Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Łubin angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) to roślina strączkowa wykorzystywana do produkcji żywności i ulepszania gleby.Globalna ekspansja NLL jako rośliny uprawnej przyciągnęła wiele grzybów chorobotwórczych, w tym antraknozę łubinu, która powoduje wyniszczającą chorobę antraknozy.W hodowli NLL zastosowano dwa allele, Lanr1 i AnMan, które nadają zwiększoną oporność, ale leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane.W tym badaniu markery Lanr1 i AnMan zastosowano do przeszukiwania europejskich próbek NLL.Testowanie szczepionki w kontrolowanym środowisku potwierdziło skuteczność obu opornych dawców.Profilowanie różnicowej ekspresji genów przeprowadzono na reprezentatywnych liniach opornych i wrażliwych.Oporność na antraknozę była związana z nadekspresją terminów ontologii genów „GO:0006952 Defense Response”, „GO:0055114 Proces redoks” i „GO:0015979 Fotosynteza”.Ponadto linia Lanr1(83A:476) wykazywała znaczące przeprogramowanie transkryptomu szybko po inokulacji, podczas gdy inne linie wykazywały opóźnienie w tej odpowiedzi o około 42 godziny.Odpowiedzi obronne są związane z genami TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 białkami zaangażowanymi w patogenezę, białkami przenoszącymi lipidy, endoglukan-1,3-β-glukozydazą, białkami ściany komórkowej bogatymi w glicynę i genami z reaktywnej ścieżki tlenu.Wczesne reakcje na 83A:476, w tym ostrożne tłumienie genów związanych z fotosyntezą, zbiegły się z skuteczną ochroną podczas fazy wzrostu wegetatywnego biologii grzybów, co sugeruje, że efektor wyzwala odporność.Reakcja Mandeloop jest spowolniona, podobnie jak ogólny opór poziomy.
Łubin wąskolistny (NLL, Lupinus angustifolius L.) to wysokobiałkowe zboże pochodzące z zachodniego regionu Morza Śródziemnego1,2.Obecnie jest uprawiana jako roślina spożywcza dla zwierząt i ludzi.Jest również uważany za zielony nawóz w systemach płodozmianu ze względu na wiązanie azotu przez symbiotyczne bakterie wiążące azot i ogólną poprawę struktury gleby.NLL przeszedł szybki proces udomowienia w ostatnim stuleciu i nadal znajduje się pod silną presją hodowlaną3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Wraz z powszechną uprawą NLL sukcesja grzybów chorobotwórczych stworzyła nowe nisze rolnicze i spowodowała nowe choroby niszczące uprawy. Najbardziej niezwykłe dla rolników i hodowców łubinu było pojawienie się antraknozy, wywołanej przez chorobotwórczego grzyba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najbardziej niezwykłe dla rolników i hodowców łubinu było pojawienie się antraknozy, wywołanej przez chorobotwórczego grzyba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патог енным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najbardziej godne uwagi dla rolników i hodowców łubinu było pojawienie się antraknozy spowodowanej przez chorobotwórczego grzyba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Z włosami。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najbardziej uderzające dla rolników i hodowców łubinu jest pojawienie się antraknozy spowodowanej przez chorobotwórczego grzyba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Najwcześniejsze doniesienia o chorobie pochodziły z Brazylii i Stanów Zjednoczonych, a typowe objawy pojawiły się odpowiednio w 1912 i 1929 roku.Jednak po około 30 latach patogen został określony jako Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld w Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld w ukierunkowanej morfologii. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .i H. Schrenka. & H.施伦克，. & H.施伦克，.i H. Schlenka, .Wstępne fenotypowanie choroby przeprowadzone w połowie XX wieku wykazało pewną oporność u łubinu żółtego i łubinu żółtego (L. luteus L.), ale wszystkie testowane przyrosty łubinu białego (L. albus L.) były bardzo podatne15,16.Badania wykazały, że rozwój antraknozy związany jest ze zwiększonymi opadami (wilgotnością powietrza) i temperaturą (w zakresie 12-28°C), co prowadzi do naruszenia odporności w wyższych temperaturach17,18. W rzeczywistości czas potrzebny do wykiełkowania konidiów i rozpoczęcia choroby był czterokrotnie krótszy w temperaturze 24°C (4 godziny) niż w temperaturze 12°C (16 godzin) w warunkach wysokiej wilgotności19.Tak więc postępujące globalne ocieplenie doprowadziło do rozprzestrzenienia się antraknozy.Chorobę zaobserwowano jednak we Francji (1982) i na Ukrainie (1983) jako zwiastun zbliżającego się zagrożenia, ale najwyraźniej została zignorowana przez ówczesny przemysł łubinowy20,21.Kilka lat później ta wyniszczająca choroba rozprzestrzeniła się na cały świat i dotknęła również główne kraje produkujące łubin, takie jak Australia, Polska i Niemcy22,23,24.Po wybuchu antraknozy w połowie lat 90. szeroko zakrojone badania przesiewowe doprowadziły do ​​zidentyfikowania kilku opornych dawców w próbkach NLL19.Odporność NLL na antraknozę jest kontrolowana przez dwa odrębne dominujące allele występujące w różnych źródłach plazmy zarodkowej: Lanr1 u odmiany Tanjil i Wonga oraz AnMan u odmiany.Mandalay 25, 26. Allele te uzupełniają markery molekularne, które wspierają selekcję opornej plazmy zarodkowej w programach hodowlanych25,26,27,28,29,30.Odporna linia hodowlana 83A:476 niosąca allel Lanr1 została skrzyżowana z podatną linią dziką P27255 w celu uzyskania populacji RIL segregującej pod kątem oporności na antraknozę, co umożliwiło przypisanie locus Lanr1 do chromosomu NLL-1131, 32, 33. Wyrównanie markerów mapy powiązań od flankujących loci odporności do antraknozy ze zrębem genomowym, NLL ujawniło lokalizację wszystkich trzech alleli na ten sam chromosom (NLL-11), ale w różnych pozycjach29,34,35.Jednak ze względu na niewielką liczbę RIL i dużą odległość genetyczną między markerami a odpowiadającymi im allelami nie można wyciągnąć wiarygodnych wniosków na temat genów leżących u ich podstaw.Z drugiej strony zastosowanie genetyki odwrotnej u łubinów jest utrudnione ze względu na ich bardzo niski potencjał regeneracyjny, co sprawia, że ​​manipulacje genetyczne są uciążliwe37.
Rozwój udomowionej plazmy zarodkowej niosącej pożądany allel w stanie homozygotycznym, takim jak 83A: 476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), otworzył drzwi do badania oporności na antraknozę w obliczu obecności przeciwstawnych kombinacji alleli w dzikich populacjach.Możliwości mechanizmów molekularnych.Porównaj reakcje obronne generowane przez określone genotypy.W badaniu tym oceniano wczesną odpowiedź transkryptomu NLL na szczepienie C. lupini.Najpierw przeszukano europejski panel plazmy zarodkowej NLL zawierający 215 linii przy użyciu markerów molekularnych, które oznaczają allele Lanr1 i AnMan.Następnie przeprowadzono fenotypowanie antraknozy na 50 liniach NLL, uprzednio wybranych do markerów molekularnych, w kontrolowanych warunkach.Na podstawie tych eksperymentów wybrano cztery linie różniące się opornością na antraknozę i składem alleli Lanr1/AnMan do profilowania ekspresji genów obrony różnicowej przy użyciu dwóch uzupełniających się podejść: wysokowydajnego sekwencjonowania RNA i kwantyfikacji PCR w czasie rzeczywistym.
