Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić stałe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla karuzelę trzech slajdów na raz. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przejść przez trzy slajdy na raz, lub użyj przycisków suwaka na końcu, aby przejść przez trzy slajdy na raz.
Porowate cząstki krzemionki przygotowano metodą sol-żel z pewnymi modyfikacjami w celu uzyskania cząstek o szerokich porach. Cząstki te poddano derywatyzacji za pomocą izocyjanianu N-fenylomaleimidu-metylowinylu (PMI) i styrenu poprzez polimeryzację z odwrotnym przeniesieniem łańcucha-fragmentacją (RAFT) w celu wytworzenia interkalowanych poliamidów N-fenylomaleimidu. Faza stacjonarna styrenu (PMP). Wąskie kolumny ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) wypełniono wypełnieniem zawiesinowym. Wydajność chromatograficzna kolumny PMP została oceniona w celu oddzielenia mieszaniny syntetycznych peptydów składających się z pięciu peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokwas enkefalina) i tryptycznego hydrolizatu ludzkiej albuminy surowicy (HAS). W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba płytek z mieszaniną peptydów osiągnęła 280 000 płytek/m2. Porównując wydajność separacji opracowanej kolumny z komercyjną kolumną Ascentis Express RP-Amide, zaobserwowano, że wydajność separacji kolumny PMP była lepsza od kolumny komercyjnej pod względem wydajności separacji i rozdzielczości.
Przemysł biofarmaceutyczny stał się rozwijającym się rynkiem globalnym, który w ostatnich latach odnotował znaczny wzrost udziału w rynku. Wraz z eksplozywnym wzrostem przemysłu biofarmaceutycznego1,2,3 istnieje duże zapotrzebowanie na analizę peptydów i białek. Oprócz docelowego peptydu, podczas syntezy peptydu powstają różne zanieczyszczenia, dlatego w celu uzyskania pożądanej czystości peptydu wymagane jest oczyszczanie chromatograficzne. Analiza i charakterystyka białek w płynach ustrojowych, tkankach i komórkach jest niezwykle trudnym zadaniem ze względu na dużą liczbę potencjalnie wykrywalnych gatunków obecnych w pojedynczej próbce. Chociaż spektrometria masowa jest skutecznym narzędziem do sekwencjonowania peptydów i białek, jeśli takie próbki zostaną bezpośrednio wprowadzone do spektrometru masowego, separacja będzie niezadowalająca. Problem ten można rozwiązać, wykonując chromatografię cieczową (LC) przed analizą MS, co zmniejszy ilość analitów wprowadzanych do spektrometru masowego w danym momencie4,5,6. Ponadto anality mogą koncentrować się w wąskim obszarze podczas rozdzielania fazy ciekłej, co powoduje koncentrację tych anality i zwiększa czułość wykrywania MS. Chromatografia cieczowa (LC) znacznie rozwinęła się w ciągu ostatniej dekady i stała się szeroko stosowaną metodą analizy proteomicznej7,8,9,10.
