykrycia obecności krótkotrwałych pośrednich rodników w EWNS. Aerozole przepuszczano przez roztwór zawierający 235 mM DEPMPO (5-(dietoksyfosforyl)-5-metylo-1-pirolino-N-tlenek) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Wszystkie pomiary EPR przeprowadzono przy użyciu spektrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) i płaskich matryc komórkowych. Oprogramowanie Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) zostało użyte do zebrania i analizy danych. Charakterystykę ROS przeprowadzono tylko dla zestawu warunków pracy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Stężenia EWNS mierzono przy użyciu SMPS po uwzględnieniu utraty EWNS w impaktorze.
Poziom ozonu monitorowano przy użyciu dwuwiązkowego monitora ozonu 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Dla wszystkich właściwości EWNS wartość pomiaru jest średnią pomiarów, a błąd pomiaru jest odchyleniem standardowym. Wykonano test t, aby porównać wartość zoptymalizowanego atrybutu EWNS z odpowiadającą wartością bazowego EWNS.
Rysunek 2c przedstawia wcześniej opracowany i scharakteryzowany system EPES (ang. Electrostatic Precipitation Pass Through System), który może być używany do kierowania EWNS11 na powierzchnie. EPES wykorzystuje ładunek EWNS w połączeniu z silnym polem elektrycznym, aby „skierować” bezpośrednio na powierzchnię celu. Szczegóły systemu EPES przedstawiono w niedawnej publikacji Pyrgiotakisa i in.11. EPES składa się zatem z komory z PVC drukowanej w technologii 3D ze stożkowymi końcami, zawierającej dwie równoległe płyty metalowe ze stali nierdzewnej (stal nierdzewna 304, polerowana na lustro) pośrodku w odległości 15,24 cm od siebie. Płyty były podłączone do zewnętrznego źródła wysokiego napięcia (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), dolna płyta była zawsze dodatnia, a górna płyta była zawsze uziemiona (pływająca). Ściany komory są pokryte folią aluminiową, która jest uziemiona elektrycznie, aby zapobiec utracie cząstek. Komora ma uszczelnione przednie drzwi załadunkowe, które umożliwiają umieszczanie powierzchni testowych na plastikowych stojakach, podnosząc je z dolnej płyty metalowej, aby uniknąć zakłóceń wysokiego napięcia.
Wydajność osadzania EWNS w EPES obliczono zgodnie z opracowanym wcześniej protokołem szczegółowo opisanym na rysunku uzupełniającym S111.
Jako komora kontrolna, drugi przepływ przez komorę cylindryczną jest połączony szeregowo z systemem EPES za pomocą pośredniego filtra HEPA w celu usunięcia EWNS. Jak pokazano na rys. 2c, aerozol EWNS został przepompowany przez dwie komory połączone szeregowo. Filtr między pomieszczeniem kontrolnym a EPES usuwa wszelkie pozostałe EWNS, co skutkuje taką samą temperaturą (T), wilgotnością względną (RH) i poziomem ozonu.
Stwierdzono, że ważne mikroorganizmy przenoszone przez żywność zanieczyszczają świeże produkty, takie jak Escherichia coli (ATCC #27325), wskaźnik kałowy, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen przenoszony przez żywność, Listeria innocua (ATCC #33090), alternatywa dla patogennej Listeria monocytogenes. Od ATCC (Manassas, Wirginia) zakupiono Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) jako alternatywę dla drożdży powodujących psucie się produktów oraz Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) jako bardziej odporne żywe bakterie.
Kupuj losowo pudełka organicznych pomidorków koktajlowych w lokalnym markecie i przechowuj je w lodówce w temperaturze 4°C do momentu spożycia (do 3 dni). Wybierz pomidory, aby poeksperymentować z jednym rozmiarem, około 1/2 cala średnicy.