Badanie przesiewowe zestawu plazmy zarodkowej NLL (N = 215) z markerami Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) i AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) wykazało, że tylko jedna linia (95726, w pobliżu Salamanca-b) wzmacnia allel „oporności” dla wszystkich markerów, podczas gdy „Obecność alleli„ wrażliwych ”” znalazła odsetek wszystkich markerów w 158 (~ 7 linie 3,5%).Trzynaście linii wytworzyło dwa „odporne” allele markera Lanr1, a 8 linii wytworzyło „odporne” allele Lanr1.znacznik.Allel „oporności” markera AnMan (tabela uzupełniająca S1).Dwie linie były heterozygotyczne pod względem markera Anseq3 i jedna heterozygotyczna pod względem markera AnManM1.42 linie (19,5%) miały przeciwne fazy alleli Anseq3 i Anseq4, co wskazuje na wysoką częstość rekombinacji między tymi dwoma loci.Fenotypy antraknozy w kontrolowanych warunkach (tabela uzupełniająca S2) ujawniły zmienność odporności testowanych genotypów, co znalazło odzwierciedlenie w nasileniu antraknozy.Różnice w średnich wynikach wahały się od 1,8 (umiarkowanie odporne) do 6,9 (wrażliwe), a różnice masy roślin wahały się od 0,62 (wrażliwe) do 4,45 g (odporne). Wystąpiła istotna korelacja między wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach doświadczenia (0,51 dla ocen nasilenia choroby, P = 0,00017 i 0,61 dla masy roślin, P < 0,0001), jak również między tymi dwoma parametrami (-0,59 i - 0,77, P < 0,0001). Wystąpiła istotna korelacja między wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach doświadczenia (0,51 dla ocen ciężkości choroby, P = 0,00017 i 0,61 dla masy roślin, P < 0,0001) oraz między tymi dwoma parametrami (− 0,59 i − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 дл я баллов тяжести болезни, P = 0,00017 i 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0, 59 i -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Stwierdzono istotną korelację między wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach doświadczenia (0,51 dla ocen ciężkości choroby, P = 0,00017 i 0,61 dla masy roślin, P < 0,0001), a także między tymi dwoma parametrami (- 0,59 i -0,77, P < 0,0001) 0,0001).P = 0,00017物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0.5 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 , p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыmi в двух повторностях (оценка тяж ести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P < 0,0001. Wystąpiła istotna korelacja między wartościami obserwowanymi w dwóch powtórzeniach (ocena ciężkości choroby 0,51, P = 0,00017 i masa rośliny 0,61, P < 0,0001) oraz między tymi dwoma parametrami (-0,59 i -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Typowe objawy obserwowane u podatnych roślin obejmują zaginanie i skręcanie łodygi przypominające strukturę „łuku pasterskiego”, a następnie owalne zmiany chorobowe z pomarańczowo-różowymi sporozoitami (rys. Uzupełniająca 1).Akcesje australijskie niosące geny Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) są umiarkowanie odporne, 0,0331 i 0,0036).Niektóre linie, które również niosą „odporne” allele Lanr1 i/lub AnMan, wykazują objawy choroby.
Co ciekawe, kilka linii NLL pozbawionych jakiegokolwiek „odpornego” allelu markerowego wykazało wysoki poziom odporności na antraknozę (porównywalny lub wyższy niż w przypadku genotypów Lanr1 lub AnMan), takich jak Boregine (wartość P <0,0001 dla obu parametrów), Bojar (wartość P <0,0001 dla wyniku i 0,001 dla masy rośliny) i populacja B-549/79b (wartość P <0,0001 dla wyniku i nie- istotne dla wagi). Co ciekawe, kilka linii NLL pozbawionych jakiegokolwiek „odpornego” allelu markerowego wykazało wysoki poziom odporności na antraknozę (porównywalny lub wyższy niż w przypadku genotypów Lanr1 lub AnMan), takich jak Boregine (wartość P <0,0001 dla obu parametrów), Bojar (wartość P <0,0001 dla wyniku i 0,001 dla masy rośliny) i populacja B-549/79b (wartość P <0,0001 dla wyniku i nie- istotne dla wagi). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уров ень устойчивости к антракнозу (сопоставимый lub более высокий, чем для генотипов Lanr1 lub AnMan), tak jak Boregine (значение P <0 ,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) i популяции B-549/79b (з начение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Co ciekawe, kilka linii NLL pozbawionych jakiegokolwiek „odpornego” allelu markerowego wykazało wysoki poziom odporności na antraknozę (porównywalny lub wyższy niż dla genotypów Lanr1 lub AnMan), takich jak Boregine (wartość P < 0,0001 dla obu parametrów), Bojar (wartość P < 0,0001 dla oceny i 0,001 dla masy rośliny) i populacja B-549/79b (wartość P < 0,0001 dla oceny i nie istotne dla wagi).有趣的是，一些缺乏任何„抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0. 001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）. Co ciekawe, niektóre systemy NLL, które nie mają żadnych „antygenowych” markerów, wykazują wysoką odporność poziomą (równoważną genom Lanr1 lub AnMan lub wyższą), takie jak Boregine (oba parametry P < 0,0001), Bojar (wartość P < 0,0001, masa rośliny 0,001) i szczep B-549/79b (wartość P < 0,0001, waga nieistotna). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уров ни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 lub AnMan), tak jak Boregine (значение P для обоих парамет ров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незна чительна). Co ciekawe, niektóre linie NLL pozbawione jakichkolwiek alleli markerów „odporności” wykazały wysokie poziomy oporności antracnozowej (porównywalne z genotypami Lanr1 lub Anman), takie jak boregine (wartość P dla obu parametrów <0,0001), Bojar (wartość p <0,0001, masa rośliny 0,001) i populacja B-549/79b (P-0,0001), Bojar (wartość p <0,0001, masa rośliny 0,001) i populacja B-549/79b (P-0,0001, niewielka waga).Zjawisko to sugeruje możliwość nowego genetycznego źródła oporności, wyjaśniając obserwowany brak korelacji między genotypami markerowymi a fenotypami choroby (wartości P od ~0,42 do ~0,98).Tak więc test Kołmogorowa-Smirnowa wykazał, że dane dotyczące odporności na antraknozę były w przybliżeniu normalnie rozłożone dla wyników (wartości P 0,25 i 0,11) i masy roślin (wartości P 0,47 i 0,55), co sugeruje, że stawiam hipotezę, że zaangażowanych jest więcej alleli niż Lanr1 i AnMan.
Na podstawie wyników badania przesiewowego oporności na antraknozę wybrano 4 linie do analizy transkryptomu: 83A:476, Boregine, Mandelup i populacja 22660. Linie te ponownie przetestowano pod kątem oporności na wąglika w eksperymentach inokulacji przez sekwencjonowanie RNA, pod warunkiem, że były takie same jak w poprzednim teście.Wartości punktacji przedstawiały się następująco: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i populacja 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokół Illumina NovaSeq 6000 osiągnął średnio 40,5 par Mread na próbkę (29,7 do 54,4 Mreads) (tabela uzupełniająca S3).Wyniki wyrównania w sekwencji referencyjnej wahały się od 75,5% do 88,6%.Średnia korelacja danych zliczania odczytów między wariantami eksperymentalnymi między powtórzeniami biologicznymi wahała się od 0,812 do 0,997 (średnia 0,959). Spośród 35 170 analizowanych genów 2917 nie wykazywało ekspresji, a ekspresja pozostałych 4785 genów była na znikomym poziomie (średnia podstawowa < 5). Spośród 35 170 analizowanych genów 2917 nie wykazywało ekspresji, a ekspresja pozostałych 4785 genów była na znikomym poziomie (średnia podstawowa < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а ostalьные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Spośród 35 170 analizowanych genów 2917 nie wykazywało ekspresji, a pozostałe 4785 genów ulegało ekspresji na znikomym poziomie (średnia podstawowa <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Spośród 35 170 analizowanych genów 2917 nie uległo ekspresji, a pozostałe 4785 genów miało ekspresję znikomą (średnia podstawowa <5).Zatem liczba genów uważanych za ekspresjonowanych (średnia podstawowa ≥ 5) podczas eksperymentu wyniosła 27 468 (78, 1%) (tabela uzupełniająca S4).
