Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Istnieje potrzeba niezawodnego systemu in vitro, który może dokładnie odtworzyć fizjologiczne środowisko serca do testów leków. Ograniczona dostępność systemów hodowli tkanek ludzkiego serca doprowadziła do niedokładnych interpretacji wpływu leków na serce. W tym przypadku opracowaliśmy model hodowli tkanek serca (CTCM), który elektromechanicznie stymuluje plasterki serca i poddaje się fizjologicznemu rozciąganiu podczas faz skurczowej i rozkurczowej cyklu sercowego. Po 12 dniach hodowli podejście to częściowo poprawiło żywotność skrawków serca, ale nie zachowało w pełni ich integralności strukturalnej. Dlatego po przesiewie małych cząsteczek odkryliśmy, że dodanie 100 nM trójjodotyroniny (T3) i 1 μM deksametazonu (Dex) do naszego medium utrzymywało mikrostrukturę skrawków przez 12 dni. W połączeniu z leczeniem T3/Dex system CTCM utrzymywał profile transkrypcyjne, żywotność, aktywność metaboliczną i integralność strukturalną na tym samym poziomie co świeża tkanka serca przez 12 dni. Ponadto nadmierne rozciąganie tkanki serca w hodowli wywołuje przerostowe sygnały sercowe, co dostarcza dowodów na zdolność CTCM do naśladowania stanów przerostowych wywołanych przez rozciąganie serca. Podsumowując, CTCM może modelować fizjologię i patofizjologię serca w hodowli przez długi czas, umożliwiając wiarygodne przesiewy leków.
Przed badaniami klinicznymi potrzebne są niezawodne systemy in vitro, które mogą dokładnie odtworzyć środowisko fizjologiczne ludzkiego serca. Takie systemy powinny naśladować zmienione rozciąganie mechaniczne, częstość akcji serca i właściwości elektrofizjologiczne. Modele zwierzęce są powszechnie stosowane jako platforma przesiewowa fizjologii serca z ograniczoną niezawodnością w odzwierciedlaniu skutków leków w ludzkim sercu1,2. Ostatecznie Idealny Eksperymentalny Model Kultury Tkankowej Serca (CTCM) jest modelem, który jest wysoce czuły i specyficzny dla różnych interwencji terapeutycznych i farmakologicznych, dokładnie odtwarzając fizjologię i patofizjologię ludzkiego serca3. Brak takiego systemu ogranicza odkrywanie nowych metod leczenia niewydolności serca4,5 i doprowadził do tego, że kardiotoksyczność leków stała się głównym powodem wycofania się z rynku6.
W ciągu ostatniej dekady osiem leków niekardiologicznych zostało wycofanych z użytku klinicznego, ponieważ powodują wydłużenie odstępu QT, co prowadzi do arytmii komorowych i nagłej śmierci7. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na niezawodne strategie badań przedklinicznych w celu oceny skuteczności i toksyczności sercowo-naczyniowej. Niedawne zastosowanie ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych (hiPS-CM) w badaniach przesiewowych leków i testach toksyczności zapewnia częściowe rozwiązanie tego problemu. Jednak niedojrzała natura hiPS-CM i brak wielokomórkowej złożoności tkanki serca stanowią główne ograniczenia tej metody. Ostatnie badania wykazały, że ograniczenie to można częściowo przezwyciężyć, stosując wczesne hiPS-CM do tworzenia hydrożeli tkanki serca wkrótce po rozpoczęciu spontanicznych skurczów i stopniowo zwiększając stymulację elektryczną w czasie. Jednak te mikrotkanki hiPS-CM nie mają dojrzałych właściwości elektrofizjologicznych i skurczowych dorosłego mięśnia sercowego. Ponadto ludzka tkanka sercowa ma bardziej złożoną strukturę, składającą się z heterogenicznej mieszanki różnych typów komórek, w tym komórek śródbłonka, neuronów i fibroblastów podścieliska, połączonych ze sobą za pomocą specyficznych zestawów białek macierzy pozakomórkowej. Ta heterogeniczność populacji niekardiomiocytów11,12,13 w sercu dorosłego ssaka stanowi główną przeszkodę w modelowaniu tkanki sercowej przy użyciu poszczególnych typów komórek. Te główne ograniczenia podkreślają znaczenie opracowywania metod hodowli nienaruszonej tkanki mięśnia sercowego w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Wyhodowane cienkie (300 µm) przekroje ludzkiego serca okazały się obiecującym modelem nienaruszonego ludzkiego mięśnia sercowego. Ta metoda zapewnia dostęp do kompletnego trójwymiarowego wielokomórkowego układu podobnego do tkanki ludzkiego serca. Jednak do 2019 r. wykorzystanie wyhodowanych przekrojów serca było ograniczone przez krótki (24 h) czas przeżycia hodowli. Wynika to z szeregu czynników, w tym braku rozciągania fizyczno-mechanicznego, interfejsu powietrze-ciecz i stosowania prostych mediów, które nie obsługują potrzeb tkanki serca. W 2019 r. kilka grup badawczych wykazało, że włączenie czynników mechanicznych do systemów hodowli tkanek serca może wydłużyć żywotność hodowli, poprawić ekspresję serca i naśladować patologię serca. Dwa eleganckie badania 17 i 18 pokazują, że jednoosiowe obciążenie mechaniczne ma pozytywny wpływ na fenotyp serca podczas hodowli. Jednak w badaniach tych nie wykorzystano dynamicznego trójwymiarowego obciążenia fizyczno-mechanicznego cyklu sercowego, ponieważ przekroje serca były obciążane albo izometrycznymi siłami rozciągającymi 17, albo liniowym obciążeniem auksotonicznym 18 . Te metody rozciągania tkanek skutkowały supresją wielu genów serca lub nadmierną ekspresją genów związanych z nieprawidłowymi reakcjami na rozciąganie. Co godne uwagi, Pitoulis i in. 19 opracowali dynamiczną kąpiel hodowlaną w plastrach serca do rekonstrukcji cyklu serca przy użyciu sprzężenia zwrotnego przetwornika siły i napędów naprężeniowych. Chociaż system ten umożliwia dokładniejsze modelowanie cyklu serca in vitro, złożoność i niska przepustowość metody ograniczają zastosowanie tego systemu. Nasze laboratorium niedawno opracowało uproszczony system hodowli przy użyciu stymulacji elektrycznej i zoptymalizowanego medium w celu utrzymania żywotności skrawków tkanki serca wieprzowego i ludzkiego przez okres do 6 dni20,21.
W niniejszym manuskrypcie opisujemy model hodowli tkanki serca (CTCM) wykorzystujący przekroje serca świni, które zawierają wskazówki humoralne, aby odtworzyć trójwymiarową fizjologię serca i patofizjologiczne rozdęcie podczas cyklu sercowego. Ten CTCM może zwiększyć dokładność przedklinicznej prognozy leku do poziomu nigdy wcześniej nieosiągniętego, zapewniając opłacalny, średnioprzepustowy układ sercowy, który naśladuje fizjologię/patofizjologię serca ssaków do przedklinicznych testów leków.
Sygnały hemodynamiczne odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu funkcji kardiomiocytów in vitro 22,23,24. W niniejszym manuskrypcie opracowaliśmy CTCM (rysunek 1a), który może naśladować środowisko serca dorosłego, indukując zarówno stymulację elektryczną, jak i mechaniczną o częstotliwościach fizjologicznych (1,2 Hz, 72 uderzenia na minutę). Aby uniknąć nadmiernego rozciągania tkanek podczas rozkurczu, użyto urządzenia do drukowania 3D w celu zwiększenia rozmiaru tkanki o 25% (rysunek 1b). Stymulacja elektryczna indukowana przez system C-PACE została zaprogramowana tak, aby rozpocząć się 100 ms przed skurczem, przy użyciu systemu akwizycji danych w celu pełnego odtworzenia cyklu serca. System hodowli tkanek wykorzystuje programowalny siłownik pneumatyczny (LB Engineering, Niemcy) w celu cyklicznego rozszerzania elastycznej silikonowej membrany w celu spowodowania rozszerzenia plastrów serca w górnej komorze. Układ podłączono do zewnętrznego przewodu powietrznego poprzez przetwornik ciśnienia, co umożliwiło precyzyjną regulację ciśnienia (± 1 mmHg) i czasu (± 1 ms) (rys. 1c).
