Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Łubin angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) to roślina strączkowa wykorzystywana do produkcji żywności i poprawy jakości gleby. Globalna ekspansja NLL jako uprawy przyciągnęła wiele grzybów patogennych, w tym antraknozę łubinu, która powoduje wyniszczającą chorobę antraknozową. Dwa allele, Lanr1 i AnMan, które nadają zwiększoną odporność, zostały wykorzystane w hodowli NLL, ale leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W tym badaniu markery Lanr1 i AnMan zostały wykorzystane do przesiewania europejskich próbek NLL. Testowanie szczepionki w kontrolowanym środowisku potwierdziło skuteczność obu dawców opornych. Przeprowadzono różnicowe profilowanie ekspresji genów na reprezentatywnych liniach odpornych i podatnych. Odporność na antraknozę była związana z nadmierną ekspresją terminów ontologii genu „GO:0006952 Defense Response”, „GO:0055114 Redox Process” i „GO:0015979 Photosynthesis”. Ponadto linia Lanr1(83A:476) wykazała znaczną reprogramację transkryptomu szybko po zaszczepieniu, podczas gdy inne linie wykazały opóźnienie tej odpowiedzi o około 42 godziny. Odpowiedzi obronne są związane z genami TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 białkami zaangażowanymi w patogenezę, białkami transportującymi lipidy, endoglukan-1,3-β-glukozydazą, bogatymi w glicynę białkami ściany komórkowej i genami z reaktywnej ścieżki tlenu. Wczesne odpowiedzi na 83A:476, w tym ostrożne tłumienie genów związanych z fotosyntezą, zbiegły się z skuteczną ochroną podczas fazy wzrostu wegetatywnego biologii grzybów, co sugeruje, że efektor wyzwala odporność. Reakcja Mandeloopa jest spowolniona, podobnie jak ogólny opór poziomy.
Łubin wąskolistny (NLL, Lupinus angustifolius L.) to zboże o wysokiej zawartości białka pochodzące z zachodniego regionu Morza Śródziemnego1,2. Obecnie uprawia się go jako żywność dla zwierząt i ludzi. Jest również uważany za zielony nawóz w systemach płodozmianu ze względu na wiązanie azotu przez symbiotyczne bakterie wiążące azot i ogólną poprawę struktury gleby. NLL przeszedł szybki proces udomowienia w ostatnim stuleciu i nadal znajduje się pod dużą presją hodowlaną3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Wraz z powszechną uprawą NLL, sukcesja grzybów patogenicznych rozwinęła nowe nisze rolnicze i spowodowała nowe choroby niszczące uprawy. Najbardziej godnym uwagi wydarzeniem dla hodowców i plantatorów łubinu było pojawienie się antraknozy, wywołanej przez patogenny grzyb Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najbardziej godnym uwagi wydarzeniem dla hodowców i plantatorów łubinu było pojawienie się antraknozy, wywołanej przez patogenny grzyb Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Złodziej 13. Najbardziej zauważalnym problemem dla hodowców i plantatorów łubinu było pojawienie się antraknozy wywołanej przez patogeniczny grzyb Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说,最引人注目的是炭疽病的出现,它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler i Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说,最引人注目的是炭疽病的出现,它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) 嵵Haired。 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler i Hagedorn13. Najbardziej uderzającym problemem dla hodowców i plantatorów łubinu jest pojawienie się antraknozy wywołanej przez patogenny grzyb Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Najwcześniejsze doniesienia o chorobie pochodziły z Brazylii i Stanów Zjednoczonych, a typowe objawy pojawiły się odpowiednio w 1912 i 1929 roku. Jednak po około 30 latach patogen oznaczono jako Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., telелеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld w Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld w Morfologii ukierunkowanej. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .i H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。i H. Schlenk, .Wstępne fenotypowanie chorób przeprowadzone w połowie XX wieku wykazało pewną odporność u odmian NLL i łubinu żółtego (L. luteus L.), ale wszystkie testowane odmiany łubinu białego (L. albus L.) były bardzo podatne15,16. Badania wykazały, że rozwój antraknozy jest związany ze zwiększonymi opadami (wilgotnością powietrza) i temperaturą (w zakresie 12-28°C), co prowadzi do naruszenia odporności w wyższych temperaturach17, 18. W rzeczywistości czas potrzebny do wykiełkowania konidiów i rozpoczęcia choroby był czterokrotnie krótszy w temperaturze 24°C (4 godziny) niż w temperaturze 12°C (16 godzin) w warunkach wysokiej wilgotności19. Tak więc trwające globalne ocieplenie doprowadziło do rozprzestrzenienia się antraknozy. Jednakże chorobę zaobserwowano we Francji (1982) i na Ukrainie (1983) jako zwiastun zbliżającego się zagrożenia, ale najwyraźniej została zignorowana przez ówczesny przemysł łubinowy20,21. Kilka lat później ta wyniszczająca choroba rozprzestrzeniła się na cały świat i dotknęła również główne kraje produkujące łubin, takie jak Australia, Polska i Niemcy22,23,24. Po wybuchu antraknozy w połowie lat 90. XX wieku, obszerne badania przesiewowe doprowadziły do ​​zidentyfikowania kilku dawców opornych w próbkach NLL19. Odporność NLL na antraknozę jest kontrolowana przez dwa oddzielne dominujące allele znajdujące się w różnych źródłach plazmy zarodkowej: Lanr1 w odmianie Tanjil i Wonga oraz AnMan w odmianie. Mandalay 25, 26. Allele te uzupełniają markery molekularne, które wspierają selekcję plazmy zarodkowej odpornej w programach hodowlanych25,26,27,28,29,30. Odporna linia hodowlana 83A:476 niosąca allel Lanr1 została skrzyżowana z podatną dziką linią P27255 w celu uzyskania populacji RIL segregującej pod kątem odporności na antraknozę, co umożliwiło przypisanie locus Lanr1 do chromosomu NLL-1131, 32, 33. Dopasowanie markerów mapy sprzężeń od flankujących loci odporności na antraknozę do szkieletu genomowego, NLL ujawniło lokalizację wszystkich trzech alleli na tym samym chromosomie (NLL-11), ale w różnych pozycjach29,34,35. Jednak ze względu na niewielką liczbę RIL i dużą odległość genetyczną między markerami i odpowiadającymi im allelami nie można wyciągnąć wiarygodnych wniosków na temat ich genów bazowych. Z drugiej strony, stosowanie odwrotnej genetyki u łubinów jest trudne ze względu na ich bardzo niski potencjał regeneracji, co sprawia, że ​​manipulacja genetyczna jest uciążliwa37.
Rozwój udomowionej plazmy zarodkowej niosącej pożądany allel w stanie homozygotycznym, takiej jak 83A:476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), otworzył drzwi do badania odporności na antraknozę w obliczu obecności przeciwstawnych kombinacji alleli w dzikich populacjach. Możliwości mechanizmów molekularnych. Porównanie odpowiedzi obronnych generowanych przez określone genotypy. W tym badaniu oceniono wczesną odpowiedź transkryptomu NLL na szczepienie C. lupini. Najpierw przeszukano europejski panel plazmy zarodkowej NLL zawierający 215 linii przy użyciu markerów molekularnych, które oznaczają allele Lanr1 i AnMan. Następnie przeprowadzono fenotypowanie antraknozy na 50 liniach NLL, wcześniej wybranych pod kątem markerów molekularnych, w kontrolowanych warunkach. Na podstawie tych eksperymentów wybrano cztery linie różniące się odpornością na antraknozę i składem allelicznym Lanr1/AnMan do profilowania zróżnicowanej ekspresji genów obronnych przy użyciu dwóch uzupełniających się podejść: sekwencjonowania RNA o wysokiej przepustowości i ilościowego oznaczania metodą PCR w czasie rzeczywistym.