Od pierwszego punktu czasowego wszystkie linie NLL odpowiedziały na inokulację C. lupini (szczep Col-08) przez przeprogramowanie transkryptomu (Tabela 1), jednak zaobserwowano znaczące różnice między liniami.Zatem linia odporności 83A:476 (niosąca gen Lanr1) wykazała znaczące przeprogramowanie transkryptomu w pierwszym punkcie czasowym (6 hpi) z 31-69-krotnym wzrostem liczby izolowanych genów w górę iw dół w porównaniu z innymi punktami czasowymi w tym punkcie czasowym.Ponadto ten szczyt był krótkotrwały, ponieważ ekspresja tylko kilku genów pozostała znacząco zmieniona w drugim punkcie czasowym (12 hpi).Co ciekawe, Boregine, który również wykazywał wysoki poziom oporności w teście przeszczepu, nie przeszedł podczas eksperymentu tak masowego przeprogramowania transkrypcji.Jednak liczba genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) była taka sama dla Boregine i 83A:476 przy 12 HPI.Zarówno Mandelup, jak i populacja 22660 wykazywały piki DEG w ostatnim punkcie czasowym (48 l/s), co wskazuje na względne opóźnienie odpowiedzi obronnych.
Ponieważ 83A: 476 przeszedł masowe przeprogramowanie transkryptomu w odpowiedzi na C. lupini przy 6 HPI w porównaniu ze wszystkimi innymi liniami, ~ 91% DEG obserwowanych w tym punkcie czasowym było specyficznych dla linii (ryc. 1).Jednak wczesne reakcje między badanymi liniami w pewnym stopniu pokrywały się, ponieważ odpowiednio 68,5%, 50,9% i 52,6% DEG w Boregine, Mandelup i populacji 22660 pokrywało się z tymi znalezionymi w 83A:476 w pewnych punktach czasowych.Jednak te DEG stanowiły tylko niewielką część (0,97–1,70%) wszystkich DEG obecnie wykrywanych przy użyciu 83A: 476.Ponadto 11 DEG ze wszystkich linii było w tym czasie spójnych (tabele uzupełniające S4-S6), w tym wspólne składniki odpowiedzi obronnych roślin: białko przenoszące lipidy (TanjilG_32225), enzym endoglukan-1,3-β-glukozyd (TanjilG_23384), dwa białka indukowane stresem, takie jak SAM22 (TanjilG_31528 i TanjilG_31531), podstawowe białko lateksowe (TanjilG_32352) i dwa bogate w glicynę strukturalne białka ściany komórkowej (TanjilG_19701 i TanjilG_19702).Istniało również stosunkowo duże nakładanie się odpowiedzi transkryptomu między 83A:476 i Boregine przy 24 HPI (łącznie 16-38% DEG) oraz między Mandelupem i populacją 22660 przy 48 HPI (łącznie 14-20% DEG).
Diagram Venna przedstawiający liczbę genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) w liniach łubinu wąskolistnego (NLL) zaszczepionych Colletotrichum lupini (szczep Col-08 uzyskany z pól łubinowych w Wierzhenicach, Polska, 1999).Analizowane linie NLL to: 83A:476 (odporne, niosące allel Lanr1), Boregine (odporne, podłoże genetyczne nieznane), Mandelup (umiarkowanie odporne, niosące allel AnMan) i populacja 22660 (bardzo wrażliwa).Skrót hpi oznacza godziny po szczepieniu.Wartości zerowe zostały usunięte w celu uproszczenia wykresu.
Zestaw nadeksprymowanych genów przy 6 hpi analizowano pod kątem obecności kanonicznych domen genów R (tabela uzupełniająca S7).To badanie ujawniło indukcję transkryptomu klasycznych genów odporności na choroby z domenami NBS-LRR tylko w 83A: 476.Ten zestaw składał się z jednego genu TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), pięciu genów CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 i tanjilg_16162) oraz czterech NBS-LR, Tanjilg_16162) i czterech NBS-LRRE (tanjilg_16162) a także Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) i Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Wszystkie te geny mają domeny kanoniczne ułożone w konserwatywne sekwencje.Oprócz genów domeny NBS-LRR kilka kinaz RLL aktywowano przy 6 HPi, a mianowicie jeden w boregine (Tanjilg_19877), dwa w mandelup (Tanjilg_07141 i Tanjilg_19877) oraz w populacji 22660 (Tanjilg_09014 i
Geny o znacząco zmienionej ekspresji w odpowiedzi na inokulację C. lupini (szczep Col-08) poddano analizie wzbogacania Gene Ontology (GO) (tabela uzupełniająca S8). Najczęściej nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego była „GO: 0006952 odpowiedź obronna”, która pojawiła się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość P <0, 001) (ryc. 2). Najczęściej nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego była „GO: 0006952 odpowiedź obronna”, która pojawiła się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość P <0, 001) (ryc. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным terminom биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», ко торый появлялся в 6 z 16 (значение P <0,001) (ryc. 2). Najczęściej nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego była „GO: 0006952 odpowiedź obronna”, która pojawiła się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość P <0, 001) (ryc. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”, 它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Najbardziej reprezentatywnym terminem procesu biologicznego jest „GO: 0006952 odpowiedź obronna”, która pojawia się w 6 z 16 (时间×线) kombinacji, z dużą istotnością (wartość P <0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным terminom биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появля лся в 6 z 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (ryc. 2). Najczęściej nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego był „GO: 0006952 Odpowiedź obronna”, który pojawił się w 6 z 16 kombinacji (czas × linia) o wysokim znaczeniu (wartość P <0, 001) (ryc. 2).Termin ten był nadreprezentowany w dwóch punktach czasowych w 83A: 476 i Boregine (6 i 24 hpi) oraz w jednym punkcie czasowym w Mandelup i populacji 22660 (odpowiednio 12 i 6 hpi).Jest to oczekiwany wynik, podkreślający odpowiedź przeciwgrzybiczą opornych linii.Ponadto 83A:476 odpowiedział na C. lupini przez szybką indukcję genów związanych z wybuchem oksydacyjnym reprezentowanym przez termin „GO:0055114 proces redoks”, wskazujący na specyficzną odpowiedź obronną, podczas gdy Boregine ujawnił specyficzne reakcje obronne, związane z terminem „GO”.:0006950 Reakcja na stres”.Populacja 22660 aktywowała odpowiedź odporności poziomej z udziałem metabolitów wtórnych, podkreślając nadmierną liczbę terminów „GO:0016104 Proces biosyntezy triterpenów” i „GO:0006722 Proces metabolizmu triterpenów” (oba terminy należą do tego samego zestawu genów), biorąc pod uwagę wyniki analizy wzbogacenia terminu GO, stabilność reakcji Mandelupa była między Boregine a populacją 22660. Ponadto wczesna reakcja 83A :476 (6 hpi) i opóźniona reakcja Mandelup i populacja 22660 zawierają termin GO:0015979 „fotosynteza” i inne powiązane procesy biologiczne.
Terminy ontologii genów bioprocesowych wybrane w adnotacji genów o zróżnicowanej ekspresji podczas odpowiedzi transkryptomu łubinu wąskolistnego (NLL) zaszczepionego łubinem wąglika (szczep Col-08 uzyskany z pól łubinowych w Wierzhenicach w Polsce w 1999 r.) są mocno przesadzone.Analizowane linie NLL to: 83A:476 (odporne, niosące homozygotyczny allel Lanr1), Boregine (odporne, nieznane podłoże genetyczne), Mandelup (umiarkowanie odporne, niosące homozygotyczny allel AnMan) i populacja 22660 (wrażliwe).
Ponieważ badanie to miało na celu identyfikację genów, które przyczyniają się do oporności na antraknozę, geny przypisane do terminów GO „GO: 0006952 Reakcje obronne” i „GO: 0055114 Procesy redoks” analizowano z wartościami odcięcia od wartości wyjściowych średnich ≥ 30 z co najmniej jedną linią.× punkt w czasie łączący statystycznie istotne wartości log2 (krotność zmiany).Liczba genów spełniających te kryteria wynosiła 65 dla GO:0006952 i 524 dla GO:0055114.