a Przymocuj sekcję tkanki do 7 mm pierścienia podporowego, pokazanego na niebiesko, wewnątrz komory hodowlanej urządzenia. Komora hodowlana jest oddzielona od komory powietrznej cienką, elastyczną membraną silikonową. Umieść uszczelkę między każdą komorą, aby zapobiec wyciekom. Pokrywa urządzenia zawiera elektrody grafitowe, które zapewniają stymulację elektryczną. b Schematyczne przedstawienie dużego urządzenia tkankowego, pierścienia prowadzącego i pierścienia podporowego. Sekcje tkanki (brązowe) są umieszczane na urządzeniu o dużych rozmiarach z pierścieniem prowadzącym umieszczonym w rowku na zewnętrznej krawędzi urządzenia. Używając prowadnicy, ostrożnie umieść pierścień podporowy pokryty klejem akrylowym do tkanek na sekcji tkanki serca. c Wykres przedstawiający czas stymulacji elektrycznej jako funkcję ciśnienia w komorze powietrznej sterowanego przez programowalny siłownik pneumatyczny (PPD). Urządzenie do akwizycji danych zostało użyte do synchronizacji stymulacji elektrycznej za pomocą czujników ciśnienia. Gdy ciśnienie w komorze hodowlanej osiągnie ustawiony próg, sygnał impulsowy jest wysyłany do C-PACE-EM w celu uruchomienia stymulacji elektrycznej. d Obraz czterech CTCM umieszczonych na półce inkubatora. Cztery urządzenia są podłączone do jednego PPD za pomocą obwodu pneumatycznego, a czujniki ciśnienia są wprowadzane do zaworu hemostatycznego w celu monitorowania ciśnienia w obwodzie pneumatycznym. Każde urządzenie zawiera sześć sekcji tkanki.
Używając pojedynczego siłownika pneumatycznego, mogliśmy sterować 4 urządzeniami CTCM, z których każde mogło pomieścić 6 przekrojów tkanek (rys. 1d). W CTCM ciśnienie powietrza w komorze powietrznej jest przekształcane na ciśnienie synchroniczne w komorze płynowej i wywołuje fizjologiczne rozszerzenie przekroju serca (rys. 2a i film uzupełniający 1). Ocena rozciągnięcia tkanki przy 80 mm Hg. Art. pokazał rozciągnięcie przekrojów tkanki o 25% (rys. 2b). Wykazano, że to procentowe rozciągnięcie odpowiada fizjologicznej długości sarkomeru wynoszącej 2,2–2,3 µm dla normalnej kurczliwości przekroju serca17,19,25. Ruch tkanki oceniano przy użyciu niestandardowych ustawień kamery (rysunek uzupełniający 1). Amplituda i prędkość ruchu tkanki (rys. 2c, d) odpowiadały rozciągnięciu podczas cyklu serca i czasowi podczas skurczu i rozkurczu (rys. 2b). Rozciągnięcie i prędkość tkanki serca podczas skurczu i rozkurczu pozostawały stałe przez 12 dni w hodowli (ryc. 2f). Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej na kurczliwość w trakcie hodowli, opracowaliśmy metodę określania aktywnej deformacji przy użyciu algorytmu cieniowania (rys. uzupełniający 2a,b) i byliśmy w stanie odróżnić deformacje ze stymulacją elektryczną i bez niej. Ta sama sekcja serca (ryc. 2f). W ruchomym obszarze nacięcia (R6-9) napięcie podczas stymulacji elektrycznej było o 20% wyższe niż w przypadku braku stymulacji elektrycznej, co wskazuje na wkład stymulacji elektrycznej w funkcję skurczową.
Reprezentatywne ślady ciśnienia w komorze powietrznej, ciśnienia w komorze płynowej i pomiary ruchu tkanek potwierdzają, że ciśnienie w komorze zmienia ciśnienie w komorze płynowej, powodując odpowiedni ruch wycinka tkanki. b Reprezentatywne ślady procentowego rozciągnięcia (niebieskie) przekrojów tkanki odpowiadające procentowemu rozciągnięciu (pomarańczowe). c Zmierzony ruch wycinka serca jest zgodny ze zmierzoną prędkością ruchu. (d) Reprezentatywne trajektorie ruchu cyklicznego (niebieska linia) i prędkości (pomarańczowa linia przerywana) w wycinku serca. e Kwantyfikacja czasu cyklu (n = 19 wycinków na grupę, od różnych świń), czasu skurczu (n = 19 wycinków na grupę), czasu relaksacji (n = 19 wycinków na grupę, od różnych świń), ruchu tkanek (n = 25). wycinków)/grupę od różnych świń), szczytowej prędkości skurczowej (n = 24(D0), 25(D12) wycinków/grupę od różnych świń) i szczytowej szybkości relaksacji (n = 24(D0), 25(D12) wycinków/grupę od różnych świń). Dwustronny test t-Studenta nie wykazał istotnej różnicy w żadnym parametrze. f Reprezentatywne ślady analizy odkształceń przekrojów tkanek ze (czerwony) i bez (niebieski) stymulacji elektrycznej, dziesięć obszarów regionalnych przekrojów tkanek z tego samego przekroju. Dolne panele pokazują kwantyfikację procentowej różnicy odkształceń w przekrojach tkanek ze stymulacją elektryczną i bez niej w dziesięciu obszarach z różnych przekrojów. (n = 8 plasterków/grupa od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 plasterków/grupa od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sekcji/grupa od różnych świń, dwustronny test t-Studenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sekcji/grupa, od różnych świń, dwustronny test t-Studenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Błędy przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
W naszym poprzednim statycznym biomimetycznym systemie hodowli plastrów serca [20, 21] utrzymywaliśmy żywotność, funkcję i integralność strukturalną plastrów serca przez 6 dni, stosując stymulację elektryczną i optymalizując skład medium. Jednak po 10 dniach wartości te gwałtownie spadły. Będziemy odnosić się do sekcji hodowanych w naszym poprzednim statycznym biomimetycznym systemie hodowli 20, 21 w warunkach kontrolnych (Ctrl) i będziemy używać naszego wcześniej zoptymalizowanego medium jako warunków MC i hodowli w warunkach jednoczesnej stymulacji mechanicznej i elektrycznej (CTCM). zwanej . Po pierwsze, ustaliliśmy, że stymulacja mechaniczna bez stymulacji elektrycznej była niewystarczająca do utrzymania żywotności tkanki przez 6 dni (Rys. uzupełniający 3a, b). Co ciekawe, po wprowadzeniu stymulacji fizjomechanicznej i elektrycznej za pomocą STCM, żywotność 12-dniowych sekcji serca pozostała taka sama jak w świeżych sekcjach serca w warunkach MS, ale nie w warunkach Ctrl, jak pokazano w analizie MTT (Rys. 1). 3a). Sugeruje to, że mechaniczna stymulacja i symulacja cyklu serca mogą utrzymać żywotność skrawków tkanki dwukrotnie dłużej niż w naszym poprzednim statycznym systemie hodowlanym. Jednak ocena integralności strukturalnej skrawków tkanki poprzez immunoznakowanie sercowej troponiny T i koneksyny 43 wykazała, że ​​ekspresja koneksyny 43 była istotnie wyższa w tkankach MC 12. dnia niż w kontrolach tego samego dnia. Jednak jednolita ekspresja koneksyny 43 i formowanie dysku Z nie zostały w pełni utrzymane (ryc. 3b). Używamy ram sztucznej inteligencji (AI) do ilościowego określenia integralności strukturalnej tkanki26, opartego na obrazach głębokiego uczenia się opartego na barwieniu troponiną-T i koneksyną43 w celu automatycznego ilościowego określenia integralności strukturalnej i fluorescencji plastrów serca pod względem siły lokalizacji. Ta metoda wykorzystuje sieć neuronową splotową (CNN) i ramy głębokiego uczenia się w celu niezawodnego ilościowego określenia integralności strukturalnej tkanki serca w sposób zautomatyzowany i bezstronny, jak opisano w odniesieniu. 26. Tkanka MC wykazała lepsze podobieństwo strukturalne do dnia 0 w porównaniu do statycznych sekcji kontrolnych. Ponadto barwienie trichromem Massona wykazało znacząco niższy odsetek włóknienia w warunkach MS w porównaniu do warunków kontrolnych w 12. dniu hodowli (ryc. 3c). Podczas gdy CTCM zwiększyło żywotność sekcji tkanki serca w dniu 12. do poziomu podobnego do świeżej tkanki serca, nie poprawiło znacząco integralności strukturalnej sekcji serca.