Chromatografia cieczowa w fazie odwróconej (RP-LC) jest szeroko stosowana do oczyszczania i rozdzielania mieszanin peptydów przy użyciu oktadecylo-modyfikowanej krzemionki (ODS) jako fazy stacjonarnej11,12,13. Jednak ze względu na złożoną strukturę i amfoteryczną naturę14,15 fazy stacjonarne RP nie mogą zapewnić zadowalającego rozdzielenia peptydów i białek. Dlatego analiza peptydów i białek z fragmentami polarnymi i niepolarnymi wymaga specjalnie zaprojektowanych faz stacjonarnych w celu interakcji i zatrzymania tych analitów16. Chromatografia mieszana, która oferuje interakcje multimodalne, może być alternatywą dla RP-LC w przypadku rozdzielania peptydów, białek i innych złożonych mieszanin. Przygotowano kilka faz stacjonarnych typu mieszanego, a kolumny wypełnione tymi fazami stacjonarnymi wykorzystano do rozdzielenia peptydów i białek17,18,19,20,21. Ze względu na obecność grup polarnych i niepolarnych, fazy stacjonarne o mieszanym trybie (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacja/RPLC) nadają się do rozdzielania peptydów i białek22,23,24,25,26,27,28. , polarne interkalowane fazy stacjonarne z kowalencyjnie związanymi grupami polarnymi wykazują dobre zdolności rozdzielcze i wyjątkową selektywność dla analitów polarnych i niepolarnych, ponieważ rozdzielenie zależy od interakcji między analitem a fazą stacjonarną. Oddziaływania multimodalne29,30,31,32. Niedawno Zhang i in.30 uzyskali behenylowo-zakończone fazy stacjonarne poliamin i pomyślnie oddzielili węglowodory, leki przeciwdepresyjne, flawonoidy, nukleozydy, estrogeny i niektóre inne anality. Polarny osadzony materiał stacjonarny ma zarówno grupy polarne, jak i niepolarne, więc może być stosowany do rozdzielania peptydów i białek na części hydrofobowe i hydrofilowe. Kolumny polarne inline (np. kolumny C18 z inline amidowym) są dostępne pod nazwą handlową Ascentis Express RP-Amide columns, ale kolumny te były używane wyłącznie do analizy aminy 33.
W niniejszym badaniu przygotowano i oceniono polarną fazę stacjonarną (N-fenylomaleimid, polistyren) pod kątem separacji peptydów i rozszczepienia tryptycznego HSA. Do przygotowania fazy stacjonarnej zastosowano następującą strategię. Porowate cząstki krzemionki przygotowano zgodnie z procedurami opisanymi w naszych poprzednich publikacjach, z pewnymi zmianami w schematach przygotowania 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Proporcje mocznika, glikolu polietylenowego (PEG), TMOS i wodnego kwasu octowego dostosowano w celu uzyskania cząstek krzemionki o dużych rozmiarach porów. Po drugie, zsyntetyzowano nowy ligand fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian, a jego pochodne cząstki krzemionki wykorzystano do przygotowania polarnych osadzonych faz stacjonarnych. Otrzymaną fazę stacjonarną umieszczono w kolumnie ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) zgodnie ze zoptymalizowanym schematem pakowania. Wypełnienie kolumny wspomagane jest przez wibracje mechaniczne, aby zapewnić równomierną warstwę w kolumnie. Wypełnioną kolumnę oceniano pod kątem rozdzielania mieszaniny peptydów składającej się z pięciu peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptyd leucyna-enkefalina). i tryptycznych hydrolizatów ludzkiej albuminy surowicy (HSA). Zaobserwowano, że mieszanina peptydów i tryptyczny digest HSA rozdzieliły się z dobrą rozdzielczością i wydajnością. Wydajność rozdzielania kolumny PMP porównano z wydajnością kolumny Ascentis Express RP-Amide. Zaobserwowano, że peptydy i białka mają dobrą rozdzielczość i wysoką wydajność rozdzielania na kolumnie PMP, a wydajność rozdzielania kolumny PMP jest wyższa niż kolumny Ascentis Express RP-Amide.
PEG (glikol polietylenowy), mocznik, kwas octowy, trimetoksyortokrzemian (TMOS), trimetylochlorosilan (TMCS), trypsyna, albumina surowicy ludzkiej (HSA), chlorek amonu, mocznik, heksametylometakryloyldisilazan (HMDS), chlorek metakryloilu (MC), styren, 4-hydroksy-TEMPO, nadtlenek benzoilu (BPO), acetonitryl (ACN) do HPLC, metanol, 2-propanol i aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Mieszaninę mocznika (8 g), glikolu polietylenowego (8 g) i 8 ml 0,01 N kwasu octowego mieszano przez 10 minut, a następnie dodano do niej 24 ml TMOS podczas chłodzenia lodem. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C przez 6 godzin, a następnie w temperaturze 120°C przez 8 godzin w autoklawie ze stali nierdzewnej. Wodę zdekantowano, a pozostałość suszono w temperaturze 70°C przez 12 godzin. Wysuszone miękkie bloki zmielono na gładko i kalcynowano w piecu w temperaturze 550°C przez 12 godzin. Przygotowano i scharakteryzowano trzy partie w celu przetestowania powtarzalności rozmiarów cząstek, wielkości porów i powierzchni.