83A:476 ujawnił dwa piki DEG oznaczone terminem GO:0006952, pierwszy przy 6 genach na cal (64 geny, regulacja w górę iw dół), a drugi przy 24 genach na cal (15 genów, tylko regulacja w górę).Boregine wykazał również, że GO:0006952 osiągnął szczyt w tym samym punkcie czasowym, ale z mniejszą liczbą DEG (11 i 8) i preferencyjną aktywacją.Mandeloop wykazał dwa piki GO:0006952 przy 12 i 48 HPI, oba niosące 12 genów (pierwszy z genami aktywującymi, a drugi tylko z genami supresyjnymi), podczas gdy populacja 22660 przy 6 HPI (13 genów) miała większą przewagę piku wzrostu.rozporządzenie.Należy zauważyć, że 96,4% GO: 0006952 DEG w tych pikach miało ten sam typ odpowiedzi (w górę lub w dół), co wskazuje na znaczne nakładanie się odpowiedzi obronnych pomimo różnic w liczbie zaangażowanych genów.Największa grupa sekwencji związanych z terminem GO: 0006952 koduje białko wiadomości związane ze stresem głodowym 22 (podobne do SAM22), które należy do kladu białek związanych z patogenezą (PR-10) klasy 10 i lateksu białka rdzeniowego.podobne (podobne do MLP) białko (ryc. 3).Obie grupy różniły się charakterem wypowiedzi i kierunkiem reakcji.Geny kodujące białka podobne do SAM22 wykazywały spójną i znaczącą indukcję we wczesnych punktach czasowych (6 lub 12 hpi) i generalnie nie reagowały na koniec eksperymentu (48 hpi), podczas gdy białka podobne do MLP wykazywały koordynację przy 6 hpi.hpi.83A:476 i Mandelupa przy 48 KM/cal, prawie wszystkie inne punkty danych nie reagowały.Ponadto różnice w profilach ekspresji genów białek podobnych do SAM22 podążały za obserwowaną zmiennością oporności na antraknozę, ponieważ bardziej odporne linie miały więcej punktów czasowych znacząco indukujących te geny niż geny bardziej podatne.Inny gen PR-10 podobny do L1R18A/B wykazywał bardzo podobny wzorzec ekspresji do genu białka podobnego do SAM22.
Zidentyfikowano główne składniki procesu biologicznego, określanego terminem „GO: 0006952 Defense Response” oraz wzorce ekspresji genów kandydujących alleli Lanr1 i AnMan.Skala Log2 reprezentuje wartości log2 (krotność zmiany) między zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu, Wizhenica, Polska, 1999) i kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) roślinami w tym samym punkcie czasowym.Analizie poddano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporne, niosące homozygotyczny allel Lanr1), Boregine (odporne, podłoże genetyczne nieznane), Mandelup (umiarkowanie odporne, niosące homozygotyczny allel AnMan) i populacja 22660 (wrażliwe).
Ponadto oceniono profile ekspresji genów kandydujących na sekwencję RNA Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (ryc. 3).Gen TanjilG_05042 wykazał znaczącą odpowiedź (aktywację) przy 83A: 476 tylko w pierwszym punkcie czasowym (6 hpi), podczas gdy TanjilG_12861 był znaczący w Mandeloop tylko w dwóch punktach czasowych: 6 hpi (regulacja w dół) i 24 hpi (6 hpi).Z.).regulowany) ).
Najbardziej nadeksprymowanymi genami w terminie GO: 0055114 „proces redoks” były geny kodujące białka cytochromu P450 i peroksydazę (ryc. 4).W przypadku próbek wyizolowanych z 83A:476 przy 6 HPI, maksymalne lub minimalne wartości log2 (krotna zmiana) (dla 86,6% genów) były generalnie obserwowane między roślinami inokulowanymi i kontrolnymi, co podkreśla wysoką odpowiedź tego genotypu na płeć inokulacyjną.83A:476 wykazało najbardziej znaczące GO: 0055114 DEG przy 6 hpi (503 geny), podczas gdy pozostałe linie przy 48 hpi (Boregine, 31 genów; Mandelup, 85 genów; i populacja 22660, 78 genów)).W większości genów z rodziny GO:0055114 zaobserwowano dwa rodzaje odpowiedzi na szczepienie (aktywację i inhibicję).Co ciekawe, do 97,6% DEG zidentyfikowanych dla terminu GO: 0055114 w Mandelupe przy 48 hp Obserwacje te sugerują, że pomimo znacznie mniejszej skali (tj. liczby zmutowanych genów redoks, 85 w porównaniu z 503), wzorzec opóźnionych odpowiedzi transkryptomu mandelupy na antraknozę jest podobny do wczesnej odpowiedzi 83A:476.W Boregine i populacji 22660 zbieżność ta jest niższa i wynosi odpowiednio 51,6% i 75,6%.
Ujawniono wzorce ekspresji głównych składników terminu procesu biologicznego „GO:0055114 proces redoks”.Skala Log2 reprezentuje wartości log2 (krotność zmiany) między zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu, Wizhenica, Polska, 1999) i kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) roślinami w tym samym punkcie czasowym.Analizie poddano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporne, niosące homozygotyczny allel Lanr1), Boregine (odporne, podłoże genetyczne nieznane), Mandelup (umiarkowanie odporne, niosące homozygotyczny allel AnMan) i populacja 22660 (wrażliwe).
83A:476 Odpowiedzi transkryptomiczne na inokulację C. lupini (szczep Col-08) obejmowały również skoordynowane wyciszanie genów przypisywanych terminowi GO:0015979 „fotosynteza” i innym pokrewnym procesom biologicznym (RYS. 5).Ten zestaw GO:0015979 DEG zawierał 105 genów, które uległy znaczącej represji przy 6 hpi przy 83A:476.W tym podzbiorze 37 genów zostało również obniżonych w Mandelup przy 48 HPI i 35 w tym samym punkcie czasowym w populacji 22660, w tym 19 DEG wspólnych dla obu genotypów.Żadne DEG związane z terminem GO: 0015979 nie zostały znacząco aktywowane w dowolnej kombinacji (linia x czas).
Ujawniono wzorce ekspresji głównych składników terminu procesu biologicznego „GO: 0015979 Fotosynteza”.Skala Log2 reprezentuje wartości log2 (krotność zmiany) między zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu, Wizhenica, Polska, 1999) i kontrolnymi (pozornie zaszczepionymi) roślinami w tym samym punkcie czasowym.Analizie poddano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporne, niosące homozygotyczny allel Lanr1), Boregine (odporne, podłoże genetyczne nieznane), Mandelup (umiarkowanie odporne, niosące homozygotyczny allel AnMan) i populacja 22660 (wrażliwe).
Na podstawie wyników analizy różnicowej ekspresji i przypuszczalnie zaangażowanych w reakcje obronne przeciwko grzybom chorobotwórczym, ten zestaw siedmiu genów wybrano do ilościowego określenia profili ekspresji za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (tabela uzupełniająca S9).