Wykres słupkowy przedstawia ilościowe określenie żywotności MTT świeżych plastrów serca (D0) lub hodowli plastrów serca przez 12 dni w hodowli statycznej (D12 Ctrl) lub w CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). Wykres słupkowy przedstawia ilościowe określenie żywotności MTT świeżych plastrów serca (D0) lub hodowli plastrów serca przez 12 dni w hodowli statycznej (D12 Ctrl) lub w CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl).histogram przedstawia ilościową ocenę żywotności świeżych skrawków serca MTT (D0) lub hodowli skrawków serca przez 12 dni w hodowli statycznej (kontrola D12) lub CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12). )), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA;####p < 0,0001 dla D0 i **p < 0,01 dla D12 Ctrl). ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl相比，**p。)histogram przedstawiający ilościową ocenę żywotności MTT w świeżych przekrojach serca (D0) lub przekrojach serca hodowanych przez 12 dni w hodowli statycznej (kontrola D12) lub CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)), 12 (D12 MC) przekrojów/grupę od różnych świń, jednokierunkowy test ANOVA;####p < 0,0001 w przypadku D0, **p < 0,01 w przypadku D12 Ctrl). ####p < 0,0001 w porównaniu do D0, **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl).b Troponina T (zielona), koneksyna 43 (czerwona) i DAPI (niebieska) w świeżo wyizolowanych przekrojach serca (D0) lub przekrojach serca hodowanych w warunkach statycznych (Ctrl) lub warunkach CTCM (MC) przez 12 dni) reprezentatywnych obrazów immunofluorescencyjnych (skala próby pustej = 100 µm). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plastrów/grupę, każdy od innej świni, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plastrów/grupę, każdy od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный test ANOVA; ####p < 0,0001 za zmianą w D0 i ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca za pomocą sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skrawków/grup od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) wycinków/grupę każdej innej świni, jednokierunkowy test ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) wycinków/grupę każdej różnej świni, jednoczynnikowy test ANOVA;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 za pomocą D12 Ctrl). Sztuczna inteligencja służąca do ilościowego określenia integralności strukturalnej tkanki serca (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skrawków/grupę, każda od różnych świń, jednokierunkowy test ANOVA; ####p<0,0001 w porównaniu z .D0, dla porównania ****p <0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i kwantyfikacja (po prawej) dla plastrów serca barwionych barwnikiem trójchromianowym Massona (skala odchyleń = 500 µm) (n = 10 plastrów/grupę, każdy od innej świni, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i kwantyfikacja (po prawej) plastrów serca barwionych barwnikiem trójbarwnym Massona (skala odsłaniająca = 500 µm) (n = 10 plastrów/grupę, każdy od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ***p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 сравнению с D0 i ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i kwantyfikacja (po prawej) przekrojów serca barwionych barwnikiem trójbarwnym Massona (skala niepowlekana = 500 µm) (n = 10 przekrojów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ***p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像(左)和量化(右)（裸尺度= 500 µm）(n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比). C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 w stosunku do D0, ***p < 0,001 w stosunku do D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i ilościowe oznaczenie (po prawej) przekrojów serca barwionych barwnikiem trójchromianowym Massona (ślepa próba = 500 µm) (n = 10 przekrojów/grupę, każdy od innej świni, testowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji ;### # p < 0,0001 w porównaniu z D0, ***p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl).Błędy przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Postawiliśmy hipotezę, że dodanie małych cząsteczek do podłoża hodowlanego może poprawić integralność kardiomiocytów i zmniejszyć rozwój włóknienia podczas hodowli CTCM. Dlatego też przeszukaliśmy nasze statyczne hodowle kontrolne pod kątem małych cząsteczek20,21 ze względu na niewielką liczbę czynników zakłócających. Do tego badania wybrano deksametazon (Dex), trójjodotyroninę (T3) i SB431542 (SB). Te małe cząsteczki były wcześniej stosowane w hodowlach hiPSC-CM w celu indukowania dojrzewania kardiomiocytów poprzez zwiększanie długości sarkomerów, kanalików T i prędkości przewodzenia. Ponadto wiadomo, że zarówno Dex (glukokortykoid), jak i SB tłumią stan zapalny29,30. Dlatego też sprawdziliśmy, czy włączenie jednej lub kombinacji tych małych cząsteczek poprawi integralność strukturalną przekrojów serca. Do wstępnego przesiewu dawka każdego związku została wybrana na podstawie stężeń powszechnie stosowanych w modelach hodowli komórkowej (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31). Po 12 dniach hodowli połączenie T3 i Dex skutkowało optymalną integralnością strukturalną kardiomiocytów i minimalnym przebudową włóknistą (rysunki uzupełniające 4 i 5). Ponadto użycie podwójnych lub podwójnych tych stężeń T3 i Dex dawało szkodliwe efekty w porównaniu ze stężeniami normalnymi (rysunki uzupełniające 6a, b).
Po wstępnym przesiewie przeprowadziliśmy bezpośrednie porównanie 4 warunków hodowli (Rysunek 4a): Ctrl: przekroje serca hodowane w naszej wcześniej opisanej statycznej hodowli przy użyciu naszego zoptymalizowanego medium; 20.21 TD: T3 i Ctrl s Dodano Dex w środę; MC: przekroje serca hodowane w CTCM przy użyciu naszego wcześniej zoptymalizowanego medium; i MT: CTCM z T3 i Dex dodanymi do medium. Po 12 dniach hodowli żywotność tkanek MS i MT pozostała taka sama jak w świeżych tkankach ocenianych za pomocą testu MTT (Rys. 4b). Co ciekawe, dodanie T3 i Dex do kultur transwell (TD) nie spowodowało znaczącej poprawy żywotności w porównaniu z warunkami Ctrl, co wskazuje na ważną rolę stymulacji mechanicznej w utrzymaniu żywotności przekrojów serca.
Schemat eksperymentu przedstawiający cztery warunki hodowli stosowane do oceny efektów stymulacji mechanicznej i suplementacji T3/Dex na podłożu przez 12 dni. b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plastrów serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) plastrów/grupę od różnych świń; wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plastrów serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) plastrów/grupę od różnych świń; wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 dni после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w przypadku D0 i **p < 0,01 w przypadku D12 Ctrl). b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności po 12 dniach od hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych skrawków serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001,###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12 控制).b 4 12 (K12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC i MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 w stosunku do D0, **p <0,01 w stosunku do partnera D12). b Histogram przedstawiający wszystkie 4 warunki hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych skrawków serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), z różnych świń, 12 (D12 MC) skrawków/grupę, jednokierunkowy test ANOVA; ####p<0,0001, ###p<0,001 w porównaniu z D0, **p<0,01 w porównaniu z kontrolą D12). c Wykres słupkowy przedstawia ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plastrów serca (D0) (n = 6 plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ###p < 0,001, w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c Wykres słupkowy przedstawia ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plastrów serca (D0) (n = 6 plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ###p < 0,001, w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 dni после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется test ANOVA; ###p < 0,001 za zmianą w D0 i ***p < 0,001 za zmianą za D12 Ctrl). c Histogram przedstawia ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych skrawków serca (D0) (n = 6 skrawków/grupa od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Control). c 条形图显示所有4 种培养条件(Ctrl, TD, MC 和MT) 与新鲜心脏切片(D0) 相比,培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （(ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪Wyświetl ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 dni после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены testy ANOVA; ###p < 0,001 w stosunku do D0, ***p < 0,001 w stosunku do D12 (kontrоль). c Histogram przedstawiający ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli dla wszystkich 4 warunków hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych skrawków serca (D0) (n = 6 skrawków/grupę, od różnych świń, jednostronne). Przeprowadzono testy ANOVA, ###p < 0,001 w porównaniu do D0, ***p < 0,001 w porównaniu do D12 (kontrola).d Wykresy analizy szczepów świeżych (niebieski), 12. dnia MC (zielony) i 12. dnia MT (czerwony) tkanek w dziesięciu punktach regionalnych przekrojów tkanek (n = 4 plasterki/grupa, jednokierunkowy test ANOVA; nie było znaczącej różnicy między grupami). e Wykres wulkanu pokazujący różnicowo ekspresjonowane geny w świeżych przekrojach serca (D0) w porównaniu do przekrojów serca hodowanych w warunkach statycznych (Ctrl) lub w warunkach MT (MT) przez 10-12 dni. f Mapa cieplna genów sarkomerów dla przekrojów serca hodowanych w każdych z warunków hodowli. Błędy słupkowe oznaczają średnią ± odchylenie standardowe.