Protokoły inkubacji, inokulacji, ekspozycji i liczenia kolonii zostały szczegółowo opisane w naszych poprzednich publikacjach i wyjaśnione szczegółowo w Supplementary Data 11. Wydajność EWNS została oceniona poprzez wystawienie zaszczepionych pomidorów na działanie 40 000 #/cm3 przez 45 minut. Krótko mówiąc, w czasie t = 0 min, trzy pomidory zostały użyte do oceny przeżywających mikroorganizmów. Trzy pomidory umieszczono w EPES i wystawiono na działanie EWNS w stężeniu 40 000 #/cc (pomidory wystawione na działanie EWNS), a trzy inne umieszczono w komorze kontrolnej (pomidory kontrolne). Żadna z grup pomidorów nie została poddana dodatkowej obróbce. Pomidory wystawione na działanie EWNS i kontrole zostały usunięte po 45 minutach w celu oceny wpływu EWNS.
Każdy eksperyment przeprowadzono trzykrotnie. Analizę danych przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w danych uzupełniających.
Próbki bakterii E. coli, Enterobacter i L. innocua wystawione na działanie EWNS (45 min, stężenie aerozolu EWNS 40 000 #/cm3) i nienarażone zostały zgranulowane w celu oceny mechanizmów inaktywacji. Osad utrwalano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu (pH 7,4) z utrwalaczem 2,5% glutaraldehydu, 1,25% paraformaldehydu i 0,03% kwasu pikrynowego. Po przemyciu utrwalano je 1% tetratlenkiem osmu (OsO4)/1,5% żelazocyjankiem potasu (KFeCN6) przez 2 godziny, przemywano 3 razy wodą i inkubowano w 1% octanie uranylu przez 1 godzinę, a następnie przemywano dwukrotnie wodą. Następnie przeprowadzano 10-minutowe odwodnienie w 50%, 70%, 90%, 100% alkoholu. Następnie próbki umieszczono w tlenku propylenu na 1 godzinę i zaimpregnowano mieszaniną tlenku propylenu i TAAP Epon w stosunku 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Próbki zatopiono w TAAB Epon i polimeryzowano w temperaturze 60°C przez 48 godzin. Utwardzoną żywicę granulowaną pocięto i uwidoczniono za pomocą TEM przy użyciu JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonia), konwencjonalnego transmisyjnego mikroskopu elektronowego wyposażonego w kamerę AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Dla każdego punktu czasowego płukanki bakteryjne posiewano w trzech powtórzeniach, co dało łącznie dziewięć punktów danych na punkt, z których średnia została użyta jako stężenie bakterii dla danego organizmu. Odchylenie standardowe zostało użyte jako błąd pomiaru. Wszystkie punkty się liczą.
Logarytm spadku stężenia bakterii w porównaniu do t = 0 min obliczono według następującego wzoru:
gdzie C0 oznacza stężenie bakterii w próbce kontrolnej w czasie 0 (czyli po wyschnięciu powierzchni, ale przed umieszczeniem jej w komorze), a Cn oznacza stężenie bakterii na powierzchni po n minutach ekspozycji.
Aby uwzględnić naturalny rozkład bakterii podczas 45-minutowego okresu ekspozycji, obliczono także logarytmiczną redukcję w porównaniu do kontroli po 45 minutach w następujący sposób:
Gdzie Cn to stężenie bakterii w próbce kontrolnej w czasie n, a Cn-Kontrola to stężenie bakterii kontrolnych w czasie n. Dane przedstawiono jako redukcję logarytmiczną w porównaniu z próbką kontrolną (bez narażenia na EWNS).