Grupa polarna i faza stacjonarna dla łańcuchów polistyrenowych. Poniżej opisano procedurę przygotowania.
N-fenylomaleimid (200 mg) i izocyjanian metylowinylu (100 mg) rozpuszczono w bezwodnym toluenie, a następnie do kolby reakcyjnej dodano 0,1 ml 2,2′-azoizobutyronitrylu (AIBN), aby uzyskać kopolimer fenylomaleimidu i izocyjanianu metylowinylu (PMCP). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60°C przez 3 godziny, przefiltrowano i wysuszono w piecu w temperaturze 40°C przez 3 godziny.
Wysuszone cząstki krzemionki (2 g) rozproszono w suchym toluenie (100 ml), mieszano i poddawano działaniu ultradźwięków przez 10 min w 500 ml okrągłodennej kolbie. PMCP (10 mg) rozpuszczono w toluenie i dodawano kroplami do kolby reakcyjnej za pomocą lejka dozującego. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w 100°C przez 8 godzin, przefiltrowano, przemyto acetonem i suszono w temperaturze 60°C przez 3 godziny. Następnie cząstki krzemionki związane z PMCP (100 g) rozpuszczono w toluenie (200 ml) i dodano do nich 4-hydroksy-TEMPO (2 ml) w obecności 100 μl dilaurynianu dibutylocyny jako katalizatora. Mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 8 godzin, filtrowano i suszono w temperaturze 50°C przez 3 godziny.
Styren (1 ml), nadtlenek benzoilu BPO (0,5 ml) i cząsteczki krzemionki przyłączone do TEMPO-PMCP (1,5 g) rozproszono w toluenie i przedmuchano azotem. Polimeryzację styrenu prowadzono w temperaturze 100°C przez 12 godzin. Otrzymany produkt przemyto metanolem i wysuszono przez noc w temperaturze 60°C. Ogólny schemat reakcji pokazano na rys. 1.
Próbki odgazowywano w temperaturze 393 K przez 1 h, aż do uzyskania ciśnienia resztkowego mniejszego niż 10–3 Torr. Ilość N2 zaadsorbowanego przy ciśnieniu względnym P/P0 = 0,99 została użyta do określenia całkowitej objętości porów. Morfologię czystych i związanych z ligandem cząstek krzemionki zbadano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonia). Suche próbki (czysta krzemionka i cząstki krzemionki związane z ligandem) umieszczono na prętach aluminiowych za pomocą taśmy węglowej. Złoto osadzano na próbce za pomocą urządzenia rozpylającego Q150T, a na próbce osadzono warstwę Au o grubości 5 nm. Poprawia to wydajność procesu niskonapięciowego i zapewnia drobne natryskiwanie na zimno. Analizę pierwiastkową wykonano za pomocą analizatora składu pierwiastkowego Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Do uzyskania rozkładu wielkości cząstek użyto analizatora wielkości cząstek Malvern (Worcestershire, Wielka Brytania) Mastersizer 2000. Niepowlekane cząstki krzemionki i cząstki krzemionki związane z ligandem (po 5 mg) rozproszono w 5 ml izopropanolu, poddano działaniu ultradźwięków przez 10 minut, mieszano przez 5 minut i umieszczono na stole optycznym Mastersizer. Analiza termograwimetryczna jest przeprowadzana z szybkością 5 °C na minutę w zakresie temperatur od 30 do 800 °C.
