Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczone wsparcie dla CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Porowate cząstki krzemionki przygotowano metodą zol-żel z pewnymi modyfikacjami w celu uzyskania cząstek makroporowatych. Cząstki te poddano derywatyzacji przez polimeryzację z przeniesieniem łańcucha z odwracalnym addycją (RAFT) z N-fenylomaleimidem-metylowinyloizocyjanianem (PMI) i styrenem w celu przygotowania N-fenylomaleimidu interkalacji fazy stacjonarnej polistyrenu (PMP). Kolumny ze stali nierdzewnej o wąskim otworze (100 × 1, 8 mm id ) zostały upakowane w zawiesinie. Oceniono rozdział kolumnowy PMP mieszaniny peptydów składającej się z pięciu peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucyna enkefalina) wydajność chromatograficzną) i trawienie trypsyną ludzkiej albuminy surowicy (HAS). W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba płytek mieszaniny peptydów wynosi nawet 280,0 00 płytek/m². Porównując wydajność separacji opracowanej kolumny z komercyjną kolumną Ascentis Express RP-Amide, zaobserwowano, że wydajność separacji kolumny PMP była lepsza niż kolumny komercyjnej pod względem wydajności separacji i rozdzielczości.
W ostatnich latach przemysł biofarmaceutyczny stał się rozwijającym się rynkiem światowym ze znacznym wzrostem udziału w rynku. Wraz z gwałtownym rozwojem przemysłu biofarmaceutycznego1,2,3 analiza peptydów i białek jest bardzo pożądana. Oprócz peptydu docelowego, podczas syntezy peptydów powstaje kilka zanieczyszczeń, co wymaga oczyszczania chromatograficznego w celu uzyskania peptydów o pożądanej czystości. Analiza i charakterystyka białek w płynach ustrojowych, tkankach i komórkach jest niezwykle trudnym zadaniem ze względu na dużą liczbę potencjalnie wykrywalnych gatunków w Chociaż spektrometria mas jest skutecznym narzędziem do sekwencjonowania peptydów i białek, jeśli takie próbki zostaną wstrzyknięte do spektrometru mas w jednym przejściu, rozdział nie będzie idealny. Problem ten można złagodzić, wdrażając rozdziały metodą chromatografii cieczowej (LC) przed analizą MS, co zmniejszy liczbę analitów wchodzących do spektrometru mas w danym czasie4,5,6. Ponadto podczas rozdzielania w fazie ciekłej anality mogą być skupione w wąskich obszarach, tym samym koncentrując te anality i poprawiając MS czułość detekcji. Chromatografia cieczowa (LC) znacznie się rozwinęła w ciągu ostatniej dekady i stała się popularną techniką w analizie proteomicznej7,8,9,10.
Chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RP-LC) jest szeroko stosowana do oczyszczania i rozdzielania mieszanin peptydów przy użyciu krzemionki modyfikowanej oktadecylem (ODS) jako fazy stacjonarnej11,12,13. Jednak fazy stacjonarne RP nie zapewniają zadowalającego rozdziału peptydów i białek ze względu na ich złożoną strukturę i amfifilowy charakter14,15. Dlatego do analizy peptydów i białek z ugrupowaniami polarnymi i niepolarnymi wymagane są specjalnie zaprojektowane fazy stacjonarne do interakcji z i zatrzymywania tych analitów16.Chromatografia w trybie mieszanym, która zapewnia interakcje multimodalne, może być alternatywą dla RP-LC do rozdzielania peptydów, białek i innych złożonych mieszanin. Przygotowano kilka faz stacjonarnych w trybie mieszanym, a kolumny wypełnione tymi fazami zastosowano do rozdzielania peptydów i białek17,18,19,20,21.Fazy stacjonarne w trybie mieszanym (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalacja polarna/RPLC) są odpowiednie do rozdzielania peptydów i białek ze względu na obecność zarówno grup polarnych, jak i niepolarnych22,23,24,25,26,27,28. Podobnie, polarne interkalujące fazy stacjonarne z kowalencyjnie związanymi grupami polarnymi wykazują dobrą moc separacji i wyjątkową selektywność dla polarnych i niepolarnych analitów, ponieważ separacja zależy od interakcji między analitem a fazą stacjonarną.Interakcje multimodalne 29, 30, 31, 32. Ostatnio Zhang et al.30 przygotował poliaminową fazę stacjonarną zakończoną dodecylem i skutecznie oddzielił węglowodory, leki przeciwdepresyjne, flawonoidy, nukleozydy, estrogeny i kilka innych analitów. Interkalator polarny ma zarówno grupy polarne, jak i niepolarne, dzięki czemu można go stosować do rozdzielania peptydów i białek, które mają zarówno ugrupowania hydrofobowe, jak i hydrofilowe. centis Express RP-Amide, ale te kolumny są używane tylko do analizy aminy 33.
