د Nature.com د لیدلو لپاره مننه. د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ د CSS لپاره محدود ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت بند کړئ).
د انسان د کولمو مورفوګینسیس د 3D اپیتیلیل مایکرو آرکیټیکچر او ځایي سازمان crypt-villus ځانګړتیاوې رامینځته کوي. دا ځانګړی جوړښت د دې لپاره اړین دی چې د کولمو هومیوستاسیس وساتي ترڅو د سټم سیل طاق د خارجي مایکروبیل انټيجنونو او د دوی میټابولیتونو څخه ساتنه وکړي. د کولمو د مغز په سطح کې خنډ. له همدې امله، د 3D اپیتیلیل جوړښتونو بیارغونه د ویټرو غوټ ماډلونو جوړولو لپاره خورا مهم دی. د پام وړ، د عضوي ممیټیک غوټ-این-ا-چپ کولی شي د کولمو د 3D مورفوګینیسیس په زړه پورې کړي، د کولمو د انفجولوژیکي فعالیت سره د بایوفیزیم انفیژیکي فعالیت چمتو کوي. د تولید وړ پروتوکول په کولمو کې د کولمو مورفوګینسیس په قوي توګه د مایکرو فلوایډیک چپ او همدارنګه په ټرانس ویل سرایت شوي هایبرډ چپ کې هڅوو. موږ د وسیلې جوړولو لپاره مفصل میتودونه تشریح کوو ، د کاکو -2 کلتور کول یا د کولمو ارګانایډ اپیتیلیل حجرو کې د مایکرو فلوډیک 3 پلیټ فارم کې د مایکرو فلوډیک سیسټم په توګه. د 3D اپیتیلیا د ډیری امیجنګ طریقو په کارولو سره د رامینځته شوي 3D اپیتیلیا ځانګړتیا ده. دا پروتوکول د 5 d لپاره د باسولټرل مایع جریان کنټرولولو سره د فعال کولمو مایکرو آرکیټیکچر بیا رغونه ترلاسه کوي. زموږ د ویټرو مورفوګینسیس میتود د فزیولوژیکي پلوه اړونده شین فشار او میخانیکي حرکت ګماري او ممکن زموږ د حجرو نور پیچلي تخنیکونو ته اړتیا ونلري. وړاندیز شوی پروتوکول کولی شي د بایو میډیکل څیړنې ټولنې لپاره پراخه اغیزې ولري، د بایو میډیکل، کلینیکي، او درمل جوړونې غوښتنلیکونو لپاره په ویټرو کې د 3D کولمو اپیتیلیل پرتونو د بیا رامینځته کولو میتود چمتو کوي.
تجربې ښیي چې د کولمو اپیتیلیل Caco-2 حجرې چې په کولټ-on-a-chip1,2,3,4,5 یا bilayer microfluidic وسیلو کې 6,7 کولی شي د اصلي میکانیزم روښانه پوهیدو پرته په ویټرو کې په ناڅاپي ډول 3D مورفوګینسیس تیر کړي. s په ویټرو کې د 3D اپیتیلیل مورفوګینسیس هڅولو لپاره اړین او کافي دی ، کوم چې د Caco-2 او د ناروغ څخه ترلاسه شوي کولمو ارګانایډونو لخوا ښودل شوي.په دې څیړنه کې، موږ په ځانګړې توګه د یو قوي Wnt مخالف، Dickkopf-1 (DKK-1) د حجرو تولید او غلظت توزیع باندې تمرکز وکړ، په کولمو کې یو چپ او ترمیم شوي مایکرو فلویډیک وسیلو کې چې Transwell inserts لري، د "Hybrid Chipgontous Extragonta DVK) په نوم یادیږي. -1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) on-chip gut د مورفوجنیسیس مخنیوی کوي یا د مخکینۍ 3D اپیتیلیل طبقه ګډوډوي، دا وړاندیز کوي چې د کلتور په جریان کې مخالف فشار د کولمو مورفوجینسي مسؤول دی چې د ویټروپرایسټیک طریقې د لاسته راوړلو لپاره د کولمو مورفوګینیکیک روبو کې. elial انٹرفیس د فعال فلش کولو (د مثال په توګه په ګوټ-on-a-chip یا هایبرډ-on-a-چپ پلیټ فارمونو کې) یا خپریدو په واسطه په بیسولټرل کمپارټمینټ کې د Wnt مخالفانو کچه لرې کول یا لږترلږه ساتل دي .Basolateral میډیا (د بیلګې په توګه ، د ټرانس ویل څخه د لوی بیسولټرل څاه داخلولو کې داخلیږي).