Kolumny ze stali nierdzewnej o wąskim otworze wyłożone włóknem szklanym o wymiarach (ID 100 × 1,8 mm) wypełniono metodą wypełniania zawiesiną, stosując tę ​​samą procedurę, co w odniesieniu 31. Kolumna ze stali nierdzewnej (wyłożona szkłem, ID 100 × 1,8 mm) i wylot zawierający 1 µm frytę podłączono do maszyny pakującej zawiesinę (Alltech Deerfield, IL, USA). Przygotuj zawiesinę fazy stacjonarnej, zawieszając 150 mg fazy stacjonarnej w 1,2 ml metanolu i wprowadzając ją do kolumny zbiornikowej. Metanol zastosowano jako rozpuszczalnik zawiesiny i rozpuszczalnik kontrolny. Wypełnij kolumnę, stosując sekwencję ciśnień 100 MP przez 10 min, 80 MP przez 15 min i 60 MP przez 30 min. W procesie pakowania wykorzystano dwa wibratory kolumn chromatografii gazowej (Alltech, Deerfield, IL, USA) do wibracji mechanicznej, aby zapewnić równomierne wypełnienie kolumny. Zamknij paker szlamowy i powoli uwolnij ciśnienie, aby zapobiec uszkodzeniu sznura. Kolumna została odłączona od dyszy szlamowej, a do wlotu podłączono inną złączkę i podłączono ją do systemu LC, aby przetestować jego działanie.
Niestandardową kolumnę MLC skonstruowano przy użyciu pompy LC (10AD Shimadzu, Japonia), próbnika z pętlą wtryskową 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), odgazowywacza membranowego (Shimadzu DGU-14A) i okienka kapilarnego UV-VIS. Urządzenie detektorowe (UV-2075) i emaliowana mikrokolumna. Użyj bardzo wąskich i krótkich rurek łączących, aby zminimalizować efekt dodatkowej ekspansji kolumny. Po napełnieniu kolumny zainstaluj kapilarę (50 µm, id 365) na wylocie złącza redukcyjnego 1/16″ i zainstaluj kapilarę (50 µm) złącza redukcyjnego. Zbieranie danych i przetwarzanie chromatogramu odbywa się przy użyciu oprogramowania Multichro 2000. Przy 254 nm absorbancję UV badanych analitów monitorowano przy 0. Dane chromatograficzne analizowano przy użyciu OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina surowicy ludzkiej, liofilizowany proszek, ≥ 96% (elektroforeza w żelu agarozowym) 3 mg zmieszane z trypsyną (1,5 mg), 4,0 M mocznikiem (1 ml) i 0,2 M wodorowęglanem amonu (1 ml). Roztwór mieszano przez 10 min i trzymano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 6 h, a następnie zgaszono 1 ml 0,1% TFA. Przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze poniżej 4°C.
Oddzielanie mieszaniny peptydów i trawionego trypsyną HSA na kolumnie PMP oceniano oddzielnie. Sprawdź hydrolizę trypsyną mieszaniny peptydów i HSA rozdzielonych na kolumnie PMP i porównaj wyniki z kolumną Ascentis Express RP-Amide. Liczbę półek teoretycznych oblicza się, korzystając z następującego równania:
Obrazy SEM czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na rysunku 2. Obrazy SEM czystych cząstek krzemionki (A, B) pokazują kulisty kształt, w którym cząstki są wydłużone lub mają nieregularną symetrię w porównaniu z naszymi poprzednimi badaniami. Powierzchnia cząstek krzemionki związanych z ligandem (C, D) jest gładsza niż powierzchnia czystych cząstek krzemionki, co może być spowodowane łańcuchami polistyrenu pokrywającymi powierzchnię cząstek krzemionki.
Mikrofotografie skaningowe elektronowe czystych cząstek krzemionki (A, B) i cząstek krzemionki związanych z ligandem (C, D).
Rozkład wielkości cząstek czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na rys. 2. 3(A). Krzywe rozkładu wielkości cząstek objętościowych wykazały, że wielkość cząstek krzemionki wzrosła po modyfikacji chemicznej (rys. 3A). Dane dotyczące rozkładu wielkości cząstek krzemionki z bieżącego badania i poprzedniego badania porównano w tabeli 1(A). Objętościowy rozmiar cząstek d(0,5) PMP wynosił 3,36 µm, w porównaniu do wartości d(0,5) wynoszącej 3,05 µm w naszym poprzednim badaniu (cząstki krzemionki związane z polistyrenem)34. Ze względu na zmianę stosunku PEG, mocznika, TMOS i kwasu octowego w mieszaninie reakcyjnej, rozkład wielkości cząstek tej partii był węższy w porównaniu z naszym poprzednim badaniem. Rozmiar cząstek fazy PMP jest nieznacznie większy niż w przypadku fazy cząstek krzemionki związanej z polistyrenem, którą badaliśmy wcześniej. Oznacza to, że funkcjonalizacja powierzchni cząstek krzemionki styrenem spowodowała osadzenie się na powierzchni krzemionki tylko warstwy polistyrenu (0,97 µm), podczas gdy w fazie PMP grubość warstwy wynosiła 1,38 µm.