Podczas badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, stabilności stożka Taylora, stabilności produkcji EWNS i powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w Tabeli uzupełniającej S1. Wybrano dwa przypadki do pełnego badania wykazującego stabilne i powtarzalne właściwości (stożek Taylora, produkcja EWNS i stabilność w czasie). Na rys. 3 przedstawiono wyniki dotyczące ładunku, rozmiaru i zawartości ROS dla dwóch przypadków. Wyniki podsumowano również w Tabeli 1. Dla porównania, Rysunek 3 i Tabela 1 obejmują właściwości wcześniej zsyntetyzowanego nieoptymalizowanego EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS bazowy). Obliczenia istotności statystycznej przy użyciu dwustronnego testu t zostały ponownie opublikowane w Tabeli uzupełniającej S2. Ponadto dodatkowe dane obejmują badania dotyczące wpływu średnicy otworu próbkującego elektrody przeciwnej (D) i odległości między elektrodą uziemiającą a końcem igły (L) (rysunki uzupełniające S2 i S3).
(a–c) Rozkład wielkości AFM. (d – f) Charakterystyka ładunku powierzchniowego. (g) Charakterystyka ROS i ESR.
Ważne jest również zauważenie, że dla wszystkich powyższych warunków zmierzone prądy jonizacji mieściły się w zakresie 2-6 µA, a napięcia w zakresie od -3,8 do -6,5 kV, co skutkowało poborem mocy dla tego pojedynczego terminala EWNS mniejszym niż 50 mW. . moduł generacji. Chociaż EWNS był syntetyzowany pod wysokim ciśnieniem, poziomy ozonu były bardzo niskie, nigdy nie przekraczając 60 ppb.
Rysunek uzupełniający S4 przedstawia symulowane pola elektryczne dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pola według scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] są obliczane jako odpowiednio 2 × 105 V/m i 4,7 × 105 V/m. Jest to do przewidzenia, ponieważ stosunek napięcia do odległości jest znacznie wyższy w drugim przypadku.
Na rys. 3a,b pokazano średnicę EWNS zmierzoną za pomocą AFM8. Średnie średnice EWNS dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] obliczono odpowiednio na 27 nm i 19 nm. Geometryczne odchylenia standardowe rozkładów dla przypadków [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] wynoszą odpowiednio 1,41 i 1,45, co wskazuje na wąski rozkład wielkości. Zarówno średni rozmiar, jak i geometryczne odchylenie standardowe są bardzo zbliżone do bazowego EWNS, wynosząc odpowiednio 25 nm i 1,41. Na rys. 3c pokazano rozkład wielkości bazowego EWNS zmierzonego tą samą metodą w tych samych warunkach.
Na rys. 3d,e przedstawiono wyniki charakterystyki ładunku. Dane stanowią średnie pomiary 30 równoczesnych pomiarów stężenia (#/cm3) i prądu (I). Analiza pokazuje, że średni ładunek na EWNS wynosi 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- dla [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], odpowiednio. W porównaniu do Baseline-EWNS (10 ± 2 e-), ich ładunek powierzchniowy jest znacznie wyższy, dwukrotnie wyższy niż w scenariuszu [-6,5 kV, 4,0 cm] i czterokrotnie wyższy niż w scenariuszu [-3,8 kV, 0,5 cm]. Rys. 3f przedstawia podstawowe dane dotyczące płatności EWNS.
Z map koncentracji liczb EWNS (rysunki uzupełniające S5 i S6) widać, że scena [-6,5 kV, 4,0 cm] ma znacznie większą liczbę cząstek niż scena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Należy również zauważyć, że stężenia liczb EWNS monitorowano przez okres do 4 godzin (rysunki uzupełniające S5 i S6), gdzie stabilność generacji EWNS wykazała takie same poziomy koncentracji liczb cząstek w obu przypadkach.