Domniemany gen białka TanjilG_10657 był istotnie indukowany we wszystkich badanych liniach i punktach czasowych w porównaniu z roślinami kontrolnymi (naśladującymi) (tabele uzupełniające S10, S11).Ponadto profil ekspresji TanjilG_10657 wykazywał tendencję wzrostową w trakcie eksperymentu dla wszystkich linii.Populacja 22660 wykazała najwyższą wrażliwość TanjilG_10657 na inokulację z 114-krotną aktywacją i najwyższym względnym poziomem ekspresji (4, 4 ± 0, 4) przy 24 HPI (ryc. 6a).Gen białka PR10 LlR18A TanjilG_27015 również wykazał aktywację we wszystkich liniach i punktach czasowych, ze statystyczną istotnością w większości punktów danych (ryc. 6b).Podobnie jak TanjilG_10657, najwyższy względny poziom ekspresji TanjilG_27015 zaobserwowano w zaszczepionej populacji 22660 przy 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gen kwaśnej endochitynazy TanjilG_04706 był znacząco zwiększony we wszystkich liniach i we wszystkich punktach czasowych z wyjątkiem Boregine 6 hpi (ryc. 6c).Była silnie indukowana w pierwszym punkcie czasowym (6 HPI) przy 83A:476 (10,5-krotnie) i umiarkowanie wzrastała w pozostałych liniach (6,6-7,5-krotnie).Podczas eksperymentu ekspresja TanjilG_04706 utrzymywała się na zbliżonym poziomie w 83A:476 i Boregine, natomiast w Mandelup i Population 22660 znacznie wzrosła, osiągając stosunkowo wysokie wartości (odpowiednio 5,9 ± 1,5 i 6,2 ± 1,5).Gen endoglukan-1,3-β-glukozydazy podobny do TanjilG_23384 wykazywał wysoką aktywację w pierwszych dwóch punktach czasowych (6 i 12 hpi) we wszystkich liniach z wyjątkiem populacji 22660 (ryc. 6d).Najwyższe względne poziomy ekspresji TanjilG_23384 zaobserwowano w drugim punkcie czasowym (12 hpi) w Mandelup (2,7 ± 0,3) i 83A: 476 (1,5 ± 0,1).Przy 24 HPI ekspresja TanjilG_23384 była stosunkowo niska we wszystkich badanych liniach (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profile ekspresji wybranych genów (ag) ujawnione metodą ilościowego PCR.Liczby 6, 12 i 24 oznaczają godziny po szczepieniu.Geny LanDExH7 i LanTUB6 zastosowano do normalizacji, a LanTUB6 do kalibracji między seriami.Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe na podstawie trzech replik biologicznych, z których każda jest średnią z trzech replik technicznych. Powyżej punktów danych zaznaczono istotność statystyczną różnic w poziomach ekspresji między roślinami zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany w 1999 r. z pola łubinu w Wierzenicy, Polska) a kontrolnymi (zaszczepionymi próbnie) (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001). Powyżej punktów danych zaznaczono istotność statystyczną różnic w poziomach ekspresji między roślinami zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany w 1999 r. z pola łubinu w Wierzenicy, Polska) a kontrolnymi (zaszczepionymi próbnie) (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statystycznie istotne różnice w poziomach ekspresji między roślinami zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany w 1999 r. z pola łubinu w Wierzhenicach, Polska) i kontrolnymi (zaszczepionymi pozornie) odnotowano powyżej punktów danych (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差 异 的 统 计 学 显 着 性 标 记 数 据 点 上 方 上 方 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученн ый с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г). nad точками данных (* значение P < 0,05, ** P- значение ≤ 0,01, *** P- значение ≤ 0,001). Statystycznie istotne różnice w poziomach ekspresji między zaszczepionymi (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, uzyskany z pól łubinu w Verzhenice, Polska, w 1999 r.) i kontrolnymi (zaszczepionymi pozornie) roślinami odnotowano powyżej punktów danych (*wartość P < 0,05, **wartość P ≤ 0,01, ***wartość P ≤ 0,001).Analizowane linie NLL to: 83A:476 (oporne, niosące homozygotyczny allel Lanr1), Mandelup (umiarkowanie oporne, niosące homozygotyczny allel AnMan), Boregine (oporne, nieznane tło genetyczne) i populacja 22660 (wrażliwe).
Kandydujący gen TanjilG_05042 w locus Lanr1 wykazywał wyraźnie inny wzór ekspresji niż profile uzyskane z badań RNA-seq (ryc. 6e).Znaczącą aktywację tego genu zaobserwowano w populacji Mandelup i 22660 (odpowiednio do 39,7 i 11,7 razy), co skutkowało stosunkowo wysokimi poziomami ekspresji (odpowiednio do 1,4 ± 0,14 i 7,2 ± 1,3).83A:476 również ujawniło pewną regulację w górę genu TanjilG_05042 (do 3,8-krotności), jednak osiągnięte względne poziomy ekspresji (0,044 ± 0,002) były ponad 30-krotnie niższe niż obserwowane w populacji Mandelup i 22660.analizowane za pomocą qPCR wykazały znaczące różnice w poziomach ekspresji między genotypami w wariantach szczepionych pozornie (kontrolnych), osiągając 58-krotną różnicę między populacjami 22660 i 83A: 476, a także między populacjami 22660 i 22660. Osiągnięto dwukrotną różnicę między Boregine i Mandalup.
Gen kandydujący w locus AnMan, TanjilG_12861, został aktywowany w odpowiedzi na szczepienie w 83A: 476 i Mandelup, był neutralny w populacji 22660 i został obniżony w Boregine (ryc. 6f).Względna ekspresja genu TanjilG_12861 była najwyższa w inokulowanym 83A: 476 (0,14±0,01).Gen białka szoku cieplnego klasy I o masie 17, 4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 wykazywał niższe względne poziomy ekspresji we wszystkich badanych szczepach i punktach czasowych (ryc. 6g).Najwyższą wartość zaobserwowano przy 24 HPI w populacji 22660 (0,14 ± 0,02, ośmiokrotny wzrost odpowiedzi na szczepienie).
Porównanie profili ekspresji genów (ryc. 7) ujawniło wysoką korelację między TanjilG_10657 a czterema innymi genami: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) i TanjilG_04706 (r = 0,79).Takie wyniki mogą wskazywać na współregulację tych genów podczas reakcji obronnych.Geny TanjilG_12861 i TanjilG_23384 wykazywały różne profile ekspresji z niższymi wartościami współczynnika korelacji Pearsona (odpowiednio od 0,08 do 0,43 i -0,19 do 0,28) w porównaniu z innymi genami.
Korelacje między profilami ekspresji genów wykryto za pomocą ilościowego PCR.Analizie poddano następujące linie łubinu wąskolistnego: 83A:476 (odporne, niosące homozygotyczny allel Lanr1), Mandelup (umiarkowanie odporne, niosące homozygotyczny allel AnMan), Boregine (odporne, podłoże genetyczne nieznane) i populacja 22660 (wrażliwe).Obliczono trzy punkty czasowe (6, 12 i 24 godziny po inokulacji), w tym inokulowane (Colletotrichum lupini, szczep Col-08, pozyskane z pól łubinowych w Wierzhenicach, Polska, w 1999 r.) oraz kontrolne (pozorowane).Skala pokazuje wartość współczynnika korelacji Pearsona.
Na podstawie danych uzyskanych przy 6 koni mechanicznych na cal, WGCNA przeprowadzono na 9981 DEG zidentyfikowanym przez porównanie zaszczepionych i kontrolnych roślin, aby skupić się na wczesnych reakcjach obronnych (tabela uzupełniająca S12).Znaleziono dwadzieścia dwa moduły genów (skupiska) ze skorelowanymi (dodatnimi lub negatywnymi) profilami ekspresji między genotypami a wariantami eksperymentalnymi. Średnio poziomy ekspresji genów spadały w kolejności 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (jednak w obu wariantach trend ten był silniejszy w roślinach kontrolnych). Średnio poziomy ekspresji genów spadały w kolejności 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (jednak w obu wariantach trend ten był silniejszy w roślinach kontrolnych). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Średnio poziomy ekspresji genów spadły w kolejności 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (jednak w obu wariantach trend ten był silniejszy w roślinach kontrolnych).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 的顺序下降（然而,在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强).平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populacja 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (однако в обоих вариантах эта тенден ция была сильнее у контрольных растений). Średnio poziomy ekspresji genów spadły w serii 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacja 22660 (jednak w obu wariantach trend ten był silniejszy w roślinach kontrolnych).Szczepienie skutkowało zwiększeniem ekspresji genów, zwłaszcza w modułach 18, 19, 14, 6 i 1 (w malejącej kolejności skutków), regulacją negatywną (np. moduły 9 i 20) lub efektami neutralnymi (np. moduły 11, 22, 8 i 13).Analiza wzbogacenia terminów GO (tabela uzupełniająca S13) ujawniła „GO: 0006952 Odpowiedzi ochronne” dla zaszczepionego modułu (18) z maksymalną aktywacją, w tym geny analizowane przez qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015), a także wiele najbardziej tłumionych modułów fotosyntezy Inoculate (9).Koncentrator modułu 18 (ryc. 8) zidentyfikowano jako gen TanjilG_26536 kodujący białko L1R18B podobne do PR-10, a koncentrator modułu 9 zidentyfikowano jako gen TanjilG_28955 kodujący białko fotosystemu II PsbQ.Kandydujący gen oporności na antraknozę Lanr1, TanjilG_05042, został znaleziony w module 22 (ryc. 9) i jest powiązany z terminami „GO: 0044260 komórkowe procesy metaboliczne makrocząsteczkowe” i „GO: 0006355 regulacja transkrypcji, szablonowanie DNA” niosące piastę TanjilG_01212.gen koduje czynnik transkrypcyjny stresu cieplnego A-4a (HSFA4a).