Przesiewanie zestawu plazmy zarodkowej NLL (N = 215) z markerami Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) oraz AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) wykazało, że tylko jedna linia (95726, w pobliżu Salamanca-b) amplifikuje allel „oporności” dla wszystkich markerów, podczas gdy „Obecność alleli „podatnych”” wykazała proporcję wszystkich markerów w 158 (~73,5%) liniach. Trzynaście linii wyprodukowało dwa allele „oporności” markera Lanr1, a 8 linii wyprodukowało allele „oporności” markera Lanr1. Allel „oporności” markera AnMan (Tabela uzupełniająca S1). Dwie linie były heterozygotyczne dla markera Anseq3, a jedna heterozygotyczna dla markera AnManM1. 42 linie (19,5%) miały przeciwne fazy alleli Anseq3 i Anseq4, co wskazuje na wysoką częstotliwość rekombinacji między tymi dwoma loci. Fenotypy antraknozy w kontrolowanych warunkach (tabela uzupełniająca S2) ujawniły zmienność odporności testowanych genotypów, co znalazło odzwierciedlenie w nasileniu antraknozy. Różnice w średnich wynikach wahały się od 1,8 (umiarkowanie odporny) do 6,9 (podatny), a różnice w masie roślin wahały się od 0,62 (podatny) do 4,45 g (odporny). Wykazano istotną korelację pomiędzy wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach eksperymentu (0,51 dla punktacji nasilenia choroby, P = 0,00017 i 0,61 dla masy rośliny, P < 0,0001), a także pomiędzy tymi dwoma parametrami (− 0,59 i − 0,77, P < 0,0001). Wykazano istotną korelację pomiędzy wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach eksperymentu (0,51 dla punktacji nasilenia choroby, P = 0,00017 i 0,61 dla masy roślin, P < 0,0001), jak również pomiędzy tymi dwoma parametrami (− 0,59 i − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 i 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 i -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Istotną korelację stwierdzono pomiędzy wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach eksperymentu (0,51 dla punktacji nasilenia choroby, P = 0,00017 i 0,61 dla masy rośliny, P < 0,0001), a także pomiędzy tymi dwoma parametrami (-0,59 i -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性(疾病严重程度评分为0,51,P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77, P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 i масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Wykazano istotną korelację pomiędzy wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach (punktacja nasilenia choroby 0,51, P = 0,00017 i masa rośliny 0,61, P < 0,0001) a pomiędzy tymi dwoma parametrami (-0,59 i -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Typowe objawy widoczne u podatnych roślin obejmują załamanie i skręcenie łodygi przypominające strukturę „łuk pasterski”, po którym następują owalne zmiany z pomarańczowymi/różowymi sporozoitami (Rys. uzupełniający 1). Australijskie akcesje niosące geny Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) są umiarkowanie odporne, 0,0331 i 0,0036). Niektóre linie, które również niosą „odporne” allele Lanr1 i/lub AnMan, wykazują objawy choroby.
Co ciekawe, kilka linii NLL pozbawionych jakiegokolwiek allelu markerowego „oporności” wykazało wysoki poziom odporności na antraknozę (porównywalny lub wyższy niż w przypadku genotypów Lanr1 lub AnMan), takich jak Boregina (wartość p < 0,0001 dla obu parametrów), Bojar (wartość p < 0,0001 dla wyniku i 0,001 dla masy rośliny) i populacja B-549/79b (wartość p < 0,0001 dla wyniku i nieistotna statystycznie dla masy). Co ciekawe, kilka linii NLL pozbawionych jakiegokolwiek allelu markerowego „oporności” wykazało wysoki poziom odporności na antraknozę (porównywalny lub wyższy niż w przypadku genotypów Lanr1 lub AnMan), takich jak Boregina (wartość p < 0,0001 dla obu parametrów), Bojar (wartość p < 0,0001 dla wyniku i 0,001 dla masy rośliny) i populacja B-549/79b (wartość p < 0,0001 dla wyniku i nieistotna statystycznie dla masy). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boegine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Co ciekawe, kilka linii NLL pozbawionych jakiegokolwiek allelu markerowego „odporności” wykazało wysoki poziom odporności na antraknozę (porównywalny lub wyższy niż w przypadku genotypów Lanr1 lub AnMan), takich jak Boregina (wartość p < 0,0001 dla obu parametrów), Bojar (wartość p < 0,0001 dla oceny i 0,001 dla masy rośliny) i populacja B-549/79b (wartość p < 0,0001 dla oceny i nieistotna dla masy).有趣的是，一些缺乏任何„抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Ciekawe jest to, że niektóre systemy NLL, które nie mają żadnych „antygenowych” markerów, wykazują wysoką oporność poziomą (równoważną genom Lanr1 lub AnMan lub wyższym), takie jak Boregine (oba parametry P < 0,0001), Bojar (wartość P < 0,0001, masa rośliny 0,001) i szczep B-549/79b (wartość P < 0,0001, masa nieistotna statystycznie). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boegine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) i популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Co ciekawe, niektóre linie NLL pozbawione jakichkolwiek alleli markerowych „oporności” wykazywały wysoki poziom odporności na antraknozę (porównywalny lub wyższy niż genotypy Lanr1 lub AnMan), takie jak Boregine (wartość p dla obu parametrów <0,0001), Bojar (wartość p <0,0001, masa rośliny 0,001) i populacja B-549/79b (wartość p <0,0001, masa nieistotna statystycznie).Zjawisko to sugeruje możliwość nowego genetycznego źródła odporności, wyjaśniając zaobserwowany brak korelacji między genotypami markerowymi a fenotypami choroby (wartości p od ~0,42 do ~0,98). Tak więc test Kołmogorowa-Smirnowa wykazał, że dane dotyczące odporności na antraknozę były w przybliżeniu rozłożone normalnie dla wyników (wartości p 0,25 i 0,11) i masy rośliny (wartości p 0,47 i 0,55), co sugeruje, że stawiam hipotezę, że zaangażowanych jest więcej alleli niż Lanr1 i AnMan.
Na podstawie wyników badań przesiewowych w kierunku oporności na antraknozę wybrano 4 linie do analizy transkryptomu: 83A:476, Boreginę, Mandelup i populację 22660. Linie te ponownie przetestowano pod kątem oporności na wąglika w eksperymentach inokulacyjnych za pomocą sekwencjonowania RNA, pod warunkiem, że były takie same jak w poprzednim teście. Wartości punktowe były następujące: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i populację 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokół Illumina NovaSeq 6000 osiągnął średnio 40,5 par Mread na próbkę (29,7 do 54,4 Mreads) (tabela uzupełniająca S3). Wyniki dopasowania w sekwencji referencyjnej wahały się od 75,5% do 88,6%. Średnia korelacja danych dotyczących liczby odczytów między wariantami eksperymentalnymi między replikatami biologicznymi wahała się od 0,812 do 0,997 (średnia 0,959). Spośród 35 170 przeanalizowanych genów, 2917 nie wykazywało żadnej ekspresji, a ekspresja pozostałych 4785 genów była na poziomie nieistotnym (średnia bazowa < 5). Spośród 35 170 przeanalizowanych genów, 2917 nie wykazywało żadnej ekspresji, a ekspresja pozostałych 4785 genów była na poziomie nieistotnym (średnia bazowa < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Spośród 35 170 przeanalizowanych genów 2917 nie wykazywało żadnej ekspresji, a pozostałych 4785 genów wykazywało ekspresję na poziomie nieistotnym (średnia bazowa < 5).35,170 个基因中, 2917 个没有表达, 其他4785个基因的表达可以忽略不计(基本平均值< 5）。35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее świadomość <5). Spośród 35 170 przeanalizowanych genów 2917 nie było wyrażonych, a pozostałych 4785 genów wykazywało nieistotną ekspresję (średnia bazowa < 5).Tak więc liczba genów uznanych za wyrażone (średnia bazowa ≥ 5) podczas eksperymentu wyniosła 27 468 (78,1%) (Tabela uzupełniająca S4).