Metaboliczna zależność od przejścia z utleniania kwasów tłuszczowych na glikolizę jest cechą charakterystyczną dedyferencjacji kardiomiocytów. Niedojrzałe kardiomiocyty wykorzystują glukozę głównie do produkcji ATP i mają hipoplastyczne mitochondria z niewielką liczbą grzebieni5,32. Analizy wykorzystania glukozy wykazały, że w warunkach MC i MT wykorzystanie glukozy było podobne do tego w tkankach dnia 0 (rysunek 4c). Jednak próbki Ctrl wykazały znaczący wzrost wykorzystania glukozy w porównaniu ze świeżą tkanką. Wskazuje to, że połączenie CTCM i T3/Dex zwiększa żywotność tkanki i zachowuje fenotyp metaboliczny 12-dniowych hodowanych skrawków serca. Ponadto analiza odkształceń wykazała, że ​​poziomy odkształceń pozostały takie same jak w świeżej tkance serca przez 12 dni w warunkach MT i MS (rysunek 4d).
Aby przeanalizować ogólny wpływ CTCM i T3/Dex na globalny krajobraz transkrypcyjny tkanki plastra serca, przeprowadziliśmy RNAseq na plastrach serca ze wszystkich czterech różnych warunków hodowli (Dane uzupełniające 1). Co ciekawe, przekroje MT wykazały wysokie podobieństwo transkrypcyjne do świeżej tkanki serca, przy czym tylko 16 różnicowo wyrażonych genów z 13 642. Jednak, jak pokazaliśmy wcześniej, przekroje Ctrl wykazywały 1229 różnicowo wyrażonych genów po 10–12 dniach w hodowli (Rys. 4e). Dane te zostały potwierdzone przez qRT-PCR genów serca i fibroblastów (Rys. uzupełniające 7a-c). Co ciekawe, przekroje Ctrl wykazały zmniejszenie ekspresji genów serca i cyklu komórkowego oraz aktywację programów genów zapalnych. Dane te sugerują, że dedyferencjacja, która normalnie występuje po długotrwałej hodowli, jest całkowicie osłabiona w warunkach MT (Rys. uzupełniające 8a,b). Dokładne badanie genów sarkomeru wykazało, że tylko w warunkach MT geny kodujące sarkomer (ryc. 4f) i kanał jonowy (ryc. uzupełniająca 9) są zachowane, chroniąc je przed supresją w warunkach Ctrl, TD i MC. Dane te pokazują, że przy połączeniu stymulacji mechanicznej i humoralnej (T3/Dex) transkryptom plasterka serca może pozostać podobny do świeżych plasterków serca po 12 dniach w hodowli.
Te ustalenia transkrypcyjne są poparte faktem, że strukturalna integralność kardiomiocytów w przekrojach serca jest najlepiej zachowana w warunkach MT przez 12 dni, jak pokazano na przykładzie nienaruszonej i zlokalizowanej koneksyny 43 (ryc. 5a). Ponadto włóknienie w przekrojach serca w warunkach MT było znacząco zmniejszone w porównaniu z Ctrl i podobne do świeżych przekrojów serca (ryc. 5b). Dane te pokazują, że połączenie stymulacji mechanicznej i leczenia T3/Dex skutecznie zachowuje strukturę serca w przekrojach serca w hodowli.
a Typowe obrazy immunofluorescencji troponiny T (zielona), koneksyny 43 (czerwona) i DAPI (niebieska) w świeżo wyizolowanych przekrojach serca (D0) lub hodowanych przez 12 dni we wszystkich czterech warunkach hodowli przekrojów serca (skala = 100 µm). ). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu do D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный test ANOVA; #### p < 0,0001 za zmianą w D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). Ocena ilościowa integralności strukturalnej tkanki serca z wykorzystaniem sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) skrawków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu do D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性(n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或**p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组)人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Sterowanie 相比).Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji u różnych świń (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) przekrojów/grupę) przy użyciu jednokierunkowego testu ANOVA;#### p < 0,0001 za zmianą w D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). #### p < 0,0001 w porównaniu do D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja plastrów serca barwionych barwnikiem trichromowym Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja plastrów serca barwionych barwnikiem trichromowym Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001 dla D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 za pomocą klawisza D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja przekrojów serca barwionych barwnikiem trichromowym Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) przekrojów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkową analizę wariancji; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化 (比例尺= 500 µm) (n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比,***str < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 za zmianą w D0, ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja przekrojów serca barwionych trichromem Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) przekrojów od różnych świń/grupę, jedna metoda ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0, ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl).Błędy przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Na koniec, zdolność CTCM do naśladowania przerostu serca została oceniona poprzez zwiększenie rozciągnięcia tkanki serca. W CTCM szczytowe ciśnienie w komorze powietrznej wzrosło z 80 mmHg do 80 mmHg. Art. (normalne rozciągnięcie) do 140 mmHg Art. (Rys. 6a). Odpowiada to 32% wzrostowi rozciągnięcia (Rys. 6b), co wcześniej pokazano jako odpowiedni procent rozciągnięcia wymagany do uzyskania przez sekcje serca długości sarkomeru podobnej do tej obserwowanej w przeroście. Rozciągnięcie i prędkość tkanki serca podczas skurczu i rozkurczu pozostały stałe przez sześć dni hodowli (Rys. 6c). Tkanka serca z warunków MT została poddana normalnemu rozciągnięciu (MT (Normal)) lub warunkom nadmiernego rozciągnięcia (MT (OS)) przez sześć dni. Już po czterech dniach hodowli, hipertroficzny biomarker NT-ProBNP był istotnie podwyższony w medium w warunkach MT (OS) w porównaniu do warunków MT (normalnych) (Rys. 7a). Ponadto po sześciu dniach hodowli wielkość komórek w MT (OS) (ryc. 7b) znacznie wzrosła w porównaniu do przekrojów serca MT (normalnego). Ponadto translokacja jądrowa NFATC4 była znacznie zwiększona w nadmiernie rozciągniętych tkankach (ryc. 7c). Wyniki te pokazują postępujący rozwój patologicznej przebudowy po hiperrozciągnięciu i potwierdzają koncepcję, że urządzenie CTCM może być używane jako platforma do badania sygnalizacji przerostu serca wywołanego rozciąganiem.
Typowe ślady ciśnienia w komorze powietrznej, ciśnienia w komorze z płynem i pomiarów ruchu tkanek potwierdzają, że ciśnienie w komorze zmienia ciśnienie w komorze z płynem, powodując odpowiedni ruch wycinka tkanki. b Typowe krzywe procentowego rozciągnięcia i szybkości rozciągania dla normalnie rozciągniętych (pomarańczowe) i nadmiernie rozciągniętych (niebieskie) przekrojów tkanki. c Wykres słupkowy pokazujący czas cyklu (n = 19 plastrów na grupę, od różnych świń), czas skurczu (n = 18-19 plastrów na grupę, od różnych świń), czas relaksacji (n = 19 plastrów na grupę, od różnych świń)), amplitudę ruchu tkanki (n = 14 plastrów/grupę, od różnych świń), szczytową prędkość skurczową (n = 14 plastrów/grupę, od różnych świń) i szczytową szybkość relaksacji (n = 14 (D0), 15 (D6)) przekrojów/grup od różnych świń), dwustronny test t-Studenta nie wykazał istotnej różnicy w żadnym parametrze, co wskazuje, że parametry te pozostały stałe podczas 6 dni hodowli z przepięciem. Błędy przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
a Wykres słupkowy oznaczający stężenie NT-ProBNP w podłożu hodowlanym z plastrów serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia (Norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) plastry/grupę od różnych świń; wykonano dwukierunkową analizę wariancji; **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia). a Wykres słupkowy oznaczający stężenie NT-ProBNP w podłożu hodowlanym z plastrów serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia (Norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) plastry/grupę od różnych świń; wykonano dwukierunkową analizę wariancji; **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia).Histogram ilościowy stężenia NT-ProBNP w podłożu hodowlanym z plastrów serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4).MTOS) plastrów /grupę od różnych świń, przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化 (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01）。 