Ważona analiza sieci koekspresji genów modułów z nadreprezentowanymi terminami procesów biologicznych „GO: 0006952 Odpowiedzi obronne”.Ligację uproszczono, aby wyróżnić cztery geny analizowane przez qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Ważona analiza sieci koekspresji genów modułu z nadreprezentowanym terminem procesu biologicznego „GO: 0006355: regulacja transkrypcji, szablony DNA” i niosący kandydata na gen oporności na antraknozę Lanr1 TanjilG_05042.Ligację uproszczono, aby wyizolować gen TanjilG_05042 i centralny gen TanjilG_01212.
Badania przesiewowe odporności na antraknozę przeprowadzone w Australii wykazały, że większość wczesnych odmian była podatna;Kalya, Coromup i Mandelup zostali opisani jako umiarkowanie odporni, podczas gdy Wonga, Tanjil i 83A:476 zostali opisani jako wysoce odporni26,27,31.miał ten sam allel odporności, oznaczony jako Lanr1, a Coromup i Mandelup mieli inny allel, oznaczony jako AnMan10, 26, 39, podczas gdy Kalya przekazał inny allel., Lanr2.Badania przesiewowe pod kątem oporności na antraknozę w Niemczech doprowadziły do ​​identyfikacji odpornej linii Bo7212 z allelem kandydującym innym niż Lanr1, oznaczonym jako LanrBo36.
Nasze badanie wykazało bardzo niską częstość (około 6%) allelu Lanr1 w badanej plazmie zarodkowej.Ta obserwacja jest zgodna z wynikami badań przesiewowych wschodnioeuropejskiej plazmy zarodkowej przy użyciu markerów Anseq3 i Anseq4, które wykazały, że allel Lanr1 jest obecny tylko w dwóch białoruskich liniach.Sugeruje to, że allel Lanr1 nie jest jeszcze szeroko stosowany w lokalnych programach hodowlanych, w przeciwieństwie do Australii, gdzie jest jednym z kluczowych alleli w hodowli wspomaganej markerami.Może to wynikać z niższego poziomu odporności zapewnianej przez allel Lanr1 w europejskich warunkach polowych w porównaniu z raportem australijskim.Ponadto badania antraknozy na obszarach o dużych opadach deszczu w Australii wykazały, że reakcje odporności, w których pośredniczy allel Lanr1, mogą nie być skuteczne w warunkach pogodowych sprzyjających wzrostowi i szybkiemu rozwojowi patogenu19,42.W rzeczywistości w niniejszym badaniu pewne objawy antraknozy zaobserwowano również w genotypach niosących allel Lanr1, co sugeruje, że oporność może zanikać w optymalnych warunkach dla rozwoju C. lupini.Ponadto możliwe są fałszywie dodatnie interpretacje obecności markerów Anseq3 i Anseq4, które znajdują się około 1 cM od locus Lanr128,30,43.
Nasze badanie wykazało, że 83A: 476, niosący allel Lanr1, odpowiedział na inokulację C. lupini przeprogramowaniem transkryptomu na dużą skalę w pierwszym analizowanym punkcie czasowym (6 hpi), podczas gdy w Mandelup, niosącym allel AnMan, odpowiedzi transkryptomiczne zaobserwowano znacznie później.(od 24 do 48 KM).Te czasowe zmiany w reakcjach obronnych są związane z różnicami w objawach choroby, co podkreśla znaczenie wczesnego rozpoznania patogenu dla skutecznej odpowiedzi na oporność.Aby zainfekować tkankę roślinną, zarodniki wąglika muszą przejść przez kilka stadiów rozwojowych na powierzchni żywiciela, w tym kiełkowanie, podział komórek i tworzenie appressorium.Wyrostek to infekcyjna struktura, która przyczepia się do powierzchni żywiciela i ułatwia penetrację do tkanek żywiciela.Tak więc zarodniki C. gloeosporioides w ekstrakcie z grochu wykazywały pierwszy podział jądra po 75-90 minutach inkubacji, tworzenie się zarodka po 90-120 minutach i supresję po 4 godzinach 45 .Mango C. gloeosporioides wykazało ponad 40% kiełkowania konidiów po 3 godzinach inkubacji i około 20% tworzenia apresorów po 4 godzinach.Związany z wirulencją gen CAP20 z C. gloeosporioides wykazywał aktywność transkrypcyjną w konidiach tworzących epifity po 3,5 godz. inkubacji w wosku powierzchniowym z awokado z wysokimi stężeniami białka CAP20 po 4 godz. 46 min.Podobnie indukowano aktywność genów biosyntezy melaniny w C. trifolii podczas 2-godzinnej inkubacji, po której następowało tworzenie appressorium po 1 godzinie.Badania tkanek liści wykazały, że truskawki zaszczepione C. acutatum mają pierwszą supresję przy 8 hpi, podczas gdy pomidory zaszczepione C. coccodes mają pierwszą supresję przy 4 hpi48,49.w dużej mierze zgodne ze skalą czasową Colletotrichum spp.proces zakaźny.Szybkie odpowiedzi obronne na 83A:476 sugerują udział w tej linii genów odporności roślin i odporności wywołanej efektorami (ETI), podczas gdy opóźnione odpowiedzi Mandelupa potwierdzają hipotezę mikropowiązanej odporności wywołanej wzorcem molekularnym (MTI) 50. Wczesne odpowiedzi na 83A: 476 i Mandelup.Częściowe nakładanie się genów regulowanych w górę lub w dół w opóźnionej odpowiedzi również potwierdza tę koncepcję, ponieważ ETI jest często uważana za przyspieszoną i wzmocnioną odpowiedź MTI, której kulminacją jest zaprogramowana śmierć komórki w miejscu infekcji, znana jako wstrząs anafilaktyczny 51,52 .
Większość genów przypisywanych nadreprezentowanemu terminowi Gene Ontology GO: 0006952 „Reakcja obronna” to 11 homologów wywołanego stresem białka wiadomości na czczo 22 (podobnego do SAM22) i siedmiu głównych białek podobnych do lateksu (MLP).białka podobne do białek 31, 34, 43 i 423 wykazywały podobieństwo sekwencji.Geny podobne do SAM22 wykazywały znaczną aktywację, która trwała dłużej, wykazując zwiększone poziomy oporności na antraknozę (83A:476 i Boregine).Jednak geny podobne do MLP były regulowane w dół tylko w liniach niosących kandydujący allel oporności (83A: 476/Lanr1 przy 6 hpi i Mandelup/AnMan przy 24 hpi).Należy zauważyć, że wszystkie zidentyfikowane homologi podobne do SAM22 pochodzą z klastra genów obejmującego około 105 kb, podczas gdy geny podobne do MLP pochodzą z oddzielnych regionów genomu.Skoordynowaną aktywację takich genów podobnych do SAM22 stwierdzono również w naszym poprzednim badaniu odporności NLL na inokulację Diaporthetoxica, co sugeruje, że są one zaangażowane w poziome składniki odpowiedzi obronnej.Wniosek ten potwierdzają również doniesienia o pozytywnej odpowiedzi genów podobnych do SAM22 na uraz lub leczenie kwasem salicylowym, induktorami grzybów lub nadtlenkiem wodoru.