Od pierwszego punktu czasowego wszystkie linie NLL odpowiedziały na szczepienie C. lupini (szczep Col-08) poprzez przeprogramowanie transkryptomu (Tabela 1), jednak zaobserwowano istotne różnice między liniami. Tak więc linia oporności 83A:476 (niosąca gen Lanr1) wykazała istotne przeprogramowanie transkryptomu w pierwszym punkcie czasowym (6 hpi) z 31-69-krotnym wzrostem liczby izolowanych genów w górę i w dół w porównaniu z innymi punktami czasowymi w tym punkcie czasowym. Ponadto szczyt ten był krótkotrwały, ponieważ ekspresja tylko kilku genów pozostała istotnie zmieniona w drugim punkcie czasowym (12 hpi). Co ciekawe, Boregina, która również wykazała wysoki poziom oporności w teście przeszczepu, nie przeszła tak masywnego przeprogramowania transkrypcyjnego podczas eksperymentu. Jednak liczba różnicowo ekspresjonowanych genów (DEG) była taka sama dla Boregina i 83A:476 w 12 HPI. Zarówno Mandelup, jak i populacja 22660 wykazały szczyty DEG w ostatnim punkcie czasowym (48 l/s), co wskazuje na względne opóźnienie reakcji obronnych.
Ponieważ 83A:476 przeszło masowe przeprogramowanie transkryptomu w odpowiedzi na C. lupini w 6 HPI w porównaniu do wszystkich innych linii, ~91% DEGs zaobserwowanych w tym punkcie czasowym było specyficznych dla linii (ryc. 1). Jednakże występowało pewne nakładanie się wczesnych odpowiedzi między badanymi liniami, ponieważ 68,5%, 50,9% i 52,6% DEG w Boreginie, Mandelup i populacji 22660, odpowiednio, nakładało się z tymi znalezionymi w 83A:476 w pewnych punktach czasowych. Jednakże te DEGs stanowiły tylko niewielką część (0,97–1,70%) wszystkich DEGs obecnie wykrywanych przy użyciu 83A:476. Ponadto 11 DEGs ze wszystkich linii było w tym czasie spójne (tabele uzupełniające S4-S6), w tym wspólne składniki reakcji obronnych roślin: białko transportujące lipidy (TanjilG_32225), enzym endoglukan-1,3-β-glukozyd (TanjilG_23384), dwa białka indukowane stresem, takie jak SAM22 (TanjilG_31528 i TanjilG_31531), zasadowe białko lateksowe (TanjilG_32352) oraz dwa bogate w glicynę białka strukturalne ściany komórkowej (TanjilG_19701 i TanjilG_19702). Zaobserwowano również stosunkowo duże nakładanie się odpowiedzi transkryptomu pomiędzy 83A:476 i Boreginą w 24 HPI (łącznie 16-38% DEG) oraz pomiędzy Mandelup i populacją 22660 w 48 HPI (łącznie 14-20% DEG).
Diagram Venna przedstawiający liczbę różnicowo ekspresjonowanych genów (DEG) w liniach łubinu wąskolistnego (NLL) zaszczepionych Colletotrichum lupini (szczep Col-08 uzyskany z pól łubinu w Wierzhenicach, Polska, 1999). Analizowane linie NLL to: 83A:476 (odporna, niosąca allel Lanr1), Boregina (odporna, nieznane tło genetyczne), Mandelup (umiarkowanie odporna, niosąca allel AnMan) i populacja 22660 (bardzo podatna). Skrót hpi oznacza godziny po szczepieniu. Wartości zerowe zostały usunięte w celu uproszczenia wykresu.
Zestaw nadmiernie ekspresjonowanych genów po 6 hpi został przeanalizowany pod kątem obecności kanonicznych domen genu R (tabela uzupełniająca S7). Badanie to wykazało indukcję transkryptomu klasycznych genów oporności na choroby z domenami NBS-LRR tylko w 83A:476. Zestaw ten składał się z jednego genu TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), pięciu genów CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 i tanjilg_16162) oraz czterech genów NBS-LR, Tanjilg_16162) i czterech genów NBS-LRRE (tanjilg_16162), a także czterech genów NBS-Lrr (tanjilg_16162) i czterech genów NBS-LRR (TANJILG_16162). Wszystkie te geny mają domeny kanoniczne ułożone w konserwatywnych sekwencjach. Oprócz genów domeny NBS-LRR, kilka kinaz RLL zostało aktywowanych w 6 hpi, mianowicie jedna w Boreginie (TanjilG_19877), dwie w Mandelup (TanjilG_07141 i TanjilG_19877) i w populacji 22660 (TanjilG_09014 i TanjilG_10361) i dwie w 83A 27:476.
Geny, których ekspresja uległa znacznej zmianie w odpowiedzi na szczepienie C. lupini (szczep Col-08), poddano analizie wzbogacania metodą Gene Ontology (GO) (tabela uzupełniająca S8). Najczęściej nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego był „GO:0006952 reakcja obronna”, który pojawił się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość p < 0,001) (ryc. 2). Najczęściej nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego był „GO:0006952 reakcja obronna”, który pojawił się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość p < 0,001) (ryc. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 z 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (ryz. 2). Najczęściej nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego był „GO:0006952 reakcja obronna”, który pojawił się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość p < 0,001) (ryc. 2).最常被过度代表的生物过程术语是„GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Najbardziej reprezentatywnym terminem procesu biologicznego jest „GO:0006952 reakcja obronna”, który pojawia się w 6 z 16 kombinacji (时间×线) i ma duże znaczenie (wartość p < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным терminом биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 z 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Najczęściej nadreprezentowanym terminem dotyczącym procesu biologicznego był „GO:0006952 Defense Response”, który pojawił się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość p < 0,001) (ryc. 2).Ten termin był nadreprezentowany w dwóch punktach czasowych w 83A: 476 i Boreginie (6 i 24 hpi) oraz w jednym punkcie czasowym w Mandelup i Populacji 22660 (odpowiednio 12 i 6 hpi). Jest to oczekiwany wynik, podkreślający odpowiedź przeciwgrzybiczą linii odpornych. Ponadto 83A:476 odpowiedział na C. lupini, szybko indukując geny związane z wybuchem oksydacyjnym reprezentowanym przez termin „proces redoks GO:0055114”, wskazując na specyficzną odpowiedź obronną, podczas gdy Boreginie ujawnił specyficzne odpowiedzi obronne, związane z terminem „GO”. :0006950 Odpowiedź na stres”. Populacja 22660 aktywowała poziomą odpowiedź odpornościową obejmującą metabolity wtórne, co podkreśla nadmierną liczbę terminów „GO:0016104 Proces biosyntezy triterpenów” i „GO:0006722 Proces metabolizmu triterpenów” (oba terminy należą do tego samego zestawu genów), biorąc pod uwagę wyniki analizy wzbogacenia terminów GO, stabilność reakcji Mandelupa była między Boreginą a populacją 22660. Ponadto wczesna reakcja 83A:476 (6 hpi) i opóźniona reakcja Mandelupa i populacja 22660 obejmują termin GO:0015979 „fotosynteza” i inne powiązane procesy biologiczne.
Terminy ontologii genów bioprocesu wybrane w adnotacji różnicowo ekspresjonowanych genów podczas odpowiedzi transkryptomu łubinu wąskolistnego (NLL) zaszczepionego łubinem wąglikowym (szczep Col-08 uzyskany z pól łubinu w Wierzhenicach, Polska, w 1999 r.) są znacznie przesadzone. Analizowane linie NLL to: 83A:476 (odporna, niosąca homozygotyczny allel Lanr1), Boregina (odporna, nieznane tło genetyczne), Mandelup (umiarkowanie odporna, niosąca homozygotyczny allel AnMan) i populacja 22660 (podatna).
Ponieważ celem tego badania była identyfikacja genów, które przyczyniają się do odporności na antraknozę, geny przypisane do terminów GO „GO: 0006952 Defensive responses” i „GO: 0055114 Redox processes” analizowano z punktami odcięcia, ponieważ średnie bazowe ≥ 30 z co najmniej jedną linią. × punkt w czasie łączący statystycznie istotne wartości log2 (krotna zmiana). Liczba genów spełniających te kryteria wynosiła 65 dla GO:0006952 i 524 dla GO:0055114.