په دې پروتوکول کې، موږ د ګوټ-آن-ا-چپ مایکرو وسیلو د جوړولو او د Transwell-insertable هایبرډ چپس (مرحلې 1-5) د پولیډیمیتیلسیلوکسین (PDMS) پر بنسټ د پورس میمبرینونو د کولتور کولو لپاره یو مفصل میتود چمتو کوو. 6B, 7B, 8, 9) او په ویټرو کې د 3D مورفوګینسیس هڅول (10 ګام). موږ همدارنګه د حجرو او مالیکولر ځانګړتیاوې په ګوته کړې چې د نسج ځانګړي هسټوجنیسیس او نسب پورې تړلي سیلولر توپیر د ډیری عکس العملونو په پلي کولو سره (مرحلې 11-24 مرحلې) په کارولو سره په ویټرو کې د انسان حجرو په توګه. 2 یا د کولمو ارګانایډونه په دوه کلتوري شکلونو کې چې تخنیکي توضیحات پکې شامل دي په شمول د سوري غشا د سطحې تعدیل ، د 2D مونویلیرونو رامینځته کول ، او د کولمو بایو کیمیکل او د بایو میخانیک مایکرو چاپیریال بیا تولید. په منځني ډول د کلتور د بیسولټرل کمپارټمینټ کې. په پای کې، موږ د بیا رغولو وړ 3D اپیتیلیل پرت د کارونې استازیتوب وړاندې کوو چې د مورفوګین پورې تړلي اپیتیلیل وده ماډل کولو لپاره کارول کیدی شي، اوږدمهاله کوربه - مایکروبیوم شریک کلتورونه، د ناروغۍ انتان، التهابي زخم او د بارریپیټریپایډیپټیسس، د انفلاسیون التهاب. .اثر کوي.
زموږ پروتوکول ممکن د ساینس پوهانو پراخه لړۍ کې ګټور وي (د مثال په توګه د کولمو میوکوسل بیولوژي ، د سټیم سیل بیولوژي ، او پرمختیایی بیولوژي) او پلي شوي څیړنې (د بیلګې په توګه ، د درملو دمخه کلینیکي ازموینې ، د ناروغۍ ماډلینګ ، د نسج انجینرۍ ، او ګیسټرو انټرولوژي) پراخه اغیزې. په ویټرو کې د کولمو اپیتیلیم، موږ فکر کوو چې زموږ تخنیکي ستراتیژي هغه لیدونکو ته خپره کیدی شي چې د کولمو د پراختیا، بیا زیږون یا هومیوستاسیس په جریان کې د حجرو سیګنالینګ متحرکات مطالعه کوي. سربیره پردې، زموږ پروتوکول د مختلفو انتاني اجنټانو لکه Norovirus 8، Severerovirus 8، Clovere-Severe-Corravirus-2-Severe-Corravirus-Coronavirus-Corovidros-Activator لاندې د انتاناتو تحقیق لپاره ګټور دی. ium difficile, Salmonella Typhimurium 9 یا Vibrio cholerae.د ناروغۍ رنځپوهنې او رنځپوهنې اوریدونکي هم ګټور دي. د آن چپ کول د مایکرو فزیولوژی سیسټم کارول ممکن د اوږدمهاله ګډ کلتور 10 او وروسته د کوربه دفاع ارزونه ، د معافیت غبرګون او د معدې (GI) په جریان کې د رنځجن پورې اړوند زخم ترمیم ته اجازه ورکړي. s ناروغي، ulcerative colitis، pouchitis، یا irritable bowel syndrome هغه وخت رامینځته کیدی شي کله چې د 3D کولمو اپیتیلیل پرتونه د ناروغ د 3D کولمو اپیتیلیل پرتونو په کارولو سره چمتو کیږي ، پدې ناروغیو کې villous atrophy، crypt shortening، mucosal loss، یا impairedelith-b-celleritem-Barederitem. oids12,13. د دې لپاره چې د ناروغۍ چاپیریال لوړ پیچلتیا ښه نمونه کړي، لوستونکي کولی شي د ناروغۍ پورې اړوند حجرو ډولونه اضافه کړي، لکه د ناروغ پریریفیرل وینې مونو نیوکلیر حجرې (PBMCs)، په ماډلونو کې چې د 3D کولمو villus-crypt مایکرو آرکیټیکچرونه لري.د نسج ځانګړي معافیت حجرې، 5.