Rozkład wielkości cząstek (A) i rozkład wielkości porów (B) czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem.
Wielkość porów, objętość porów i powierzchnia cząstek krzemionki użytych w tym badaniu przedstawiono w Tabeli 1 (B). Profile PSD czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem przedstawiono na Rys. 3(B). Wyniki były porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami34. Rozmiary porów czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem wynosiły odpowiednio 310 Å i 241 Å, co wskazuje, że po modyfikacji chemicznej rozmiar porów zmniejszył się o 69 Å, jak pokazano w Tabeli 1 (B), a krzywa przesunięcia jest pokazana na Rys. Powierzchnia właściwa cząstek krzemionki w bieżącym badaniu wynosi 116 m2/g, co jest porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami (124 m2/g). Jak pokazano w Tabeli 1(B), powierzchnia (m2/g) cząstek krzemionki po modyfikacji chemicznej również zmniejszyła się ze 116 m2/g do 105 m2/g.
Wyniki analizy pierwiastkowej fazy stacjonarnej przedstawiono w tabeli 2. Zawartość węgla w obecnej fazie stacjonarnej wynosi 6,35%, co jest wartością niższą niż w naszych poprzednich badaniach (cząstki krzemionki związane z polistyrenem, odpowiednio 7,93%35 i 10,21%) 42. Zawartość węgla w obecnej fazie stacjonarnej poniżej, ponieważ niektóre polarne ligandy, takie jak izocyjanian metylowinylu fenylomaleimid (PCMP) i 4-hydroksy-TEMPO, zostały użyte oprócz styrenu w przygotowaniu SP. Procentowa zawartość azotu w obecnej fazie stacjonarnej wynosi 2,21% w porównaniu do 0,1735 i 0,85% w poprzednich badaniach42. Oznacza to, że obecna faza stacjonarna ma wysoki procentowy udział azotu ze względu na fenylomaleimid. Podobnie produkty (4) i (5) mają zawartość węgla wynoszącą odpowiednio 2,7% i 2,9%, podczas gdy produkt końcowy (6) ma zawartość węgla wynoszącą 6,35%, jak pokazano w tabeli 2. Analiza termograwimetryczna (TGA) została użyta do przetestowania utraty masy w fazie stacjonarnej PMP, a krzywa TGA jest pokazana na rysunku 4. Krzywa TGA pokazuje utratę masy wynoszącą 8,6%, co dobrze zgadza się z zawartością węgla (6,35%), ponieważ ligandy zawierają nie tylko C, ale także N, O i H.
Ligand fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian został wybrany do modyfikacji powierzchni cząstek krzemionki ze względu na jego polarne grupy fenylomaleimidowe i winyloizocyjanianowe. Grupy winyloizocyjanianowe mogą dalej reagować ze styrenem poprzez polimeryzację rodnikową. Drugim powodem jest wstawienie grupy, która ma umiarkowane oddziaływania z analitem i nie ma silnych oddziaływań elektrostatycznych między analitem a fazą stacjonarną, ponieważ fragment fenylomaleimidowy nie ma ładunku wirtualnego przy normalnym pH. Polarność fazy stacjonarnej można kontrolować za pomocą optymalnej ilości styrenu i czasu reakcji polimeryzacji rodnikowej. Ostatni etap reakcji (polimeryzacja rodnikowa) jest krytyczny, ponieważ zmienia polarność fazy stacjonarnej. Przeprowadzono analizę elementarną w celu sprawdzenia zawartości węgla w tych fazach stacjonarnych. Zaobserwowano, że zwiększenie ilości styrenu i czasu reakcji zwiększa zawartość węgla w fazie stacjonarnej i odwrotnie. SP przygotowane z różnymi stężeniami styrenu mają różne ładunki węglowe. Podobnie, te fazy stacjonarne umieszczono na kolumnach ze stali nierdzewnej i sprawdzono ich charakterystykę chromatograficzną (selektywność, rozdzielczość, wartość N itp.). Na podstawie tych eksperymentów wybrano zoptymalizowany skład do przygotowania fazy stacjonarnej PMP, aby zapewnić kontrolowaną polarność i dobrą retencję analitu.