83A:476 ujawniło dwa szczyty DEG oznaczone terminem GO:0006952, pierwszy przy 6 genach na cal (64 geny, regulacja w górę i w dół), a drugi przy 24 genach na cal (15 genów, tylko regulacja w górę). Boregina wykazała również, że GO:0006952 osiągnął szczyt w tym samym punkcie czasowym, ale z mniejszym DEG (11 i 8) i preferencyjną aktywacją. Mandeloop wykazał dwa szczyty GO:0006952 przy 12 i 48 HPI, oba niosące 12 genów (pierwszy z genami aktywującymi, a drugi tylko z genami supresyjnymi), podczas gdy populacja 22660 przy 6 HPI (13 genów) miała większą przewagę wzrostu szczytu. regulacji. Należy zauważyć, że 96,4% GO:0006952 DEG w tych szczytach miało ten sam typ odpowiedzi (w górę lub w dół), co wskazuje na znaczące nakładanie się odpowiedzi obronnych pomimo różnic w liczbie zaangażowanych genów. Największa grupa sekwencji związanych z terminem GO:0006952 koduje białko wiadomości związane ze stresem głodowym 22 (SAM22-like), które należy do kladu białek związanych z patogenezą klasy 10 (PR-10) i białka rdzeniowego lateksu. podobne (MLP-like) białko) (Ryc. 3). Dwie grupy różniły się charakterem ekspresji i kierunkiem odpowiedzi. Geny kodujące białka podobne do SAM22 wykazywały stałą i znaczącą indukcję we wczesnych punktach czasowych (6 lub 12 hpi) i były ogólnie nieaktywne pod koniec eksperymentu (48 hpi), podczas gdy białka podobne do MLP wykazywały koordynację po 6 hpi. hpi. 83A:476 i Mandelup przy 48 hp/in, prawie wszystkie inne punkty danych były nieaktywne. Ponadto różnice w profilach ekspresji genów białka podobnego do SAM22 podążały za obserwowaną zmiennością w odporności na antraknozę, ponieważ bardziej odporne linie miały więcej punktów czasowych znacząco indukujących te geny niż geny bardziej podatne. Inny gen PR-10 podobny do LlR18A/B wykazał bardzo podobny wzór ekspresji do genu białka podobnego do SAM22.
Zidentyfikowano główne składniki biologicznego terminu procesu „GO:0006952 Defense Response” oraz wzorce ekspresji genów kandydujących alleli Lanr1 i AnMan. Skala Log2 przedstawia wartości log2 (krotna zmiana) między zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu, Wiżenica, Polska, 1999) a kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) roślinami w tym samym punkcie czasowym. Przeanalizowano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporna, niosąca homozygotyczny allel Lanr1), Boregina (odporna, nieznane tło genetyczne), Mandelup (umiarkowanie odporna, niosąca homozygotyczny allel AnMan) i Populacja 22660 (podatna).
Ponadto oceniono profile ekspresji genów kandydujących do RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (Rys. 3). Gen TanjilG_05042 wykazał istotną odpowiedź (aktywację) w 83A:476 tylko w pierwszym punkcie czasowym (6 hpi), podczas gdy TanjilG_12861 był istotny w Mandeloop tylko w dwóch punktach czasowych: 6 hpi (regulacja w dół) i 24 hpi (6 hpi). Z.). regulowany) ).
Najbardziej nadekspresjonowanymi genami w terminie GO:0055114 „proces redoks” były geny kodujące białka cytochromu P450 i peroksydazę (rys. 4). W przypadku próbek wyizolowanych z 83A:476 przy 6 HPI maksymalne lub minimalne wartości log2 (zmiana krotności) (dla 86,6% genów) obserwowano na ogół między roślinami szczepionymi i kontrolnymi, co podkreśla wysoką odpowiedź tego genotypu na płeć szczepioną. 83A:476 wykazało najbardziej znaczące GO:0055114 DEG przy 6 hpi (503 geny), podczas gdy pozostałe linie przy 48 hpi (Boregine, 31 genów; Mandelup, 85 genów; i Population 22660, 78 genów)). W większości genów rodziny GO:0055114 obserwowano dwa typy odpowiedzi na szczepienie (aktywację i hamowanie). Co ciekawe, aż do 97,6% DEG zidentyfikowanych dla terminu GO: 0055114 w Mandelupe przy 48 hp Te obserwacje sugerują, że pomimo znacznie mniejszej skali (tj. liczby zmutowanych genów redoks, 85 w porównaniu do 503), wzór opóźnionych odpowiedzi transkryptomu mandeloup na antraknozę jest podobny do wczesnej odpowiedzi 83A:476. W Boregine i populacji 22660 ta konwergencja jest niższa i wynosi odpowiednio 51,6% i 75,6%.
Ujawniono wzorce ekspresji głównych składników terminu procesu biologicznego „GO:0055114 Proces redoks”. Skala Log2 przedstawia wartości log2 (zmiana krotności) między zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu, Wiżenica, Polska, 1999) a kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) roślinami w tym samym punkcie czasowym. Przeanalizowano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporna, niosąca homozygotyczny allel Lanr1), Boregina (odporna, nieznane tło genetyczne), Mandelup (umiarkowanie odporna, niosąca homozygotyczny allel AnMan) i Populacja 22660 (podatna).
83A:476 Odpowiedzi transkryptomiczne na szczepienie C. lupini (szczep Col-08) obejmowały również skoordynowane wyciszanie genów przypisywanych terminowi GO:0015979 „fotosynteza” i innym powiązanym procesom biologicznym (RYC. 5). Ten zestaw DEG GO:0015979 zawierał 105 genów, które były znacząco represjonowane w 6 hpi w 83A:476. W tym podzbiorze 37 genów było również zmniejszonych w Mandelup w 48 HPI i 35 w tym samym punkcie czasowym w populacji 22660, w tym 19 DEG wspólnych dla obu genotypów. Żadne DEG związane z terminem GO: 0015979 nie były znacząco aktywowane w żadnej kombinacji (linia x czas).
Przedstawiono wzorce ekspresji głównych składników terminu biologicznego procesu „GO:0015979 Fotosynteza”. Skala Log2 przedstawia wartości log2 (zmiana krotności) między zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu, Wiżenica, Polska, 1999) a kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) roślinami w tym samym punkcie czasowym. Przeanalizowano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporna, niosąca homozygotyczny allel Lanr1), Boregina (odporna, nieznane tło genetyczne), Mandelup (umiarkowanie odporna, niosąca homozygotyczny allel AnMan) i Populacja 22660 (podatna).
Na podstawie wyników analizy różnicowej ekspresji i przypuszczalnie biorąc pod uwagę udział w reakcjach obronnych przeciwko grzybom patogennym, wybrano ten zestaw siedmiu genów do ilościowej oceny profili ekspresji za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (Tabela uzupełniająca S9).