W obecnym badaniu sporządzono fazę stacjonarną zatopioną w polarze (polistyren osadzony w N-fenylomaleimidzie) i oceniono pod kątem rozdzielania peptydów i produktów trawienia HSA trypsyną. Faza stacjonarna została przygotowana przy użyciu następującej strategii. Porowate cząstki krzemionki przygotowano zgodnie z procedurą podaną w naszej poprzedniej publikacji z pewnymi modyfikacjami protokołu przygotowania. Stosunek mocznika, glikolu polietylenowego (PEG), TMOS, wody i kwasu octowego dostosowano w celu przygotowania cząstek krzemionki o dużych rozmiarach porów. Po drugie, zsyntetyzowano nowy ligand, fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian, i zastosowano go do derywatyzacji cząstek krzemionki w celu przygotowania fazy stacjonarnej zatopionej w polarze. Powstałą fazę stacjonarną umieszczono w kolumnie ze stali nierdzewnej (100 × 1, 8 mm średnicy wewnętrznej) przy użyciu zoptymalizowanego schematu upakowania. Wypełnienie kolumny jest wspomagane wibracjami mechanicznymi, aby zapewnić utworzenie jednorodnego złoża w kolumnie.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucyna Enkefalina) i trawienie trypsyną ludzkiej albuminy surowicy (HAS). Zaobserwowano, że mieszanina peptydów i trawienie trypsyną HSA rozdzielają się z dobrą rozdzielczością i wydajnością. Wydajność separacji kolumny PMP porównano z wydajnością kolumny Ascentis Express RP-Amide. Zarówno peptydy, jak i białka zaobserwowano, że był dobrze rozdzielony i wydajny na kolumnie PMP, która była bardziej wydajna niż kolumna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (glikol polietylenowy), mocznik, kwas octowy, trimetoksyortokrzemian (TMOS), trimetylochlorosilan (TMCS), trypsyna, albumina surowicy ludzkiej (HSA), chlorek amonu, mocznik, heksan metylodisilazan (HMDS), chlorek metakryloilu (MC), styren, 4-hydroksy-TEMPO, nadtlenek benzoilu (BPO), aceton klasy HPLC itrile (ACN), metanol, 2-propanol i aceton Zakupione od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Mieszaninę mocznika (8 g), glikolu polietylenowego (8 g) i 8 ml 0,01 N kwasu octowego mieszano przez 10 minut, a następnie dodano do tego 24 ml TMOS w lodowatych warunkach. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 40°C przez 6 godzin, a następnie w 120°C przez 8 godzin w autoklawie ze stali nierdzewnej. Wodę wylano, a pozostały materiał suszono w 70°C przez 1 Wysuszona miękka masa była gładko mielona w piecu i kalcynowana w temperaturze 550°C przez 12 godzin. Przygotowano trzy partie i scharakteryzowano w celu zbadania odtwarzalności wielkości cząstek, wielkości porów i pola powierzchni.
Poprzez modyfikację powierzchni cząstek krzemionki wstępnie zsyntetyzowanym ligandem fenylomaleimidowo-metylowinyloizocyjanianem (PCMP), a następnie polimeryzację radialną ze styrenem, otrzymano związek zawierający grupy polarne.Faza stacjonarna dla agregatów i łańcuchów polistyrenowych. Proces przygotowania opisano poniżej.