a Kwantyfikacja stężenia NT-ProBNP w skrawkach serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (Norma) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm–D4 MTOS) z różnych猪的切片/组，可以双向方方发发动 **w porównaniu z normalnym rozciąganiem, p < 0,01).histogram Kwantyfikacja stężeń NT-ProBNP w plastrach serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) plastry/grupa od różnych świń, dwukierunkowa analiza wariancji;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania). b Obrazy reprezentatywne dla plastrów serca barwionych troponiną T i WGA (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupę z 10 różnych plastrów od różnych świń; wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia). b Obrazy reprezentatywne dla plastrów serca barwionych troponiną T i WGA (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupę z 10 różnych plastrów od różnych świń; wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Obrazy reprezentatywne przekrojów serca barwionych troponiną T i AZP (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupę z 10 różnych przekrojów od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do szczepu normalnego). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像(n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Obrazy reprezentatywne plastrów serca barwionych kalkareiną-T i WGA (po lewej) oraz wielkość komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 z 10 różnych plastrów (D6 MTNorm)) Komórki/serce, test t; w porównaniu z normalnym rozciąganiem, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) i 10 stopni na poziomie разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным rozmieszczeni). b Obrazy reprezentatywne przekrojów serca barwionych troponiną T i AZP (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) z 10 różnych przekrojów od różnych świń) Komórki/grupa, kryterium dwustronne t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do szczepu normalnego). c Obrazy reprezentatywne dla plasterków serca MTOS z dnia 0 i 6 znakowanych immunologicznie w celu wykrycia troponiny T i NFATC4 oraz ilościowe oznaczenie translokacji NFATC4 do jąder komórek mięśnia sercowego (n = 4 (D0), 3 (D6) plasterki MTOS/grupa od różnych świń; wykonano dwustronny test t-Studenta; *p < 0,05). c Obrazy reprezentatywne dla plasterków serca MTOS z dnia 0 i 6 znakowanych immunologicznie w celu wykrycia troponiny T i NFATC4 oraz ilościowe oznaczenie translokacji NFATC4 do jąder komórek mięśnia sercowego (n = 4 (D0), 3 (D6) plasterki MTOS/grupa od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 i 6 dni MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т i NFATC4, i количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; (0,05). c Obrazy reprezentatywne dla przekrojów serca w 0. i 6. dniu MTOS, znakowane immunologicznie w celu wykrycia troponiny T i NFATC4 oraz ilościowe oznaczenie translokacji NFATC4 w jądrze komórek jamistych (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plasterki/grupę od różnych świń) wykonane dwustronnym testem t-Studenta; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像,以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentatywne obrazy znakowania immunologicznego kalkaniną-T i NFATC4 第0天和第6天MTOS skrawki serca i NFATC4 z różnych jąder komórkowych NFATC4 易位至CM的ilość化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 i 6 dni dla иммуномаркировки тропонином-Т i NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Obrazy reprezentatywne plastrów serca MTOS w dniu 0 i 6 do immunoznakowania troponiny T i NFATC4 oraz ilościowego określenia translokacji NFATC4 w jądrze CM od różnych świń (n = 4 (D0), 3 (D6) plastrów MTOS/grupa, dwustronne kryterium t-Studenta; *p < 0,05).Błędy przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Translacyjne badania układu sercowo-naczyniowego wymagają modeli komórkowych, które dokładnie odtwarzają środowisko serca. W tym badaniu opracowano i scharakteryzowano urządzenie CTCM, które może stymulować ultracienkie sekcje serca. System CTCM obejmuje fizjologicznie zsynchronizowaną stymulację elektromechaniczną oraz wzbogacenie płynem T3 i Dex. Gdy sekcje serca świńskiego były wystawione na działanie tych czynników, ich żywotność, integralność strukturalna, aktywność metaboliczna i ekspresja transkrypcyjna pozostały takie same jak w świeżej tkance serca po 12 dniach hodowli. Ponadto nadmierne rozciąganie tkanki serca może powodować przerost serca spowodowany nadmiernym wyprostem. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdzają krytyczną rolę fizjologicznych warunków hodowli w utrzymaniu prawidłowego fenotypu serca i stanowią platformę do badań przesiewowych leków.
Wiele czynników przyczynia się do stworzenia optymalnego środowiska dla funkcjonowania i przeżycia kardiomiocytów. Najbardziej oczywiste z tych czynników są związane z (1) interakcjami międzykomórkowymi, (2) stymulacją elektromechaniczną, (3) czynnikami humoralnymi i (4) substratami metabolicznymi. Fizjologiczne interakcje komórka-komórka wymagają złożonych trójwymiarowych sieci wielu typów komórek wspieranych przez macierz zewnątrzkomórkową. Takie złożone interakcje komórkowe są trudne do zrekonstruowania in vitro poprzez współhodowlę poszczególnych typów komórek, ale można je łatwo osiągnąć, wykorzystując organotypową naturę przekrojów serca.
Mechaniczne rozciąganie i elektryczna stymulacja kardiomiocytów są krytyczne dla utrzymania fenotypu serca33,34,35. Podczas gdy stymulacja mechaniczna była szeroko stosowana do kondycjonowania i dojrzewania hiPSC-CM, kilka eleganckich badań niedawno podjęło próbę mechanicznej stymulacji plastrów serca w hodowli przy użyciu obciążenia jednoosiowego. Badania te pokazują, że dwuwymiarowe jednoosiowe obciążenie mechaniczne ma pozytywny wpływ na fenotyp serca w trakcie hodowli. W tych badaniach sekcje serca były obciążane izometrycznymi siłami rozciągającymi17, liniowym obciążeniem auksotonicznym18 lub cykl serca był odtwarzany przy użyciu sprzężenia zwrotnego przetwornika siły i napędów naprężających. Jednak te metody wykorzystują jednoosiowe rozciąganie tkanek bez optymalizacji środowiskowej, co skutkuje tłumieniem wielu genów serca lub nadmierną ekspresją genów związanych z nieprawidłowymi reakcjami rozciągania. Opisany tutaj CTCM zapewnia trójwymiarowy bodziec elektromechaniczny, który naśladuje naturalny cykl serca pod względem czasu cyklu i fizjologicznego rozciągania (25% rozciągania, 40% skurczu, 60% rozkurczu i 72 uderzeń na minutę). Chociaż sama trójwymiarowa stymulacja mechaniczna nie jest wystarczająca do utrzymania integralności tkanek, do odpowiedniego utrzymania żywotności, funkcji i integralności tkanek konieczna jest kombinacja stymulacji humoralnej i mechanicznej z wykorzystaniem T3/Dex.
Czynniki humoralne odgrywają ważną rolę w modulacji fenotypu serca dorosłego. Zostało to podkreślone w badaniach HiPS-CM, w których T3 i Dex zostały dodane do pożywki hodowlanej w celu przyspieszenia dojrzewania komórek. T3 może wpływać na transport aminokwasów, cukrów i wapnia przez błony komórkowe36. Ponadto T3 promuje ekspresję MHC-α i regulację w dół MHC-β, promując tworzenie szybkokurczliwych miofibryli w dojrzałych kardiomiocytach w porównaniu do wolnokurczliwych miofibryli w płodowym CM. Niedobór T3 u pacjentów z niedoczynnością tarczycy powoduje utratę pasm miofibrylarnych i zmniejszone tempo rozwoju tonu37. Dex działa na receptory glikokortykoidowe i wykazano, że zwiększa kurczliwość mięśnia sercowego w izolowanych perfundowanych sercach;38 uważa się, że ta poprawa jest związana z wpływem na napływ wapnia napędzany depozytami (SOCE)39,40. Ponadto Dex wiąże się ze swoimi receptorami, wywołując szeroką odpowiedź wewnątrzkomórkową, która tłumi funkcje odpornościowe i stany zapalne30.
Nasze wyniki wskazują, że fizyczna stymulacja mechaniczna (MS) poprawiła ogólną wydajność hodowli w porównaniu z Ctrl, ale nie utrzymała żywotności, integralności strukturalnej i ekspresji serca przez 12 dni w hodowli. W porównaniu z Ctrl, dodanie T3 i Dex do kultur CTCM (MT) poprawiło żywotność i utrzymało podobne profile transkrypcji, integralność strukturalną i aktywność metaboliczną ze świeżą tkanką serca przez 12 dni. Ponadto, kontrolując stopień rozciągnięcia tkanki, stworzono model przerostu serca wywołanego nadmiernym rozciąganiem przy użyciu STCM, ilustrując wszechstronność systemu STCM. Należy zauważyć, że chociaż przebudowa serca i włóknienie zwykle obejmują nienaruszone narządy, których krążące komórki mogą dostarczać odpowiednich cytokin, a także fagocytozę i inne czynniki przebudowy, sekcje serca mogą nadal naśladować proces włóknienia w odpowiedzi na stres i uraz. do miofibroblastów. Zostało to wcześniej ocenione w tym modelu przekroju serca. Należy zauważyć, że parametry CTCM można modulować, zmieniając amplitudę i częstotliwość ciśnienia/prądu elektrycznego, aby symulować wiele stanów, takich jak tachykardia, bradykardia i mechaniczne wspomaganie krążenia (mechaniczne serce bez obciążenia). Dzięki temu system ma średnią przepustowość do testowania leków. Zdolność CTCM do modelowania przerostu serca wywołanego nadmiernym wysiłkiem otwiera drogę do testowania tego systemu pod kątem spersonalizowanej terapii. Podsumowując, niniejsze badanie pokazuje, że rozciąganie mechaniczne i stymulacja humoralna są krytyczne dla utrzymania hodowli skrawków tkanki serca.