Przypuszczalny gen białkowy TanjilG_10657 został znacząco indukowany we wszystkich badanych liniach i punktach czasowych w porównaniu do roślin kontrolnych (naśladujących) (tabele uzupełniające S10, S11). Ponadto profil ekspresji TanjilG_10657 wykazał rosnącą tendencję w trakcie trwania eksperymentu dla wszystkich linii. Populacja 22660 wykazała najwyższą wrażliwość TanjilG_10657 na inokulację z 114-krotną aktywacją i najwyższym względnym poziomem ekspresji (4,4 ± 0,4) przy 24 HPI (rys. 6a). Gen białkowy PR10 LlR18A TanjilG_27015 również wykazał aktywację we wszystkich liniach i punktach czasowych, ze statystyczną istotnością w większości punktów danych (rys. 6b). Podobnie jak w przypadku TanjilG_10657, najwyższy względny poziom ekspresji TanjilG_27015 zaobserwowano w populacji zaszczepionej 22660 w 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen endochitynazy kwasowej TanjilG_04706 był znacząco zwiększony we wszystkich liniach i we wszystkich punktach czasowych z wyjątkiem Boreginy 6 hpi (rys. 6c). Był silnie indukowany w pierwszym punkcie czasowym (6 HPI) w 83A:476 (o 10,5 raza) i umiarkowanie zwiększony w innych liniach (o 6,6-7,5 raza). Podczas eksperymentu ekspresja TanjilG_04706 utrzymywała się na podobnym poziomie w 83A:476 i Boreginie, podczas gdy w Mandelup i populacji 22660 znacząco wzrosła, osiągając stosunkowo wysokie wartości (odpowiednio 5,9 ± 1,5 i 6,2 ± 1,5). Gen endoglukan-1,3-β-glukozydazy-podobny TanjilG_23384 wykazał wysoką aktywację w pierwszych dwóch punktach czasowych (6 i 12 hpi) we wszystkich liniach z wyjątkiem populacji 22660 (rys. 6d). Najwyższe względne poziomy ekspresji TanjilG_23384 zaobserwowano w drugim punkcie czasowym (12 hpi) w Mandelup (2,7 ± 0,3) i 83A:476 (1,5 ± 0,1). W 24 HPI ekspresja TanjilG_23384 była stosunkowo niska we wszystkich badanych liniach (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profile ekspresji wybranych genów (ag) ujawnione metodą ilościowej reakcji PCR. Liczby 6, 12 i 24 oznaczają godziny po szczepieniu. Geny LanDExH7 i LanTUB6 zostały użyte do normalizacji, a LanTUB6 do kalibracji międzyseryjnej. Błędy słupkowe oznaczają odchylenie standardowe na podstawie trzech replik biologicznych, z których każda jest średnią z trzech replik technicznych. Istotność statystyczna różnic w poziomach ekspresji pomiędzy roślinami zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany w 1999 r. z pola łubinu w Wierzenicy, Polska) i kontrolnymi (zaszczepionymi pozornie) jest zaznaczona powyżej punktów danych (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001). Istotność statystyczna różnic w poziomach ekspresji pomiędzy roślinami zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany w 1999 r. z pola łubinu w Wierzenicy, Polska) i kontrolnymi (zaszczepionymi pozornie) jest zaznaczona powyżej punktów danych (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001). Статистистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statystycznie istotne różnice w poziomach ekspresji między roślinami zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany w 1999 r. z pola łubinu w Wierzhenicach w Polsce) i kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) odnotowano powyżej punktów danych (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照(模拟接种)植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方(*P值< 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wiaranica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statystycznie istotne różnice w poziomach ekspresji pomiędzy roślinami zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu w Wierzhenicach, Polska, w 1999 r.) i kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) odnotowano powyżej punktów danych (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001).Analizowane linie NLL to: 83A:476 (odporna, nosząca homozygotyczny allel Lanr1), Mandelup (umiarkowanie odporna, nosząca homozygotyczny allel AnMan), Boregine (odporna, nieznane tło genetyczne) i populacja 22660 (podatna).
Gen kandydujący TanjilG_05042 w locus Lanr1 wykazał wyraźnie inny wzór ekspresji od profili uzyskanych z badań RNA-seq (ryc. 6e). Znaczną aktywację tego genu zaobserwowano w Mandelup i populacji 22660 (odpowiednio do 39,7 i 11,7 razy), co skutkowało stosunkowo wysokimi poziomami ekspresji (odpowiednio do 1,4 ± 0,14 i 7,2 ± 1,3). 83A:476 ujawniło również pewne zwiększenie ekspresji genu TanjilG_05042 (do 3,8-krotności), jednak uzyskane względne poziomy ekspresji (0,044 ± 0,002) były ponad 30-krotnie niższe od tych zaobserwowanych w Mandelup i populacji 22660. analizowane metodą qPCR wykazały istotne różnice w poziomach ekspresji między genotypami w wariantach pozornie szczepionych (kontrolnych), osiągając 58-krotną różnicę między populacjami 22660 i 83A:476, a także między populacjami 22660 i 22660. Dwukrotną różnicę osiągnięto między Boreginą i Mandalupem.
Gen kandydujący w locus AnMan, TanjilG_12861, został aktywowany w odpowiedzi na szczepienie w 83A:476 i Mandelup, był neutralny w populacji 22660 i był zmniejszony w Boreginie (rys. 6f). Względna ekspresja genu TanjilG_12861 była najwyższa w zaszczepionym szczepie 83A:476 (0,14±0,01). Gen białka szoku cieplnego klasy I o masie cząsteczkowej 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 wykazywał niższe względne poziomy ekspresji we wszystkich badanych szczepach i punktach czasowych (rys. 6g). Najwyższą wartość zaobserwowano w 24 HPI w populacji 22660 (0,14 ± 0,02, ośmiokrotny wzrost odpowiedzi na szczepienie).
Porównanie profili ekspresji genów (rys. 7) wykazało wysoką korelację między TanjilG_10657 a czterema innymi genami: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) i TanjilG_04706 (r = 0,79). Takie wyniki mogą wskazywać na współregulację tych genów podczas reakcji obronnych. Geny TanjilG_12861 i TanjilG_23384 wykazały różne profile ekspresji z niższymi wartościami współczynnika korelacji Pearsona (odpowiednio od 0,08 do 0,43 i -0,19 do 0,28) w porównaniu z innymi genami.
Korelacje między profilami ekspresji genów wykryto przy użyciu ilościowej reakcji PCR. Przeanalizowano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporna, niosąca homozygotyczny allel Lanr1), Mandelup (umiarkowanie odporna, niosąca homozygotyczny allel AnMan), Boregine (odporna, nieznane tło genetyczne) i Populacja 22660 (podatna). Obliczono trzy punkty czasowe (6, 12 i 24 godziny po inokulacji), w tym rośliny inokulowane (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu w Wierzhenicach, Polska, w 1999 r.) i kontrolne (pozornie inokulowane). Skala przedstawia wartość współczynnika korelacji Pearsona.
Na podstawie danych uzyskanych przy 6 KM na cal, WGCNA przeprowadzono na 9981 DEG zidentyfikowanym przez porównanie zaszczepionych i kontrolnych roślin, aby skupić się na wczesnych reakcjach obronnych (Tabela uzupełniająca S12). Znaleziono dwadzieścia dwa moduły genów (klastry) z skorelowanymi (pozytywnymi lub negatywnymi) profilami ekspresji między genotypami i wariantami eksperymentalnymi. Średnio poziomy ekspresji genów wykazywały tendencję malejącą w kolejności 83A:476 > Mandelup > Boregina > Populacja 22660 (jednak w obu wariantach tendencja ta była silniejsza w roślinach kontrolnych). Średnio poziomy ekspresji genów wykazywały tendencję malejącą w kolejności 83A:476 > Mandelup > Boregina > Populacja 22660 (jednak w obu wariantach tendencja ta była silniejsza w roślinach kontrolnych). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregina > Populacja 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Średnio poziom ekspresji genów zmniejszał się w kolejności 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (w obu wariantach tendencja ta była jednak silniejsza w roślinach kontrolnych).平均而言,基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregina > Populacja 22660的顺序下降(然而,在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populacja 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregina > Populacja 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных rozstawiony). Średnio poziom ekspresji genów zmniejszył się w serii 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (jednak w obu wariantach tendencja ta była silniejsza w roślinach kontrolnych).Szczepienie spowodowało regulację w górę ekspresji genów, szczególnie w modułach 18, 19, 14, 6 i 1 (w kolejności malejącej pod względem wpływu), regulację negatywną (np. moduły 9 i 20) lub z efektami neutralnymi (np. moduły 11, 22, 8 i 13). Analiza wzbogacenia terminów GO (Tabela uzupełniająca S13) ujawniła „GO: 0006952 Odpowiedzi ochronne” dla zaszczepionego modułu (18) z maksymalną aktywacją, w tym geny analizowane metodą qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015), a także wiele modułów fotosyntezy Inoculate o największym zahamowaniu (9). Koncentrator modułu 18 (rys. 8) został zidentyfikowany jako gen TanjilG_26536 kodujący białko PR-10-like LlR18B, a koncentrator modułu 9 został zidentyfikowany jako gen TanjilG_28955 kodujący białko fotosystemu II PsbQ. Kandydat na gen odporności na antraknozę Lanr1, TanjilG_05042, został znaleziony w module 22 (rys. 9) i jest powiązany z terminami „GO:0044260 Procesy metaboliczne makrocząsteczek komórkowych” i „GO:0006355 Regulacja transkrypcyjna, szablonowanie DNA” niosącymi hub TanjilG_01212. Gen koduje czynnik transkrypcyjny stresu cieplnego A-4a (HSFA4a).