N-fenylomaleimid (200 mg) i izocyjanian metylowo-winylowy (100 mg) rozpuszczono w suchym toluenie i do kolby reakcyjnej dodano 0,1 ml 2,2'-azoizobutyronitrylu (AIBN), aby przygotować kopolimer fenylomaleimid-izocyjanian metylowo-winylowy (PMCP). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60°C przez 3 godziny, przesączono i wysuszono w do piekarnika nagrzanego do 40°C na 3 godziny.
Wysuszone cząstki krzemionki (2 g) zdyspergowano w suchym toluenie (100 ml), mieszano i poddawano działaniu ultradźwięków w kolbie okrągłodennej o pojemności 500 ml przez 10 minut. PMCP (10 mg) rozpuszczono w toluenie i wkroplono do kolby reakcyjnej przez wkraplacz. Mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 100°C przez 8 godzin, przesączono, przemyto acetonem i suszono w temperaturze 60°C przez 3 godziny. Następnie PM Cząstki krzemionki związanej z CP (100 g) rozpuszczono w toluenie (200 ml) i dodano 4-hydroksy-TEMPO (2 ml) w obecności 100 µl dilaurynianu dibutylocyny jako katalizatora. Mieszaninę mieszano w 50°C przez 8 godzin, przesączono i suszono w 50°C przez 3 godziny.
Styren (1 ml), nadtlenek benzoilu BPO (0,5 ml) i cząsteczki krzemionki związane z TEMPO-PMCP (1,5 g) zdyspergowano w toluenie i przepłukano azotem. Polimeryzację styrenu prowadzono w temperaturze 100°C przez 12 godzin. Otrzymany produkt przemyto metanolem i suszono w temperaturze 60°C przez noc. Ogólny schemat reakcji przedstawiono na rycinie 1.
Próbki odgazowywano w temperaturze 393 K przez 1 godzinę do uzyskania ciśnienia resztkowego poniżej 10-3 Torr. Ilość N2 zaadsorbowanego przy ciśnieniu względnym P/P0 = 0,99 wykorzystano do określenia całkowitej objętości porów. Morfologię nagich i związanych z ligandem cząstek krzemionki zbadano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonia). przy użyciu samoprzylepnej taśmy węglowej. Próbki pokryto złotem za pomocą napylacza katodowego Q150T, a na próbkach osadzono warstwę Au o grubości 5 nm. Poprawia to wydajność procesu przy użyciu niskich napięć i zapewnia drobnoziarniste rozpylanie na zimno. Do analizy elementarnej zastosowano analizator elementarny Thermo Electron (Waltham, MA, USA). Cząsteczki nagiej krzemionki i cząsteczki krzemionki związane z ligandem (po 5 mg) zdyspergowano w 5 ml izopropanolu, poddawano działaniu ultradźwięków przez 10 minut, wirowano przez 5 minut i umieszczano na stole optycznym urządzenia Mastersizer. Analizę termograwimetryczną prowadzono z szybkością 5°C na minutę w zakresie temperatur od 30 do 800°C.