Chociaż przedstawione tutaj dane sugerują, że CTCM jest bardzo obiecującą platformą do modelowania nienaruszonego mięśnia sercowego, ta metoda hodowli ma pewne ograniczenia. Głównym ograniczeniem hodowli CTCM jest to, że nakłada ona ciągłe dynamiczne naprężenia mechaniczne na plastry, co uniemożliwia aktywne monitorowanie skurczów plastrów serca w każdym cyklu. Ponadto, ze względu na mały rozmiar przekrojów serca (7 mm), możliwość oceny funkcji skurczowej poza systemami hodowli przy użyciu tradycyjnych czujników siły jest ograniczona. W niniejszym manuskrypcie częściowo przezwyciężamy to ograniczenie, oceniając napięcie optyczne jako wskaźnik funkcji skurczowej. Jednak to ograniczenie będzie wymagało dalszej pracy i może zostać rozwiązane w przyszłości poprzez wprowadzenie metod optycznego monitorowania funkcji plastrów serca w hodowli, takich jak mapowanie optyczne przy użyciu barwników wrażliwych na wapń i napięcie. Innym ograniczeniem CTCM jest to, że model roboczy nie manipuluje stresem fizjologicznym (obciążeniem wstępnym i następczym). W CTCM ciśnienie było indukowane w przeciwnych kierunkach, aby odtworzyć 25% fizjologicznego rozciągnięcia w rozkurczu (pełne rozciągnięcie) i skurczu (długość skurczu podczas stymulacji elektrycznej) w bardzo dużych tkankach. To ograniczenie powinno zostać usunięte w przyszłych projektach CTCM poprzez odpowiednie ciśnienie na tkankę serca z obu stron i poprzez zastosowanie dokładnych zależności ciśnienie-objętość, które występują w komorach serca.
Przebudowa wywołana nadmiernym rozciąganiem opisana w tym manuskrypcie ogranicza się do naśladowania hipertroficznych sygnałów hiperrozciągliwych. Tak więc ten model może pomóc w badaniu hipertroficznych sygnałów wywołanych rozciąganiem bez potrzeby czynników humoralnych lub neuronalnych (które nie występują w tym systemie). Potrzebne są dalsze badania w celu zwiększenia mnogości CTCM, na przykład współhodowla z komórkami odpornościowymi, krążącymi czynnikami humoralnymi osocza i unerwieniem, gdy współhodowla z komórkami neuronalnymi poprawi możliwości modelowania choroby z CTCM.
W badaniu wykorzystano trzynaście świń. Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucji i zostały one zatwierdzone przez University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. Łuk aorty został zaciśnięty, a serce perfundowano 1 l jałowej kardioplegii (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparyny, pH do 7,4); serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do momentu przetransportowania ich na lodzie do laboratorium, co zwykle trwa krócej niż 10 min. serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do momentu przetransportowania ich na lodzie do laboratorium, co zwykle trwa krócej niż 10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно czas <10 min. serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do momentu transportu do laboratorium w lodzie, co zwykle trwa mniej niż 10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Utrzymanie serca w lodzie w kardioplegii do momentu transportu do laboratorium w lodzie, zwykle <10 min.
Urządzenie CTCM zostało opracowane w oprogramowaniu do komputerowego wspomagania projektowania (CAD) SolidWorks. Komory hodowlane, przegrody i komory powietrzne są wykonane z przezroczystego akrylowego plastiku CNC. Pierścień podporowy o średnicy 7 mm jest wykonany z polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE) w środku i ma rowek na pierścień uszczelniający, aby pomieścić silikonowy pierścień uszczelniający używany do uszczelniania podłoża pod spodem. Cienka membrana krzemionkowa oddziela komorę hodowlaną od płyty separacyjnej. Membrana silikonowa jest wycinana laserowo z arkusza silikonowego o grubości 0,02″ i ma twardość 35A. Dolne i górne uszczelki silikonowe są wycinane laserowo z arkusza silikonowego o grubości 1/16″ i mają twardość 50A. Śruby ze stali nierdzewnej 316L i nakrętki motylkowe są używane do mocowania bloku i tworzenia szczelnego uszczelnienia.
Dedykowana płytka drukowana (PCB) jest zaprojektowana do integracji z systemem C-PACE-EM. Gniazda złącza maszyny szwajcarskiej na płytce drukowanej są połączone z elektrodami grafitowymi za pomocą srebrzonych przewodów miedzianych i śrub z brązu 0-60 wkręconych w elektrody. Płytka drukowana jest umieszczona w pokrywie drukarki 3D.
Urządzenie CTCM jest sterowane przez programowalny siłownik pneumatyczny (PPD), który wytwarza kontrolowane ciśnienie krążeniowe podobne do cyklu serca. Wraz ze wzrostem ciśnienia wewnątrz komory powietrznej elastyczna silikonowa membrana rozszerza się w górę, wtłaczając medium pod miejsce tkanki. Obszar tkanki zostanie następnie rozciągnięty przez to wydalenie płynu, naśladując fizjologiczne rozszerzanie się serca podczas rozkurczu. W szczycie relaksacji zastosowano stymulację elektryczną za pomocą elektrod grafitowych, co zmniejszyło ciśnienie w komorze powietrznej i spowodowało skurcz odcinków tkanki. Wewnątrz rury znajduje się zawór hemostatyczny z czujnikiem ciśnienia, który wykrywa ciśnienie w układzie powietrznym. Ciśnienie wykrywane przez czujnik ciśnienia jest podawane do kolektora danych podłączonego do laptopa. Umożliwia to ciągłe monitorowanie ciśnienia wewnątrz komory gazowej. Po osiągnięciu maksymalnego ciśnienia w komorze (standardowo 80 mmHg, 140 mmHg OS), urządzenie do akwizycji danych otrzymało polecenie wysłania sygnału do systemu C-PACE-EM w celu wygenerowania dwufazowego sygnału napięciowego przez 2 ms, ustawionego na 4 V.
Pobrano skrawki serca i przeprowadzono następujące warunki hodowli w 6 dołkach: Przeniesiono pobrane serca z naczynia transferowego na tackę zawierającą zimną (4° C.) kardioplegię. Lewą komorę wyizolowano sterylnym ostrzem i pocięto na kawałki o wielkości 1-2 cm3. Te bloki tkankowe przymocowano do podpór tkankowych za pomocą kleju tkankowego i umieszczono w wibrującej łaźni tkankowej mikrotomu zawierającej roztwór Tyrode'a i stale natleniano (3 g/l 2,3-butanodionu monooksymu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukozy (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztworu), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztworu), do 1 L ddH2O). Mikrotom wibracyjny ustawiono tak, aby ciąć plasterki o grubości 300 µm z częstotliwością 80 Hz, amplitudą drgań poziomych 2 mm i szybkością posuwu 0,03 mm/s. Kąpiel tkankową otoczono lodem, aby utrzymać roztwór w chłodzie, a temperaturę utrzymywano na poziomie 4°C. Przenieś skrawki tkanek z kąpieli mikrotomowej do kąpieli inkubacyjnej zawierającej stale natleniony roztwór Tyrode'a na lodzie, aż uzyskasz wystarczającą liczbę skrawków na jedną płytkę hodowlaną. W przypadku kultur transwell skrawki tkanek przymocowano do sterylnych podpór poliuretanowych o szerokości 6 mm i umieszczono w 6 ml zoptymalizowanego podłoża (podłoże 199, 1x suplement ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaliczny i 2X antybiotyk-przeciwgrzybiczy). Do skrawków tkanek zastosowano stymulację elektryczną (10 V, częstotliwość 1,2 Hz) za pomocą C-Pace. W przypadku warunków TD dodawano świeże T3 i Dex w stężeniu 100 nM i 1 μM przy każdej zmianie medium. Medium jest nasycane tlenem przed wymianą 3 razy dziennie. Skrawki tkanek hodowano w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