Analiza sieci ważonej współekspresji genów modułów z nadreprezentowanymi terminami procesów biologicznych „GO: 0006952 Odpowiedzi obronne”. Ligacja została uproszczona, aby wyróżnić cztery geny analizowane przez qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Ważona analiza sieciowa współekspresji genu modułu z nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego „GO: 0006355: Regulacja transkrypcji, szablonowanie DNA” i niosącego potencjalny gen odporności na antraknozę Lanr1 TanjilG_05042. Ligację uproszczono w celu wyizolowania genu TanjilG_05042 i centralnego genu TanjilG_01212.
Badania odporności na antraknozę przeprowadzone w Australii wykazały, że większość wcześnie wprowadzonych na rynek odmian była podatna; Kalya, Coromup i Mandelup zostały opisane jako umiarkowanie odporne, podczas gdy Wonga, Tanjil i 83A:476 zostały opisane jako wysoce odporne26,27,31. miały ten sam allel odporności, oznaczony jako Lanr1, a Coromup i Mandelup miały inny allel, oznaczony jako AnMan10, 26, 39, podczas gdy Kalya przekazała inny allel., Lanr2. Badania odporności na antraknozę przeprowadzone w Niemczech doprowadziły do ​​zidentyfikowania odpornej linii Bo7212 z allelem kandydującym innym niż Lanr1, oznaczony jako LanrBo36.
Nasze badanie wykazało bardzo niską częstotliwość (około 6%) allelu Lanr1 w testowanej plazmie zarodkowej. Ta obserwacja jest zgodna z wynikami przesiewu plazmy zarodkowej Europy Wschodniej przy użyciu markerów Anseq3 i Anseq4, które wykazały, że allel Lanr1 występuje tylko w dwóch liniach białoruskich. Sugeruje to, że allel Lanr1 nie jest jeszcze szeroko stosowany w lokalnych programach hodowlanych, w przeciwieństwie do Australii, gdzie jest jednym z kluczowych alleli do hodowli wspomaganej markerami. Może to wynikać z niższego poziomu odporności zapewnianej przez allel Lanr1 w europejskich warunkach polowych w porównaniu z raportem australijskim. Ponadto badania antraknozy w obszarach o dużych opadach deszczu w Australii wykazały, że reakcje odpornościowe pośredniczone przez allel Lanr1 mogą nie być skuteczne w warunkach pogodowych sprzyjających wzrostowi i szybkiemu rozwojowi patogenu19,42. W rzeczywistości w niniejszym badaniu zaobserwowano również pewne objawy antraknozy u genotypów noszących allel Lanr1, co sugeruje, że oporność może zanikać w optymalnych warunkach rozwoju C. lupini. Ponadto możliwe są fałszywie pozytywne interpretacje obecności markerów Anseq3 i Anseq4, które znajdują się w odległości około 1 cM od locus Lanr128,30,43.
Nasze badanie wykazało, że 83A:476, niosący allel Lanr1, odpowiedział na inokulację C. lupini za pomocą przeprogramowania transkryptomu na dużą skalę w pierwszym analizowanym punkcie czasowym (6 hpi), podczas gdy w Mandelup, niosącym allel AnMan, odpowiedzi transkryptomowe obserwowano znacznie później. (od 24 do 48 hp). Te czasowe wahania w odpowiedziach obronnych są związane z różnicami w objawach choroby, podkreślając znaczenie wczesnego rozpoznania patogenu dla skutecznej odpowiedzi na oporność. Aby zainfekować tkankę roślinną, zarodniki wąglika muszą przejść przez kilka stadiów rozwojowych na powierzchni żywiciela, w tym kiełkowanie, podział komórek i tworzenie appressorium. Wyrostek to struktura zakaźna, która przyczepia się do powierzchni żywiciela i ułatwia penetrację do tkanek żywiciela. Tak więc zarodniki C. gloeosporioides w ekstrakcie z grochu wykazały pierwszy podział jądra po 75-90 minutach inkubacji, utworzenie rurki kiełkowej po 90-120 minutach i supresję po 4 godzinach 45 . Mango C. gloeosporioides wykazało ponad 40% kiełkowania zarodników po 3 godzinach inkubacji i około 20% tworzenia apresorów po 4 godzinach. Gen CAP20 związany z wirulencją C. gloeosporioides wykazał aktywność transkrypcyjną w zarodnikach tworzących epifity po 3,5 godzinach inkubacji w wosku powierzchniowym awokado z wysokimi stężeniami białka CAP20 po 4 godzinach 46 minutach. Podobnie, aktywność genów biosyntezy melaniny w C. trifolii została zaindukowana podczas 2-godzinnej inkubacji, a następnie utworzenie appressorium po 1 godzinie. Badania tkanek liści wykazały, że truskawki zaszczepione C. acutatum mają pierwsze tłumienie po 8 hpi, podczas gdy pomidory zaszczepione C. coccodes mają pierwsze tłumienie po 4 hpi48,49. w dużej mierze zgodne ze skalą czasową procesu zakaźnego Colletotrichum spp. Szybkie odpowiedzi obronne na 83A:476 sugerują udział genów odporności roślin i odporności wyzwalanej efektorami (ETI) w tej linii, podczas gdy opóźnione odpowiedzi Mandelupa potwierdzają hipotezę odporności wyzwalanej mikrozwiązanymi wzorcami molekularnymi (MTI) 50. Wczesne odpowiedzi na 83A:476 i Mandelupa. Częściowe nakładanie się genów o podwyższonej lub obniżonej ekspresji w opóźnionej odpowiedzi również potwierdza tę koncepcję, ponieważ ETI jest często uważane za przyspieszoną i wzmocnioną odpowiedź MTI, która kończy się zaprogramowaną śmiercią komórek w miejscu zakażenia, znaną jako wstrząs anafilaktyczny 51,52 .
Większość genów przypisywanych do nadreprezentowanego terminu Gene Ontology GO:0006952 „Defense Response” to 11 homologów białka 22 wiadomości postu wywołanego stresem (podobnego do SAM22) i siedem głównych białek lateksowych (MLP). -podobne białka 31, 34, 43 i 423 wykazały podobieństwo sekwencji. Geny podobne do SAM22 wykazały znaczącą aktywację, która trwała dłużej, wykazując zwiększone poziomy oporności na antraknozę (83A:476 i Boregine). Jednak geny podobne do MLP były zmniejszone tylko w liniach niosących kandydujący allel oporności (83A:476/Lanr1 po 6 hpi i Mandelup/AnMan po 24 hpi). Należy zauważyć, że wszystkie zidentyfikowane homologi podobne do SAM22 pochodzą z klastra genów obejmującego około 105 kb, podczas gdy geny podobne do MLP pochodzą z oddzielnych regionów genomu. Skoordynowaną aktywację takich genów typu SAM22 stwierdzono również w naszym poprzednim badaniu oporności NLL na szczepienie Diaporthetoxica, co sugeruje, że są one zaangażowane w poziome komponenty odpowiedzi obronnej. Wniosek ten jest również poparty doniesieniami o pozytywnej odpowiedzi genów typu SAM22 na uraz lub leczenie kwasem salicylowym, induktorami grzybów lub nadtlenkiem wodoru.