څرنګه چې د 3D اپیتیلیل مایکرو جوړښت د برخې کولو پروسې پرته تنظیم کیدی شي او لیدل کیدی شي، لیدونکي چې په ځایي ټرانسکریټومکس او لوړ ریزولوشن یا سوپر ریزولوشن امیجنگ کې کار کوي ممکن زموږ په اپیتیلیل طاقونو کې د جینونو او پروټینونو سپیټیوټیمپورل متحرکاتو نقشه کولو کې علاقه ولري.د ټیکنالوژۍ سره علاقه لري. مایکروبیل یا معافیتي محرکاتو ته غبرګون. سربیره پردې ، اوږدمهاله کوربه - مایکروبیوم کراسټالک 10, 14 چې د کولمو هومیوستاسیس همغږي کوي د 3D کولمو میوکوسل طبقه کې د مختلف مایکروبیل ډولونو په ګډه کلتور کې رامینځته کیدی شي ، په ځانګړي توګه د مایکروبیال ټولنې یا فیوز - مایکروبیاټوټوټو.په پلیټ فارم کې. دا طریقه په ځانګړې توګه د هغو لیدونکو لپاره په زړه پورې ده چې د میوکوسل معافیت، ګیسټرو انټرولوژي، انساني مایکروبیوم، کلتورومکس او کلینیکي مایکروبیولوژي مطالعه کوي چې په لابراتوار کې د پخوانیو غیر کلتوري کولمو مایکروبیوټا کرلو په لټه کې دي. tes چې په دوامداره توګه د بیسولټرل برخې ډکوي، پروتوکول هغو کسانو ته هم خپریدای شي چې درمل جوړونکي، بایو میډیکل یا د خوراکي توکو د صنعت لپاره د لوړې کچې سکرینینګ یا تصدیق کولو پلیټ فارمونو ته وده ورکوي. د اصولو د ثبوت په توګه، موږ په دې وروستیو کې د څو اړخیزو لوړ-throughput سیسټمونو لپاره امکانات ښودلي. -a-چپ محصولات سوداګریز شوي دي 16,17,18. له همدې امله زموږ د ویټرو مورفوګینسیس میتود ګړندی کول او په بالقوه توګه د ډیری څیړنیزو لابراتوارونو ، صنعت یا حکومت او تنظیم کونکو ادارو لخوا منل کیدی شي ترڅو د ویټرو ګوت مورفوګینسیس د سیلولر بیا پروګرمنګ پوهه شي ترڅو د ټرانسکرپټومیک ټرانسپورټ یا د بایوګرافیک ترانسپورت په کچه د مخدره توکو ټیسټونو ته د امیدوارۍ په توګه وټاکل شي. د 3D کولمو سروګیټونو کارول یا د ګیټ مورفوګینسیس پروسې د تولید وړتیا ارزولو لپاره د ګمرک یا سوداګریز ارګان-آن-چپ ماډلونو کارول.
د انسان اړوند تجربوي ماډلونو محدودو تجربو د کولمو اپیټسیلیال مورزیسیس د څارویو زده کړې په اړه کارول شوي، چې د زرګونو اطاعت په اړه په اهمیت سره، په کرهنه کې د بشري پرمختیایی پروسو په ګوته مه کوئ. د مختلف مغشوش یا معافیت پرتونو ته په ځواب کې ویلس محور کولی شي د کوربه فالوس او انټيکروائل پرتونو ته اجازه ورکړي چې د EGA مایکروبیوټ جوړښت څنګه پوه شي چې څنګه د جوار مایکروبیوټا جوړښتونه څنګه پوه شي ټولنې او په همغږي ډول مایکروټالټال میټابولټونه تولیدوي (د بیلګې په توګه لنډ ځناور اسیدونه.
د 3D کولمو د اپیتیلیل جوړښتونو د جوړولو لپاره زموږ د میتود سربیره، د ویټرو ډیری میتودونه شتون لري. د کولمو ارګانایډ کلتور یو عصري نسج انجنیري تخنیک دی چې د ځانګړو مورفوجن شرایطو لاندې د کولمو سټیم حجرو د کښت پر بنسټ والړ دی. ننګونې ځکه چې د کولمو لیمین د ارګانایډ په مینځ کې تړل شوی او له همدې امله د لومین اجزاو معرفي کول لکه مایکروبیل حجرې یا خارجي انټيجن محدود دي.organoid lumens ته لاسرسی د مایکرو انجیکټور په کارولو سره ښه کیدی شي ، 26,27 مګر دا میتود برید کونکی او د کار وړ دی او د ترسره کولو لپاره تخصصي پوهې ته اړتیا لري. سربیره پردې ، د هایدروجیل سکافولډونو کې ساتل شوي دودیز ارګانایډ کلتورونه د جامد شرایطو لاندې په vivo بایو میخانیک کې په سمه توګه فعال منعکس نه کوي.