Wykazano, że geny podobne do MLP reagują na różne stresy abiotyczne i biotyczne, w tym infekcje bakteryjne, wirusowe i patogenne grzyby u wielu gatunków roślin55.Kierunki odpowiedzi na określone interakcje między roślinami a patogenami wahały się od silnie wzrastających (tj. podczas porażenia bawełny przez Verticillium dahliae) do znacznie malejących (tj. po porażeniu jabłoni przez Alternaria spp.)56,57.Znaczącą regulację w dół genu MLP-podobnego 423 zaobserwowano podczas obrony awokado przed infekcją F. niger oraz podczas infekcji jabłoni Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola i Alternaria alternata są patotypami jabłek58,59.Ponadto kalusy jabłoni z nadekspresją genu MLP-podobnego 423 miały niższą ekspresję genów związanych z opornością i były bardziej podatne na infekcje grzybicze59.Po Fusarium oxysporum f, gen 423 podobny do MLP był również tłumiony w opornej plazmie zarodkowej fasoli zwyczajnej.cn.Infekcja fasoli 60.
Innymi członkami rodziny PR-10 zidentyfikowanymi w naszym badaniu seq RNA były geny LlR18A i LlR18B w odpowiedzi na regulację w górę, jak również regulowany w górę (1 gen) lub regulowany w dół (3 geny) gen białka przenoszącego lipidy DIR1..Ponadto WGCNA podkreśla gen LlR18B jako centrum w tym module, który jest wysoce podatny na szczepienie i niesie kilka genów odpowiedzi ochronnej.Geny LlR18A i LlR18B były indukowane w liściach łubinu żółtego w odpowiedzi na bakterie chorobotwórcze, jak również w łodygach NLL po zaszczepieniu D. toxica, podczas gdy homolog ryżu tych genów, RSOsPR10, był szybko indukowany przez infekcję grzybiczą przypuszczalnie zaangażowaną w szlak sygnałowy kwasu jasmonowego53,61,62. Gen DIR1 koduje nieswoiste białka transportujące lipidy, które są wymagane do zapoczątkowania systemu oporność nabyta (SAR).Wraz z rozwojem reakcji ochronnych białko DIR1 jest transportowane z ogniska infekcji przez łyko, aby wywołać SAR w odległych narządach.Co ciekawe, gen TanjilG_02313 DIR1 był istotnie indukowany w pierwszym punkcie czasowym w liniach 84A:476 i populacji 22660, ale oporność na antraknozę rozwinęła się pomyślnie tylko w linii 84A:476.Może to wskazywać na pewną subfunkcjonalizację genu DIR1 w NLL, ponieważ pozostałe trzy homologi reagowały na inokulację tylko w linii 83A:476 przy 6 hpi, a odpowiedź ta była skierowana w dół.
W naszym badaniu najczęstszymi składnikami odpowiadającymi procesowi biologicznemu o nazwie „GO: 0055114 proces redoks” były białko cytochromu P450, peroksydaza, 9S-/13S-lipoksygenaza kwasu linolowego i oksydaza kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego.Ponadto nasza WGCNA definiuje homolog HSFA4a jako piastę niosącą moduły, takie jak kandydat genu oporności Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a jest składnikiem zależnej od redoks regulacji transkrypcji jądrowej w roślinach.
Białka cytochromu P450 to oksydoreduktazy, które katalizują reakcje hydroksylacji zależne od NADPH i/lub O2 w metabolizmie pierwotnym i wtórnym, w tym w metabolizmie ksenobiotyków, a także hormonów, kwasów tłuszczowych, steroli, składników ściany komórkowej, biopolimerów i biosyntezy związków ochronnych 69. 5.7 ze względu na dużą liczbę zmienionych homologów (37) i różnice we wzorcach odpowiedzi między określonymi genami, odzwierciedlające rewizję w górę..Wykorzystanie tylko danych RNA-seq do wyjaśnienia domniemanej funkcji biologicznej genów NLL w tak dużej nadrodzinie białek byłoby wysoce spekulatywne.Warto jednak zauważyć, że niektóre geny cytochromu P450 są związane ze zwiększoną odpornością na patogenne grzyby lub bakterie, w tym z udziałem w reakcjach alergicznych69,70,71.
Peroksydazy klasy III to wielofunkcyjne enzymy roślinne zaangażowane w szeroki zakres procesów metabolicznych podczas wzrostu i rozwoju roślin, a także w odpowiedzi na stresy środowiskowe, takie jak zasolenie, susza, duże natężenie światła i atak patogenów72.Peroksydazy biorą udział w interakcji kilku gatunków roślin z Anthracis, w tym Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,76.Reakcja jest bardzo szybka, czasem nawet przy 4 HPI, zanim grzyb wniknie w tkankę roślinną73.Gen peroksydazy również odpowiadał na inokulację D. toxica NLL.Oprócz swoich typowych funkcji regulujących wybuch oksydacyjny lub eliminujących stres oksydacyjny, peroksydazy mogą zakłócać wzrost patogenów poprzez tworzenie fizycznych barier opartych na wzmocnieniu ściany komórkowej podczas lignifikacji, tworzenia podjednostek lub sieciowania określonych związków.Funkcję tę można przypisać in silico genowi TanjilG_03329 kodującemu przypuszczalną peroksydazę anionową tworzącą ligninę, która była znacznie zwiększona w naszym badaniu w linii opornej na 83A: 476 przy 6 HPI, ale nie w innych szczepach i punktach czasowych, które nie reagowały.
9S-/13S-lipoksygenaza kwasu linolowego jest pierwszym etapem oksydacyjnego szlaku biosyntezy lipidów78.Produkty tego szlaku mają wiele funkcji w obronie roślin, w tym wzmacnianie ściany komórkowej poprzez tworzenie się złogów kalozy i pektyny oraz regulację stresu oksydacyjnego poprzez produkcję reaktywnych form tlenu79,80,81,82,83.W niniejszym badaniu ekspresja 9S-/13S-lipoksygenazy kwasu linolowego była zmieniona we wszystkich szczepach, ale w podatnej populacji 22660 regulacja w górę dominowała w różnych punktach czasowych, podczas gdy w szczepach niosących oporny allel Lanr1 i AnMan, podkreśla to zróżnicowanie warstwy oksylipiny w ochronnych reakcjach wąglika między tymi genotypami.
Homolog oksydazy 1-aminocyklopropano-1-karboksylanowej (ACO) był znacząco regulowany w górę (9 genów) lub regulowany w dół (2 geny) po zaszczepieniu łubinem.Z dwoma wyjątkami wszystkie te reakcje wystąpiły przy 6 KM.w 83A:476.Reakcja enzymatyczna, w której pośredniczą białka ACO, jest etapem ograniczającym szybkość produkcji etylenu i dlatego podlega ścisłej regulacji84.Etylen jest hormonem roślinnym, który odgrywa różne role w regulacji rozwoju roślin i odpowiedzi na abiotyczne i biotyczne warunki stresowe.Indukcja transkrypcji ACO i aktywacja szlaku sygnałowego etylenu są zaangażowane w zwiększanie odporności ryżu na hemibiotroficzny grzyb oryzae oryzae poprzez regulację produkcji reaktywnych form tlenu i fitoaleksyn.Bardzo podobny proces infekcji liści stwierdzony między M. oryzae i C. lupini88,89, na tle znacznej regulacji w górę homologów ACO w linii 83A: 476 opisanej w tym badaniu, przesuwa możliwość nadania oporności na antraknozę NLL etylenu jako centralnego etapu sygnalizacji w szlakach molekularnych.
W niniejszym badaniu supresję na dużą skalę wielu genów związanych z fotosyntezą zaobserwowano przy 6 hpi w 83A: 476 i przy 48 hpi w populacji Mandeloop i 22660.Zasięg i postęp tych zmian jest proporcjonalny do poziomu.W tym eksperymencie zaobserwowano oporność na antraknozę.Ostatnio doniesiono o silnej i wczesnej represji transkryptów związanych z fotosyntezą w kilku modelach interakcji roślina-patogen, w tym patogennych bakteriach i grzybach.Pośpiech (od 2 HPI w niektórych interakcjach) i globalna supresja genów związanych z fotosyntezą w odpowiedzi na infekcję może wywołać odporność roślin w oparciu o rozmieszczenie reaktywnych form tlenu i ich interakcję ze szlakiem kwasu salicylowego w celu pośredniczenia w reakcjach alergicznych 90,94.