Rysunek 3g przedstawia widmo EPR po odjęciu kontroli (tło) dla zoptymalizowanego EWNS przy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Widmo ROS jest również porównywane z linią bazową EWNS w poprzednio opublikowanej pracy. Obliczona liczba EWNS reagujących z pułapką spinową wynosi 7,5 × 104 EWNS/s, co jest podobne do poprzednio opublikowanej linii bazowej-EWNS8. Widma EPR wyraźnie wskazują na obecność dwóch typów ROS, gdzie dominował O2-, podczas gdy OH• był obecny w mniejszej ilości. Ponadto bezpośrednie porównanie intensywności szczytów wykazało, że zoptymalizowany EWNS miał znacznie wyższą zawartość ROS w porównaniu z linią bazową EWNS.
Na rys. 4 przedstawiono wydajność osadzania EWNS w EPES. Dane podsumowano również w Tabeli I i porównano z oryginalnymi danymi EWNS. W obu przypadkach EUNS osadzanie było bliskie 100% nawet przy niskim napięciu 3,0 kV. Zazwyczaj 3,0 kV wystarcza do osiągnięcia 100% osadzania niezależnie od zmiany ładunku powierzchniowego. W tych samych warunkach wydajność osadzania Baseline-EWNS wynosiła tylko 56% ze względu na niższy ładunek (średnio 10 elektronów na EWNS).
Rysunek 5 i Tabela 2 podsumowują stopień inaktywacji mikroorganizmów zaszczepionych na powierzchni pomidorów po narażeniu na około 40 000 #/cm3 EWNS przez 45 minut w optymalnym scenariuszu [-6,5 kV, 4,0 cm]. Zaszczepione E. coli i L. innocua wykazały znaczącą redukcję o 3,8 log po 45 minutach narażenia. W tych samych warunkach S. enterica wykazała niższą redukcję log o 2,2 log, podczas gdy S. cerevisiae i M. parafortuitum wykazały redukcję o 1,0 log.
Mikrofotografie elektronowe (Rysunek 6) przedstawiające zmiany fizyczne wywołane przez EWNS w komórkach E. coli, Salmonella enterica i L. innocua prowadzące do inaktywacji. Bakterie kontrolne wykazywały nienaruszone błony komórkowe, podczas gdy bakterie wystawione na działanie miały uszkodzone błony zewnętrzne.
Badanie mikroskopowe bakterii kontrolnych i wystawionych na działanie promieni słonecznych ujawniło uszkodzenie błony komórkowej.
Dane dotyczące właściwości fizykochemicznych zoptymalizowanego EWNS łącznie pokazują, że właściwości EWNS (ładunek powierzchniowy i zawartość ROS) zostały znacząco poprawione w porównaniu z poprzednio opublikowanymi danymi bazowymi EWNS8,9,10,11. Z drugiej strony ich rozmiar pozostał w zakresie nanometrów, co jest bardzo podobne do wcześniej opublikowanych wyników, co pozwala im pozostać w powietrzu przez długi okres czasu. Obserwowaną polidyspersyjność można wyjaśnić zmianami ładunku powierzchniowego, które określają wielkość efektu Rayleigha, losowość i potencjalne łączenie się EWNS. Jednak, jak szczegółowo opisali Nielsen i in.22, wysoki ładunek powierzchniowy zmniejsza parowanie poprzez skuteczne zwiększenie energii powierzchniowej/napięcia kropli wody. Teoria ta została eksperymentalnie potwierdzona dla mikrokropli22 i EWNS w naszej poprzedniej publikacji8. Utrata nadgodzin może również wpływać na rozmiar i przyczyniać się do obserwowanego rozkładu wielkości.
Ponadto ładunek na strukturę wynosi około 22–44 e-, w zależności od okoliczności, co jest znacznie wyższe w porównaniu do podstawowego EWNS, który ma średni ładunek 10 ± 2 elektronów na strukturę. Należy jednak zauważyć, że jest to średni ładunek EWNS. Seto i in. Wykazano, że ładunek nie jest jednorodny i podąża za rozkładem logarytmiczno-normalnym21. W porównaniu z naszą poprzednią pracą, podwojenie ładunku powierzchniowego podwaja wydajność osadzania w układzie EPES do prawie 100%11.