Kolumnę PMP oceniono również pod kątem analizy pięciu mieszanin peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucyna-enkefalina) przy użyciu pojemności fazy ruchomej. 60/40 (v/v) ACN/woda (0,1% TFA) przy szybkości przepływu 80 µl/min. W optymalnych warunkach elucji (200 000 płytek/m) liczba teoretycznych płytek (N) na kolumnę (100 × 1,8 mm) wynosi 20 000 ± 100. Wartości N dla trzech kolumn PMP przedstawiono w tabeli 3, a chromatogramy przedstawiono na rysunku 5A. Szybka analiza przy dużej szybkości przepływu (700 µl/min) na kolumnie PMP, pięć peptydów eluowanych w ciągu jednej minuty, doskonała wartość N 13 500 ± 330 na kolumnę (100 x 1,8 mm średnicy), co odpowiada 135 000 płytek/m (rys. 5B). Trzy kolumny o tym samym rozmiarze (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) wypełniono trzema różnymi partiami fazy stacjonarnej PMP w celu przetestowania powtarzalności. Anality rejestrowano dla każdej kolumny poprzez rozdzielenie tej samej mieszaniny testowej na każdej kolumnie przy użyciu optymalnych warunków elucji, liczby teoretycznych płytek N i czasu retencji. Dane dotyczące powtarzalności dla kolumn PMP przedstawiono w tabeli 4. Powtarzalność kolumny PMP dobrze korelowała z bardzo niskimi wartościami %RSD, jak pokazano w tabeli 3.
Rozdział mieszanin peptydów na kolumnie PMP (B) i kolumnie Ascentis Express RP-Amide (A), faza ruchoma 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), wymiary kolumny PMP (100 x 1,8 mm), analiza Kolejność elucji związków: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (kwas leukowy enkefalina).
Kolumnę PMP (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) oceniono pod kątem rozdzielenia hydrolizatu tryptycznego albuminy surowicy ludzkiej metodą HPLC. Chromatogram na rysunku 6 pokazuje, że próbki są dobrze rozdzielone z bardzo dobrą rozdzielczością. Roztwory HSA analizowano przy przepływie 100 μl/min, fazie ruchomej 70/30 acetonitryl/woda i 0,1% TFA. Rozpad HSA podzielono na 17 pików, jak pokazano na chromatogramie (rys. 6), odpowiadających 17 peptydom. Obliczono wydajności rozdzielenia poszczególnych pików z hydrolizatu HSA, a wartości przedstawiono w tabeli 5.
Hydrolizaty tryptyczne HSA rozdzielono na kolumnie PMP (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm), szybkość przepływu 100 μl/min, faza ruchoma 60/40 acetonitryl/woda i 0,1% TFA.
gdzie L jest długością kolumny, η jest lepkością fazy ruchomej, ΔP jest ciśnieniem wstecznym kolumny, a u jest prędkością liniową fazy ruchomej. Przepuszczalność kolumny PMP wynosiła 2,5 × 10–14 m2, natężenie przepływu wynosiło 25 µl/min, użyto 60/40 v/v. ACN/woda. Przepuszczalność kolumny PMP (ID 100 × 1,8 mm) była podobna do przepuszczalności naszych poprzednich badań Ref.34. Przepuszczalność kolumny wypełnionej cząstkami porowatymi powierzchniowo wynosi 1,7×10 .6 µm, 2,5×10-14 m2 dla cząstek 5 µm43. Dlatego przepuszczalność fazy PMP jest podobna do przepuszczalności cząstek rdzeń-powłoka o rozmiarze 5 µm.