Wyłożone szkłem kolumny ze stali nierdzewnej o wąskim otworze o wymiarach (100 × 1, 8 mm średnicy wewnętrznej) pakowano metodą pakowania w zawiesinę, stosując tę ​​samą procedurę, co w ref.31. Kolumnę ze stali nierdzewnej (wyłożona szkłem, średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) z króćcem wylotowym zawierającym spiek 1 µm połączono z urządzeniem do pakowania zawiesiny (Alltech Deerfield, IL, USA). Przygotować zawiesinę fazy stacjonarnej, zawieszając 150 mg fazy stacjonarnej w 1,2 ml metanolu i przesłać ją do kolumny do przechowywania. sekwencyjnie stosując ciśnienie 100 MP przez 10 minut, 80 MP przez 15 minut i 60 MP przez 30 minut. Podczas pakowania zastosowano wibracje mechaniczne za pomocą dwóch wytrząsarek do kolumn GC (Alltech, Deerfield, IL, USA), aby zapewnić równomierne upakowanie kolumny. Zamknij paker zawiesiny i powoli zmniejszaj ciśnienie, aby zapobiec uszkodzeniom w kolumnie. jego wydajność.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Japonia), inżektor (Valco (USA) C14 W.05) z pętlą iniekcyjną 50nL, odgazowywacz membranowy (Shimadzu DGU-14A), skonstruowano okienko kapilarne UV-VIS. Specjalny detektor urządzenia µLC (UV-2075) i mikrokolumny wyłożone szkłem. Należy stosować bardzo wąskie i krótkie rurki łączące, aby zminimalizować efekt poszerzenia pasma dodatkowych kolumn. Po zapakowaniu kapilary (5 0 μm id 365 i kapilary redukujące (50 μm) zainstalowano na wylocie 1/16" złącza redukującego. Zbieranie danych i przetwarzanie chromatograficzne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Multichro 2000. Monitorowanie przy 254 nm Anality badano pod kątem absorbancji UV. Dane chromatograficzne analizowano za pomocą OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina z ludzkiej surowicy, liofilizowany proszek, ≥ 96% (elektroforeza w żelu agarozowym) 3 mg zmieszana z trypsyną (1,5 mg), 4,0 M mocznikiem (1 ml) i 0,2 M wodorowęglanem amonu (1 ml). Roztwór mieszano przez 10 minut i trzymano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 6 godzin, następnie zadano 1 ml 0,1% TFA. Przesączyć roztwór i przechowywać w temperaturze poniżej 4°C.
Rozdział mieszanin peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA oceniano oddzielnie na kolumnach PMP. Sprawdź rozdział mieszaniny peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA na kolumnie PMP i porównaj wyniki z kolumną Ascentis Express RP-Amide. Teoretyczną liczbę płytek oblicza się w następujący sposób:
Obrazy SEM nagich cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na FIG.2 Obrazy SEM nagich cząstek krzemionki (A, B) pokazują, że w przeciwieństwie do naszych poprzednich badań, cząstki te są kuliste, w których cząstki są wydłużone lub mają nieregularną symetrię. Powierzchnia cząstek krzemionki związanych z ligandem (C, D) jest gładsza niż cząstek gołej krzemionki, co może wynikać z powlekania łańcuchów polistyrenu na powierzchni cząstek krzemionki.
Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego nagich cząstek krzemionki (A, B) i cząstek krzemionki związanych z ligandem (C, D).
Rozkłady wielkości cząstek nagich cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanej z ligandem pokazano na rycinie 3 (A). Krzywe rozkładu wielkości cząstek w oparciu o objętość wykazały, że wielkość cząstek krzemionki wzrosła po modyfikacji chemicznej (ryc. 3A). Dane dotyczące rozkładu wielkości cząstek cząstek krzemionki z obecnego badania i poprzedniego badania porównano w tabeli 1 (A). Objętościowa wielkość cząstek, d (0, 5), PMP wynosi 3, 36 μm, w porównaniu z naszym poprzednim badaniem z wartością ad (0, 5) 3,05 μm (cząstki krzemionki związanej z polistyrenem)34. Ta partia miała węższy rozkład wielkości cząstek w porównaniu z naszym poprzednim badaniem ze względu na różne stosunki PEG, mocznika, TMOS i kwasu octowego w mieszaninie reakcyjnej. Wielkość cząstek fazy PMP jest nieco większa niż fazy cząstek krzemionki związanej z polistyrenem, którą badaliśmy wcześniej. Oznacza to, że funkcjonalizacja powierzchni cząstek krzemionki styrenem osadziła tylko warstwę polistyrenu (0,97 µm ) na powierzchni krzemionki, podczas gdy w fazie PMP grubość warstwy wynosiła 1,38 µm.
Rozkład wielkości cząstek (A) i rozkład wielkości porów (B) nagich cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanej z ligandem.