Podsumowując, mechanizmy odpowiedzi obronnej proponowane dla najbardziej odpornej linii (83A:476) obejmują szybkie rozpoznanie patogenu przez gen R (prawdopodobnie TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) oraz sygnalizację kwasu salicylowego i etylenu za pośrednictwem odpowiedzi alergicznej, po której następuje ustanowienie SAR dalekiego zasięgu.działanie wspiera białko DIR-1.Należy zauważyć, że okres biotroficzny zakażenia C. lupini jest bardzo krótki (około 2 dni), po którym następuje wzrost nekrotyczny95.Przejście między tymi etapami może być związane z martwicą i ekspresją białek indukowanych etylenem, które działają jako wyzwalacze reakcji nadwrażliwości u roślin żywicielskich.Dlatego okno czasowe skutecznego schwytania C. lupini na etapie biotroficznym jest bardzo wąskie.Przeprogramowanie genów związanych z redoks i fotosyntezą obserwowane w 83A:476 przy 6 hpi jest zgodne z postępem strzępek grzybów i zwiastuje rozwój skutecznej odpowiedzi ochronnej na etapie biotroficznym.Odpowiedzi transkryptomiczne Mandelupa i populacji 22660 mogą być zbyt opóźnione, aby uchwycić grzyba przed przejściem do wzrostu nekrotycznego, jednak Mandelup może być bardziej skuteczny niż populacja 22660, ponieważ stosunkowo szybka regulacja białka PR-10 promuje opór poziomy.
ETI, napędzany kanonicznym genem R, wydaje się być powszechnym mechanizmem odporności fasoli na antraknozę.Tak więc w modelowej roślinie strączkowej Medicago truncatula odporność na antraknozę jest nadawana przez gen RCT1, należący do klasy genów roślinnych R TIR-NBS-LRR97.Gen ten nadaje również lucernie lucernie odporność na antraknozę o szerokim spektrum po przeniesieniu na podatne rośliny.Do tej pory w fasoli zwyczajnej (P. vulgaris) zidentyfikowano ponad dwa tuziny genów odporności na antraknozę.Niektóre z tych genów znajdują się w regionach pozbawionych jakichkolwiek kanonicznych genów R, jednak wiele innych znajduje się na krawędziach chromosomów niosących klaster genów NBS-LRR, w tym TIR-NBS-LRR99.Badanie SSR obejmujące cały genom potwierdziło również związek genu NBS-LRR z odpornością na antraknozę fasoli zwyczajnej.Kanoniczny gen R został również znaleziony w regionie genomowym niosącym główne locus odporności na antraknozę w łubinie białym 101.
Z naszej pracy wynika, że ​​natychmiastowa reakcja odporności, uruchamiana we wczesnym stadium porażenia roślin (najlepiej nie później niż 12 hpi), skutecznie chroni łubin wąskolistny przed antraknozą powodowaną przez patogennego grzyba Collelotrichum lupini.Wykorzystując wysokowydajne sekwencjonowanie, wykazaliśmy zróżnicowane profile ekspresji genów oporności na antraknozę w roślinach NLL, w których pośredniczą geny oporności Lanr1 i AnMan.Skuteczna obrona wymaga starannego zaprojektowania genów białek biorących udział w procesie redoks, fotosyntezie i patogenezie w ciągu kilku godzin od pierwszego kontaktu rośliny z patogenem.Podobne reakcje ochronne, ale opóźnione w czasie, są znacznie mniej skuteczne w ochronie roślin przed chorobami.Oporność na wąglika, w której pośredniczy gen Lanr1, przypomina typową szybką odpowiedź genu R (odporność wyzwalana przez efektor), podczas gdy gen AnMan najprawdopodobniej zapewnia odpowiedź poziomą (odporność wyzwalana przez wzór molekularny związany z mikrobami), zapewniając umiarkowany poziom trwałości.
215 linii NLL użytych do badań przesiewowych pod kątem markerów antraknozy składało się z 74 odmian, 60 linii uzyskanych przez krzyżowanie lub hodowlę, 5 mutantów i 76 dzikich lub oryginalnych plazm zarodkowych.Linie pochodziły z 17 krajów, głównie z Polski (58), Hiszpanii (47), Niemiec (27), Australii (26), Rosji (19), Białorusi (7), Włoch (5) i innych linii.z 10 krajów.Zestaw zawiera również referencyjne linie odporne: 83A:476, Tanjil, Wonga niosące allel Lanr1 i Mandelup niosące allel AnMan.Linie uzyskano z Europejskiej Bazy Danych Zasobów Genetycznych Łubinu prowadzonej przez Poznańską Hodowlę Roślin Ltd., Wiatrowo, Polska (tabela uzupełniająca S1).
Rośliny hodowano w warunkach kontrolowanych (fotoperiod 16 godzin, temperatura 25°C w dzień i 18°C ​​w nocy).Przeanalizowano dwa powtórzenia biologiczne.DNA wyizolowano z trzytygodniowych liści przy użyciu zestawu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z protokołem.Jakość i stężenie wyizolowanego DNA oceniano metodami spektrofotometrycznymi (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Analizowano marker AnManM1 oznaczający gen oporności na antraknozę AnMan (pochodzący z odmiany Mandelup) oraz markery Anseq3 i Anseq4 flankujące gen Lanr1 (pochodzący z odmiany Tanjil) 11,26,28.Homozygoty dla allelu opornego oceniono jako „1”, podatne – jako „0”, a heterozygoty – jako 0,5.
Na podstawie wyników badań przesiewowych pod kątem markerów AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 oraz dostępności nasion do końcowych eksperymentów kontrolnych wybrano 50 linii NLL do fenotypowania oporności na antraknozę.Analizę przeprowadzono w dwóch powtórzeniach w sterowanej komputerowo szklarni z 14-godzinnym fotoperiodem i zakresem temperatur 22°C w dzień i 19°C w nocy.Nasiona są drapane (odcinanie ostrym ostrzem okrywy nasiennej po przeciwnej stronie zarodka) przed wysiewem, aby zapobiec spoczynkowi nasion spowodowanemu zbyt twardą okrywą nasienną i zapewnić równomierne kiełkowanie.Rośliny hodowano w doniczkach (11 × 11 × 21 cm) ze sterylną glebą (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warszawa, Polska).Inokulację wykonano szczepem Colletotrichum lupini Col-08, wyhodowanym w 1999 roku z łodyg łubinu wąskolistnego uprawianego na polu w Werżenicy w Wielkopolsce (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Zdobądź obszar.Izolaty hodowano w pożywce SNA w temperaturze 20°C w świetle UV przez 21 dni w celu wywołania sporulacji.Cztery tygodnie po wysianiu, gdy rośliny osiągnęły stadium 4-6 liści, przeprowadzono inokulację przez oprysk zawiesiną konidiów w stężeniu 0,5 x 106 konidiów na ml.Po inokulacji rośliny trzymano w ciemności przez 24 godziny przy wilgotności około 98% i temperaturze 25°C w celu ułatwienia kiełkowania konidiów i procesu infekcji.Następnie rośliny hodowano w 14-godzinnym fotoperiodzie w 22°C w dzień/19°C w nocy i 70% wilgotności.Ocenę choroby sporządzono 22 dni po zaszczepieniu i wahała się od 0 (odporność) do 9 (bardzo podatność) w zależności od obecności lub braku nekrotycznych uszkodzeń na łodygach i liściach.Dodatkowo po punktacji zmierzono masę roślin.Zależności między genotypami markerowymi a fenotypami choroby obliczono jako korelacje punktowe w dwóch sekwencjach (brak heterozygotycznych markerów w zestawie linii do analizy fenotypu oporności na antraknozę).