W przypadku kultur CTCM, skrawki tkanek umieszczono na specjalnie zaprojektowanej drukarce 3D w szalce Petriego zawierającej zmodyfikowany roztwór Tyrode’a. Urządzenie ma na celu zwiększenie rozmiaru wycinka serca o 25% powierzchni pierścienia podporowego. Robi się to tak, aby skrawki serca nie rozciągały się po przeniesieniu z roztworu Tyrode’a do medium i podczas rozkurczu. Za pomocą kleju histoakrylowego, skrawki o grubości 300 µm zamocowano na pierścieniu podporowym o średnicy 7 mm. Po przymocowaniu skrawków tkanek do pierścienia podporowego, odetnij nadmiar skrawków tkanek i umieść przymocowane skrawki tkanek z powrotem w kąpieli z roztworem Tyrode’a na lodzie (4°C), aż do przygotowania wystarczającej liczby skrawków dla jednego urządzenia. Całkowity czas przetwarzania dla wszystkich urządzeń nie powinien przekraczać 2 godzin. Po przymocowaniu 6 skrawków tkanek do ich pierścieni podporowych, zmontowano urządzenie CTCM. Komora hodowlana CTCM jest wstępnie wypełniona 21 ml wstępnie natlenionego medium. Przenieś sekcje tkanki do komory hodowlanej i ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą pipety. Następnie sekcję tkanki wprowadza się do otworu i delikatnie dociska na miejsce. Na koniec umieść nasadkę elektrody na urządzeniu i przenieś urządzenie do inkubatora. Następnie podłącz CTCM do przewodu powietrznego i systemu C-PACE-EM. Siłownik pneumatyczny otwiera się, a zawór powietrza otwiera CTCM. System C-PACE-EM został skonfigurowany do dostarczania 4 V przy 1,2 Hz podczas stymulacji dwufazowej przez 2 ms. Medium zmieniano dwa razy dziennie, a elektrody wymieniano raz dziennie, aby uniknąć gromadzenia się grafitu na elektrodach. W razie potrzeby sekcje tkanki można wyjąć z ich dołków hodowlanych, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły się pod nie dostać. W przypadku warunków leczenia MT, T3/Dex dodawano na świeżo przy każdej zmianie medium z 100 nM T3 i 1 μM Dex. Urządzenia CTCM hodowano w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
Aby uzyskać rozciągnięte trajektorie plastrów serca, opracowano specjalny system kamer. Zastosowano lustrzankę (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonia) z obiektywem makro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, Kalifornia). Wizualizacja została przeprowadzona w temperaturze pokojowej po wymianie medium na świeże. Kamerę ustawiono pod kątem 51°, a wideo nagrywano z szybkością 30 klatek na sekundę. Najpierw użyto oprogramowania typu open source (MUSCLEMOTION43) z Image-J, aby określić ruch plastrów serca. Maskę utworzono przy użyciu programu MATLAB (MathWorks, Natick, Massachusetts, USA), aby zdefiniować obszary zainteresowania bijącymi plastrami serca, aby uniknąć szumu. Ręcznie segmentowane maski są stosowane do wszystkich obrazów w sekwencji klatek, a następnie przekazywane do wtyczki MUSCLEMOTION. Muscle Motion wykorzystuje średnią intensywność pikseli w każdej klatce, aby określić jej ruch względem klatki odniesienia. Dane zostały zarejestrowane, przefiltrowane i wykorzystane do ilościowego określenia czasu cyklu i oceny rozciągnięcia tkanek podczas cyklu pracy serca. Nagrane wideo zostało przetworzone przy użyciu cyfrowego filtra zerowej fazy pierwszego rzędu. Aby ilościowo określić rozciągnięcie tkanek (od szczytu do szczytu), przeprowadzono analizę od szczytu do szczytu, aby odróżnić szczyty od dołków w zarejestrowanym sygnale. Ponadto przeprowadzono detrendowanie przy użyciu wielomianu 6. stopnia w celu wyeliminowania dryfu sygnału. Kod programu został opracowany w MATLAB w celu określenia globalnego ruchu tkanek, czasu cyklu, czasu relaksacji i czasu skurczu (Kod programu uzupełniającego 44).
Do analizy odkształceń, wykorzystując te same filmy, które zostały stworzone do oceny rozciągania mechanicznego, najpierw prześledziliśmy dwa obrazy reprezentujące szczyty ruchu (najwyższy (górny) i najniższy (dolny) punkt ruchu) zgodnie z oprogramowaniem MUSCLEMOTION. Następnie segmentowaliśmy obszary tkanki i zastosowaliśmy pewien rodzaj algorytmu cieniowania do segmentowanej tkanki (Rysunek uzupełniający 2a). Segmentowana tkanka została następnie podzielona na dziesięć podpowierzchni, a naprężenie na każdej powierzchni zostało obliczone przy użyciu następującego równania: Odkształcenie = (Sup-Sdown)/Sdown, gdzie Sup i Sdown to odległości kształtu od górnego i dolnego cienia tkaniny (Rysunek uzupełniający .2b).
Skrawki serca utrwalano w 4% paraformaldehydu przez 48 godzin. Utrwalone tkanki odwadniano w 10% i 20% sacharozie przez 1 godzinę, a następnie w 30% sacharozie przez noc. Następnie skrawki zatapiano w optymalnym związku o temperaturze cięcia (związek OCT) i stopniowo zamrażano w kąpieli izopentanowej/suchego lodu. Przechowywać bloki do zatapiania OCT w temperaturze -80 °C do momentu rozdzielenia. Preparaty przygotowano jako skrawki o grubości 8 μm.
Aby usunąć OCT z przekrojów serca, podgrzewaj szkiełka na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez 5 min. Dodaj 1 ml PBS do każdego szkiełka i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przepuść przez przekroje, umieszczając 0,1% Triton-X w PBS na 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec wiązaniu się niespecyficznych przeciwciał z próbką, dodaj 1 ml 3% roztworu BSA do szkiełek i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usunięto BSA, a szkiełka przemyto PBS. Oznacz każdą próbkę ołówkiem. Pierwotne przeciwciała (rozcieńczone 1:200 w 1% BSA) (koneksyna 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dodawano przez 90 minut, następnie dodawano przeciwciała wtórne (rozcieńczone 1:200 w 1% BSA) przeciwko mysim Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), przeciwko króliczym Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) przez dodatkowe 90 minut. Przemywano 3 razy PBS. Aby odróżnić barwienie docelowe od tła, użyliśmy tylko przeciwciała wtórnego jako kontroli. Na koniec dodano barwnik jądrowy DAPI, a szkiełka umieszczono w Vectashield (Vector Laboratories) i zabezpieczono lakierem do paznokci. -x powiększenie) i mikroskop Keyence z 40-krotnym powiększeniem powiększenie.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) w stężeniu 5 μg/ml w PBS użyto do barwienia WGA i nałożono na utrwalone sekcje na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie preparaty przemyto PBS, a do każdego preparatu dodano czerń sudańską i inkubowano przez 30 minut. Następnie preparaty przemyto PBS i dodano medium do zatapiania vectashield. Preparaty wizualizowano pod mikroskopem Keyence przy powiększeniu 40x.
OCT usunięto z próbek w sposób opisany powyżej. Po usunięciu OCT zanurzono preparaty w roztworze Bouina na noc. Następnie preparaty przepłukano wodą destylowaną przez 1 godzinę, a następnie umieszczono w roztworze kwasu fuksynowego aloesu Bibrich na 10 minut. Następnie preparaty przemyto wodą destylowaną i umieszczono w roztworze 5% fosfomolibdenu/5% kwasu fosfowolframowego na 10 minut. Bez płukania przeniesiono preparaty bezpośrednio do roztworu błękitu anilinowego na 15 minut. Następnie preparaty przemyto wodą destylowaną i umieszczono w 1% roztworze kwasu octowego na 2 minuty. Preparaty wysuszono w 200 N etanolu i przeniesiono do ksylenu. Barwione preparaty uwidoczniono za pomocą mikroskopu Keyence z obiektywem 10x. Procent powierzchni zwłóknienia określono ilościowo za pomocą oprogramowania Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numer katalogowy V13154, zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami. W szczególności, użyto dziurkacza chirurgicznego o średnicy 6 mm, aby zapewnić jednolity rozmiar tkanki podczas analizy MTT. Tkanki pojedynczo umieszczano w dołkach 12-dołkowej płytki zawierającej substrat MTT zgodnie z protokołem producenta. Skrawki inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny, a żywa tkanka metabolizowała substrat MTT, tworząc fioletowy związek formazanu. Zastąp roztwór MTT 1 ml DMSO i inkubuj w temperaturze 37°C przez 15 minut, aby wyekstrahować fioletowy formazan z wycinków serca. Próbki rozcieńczono w stosunku 1:10 w DMSO w 96-dołkowych płytkach z przezroczystym dnem, a intensywność fioletowego koloru mierzono przy 570 nm za pomocą czytnika płytek Cytation (BioTek). Odczyty znormalizowano do masy każdego wycinka serca.