Rozmiar porów, objętość porów i pole powierzchni cząstek krzemionki w bieżącym badaniu podano w tabeli 1 (B). Profile PSD gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanej z ligandem pokazano na rysunku 3 (B). Wyniki są porównywalne z naszym poprzednim badaniem. Rozmiary porów nagich i związanych z ligandem cząstek krzemionki wynoszą odpowiednio 310 i 241, co wskazuje, że wielkość porów zmniejsza się o 69 po modyfikacji chemicznej, jak pokazano w tabeli 1 (B), a zmiana krzywej pokazano na ryc. 3(B). Podobnie objętość porów cząstek krzemionki zmniejszyła się z 0,67 do 0,58 cm3/g po modyfikacji chemicznej. Pole powierzchni właściwej aktualnie badanych cząstek krzemionki wynosi 116 m2/g, co jest porównywalne z naszym poprzednim badaniem (124 m2/g). 105 m2/g po modyfikacji chemicznej.
Wyniki analizy elementarnej fazy stacjonarnej przedstawiono w tabeli 2. Obciążenie węglem obecnej fazy stacjonarnej wynosi 6,35%, co jest wartością niższą niż zawartość węgla w naszym poprzednim badaniu (cząstki krzemionki związanej ze styropianem, odpowiednio 7,93%35 i 10,21%). Zastosowano ide-metylowinyloizocyjanian (PCMP) i 4-hydroksy-TEMPO. Procent wagowy azotu w obecnej fazie stacjonarnej wynosi 2,21%, w porównaniu do odpowiednio 0,1735 i 0,85% wagowych azotu w poprzednich badaniach. Oznacza to, że procent wagowy azotu jest wyższy w obecnej fazie stacjonarnej z powodu fenylomaleimidu. Odpowiednio 0,9%, podczas gdy zawartość węgla w produkcie końcowym (6) wynosiła 6,35%, jak pokazano w tabeli 2. Utratę masy sprawdzono z fazą stacjonarną PMP, a krzywą TGA pokazano na rysunku 4. Krzywa TGA pokazuje utratę masy 8,6%, co jest zgodne z zawartością węgla (6,35%), ponieważ ligandy zawierają nie tylko C, ale także N, O i H.
Ligand fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian został wybrany do modyfikacji powierzchni cząstek krzemionki, ponieważ ma polarne grupy fenylomaleimidowe i grupy winyloizocyjanianowe. Grupy izocyjanianowe winylu mogą dalej reagować ze styrenem poprzez żywą polimeryzację rodnikową. polarność fazy stacjonarnej może być kontrolowana przez optymalną ilość styrenu i czas reakcji polimeryzacji wolnorodnikowej. Ostatni etap reakcji (polimeryzacja wolnorodnikowa) jest krytyczny i może zmienić polaryzację fazy stacjonarnej. Przeprowadzono analizę pierwiastkową w celu sprawdzenia obciążenia węglem tych faz stacjonarnych. Zaobserwowano, że zwiększenie ilości styrenu i czasu reakcji zwiększyło obciążenie węglem fazy stacjonarnej i odwrotnie. różne ładunki węgla. Ponownie załaduj te fazy stacjonarne do kolumn ze stali nierdzewnej i sprawdź ich wydajność chromatograficzną (selektywność, rozdzielczość, wartość N itp.). Na podstawie tych eksperymentów wybrano zoptymalizowany preparat do przygotowania fazy stacjonarnej PMP, aby zapewnić kontrolowaną polarność i dobrą retencję analitu.
Oceniono również pięć mieszanin peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, enkefalina leucyny) stosując kolumnę PMP z fazą ruchomą;60/40 (v/v) acetonitryl/woda (0,1% TFA) przy natężeniu przepływu 80 μl/min. W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba półek (N) na kolumnę (100 × 1,8 mm id) wynosi 20 000 ± 100 (200 000 płytek/m²). Tabela 3 przedstawia wartości N dla trzech kolumn PMP, a chromatogramy pokazano na rysunku 5A. Szybka analiza na kolumnie PMP przy dużym natężeniu przepływu (700 μl/min), pięć peptydów zostało eluowanych w ciągu jednej minuty, wartości N były bardzo dobre, 13 500 ± 330 na kolumnę (100 × 1,8 mm id), co odpowiada 135 000 płytek/m (Rysunek 5B). fazy stacjonarnej PMP w celu sprawdzenia odtwarzalności. Stężenie analitu dla każdej kolumny rejestrowano przy użyciu optymalnych warunków elucji i liczby półek teoretycznych N oraz czasu retencji w celu rozdzielenia tej samej mieszaniny testowej na każdej kolumnie. Dane dotyczące odtwarzalności dla kolumn PMP przedstawiono w tabeli 4. Odtwarzalność kolumny PMP dobrze koreluje z bardzo niskimi wartościami %RSD, jak pokazano w tabeli 3.