gdzie Wx jest masą kolumny wypełnionej chloroformem, Wy jest masą kolumny wypełnionej metanolem, a ρ jest gęstością rozpuszczalnika. Gęstość metanolu (ρ = 0,7866) i chloroformu (ρ = 1,484). Całkowita porowatość kolumny z cząstkami krzemionki-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 i naszej wcześniej badanej kolumny C18-mocznik31 wynosiła odpowiednio 0,63 i 0,55. Oznacza to, że obecność ligandów mocznika zmniejsza przepuszczalność fazy stacjonarnej. Z drugiej strony całkowita porowatość kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) wynosi 0,60. Kolumny PMP są mniej przepuszczalne niż kolumny wypełnione cząsteczkami krzemionki związanymi C18, ponieważ w fazach stacjonarnych typu C18 ligandy C18 są przyłączone do cząsteczek krzemionki w łańcuchach liniowych, podczas gdy w fazach stacjonarnych typu polistyrenowego wokół cząsteczek tworzy się stosunkowo gruby polimer. warstwa A. W typowym eksperymencie porowatość kolumny oblicza się w następujący sposób:
Na rys. 7A i B przedstawiono wykresy Van Deemtera dla kolumny PMP (śr. wewn. 100 x 1,8 mm) i kolumny Ascentis Express RP-Amide (śr. wewn. 100 x 1,8 mm) w tych samych warunkach elucji, 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA 20 µl/min do 800 µl/min na obu kolumnach. Minimalne wartości HETP przy optymalnej szybkości przepływu (80 µl/min) wynosiły odpowiednio 2,6 µm i 3,9 µm dla kolumny PMP i kolumny Ascentis Express RP-Amide. Wartości HETP pokazują, że wydajność separacji kolumny PMP (śr. wewn. 100 x 1,8 mm) jest znacznie wyższa niż w przypadku dostępnej w handlu kolumny Ascentis Express RP-Amide (śr. wewn. 100 x 1,8 mm). Wykres van Deemtera na rys. 7(A) pokazuje, że spadek wartości N nie jest znacząco wyższy wraz ze wzrostem przepływu w porównaniu z naszymi poprzednimi badaniami. Wyższa wydajność separacji kolumny PMP (id 100 × 1,8 mm) w porównaniu z kolumną Ascentis Express RP-Amide opiera się na ulepszonym kształcie i rozmiarze cząstek oraz zaawansowanej procedurze pakowania kolumny stosowanej w obecnej pracy34.
(A) Wykres Van Deemtera (HETP w porównaniu z prędkością liniową fazy ruchomej) uzyskany na kolumnie PMP (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA. (B) Wykres Van Deemtera (HETP w porównaniu z prędkością liniową fazy ruchomej) uzyskany na kolumnie Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA.