Wykazano, że geny podobne do MLP reagują na różne stresy abiotyczne i biotyczne, w tym bakteryjne, wirusowe i patogeniczne infekcje grzybicze u wielu gatunków roślin55. Kierunki odpowiedzi na pewne interakcje między roślinami i patogenami wahały się od silnie rosnącego (tj. podczas inwazji bawełny przez Verticillium dahliae) do znacząco malejącego (tj. po zakażeniu jabłoni przez Alternaria spp.)56,57. Znaczne zmniejszenie ekspresji genu podobnego do MLP 423 zaobserwowano podczas obrony awokado przed infekcją F. niger oraz podczas infekcji jabłoni. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola i Alternaria alternata to patotypy jabłoni58,59. Ponadto kalusy jabłoni z nadmierną ekspresją genu podobnego do MLP 423 miały niższą ekspresję genów związanych z opornością i były bardziej podatne na infekcję grzybiczą59. W następstwie zakażenia Fusarium oxysporum f, gen 423 podobny do MLP został również stłumiony w opornej plazmie zarodkowej fasoli zwykłej. cn. Zakażenie fasoli 60.
Inni członkowie rodziny PR-10 zidentyfikowani w naszym badaniu RNA-seq to geny LlR18A i LlR18B w odpowiedzi na regulację w górę, a także gen regulacji w górę (1 gen) lub regulacji w dół (3 geny) dla białka transportującego lipidy DIR1. Ponadto WGCNA podkreśla gen LlR18B jako hub w tym module, który jest bardzo podatny na szczepienia i zawiera kilka genów odpowiedzi ochronnej. Geny LlR18A i LlR18B zostały zaindukowane w liściach łubinu żółtego w odpowiedzi na bakterie patogenne, a także w łodygach NLL po zaszczepieniu D. toxica, podczas gdy homolog ryżu tych genów, RSOsPR10, został szybko zaindukowany przez infekcję grzybiczą prawdopodobnie zaangażowaną w szlak sygnałowy kwasu jasmonowego53,61, 62. Gen DIR1 koduje niespecyficzne białka transportujące lipidy, które są wymagane do wystąpienia systemowej nabytej oporności (SAR). Wraz z rozwojem reakcji ochronnych białko DIR1 jest transportowane z ogniska zakażenia przez łyko, aby wywołać SAR w odległych narządach. Co ciekawe, gen TanjilG_02313 DIR1 został znacząco zaindukowany w pierwszym punkcie czasowym w liniach 84A:476 i Populacji 22660, ale oporność na antraknozę rozwinęła się pomyślnie tylko w linii 84A:476. Może to wskazywać na pewną subfunkcjonalizację genu DIR1 w NLL, ponieważ pozostałe trzy homologi odpowiedziały na szczepienie tylko w linii 83A:476 po 6 hpi, a ta odpowiedź była skierowana w dół.
W naszym badaniu najczęstszymi składnikami odpowiadającymi procesowi biologicznemu zwanemu „GO:0055114 Redox process” były białko cytochromu P450, peroksydaza, 9S-/13S-lipooksygenaza kwasu linolowego i oksydaza kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego. Ponadto nasza WGCNA definiuje homolog HSFA4a jako hub niosący moduły, takie jak kandydat na gen oporności Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a jest składnikiem zależnej od redoks regulacji transkrypcji jądrowej w roślinach.
Białka cytochromu P450 to oksydoreduktazy, które katalizują reakcje hydroksylacji zależne od NADPH i/lub O2 w metabolizmie pierwotnym i wtórnym, w tym metabolizmie ksenobiotyków, a także hormonów, kwasów tłuszczowych, steroli, składników ścian komórkowych, biopolimerów i biosyntezie związków ochronnych 69. W naszym W badaniu zmienność funkcji roślinnego cytochromu P450 została zmniejszona z -10,6 log2 (zmiana krotności) do 5,7 ze względu na dużą liczbę zmienionych homologów (37) i różnice we wzorcach odpowiedzi między określonymi genami, co odzwierciedla rewizję w górę. . Wykorzystanie wyłącznie danych RNA-seq do wyjaśnienia domniemanej funkcji biologicznej genów NLL w tak dużej superrodzinie białek byłoby wysoce spekulatywne. Warto jednak zauważyć, że niektóre geny cytochromu P450 są powiązane ze zwiększoną odpornością na grzyby lub bakterie chorobotwórcze, w tym przyczyniają się do reakcji alergicznych69,70,71.
Peroksydazy klasy III to wielofunkcyjne enzymy roślinne biorące udział w szerokim zakresie procesów metabolicznych podczas wzrostu i rozwoju roślin, a także w odpowiedzi na stresy środowiskowe, takie jak zasolenie, susza, wysokie natężenie światła i atak patogenów72. Peroksydazy biorą udział w interakcji kilku gatunków roślin z Anthracis, w tym Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,76. Odpowiedź jest bardzo szybka, czasami nawet przy 4 HPI, zanim grzyb przeniknie do tkanki roślinnej73. Gen peroksydazy zareagował również na inokulację D. toxica NLL. Oprócz typowych funkcji regulacji wybuchu oksydacyjnego lub eliminacji stresu oksydacyjnego, peroksydazy mogą zakłócać wzrost patogenów, tworząc bariery fizyczne oparte na wzmacnianiu ścian komórkowych podczas lignifikacji, podjednostki lub sieciowania określonych związków. Tę funkcję można przypisać in silico genowi TanjilG_03329 kodującemu domniemaną anionową peroksydazę tworzącą ligninę, która była znacząco regulowana w górę w naszym badaniu w linii opornej 83A:476 w 6 HPI, ale nie w innych szczepach i punktach czasowych, które nie reagowały.
9S-/13S-lipooksygenaza kwasu linolowego jest pierwszym etapem w oksydacyjnej drodze biosyntezy lipidów78. Produkty tej drogi pełnią wiele funkcji w obronie roślin, w tym wzmacnianie ścian komórkowych poprzez tworzenie złogów kalozy i pektyny oraz regulację stresu oksydacyjnego poprzez produkcję reaktywnych form tlenu79,80,81,82,83. W niniejszym badaniu ekspresja 9S-/13S-lipooksygenazy kwasu linolowego została zmieniona we wszystkich szczepach, ale w podatnej populacji 22660, regulacja w górę przeważała w różnych punktach czasowych, podczas gdy w szczepach niosących oporny Lanr1 i allel AnMan, podkreśla to zróżnicowanie warstwy oksylipinowej w ochronnych reakcjach wąglika między tymi genotypami.
Homolog oksydazy 1-aminocyklopropano-1-karboksylanowej (ACO) był znacząco podwyższony (9 genów) lub obniżony (2 geny) po zaszczepieniu łubinem. Z dwoma wyjątkami, wszystkie te odpowiedzi wystąpiły przy 6 hp. przy 83A:476. Reakcja enzymatyczna pośredniczona przez białka ACO jest etapem ograniczającym szybkość produkcji etylenu i dlatego jest silnie regulowana84. Etylen jest hormonem roślinnym, który odgrywa wiele ról w regulacji rozwoju roślin i reakcji na warunki stresu abiotycznego i biotycznego. Indukcja transkrypcji ACO i aktywacja szlaku sygnałowego etylenu są zaangażowane w zwiększanie odporności ryżu na grzyb hemibiotroficzny oryzae oryzae poprzez regulację produkcji reaktywnych form tlenu i fitoaleksyn. Bardzo podobny proces infekcji liści zaobserwowany u M. oryzae i C. lupini88,89, na tle znacznego zwiększenia ekspresji homologów ACO w linii 83A:476 opisanego w tym badaniu, przesuwa możliwość nadania odporności na antraknozę NLL etylenu jako centralnego etapu sygnałowego w szlakach molekularnych.
W niniejszym badaniu zaobserwowano tłumienie na dużą skalę wielu genów związanych z fotosyntezą po 6 hpi w 83A:476 i po 48 hpi w Mandeloop i populacji 22660. Zakres i postęp tych zmian są proporcjonalne do poziomu. W tym eksperymencie zaobserwowano odporność na antraknozę. Ostatnio odnotowano silne i wczesne tłumienie transkryptów związanych z fotosyntezą w kilku modelach interakcji roślina-patogen, w tym patogennych bakterii i grzybów. Przyspieszenie (od 2 HPI w niektórych interakcjach) i globalne tłumienie genów związanych z fotosyntezą w odpowiedzi na infekcję może wywołać odporność roślin w oparciu o rozmieszczenie reaktywnych form tlenu i ich interakcję ze szlakiem kwasu salicylowego w celu mediacji reakcji alergicznych 90,94.