Rozdział mieszaniny peptydów na kolumnie PMP (B) i kolumnie Ascentis Express RP-Amide (A);faza ruchoma 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), wymiary kolumny PMP (100 x 1,8 mm id);analityczny Kolejność elucji związków: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucyna) kwaśna enkefalina)).
Kolumnę PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) oceniano pod kątem rozdzielania produktów trawienia trypsyną ludzkiej albuminy surowicy w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Chromatogram na rycinie 6 pokazuje, że próbka jest dobrze rozdzielona, ​​a rozdzielczość jest bardzo dobra. Trawienie HSA analizowano przy szybkości przepływu 100 µl/min, faza ruchoma 70/30 acetonitryl/woda i 0,1% TFA. Jak pokazano na chromatogramie (ryc. 6), trawienie HSA zostało podzielone na 17 pików odpowiadających 17 peptydom. Obliczono wydajność rozdziału każdego piku w trawieniu HSA i wartości podano w tabeli 5.
Produkt trawienia trypsyną HSA (100 x 1,8 mm id) rozdzielono na kolumnie PMP;szybkość przepływu (100 ul/min), faza ruchoma 60/40 acetonitryl/woda z 0,1% TFA.
gdzie L to długość kolumny, η to lepkość fazy ruchomej, ΔP to przeciwciśnienie kolumny, a u to prędkość liniowa fazy ruchomej. Przepuszczalność kolumny PMP wynosiła 2,5 × 10-14 m2, natężenie przepływu wynosiło 25 μl/min, a użyto 60/40 v/v ACN/woda. Przepuszczalność kolumny PMP (100 × 1,8 mm id) była podobna do naszej poprzedniej badanie Ref. 34. Przepuszczalność kolumny wypełnionej powierzchniowo porowatymi cząstkami wynosi: 1,7 × 10-15 dla cząstek 1,3 μm, 3,1 × 10-15 dla cząstek 1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 m2 dla cząstek 2,6 μm Dla cząstek 5 μm 43. Zatem przepuszczalność fazy PMP jest podobny do cząstek typu rdzeń-powłoka o wielkości 5 μm.
gdzie Wx to masa kolumny wypełnionej chloroformem, Wy to masa kolumny wypełnionej metanolem, a ρ to gęstość rozpuszczalnika. Gęstości metanolu (ρ = 0,7866) i chloroformu (ρ = 1,484). Całkowita porowatość kolumn SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 i C18-Mocznik 31, które wcześniej badane wyniosły odpowiednio 0,63 i 0,55. Oznacza to, że obecność ligandów mocznikowych zmniejsza przepuszczalność fazy stacjonarnej. Z drugiej strony, całkowita porowatość kolumny PMP (100 × 1,8 mm id) wynosi 0,60. Przepuszczalność kolumn PMP jest mniejsza niż kolumn wypełnionych cząstkami krzemionki związanej z C18, ponieważ w fazach stacjonarnych typu C18 ligandy C18 są przyłączone do krzemionki cząstki w postaci łańcuchów liniowych, podczas gdy w fazach stacjonarnych typu polistyren wokół niej tworzy się stosunkowo gruba warstwa polimeru A. W typowym eksperymencie porowatość kolumny oblicza się jako:
Figura 7A, B przedstawia kolumnę PMP (100 x 1,8 mm średnicy wewnętrznej) i kolumnę Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 mm średnicy wewnętrznej) przy użyciu tych samych warunków elucji (tj. 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA).) działki van Deemtera.Wyselekcjonowane mieszaniny peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucyna Enkephalin) przygotowano w 20 µL/. Kolumna amidowa wynosiła odpowiednio 2,6 µm i 3,9 µm. Wartości HETP wskazują, że wydajność separacji kolumny PMP (100 × 1,8 mm id) jest znacznie lepsza niż dostępnej w handlu kolumny Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id). Wykres van Deemtera na ryc. 7 (A) pokazuje, że spadek wartości N wraz ze wzrostem przepływu nie jest znaczący w porównaniu z naszym poprzednim badaniem. Kolumna PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) w porównaniu z kolumną Ascentis Express RP-Amide opiera się na ulepszeniach kształtu i wielkości cząstek oraz złożonych procedurach upakowania kolumn stosowanych w bieżącej pracy34.