Podłoże Heart slice zastąpiono podłożem zawierającym 1 μCi/ml [5-3H]-glukozy (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) do testu wykorzystania glukozy, jak opisano wcześniej. Po 4 godzinach inkubacji, dodaj 100 µl podłoża do otwartej probówki mikrocentrifugi zawierającej 100 µl 0,2 N HCl. Następnie probówkę umieszczono w probówce scyntylacyjnej zawierającej 500 µl dH2O w celu odparowania [3H]2O przez 72 godziny w temperaturze 37°C. Następnie wyjmij probówkę mikrocentrifugi z probówki scyntylacyjnej i dodaj 10 ml płynu scyntylacyjnego. Zliczenia scyntylacji wykonano przy użyciu analizatora scyntylacji cieczowej Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Następnie obliczono wykorzystanie glukozy, biorąc pod uwagę aktywność właściwą [5-3H]-glukozy, niepełną równowagę i tło, rozcieńczenie [5-3H]-do nieoznakowanej glukozy i wydajność licznika scyntylacyjnego. Dane są normalizowane do masy przekrojów serca.
Po homogenizacji tkanki w Trizolu, RNA wyizolowano z wycinków serca przy użyciu zestawu Qiagen miRNeasy Micro Kit nr 210874 zgodnie z protokołem producenta. Przygotowanie biblioteki RNAsec, sekwencjonowanie i analizę danych przeprowadzono w następujący sposób:
1 μg RNA na próbkę użyto jako materiału wyjściowego do przygotowania biblioteki RNA. Biblioteki sekwencjonowania wygenerowano przy użyciu zestawu NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit dla Illumina (NEB, USA) zgodnie z zaleceniami producenta, a kody indeksów dodano do sekwencji atrybutów dla każdej próbki. W skrócie, mRNA oczyszczono z całkowitego RNA przy użyciu kulek magnetycznych przyłączonych do oligonukleotydów poli-T. Fragmentację przeprowadzono przy użyciu kationów dwuwartościowych w wysokiej temperaturze w buforze reakcji syntezy pierwszego łańcucha NEBNext (5X). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy użyciu losowych starterów heksamerowych i odwrotnej transkryptazy M-MuLV (RNase H-). Drugą nić cDNA zsyntetyzowano następnie przy użyciu polimerazy DNA I i RNazy H. Pozostałe wystające fragmenty przekształcono w tępe końce przez aktywność egzonukleazy/polimerazy. Po adenylacji 3' końca fragmentu DNA, dołączono do niego adapter NEBNext ze strukturą pętli hairpin, aby przygotować go do hybrydyzacji. W celu wyselekcjonowania fragmentów cDNA o preferowanej długości 150-200 pb, fragmenty biblioteki oczyszczono przy użyciu systemu AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Następnie 3 μl enzymu USER (NEB, USA) z cDNA o wybranym rozmiarze zligowanym z adapterem użyto przez 15 minut w temperaturze 37°C, a następnie przez 5 minut w temperaturze 95°C przed PCR. Następnie przeprowadzono PCR przy użyciu polimerazy DNA Phusion High-Fidelity, uniwersalnych starterów PCR i starterów Index (X). Na koniec oczyszczono produkty PCR (system AMPure XP), a jakość biblioteki oceniono w systemie Agilent Bioanalyzer 2100. Następnie bibliotekę cDNA zsekwencjonowano przy użyciu sekwencera Novaseq. Surowe pliki obrazów z Illumina zostały przekonwertowane na surowe odczyty przy użyciu CASAVA Base Calling. Surowe dane są przechowywane w plikach w formacie FASTQ(fq), które zawierają sekwencje odczytów i odpowiadające im jakości baz. Wybierz HISAT2, aby dopasować filtrowane odczyty sekwencjonowania do genomu referencyjnego Sscrofa11.1. Zasadniczo HISAT2 obsługuje genomy dowolnej wielkości, w tym genomy większe niż 4 miliardy baz, a dla większości parametrów ustawione są wartości domyślne. Odczyty splicingowe z danych RNA Seq można skutecznie wyrównać przy użyciu HISAT2, najszybszego obecnie dostępnego systemu, z taką samą lub lepszą dokładnością niż jakakolwiek inna metoda.
Obfitość transkryptów bezpośrednio odzwierciedla poziom ekspresji genu. Poziomy ekspresji genu ocenia się na podstawie obfitości transkryptów (liczba sekwencjonowania) związanych z genomem lub eksonami. Liczba odczytów jest proporcjonalna do poziomów ekspresji genu, długości genu i głębokości sekwencjonowania. Obliczono FPKM (fragmenty na tysiąc par zasad zsekwencjonowanego transkryptu na milion par zasad), a wartości p różnicowej ekspresji określono przy użyciu pakietu DESeq2. Następnie obliczyliśmy współczynnik fałszywych odkryć (FDR) dla każdej wartości p przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga9 w oparciu o wbudowaną funkcję R „p.adjust”.
RNA wyizolowane z przekrojów serca zostało przekształcone w cDNA w stężeniu 200 ng/μl przy użyciu SuperScript IV Vilo Master mix firmy Thermo (Thermo, nr kat. 11756050). Ilościową reakcję RT-PCR przeprowadzono przy użyciu przezroczystej płytki reakcyjnej Endura Plate Microamp firmy Applied Biosystems o 384 dołkach (Thermo, nr kat. 4483319) i kleju optycznego Microamp (Thermo, nr kat. 4311971). Mieszanina reakcyjna składała się z 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, nr kat. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer i 3,5 µl H2O wymieszanych na dołek. Wykonano standardowe cykle qPCR i zmierzono wartości CT przy użyciu urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym Quantstudio 5 firmy Applied Biosystems (moduł 384-dołkowy; nr produktu A28135). Startery Taqman zakupiono od firmy Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Wartości CT wszystkich próbek znormalizowano względem genu gospodarczego GAPDH.
Uwalnianie NT-ProBNP z nośnika oceniano przy użyciu zestawu NT-ProBNP (świnia) (nr kat. MBS2086979, MyBioSource) zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, do każdego dołka dodano w dwóch powtórzeniach 250 µl każdej próbki i standardu. Natychmiast po dodaniu próbki, dodaj 50 µl odczynnika testowego A do każdego dołka. Delikatnie wstrząśnij płytką i uszczelnij uszczelniaczem. Następnie tabletki inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie odessaj roztwór i przemyj dołki 4 razy 350 µl 1X roztworu do płukania, inkubując roztwór do płukania przez 1-2 minuty za każdym razem. Następnie dodaj 100 µl odczynnika testowego B na dołek i uszczelnij uszczelniaczem płytki. Tabletkę delikatnie wstrząśnij i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut. Odessać roztwór i przemyć studzienki 5 razy 350 µl 1X roztworu do płukania. Dodać 90 µl roztworu substratu do każdego studzienki i uszczelnić płytkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 10-20 minut. Dodać 50 µl roztworu Stop do każdego studzienki. Płytkę natychmiast zmierzono za pomocą czytnika płytek Cytation (BioTek) ustawionego na 450 nm.
Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania rozmiarów grup zapewniających >80% moc wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametru przy 5% współczynniku błędu rodzaju I. Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania rozmiarów grup zapewniających >80% moc wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametru przy 5% współczynniku błędu rodzaju I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania grup o takiej wielkości, aby zapewnić >80% mocy pozwalającej na wykrycie 10% bezwzględnej zmiany parametrów przy 5% współczynniku błędu rodzaju I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров i 5% частоты ошибок типа I. Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania grupy o takiej wielkości, która zapewniłaby >80% mocy pozwalającej na wykrycie 10% bezwzględnej zmiany parametrów i 5% wskaźnika błędów typu I.Sekcje tkanek wybrano losowo przed eksperymentem. Wszystkie analizy były ślepe na warunki, a próbki dekodowano dopiero po przeanalizowaniu wszystkich danych. Do wykonania wszystkich analiz statystycznych użyto oprogramowania GraphPad Prism (San Diego, CA). W przypadku wszystkich statystyk wartości p uznawano za istotne przy wartościach <0,05. W przypadku wszystkich statystyk wartości p uznawano za istotne przy wartościach <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. W przypadku wszystkich statystyk wartości p uznawano za istotne przy wartościach <0,05.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. W przypadku wszystkich statystyk wartości p uznawano za istotne przy wartościach <0,05.Dwustronny test t-Studenta wykonano na danych z tylko 2 porównaniami. Do określenia istotności między wieloma grupami zastosowano jednokierunkową lub dwukierunkową analizę wariancji. Podczas wykonywania testów post hoc zastosowano poprawkę Tukeya, aby uwzględnić wielokrotne porównania. Dane RNAsec mają specjalne względy statystyczne podczas obliczania FDR i p.adjust, jak opisano w sekcji Metody.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu raportu badawczego Nature Research Report dostępnym pod tym artykułem.