Przygotowano polarną fazę stacjonarną interkalowanego polistyrenu i oceniono ją pod kątem rozdzielania mieszaniny syntetycznych peptydów i tryptycznego hydrolizatu ludzkiej albuminy surowicy (HSA) w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Wydajność chromatograficzna kolumn PMP dla mieszanin peptydów jest doskonała pod względem wydajności rozdziału i rozdzielczości. Poprawiona wydajność rozdziału kolumn PMP wynika z kilku powodów, takich jak wielkość cząstek krzemionki i wielkość porów, kontrolowana synteza faz stacjonarnych i złożone materiały wypełniające kolumny. Oprócz wysokiej wydajności rozdziału, inną zaletą tej fazy stacjonarnej jest niskie ciśnienie wsteczne kolumny przy wysokich natężeniach przepływu. Kolumny PMP są wysoce powtarzalne i mogą być używane do analizy mieszanin peptydów i trawienia tryptycznego różnych białek. Zamierzamy używać tej kolumny do rozdzielania związków bioaktywnych z produktów naturalnych, ekstraktów roślin leczniczych i grzybów w chromatografii cieczowej. W przyszłości kolumny PMP będą również oceniane pod kątem rozdzielania białek i przeciwciał monoklonalnych.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych. Część I: Opracowanie protokołu do charakteryzacji kolumn. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych. Część I: Opracowanie protokołu do charakteryzacji kolumn.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Badanie układów rozdziału peptydów metodą chromatografii w odwróconym układzie faz, część I: Opracowanie protokołu charakterystyki kolumnowej. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych, część I: Opracowanie protokołu dotyczącego charakterystyki kolumn. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych, część I: Opracowanie protokołu dotyczącego charakterystyki kolumn.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Badanie układów rozdziału peptydów metodą chromatografii w odwróconym układzie faz, część I: Opracowanie protokołu charakterystyki kolumnowej.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. i in. Metody tworzenia ulepszonych aktywnych peptydów do leczenia chorób zakaźnych. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. i Khrestchatisky, M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. i Khrestchatisky, M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Chreschatyski M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Khreschatsky M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek. odkrywanie leków. Dzisiaj 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa.Zobacz F., Smith RD i Shen Yu. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana kompozycja białek.Zobacz F., Smith RD i Shen Yu. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa.J. Chromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i in. Zaawansowana chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas jest w stanie połączyć szeroko zakrojoną metabolomikę i proteomikę. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju farmaceutycznym. Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju farmaceutycznym.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju farmaceutycznym.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju leków. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej ultrawysokociśnieniowej do szybkich rozdziałów. Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej ultrawysokociśnieniowej do szybkich rozdziałów.Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej do szybkiej separacji. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. & Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej ultrawysokociśnieniowej do szybkiej separacji.Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej do szybkiej separacji.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej o ultrawydajności w rozwoju farmaceutyków. Wren, SA i Tchelitcheff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej o ultrawydajności w rozwoju farmaceutyków.Ren, SA i Chelischeff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej ultrawysokowydajnej w rozwoju farmaceutycznym. Wren, SA i Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA i Tchelitcheff, P.Ren, SA i Chelischeff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej o ultrawydajności w rozwoju leków.J. Chromatografia. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i in. Monolityczny makroporowaty hydrożel uzyskany z emulsji olej w wodzie z wysoką fazą wewnętrzną do wydajnego oczyszczania enterowirusa 71. Projekt Chemical. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice.J. Chromatografia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu terapeutycznych peptydów i białek metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania. & Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu terapeutycznych peptydów i białek metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и lojalność. & Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu peptydów i białek terapeutycznych metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势:理论和应用. & Guillarme, D.i Guillarmé, D. Nowe trendy w rozdzielaniu peptydów i białek terapeutycznych metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania.J. Pharm. Biomedical Science. odbyt. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dwuwymiarowy rozdział peptydów z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC przy różnym pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdziału. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dwuwymiarowy rozdział peptydów z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC przy różnym pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdziału.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dwuwymiarowy rozdział peptydów z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC przy różnym pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdziału.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dwuwymiarowa separacja peptydów przy zastosowaniu różnych wartości pH w pierwszym i drugim wymiarze separacji z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. i in. Badanie przenoszenia masy i charakterystyk kinetycznych kolumn chromatograficznych wysokosprawnych wypełnionych całkowicie porowatymi i powierzchniowo porowatymi cząstkami C18 o wielkości mniejszej niż 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. i in. Najnowsze trendy i wyzwania analityczne w zakresie izolacji, identyfikacji i walidacji roślinnych peptydów bioaktywnych. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB i in. Proteomiczny krajobraz królestwa życia. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. i in. Post-treatment of therapeutic peptides by preparative liquid chromatography. Molecules (Basel, Szwajcaria) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia mieszana i jej zastosowanie w biopolimerach. Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia mieszana i jej zastosowanie w biopolimerach.Yang, Yu. i Geng, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie do biopolimerów. Yang, Y. i Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie w biopolimerach.Yang, Yu. i Gene, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie do biopolimerów.J. Chromatografia. A 1218(49), 8813–8825 (2011).