(A) Wykres van Deemtera (HETP w funkcji prędkości liniowej fazy ruchomej) uzyskany przy użyciu kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA. FA.
Przygotowano i oceniono fazę stacjonarną z polistyrenu zatopionego w polarze do rozdzielania mieszanin syntetycznych peptydów i produktów trawienia trypsyną ludzkiej albuminy surowicy (HAS) w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Wydajność chromatograficzna kolumn PMP dla mieszanin peptydów jest doskonała pod względem wydajności rozdzielania i rozdzielczości. Poprawiona wydajność rozdzielania kolumn PMP wynika z różnych powodów, takich jak wielkość cząstek i wielkość porów cząstek krzemionki, kontrolowana synteza fazy stacjonarnej i złożone wypełnienie kolumny. Oprócz wysokiej wydajności separacji, niska kolumna Kolejną zaletą tej fazy stacjonarnej jest przeciwciśnienie przy dużych prędkościach przepływu. Kolumny PMP wykazują dobrą powtarzalność i mogą być stosowane do analizy mieszanin peptydów i trawienia trypsyną różnych białek. Kolumnę tę zamierzamy wykorzystać do separacji produktów naturalnych, związków bioaktywnych z roślin leczniczych i ekstraktów grzybów w chromatografii cieczowej. W przyszłości kolumny PMP będą oceniane również pod kątem separacji białek i przeciwciał monoklonalnych.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Badania systemów rozdzielania peptydów metodą chromatografii z odwróconymi fazami Część I: Opracowanie protokołu charakteryzacji kolumn.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Improved active peptydsdesigned for the treatment of diseasein disease.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek.odkrywanie leków.15 (1-2) dzisiaj, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa.J.Chromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i in. Zaawansowana chromatografia cieczowa-spektrometria mas umożliwia włączenie szeroko ukierunkowanej metabolomiki i proteomiki.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w opracowywaniu leków. J.Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej do szybkich separacji.J.Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Zastosowanie ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej w opracowywaniu leków.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i wsp. Monolityczne makroporowate hydrożele przygotowane z emulsji o wysokiej fazie wewnętrznej typu olej w wodzie do wydajnego oczyszczania enterowirusów. Chemiczny. Wielka Brytania. J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Pojawiające się trendy w rozdziałach terapeutycznych peptydów i białek metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami: teoria i zastosowania.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dwuwymiarowe rozdzielanie peptydów przy użyciu systemu RP-RP-HPLC przy użyciu różnych wartości pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdzielania.J.Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. i in. Zbadano charakterystykę przenoszenia masy i wydajność kinetyczną wysokosprawnych kolumn chromatograficznych wypełnionych cząstkami C18 poniżej 2 μm w pełni i powierzchownie porowatymi.J.Wrzesień Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Najnowsze trendy i wyzwania analityczne w izolacji, identyfikacji i walidacji bioaktywnych peptydów roślinnych.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB i in. Proteomiczny krajobraz królestwa życia. Natura 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. i wsp. Obróbka peptydów terapeutycznych metodą preparatywnej chromatografii cieczowej. Molecule (Bazylea, Szwajcaria) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie do biopolimerów.J.Chromatografia.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligandy do chromatografii białek w trybie mieszanym: zasada, charakterystyka i projekt.J.Biotechnologia.144(1), 3-11 (2009).