Podsumowując, mechanizmy odpowiedzi obronnej zaproponowane dla najbardziej odpornej linii (83A:476) obejmują szybkie rozpoznanie patogenu przez gen R (prawdopodobnie TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) oraz sygnalizację kwasu salicylowego i etylenu zależną od odpowiedzi alergicznej, po której następuje ustanowienie dalekosiężnego działania SAR. jest wspierane przez białko DIR-1. Należy zauważyć, że okres biotroficzny zakażenia C. lupini jest bardzo krótki (około 2 dni), po którym następuje wzrost nekrotyczny95. Przejście między tymi etapami może być związane z martwicą i ekspresją białek indukowanych etylenem, które działają jako wyzwalacze reakcji nadwrażliwości u roślin żywicielskich. Dlatego okno czasowe na skuteczne wychwycenie C. lupini na etapie biotroficznym jest bardzo wąskie. Przeprogramowanie genów związanych z redoks i fotosyntezą obserwowane w 83A:476 w 6 hpi jest zgodne z postępem strzępek grzybów i zapowiada rozwój skutecznej odpowiedzi ochronnej na etapie biotroficznym. Odpowiedzi transkryptomowe Mandelupa i populacji 22660 mogą być zbyt opóźnione, aby uchwycić grzyba przed przejściem na wzrost nekrotyczny, jednak Mandelup może być skuteczniejszy niż populacja 22660, ponieważ stosunkowo szybka regulacja białka PR-10 promuje odporność poziomą.
ETI, napędzany przez kanoniczny gen R, wydaje się być powszechnym mechanizmem odporności fasoli na antraknozę. Tak więc w modelowej roślinie strączkowej Medicago truncatula odporność na antraknozę jest nadawana przez gen RCT1, członka klasy genów roślinnych R TIR-NBS-LRR97. Gen ten nadaje również szerokie spektrum odporności na antraknozę u lucerny po przeniesieniu do podatnych roślin. W fasoli zwykłej (P. vulgaris) do tej pory zidentyfikowano ponad dwa tuziny genów odporności na antraknozę. Niektóre z tych genów znajdują się w regionach pozbawionych jakichkolwiek kanonicznych genów R, jednak wiele innych znajduje się na krawędziach chromosomów niosących klaster genów NBS-LRR, w tym TIR-NBS-LRRs99. Badanie SSR całego genomu potwierdziło również związek genu NBS-LRR z odpornością na antraknozę u fasoli zwykłej. Kanoniczny gen R znaleziono również w regionie genomowym zawierającym główny locus odporności na antraknozę w łubinie białej 101.
Nasze badania pokazują, że natychmiastowa reakcja odporności, aktywowana na wczesnym etapie infekcji rośliny (najlepiej nie później niż 12 hpi), skutecznie chroni łubin wąskolistny przed antraknozą powodowaną przez patogenny grzyb Collelotrichum lupini. Wykorzystując sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, zademonstrowaliśmy zróżnicowane profile ekspresji genów odporności na antraknozę w roślinach NLL, które są pośredniczone przez geny odporności Lanr1 i AnMan. Skuteczna obrona polega na ostrożnym zaprojektowaniu genów dla białek zaangażowanych w redoks, fotosyntezę i patogenezę w ciągu kilku godzin od pierwszego kontaktu rośliny z patogenem. Podobne reakcje ochronne, ale opóźnione w czasie, są znacznie mniej skuteczne w ochronie roślin przed chorobami. Odporność na wąglika pośredniczona przez gen Lanr1 przypomina typową szybką odpowiedź genu R (odporność wyzwalana przez efektor), podczas gdy gen AnMan najprawdopodobniej zapewnia odpowiedź poziomą (odporność wyzwalana przez wzorzec molekularny związany z drobnoustrojem), zapewniając umiarkowany poziom zrównoważenia.
215 linii NLL użytych do przesiewu w kierunku markerów antraknozy składało się z 74 odmian uprawnych, 60 linii uzyskanych przez krzyżowanie lub hodowlę, 5 mutantów i 76 dzikich lub oryginalnych plazm zarodkowych. Linie pochodziły z 17 krajów, głównie z Polski (58), Hiszpanii (47), Niemiec (27), Australii (26), Rosji (19), Białorusi (7), Włoch (5) i innych linii. z 10 krajów. Zestaw zawiera również referencyjne linie odporne: 83A:476, Tanjil, Wonga niosące allel Lanr1 i Mandelup niosące allel AnMan. Linie uzyskano z Europejskiej Bazy Danych Zasobów Genetycznych Łubinu prowadzonej przez Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polska (Tabela Uzupełniająca S1).
Rośliny uprawiano w kontrolowanych warunkach (fotoperiod 16 godzin, temperatura 25°C w dzień i 18°C ​​w nocy). Przeanalizowano dwa powtórzenia biologiczne. DNA wyizolowano z trzytygodniowych liści przy użyciu zestawu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z protokołem. Jakość i stężenie wyizolowanego DNA oceniono metodami spektrofotometrycznymi (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Marker AnManM1 oznaczający gen odporności na antraknozę AnMan (pochodzący z odmiany Mandelup) oraz markery Anseq3 i Anseq4 flankujące gen Lanr1 (pochodzący z odmiany Tanjil) zostały przeanalizowane 11,26,28. Homozygoty dla allelu odporności zostały ocenione jako „1”, podatne – jako „0”, a heterozygoty – jako 0,5.
Na podstawie wyników przesiewu w kierunku markerów AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 oraz dostępności nasion do końcowych eksperymentów następczych wybrano 50 linii NLL do fenotypowania odporności na antraknozę. Analizę przeprowadzono w dwóch powtórzeniach w sterowanej komputerowo szklarni z 14-godzinnym fotoperiodem i zakresem temperatur 22°C w ciągu dnia i 19°C w nocy. Nasiona są zdrapywane (odcinanie łupiny nasiennej po przeciwnej stronie zarodka ostrym ostrzem) przed wysiewem, aby zapobiec uśpieniu nasion z powodu zbyt twardej łupiny nasiennej i zapewnić równomierne kiełkowanie. Rośliny uprawiano w doniczkach (11 × 11 × 21 cm) z jałową glebą (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warszawa, Polska). Inokulację wykonano szczepem Colletotrichum lupini Col-08, wyhodowanym w 1999 r. z łodyg roślin łubinu wąskolistnego uprawianych na polu w Wierzenicy, Wielkopolska (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Uzyskaj obszar. Izolaty hodowano w podłożu SNA w temperaturze 20° C. w świetle czarnym przez 21 dni w celu wywołania sporulacji. Cztery tygodnie po siewie, gdy rośliny osiągnęły stadium 4-6 liści, przeprowadzono inokulację przez oprysk zawiesiną zarodników konidialnych o stężeniu 0,5 x 106 zarodników na ml. Po inokulacji rośliny trzymano w ciemności przez 24 godziny przy wilgotności około 98% i temperaturze 25°C, aby ułatwić kiełkowanie zarodników konidialnych i proces infekcji. Rośliny uprawiano następnie w 14-godzinnym fotoperiodzie przy 22°C dzień/19°C noc i 70% wilgotności. Ocena choroby została przeprowadzona 22 dni po zaszczepieniu i wahała się od 0 (odporne) do 9 (bardzo podatne) w zależności od obecności lub braku zmian martwiczych na łodygach i liściach. Ponadto po ocenie mierzono wagę roślin. Relacje między genotypami markerów i fenotypami choroby obliczono jako korelacje punktowo-dwusekwencyjne (brak markerów heterozygotycznych w zestawie linii do analizy fenotypu odporności na antraknozę).