نورې لارې چارې چې د څو څیړنیزو ګروپونو لخوا کارول کیږي د 3D هایدروجیل سکیفولډونو څخه کار اخلي تر څو د کولمو اپیتیلیل جوړښت د جیل په سطحه د جلا شوي انساني کولمو حجرو کلتور ته وده ورکړي. ویټرو د فزیولوژیکي پلوه اړوند مورفوجن ګریډینټونو سره ، په سکافولډ کې د سټرومال حجرو په شمول د لوړ اړخ تناسب اپیتیلیل جوړښت او د سټروما اپیتیلیل کراسسټال رامینځته کوي. په هرصورت ، د مخکې جوړ شوي سکافولډونو طبیعت کولی شي د ناڅاپي مورفوګینټیک پروسې د ښودلو مخه ونیسي. دا فشار چې د کولمو حجرو ته اړتیا ده چې مورفوجینسیس ترسره کړي او فیزولوژیکي فعالیت ترلاسه کړي. بلې وروستۍ مطالعې په مایکرو فلوایډیک پلیټ فارم کې هایدروجیل سکافولډونه کارولي او د کولمو اپیتیلیل جوړښتونه یې د لیزر ایچنګ تخنیکونو په کارولو سره نمونه کړي دي. ics module.په هرصورت، دا ماډل نه په خپله خوښه مورفوجینیک پروسې ښیي او نه د کولمو میخانوبیولوژیکي حرکتونه پکې شامل دي. د ورته ګروپ څخه د 3D چاپ کولو تخنیکونه توانیدلي چې د ناڅاپه مورفوجینیک پروسو سره کوچني کولمو ټیوبونه رامینځته کړي. سره له دې چې د مختلف کولمو ډیفلومینیک ماډلونو کې د فلو ټیوب د فلومین فلوشن ماډل نشتوالی. برسیره پردې، د ماډل عملیات ممکن محدود وي، په ځانګړې توګه وروسته له دې چې د بایوپرینټینګ پروسه بشپړه شي، د تجربوي شرایطو یا د حجرو څخه تر حجرو پورې تعاملات اندیښمن کړي. پرځای یې، زموږ وړاندیز شوی پروتوکول د کولمو مورفوجینسیس، د فزیولوژیکي پلوه اړونده فشار فشار، بایو میخانیکونه چې د کولمو حرکت، او د پیچلو مایکروسولولوژیکي بیاکتنې او د بایکریټولوژیکي بیا رغاونې د لاسرسۍ سره مطابقت لري. د موډلیت چاپیریال. له همدې امله، زموږ د ویټرو 3D مورفوګینسیس پروتوکول ممکن د موجوده میتودونو ننګونو سره د مقابلې لپاره بشپړونکي چلند چمتو کړي.
زموږ پروتوکول په بشپړه توګه په 3D اپیتیلیل مورفوګینسیس باندې متمرکز دی، په کلتور کې یوازې اپیتیلیل حجرې شتون لري او د شاوخوا شاوخوا حجرو نور ډولونه لکه mesenchymal حجرې، endothelial حجرې، او د معافیت حجرې شتون نلري. لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، زموږ د پروتوکول اصلي برخه د اپیتیلیل مورفوجینسیس انډکشن دی چې د ریفورمولوژین په واسطه د پټو مورفوجین په واسطه معرفي کیږي. medium. په داسې حال کې چې زموږ د ګيټ-on-a-چپ او هایبرډ-on-a-چپ قوي ماډلریت موږ ته اجازه راکوي چې د 3D اپیتیلیل پرت بیا جوړ کړو، اضافي بیولوژیکي پیچلتیاوې لکه د اپیتیلیل-میسینچیمل تعاملات 33,34، extracellular Matrix (ECM) په ماډلونو کې، د کریپټو 3D حجرو جوړښت، د کریپټو 3D حجرو جوړښت، او د کریپټو 3D ځانګړنې. په basal crypts کې niches نور په پام کې نیولو سره پاتې دي. په mesenchyme کې د سټرومل حجرې (د بیلګې په توګه، فایبروبلاستونه) د ECM پروټینونو په تولید او په vivo35,37,38 کې د کولمو مورفوګینسیس تنظیم کولو کې کلیدي رول لوبوي. زموږ په ماډل کې د mesenchymal حجرو اضافه کول د مورفوجینیتیک یا کیپیلیلیل پرتونه د مورفوجینټیک انټیویلیل پروسیجرونو او کیپولوژیکي پروسیجرونو ته وده ورکوي. ) د کولمو مایکرو چاپیریال کې د مالیکولر ټرانسپورټ 39 او د معافیت حجرو استخدام 40 تنظیم کولو کې مهم رول لوبوي. سربیره پردې ، د نسجونو ماډلونو تر مینځ وصل شوي ویسکولیچر اجزا یو شرط دی کله چې د نسج ماډلونه د څو عضوي تعاملاتو ښودلو لپاره ډیزاین شوي وي. نو له همدې امله د حجرو د پای ته رسیدو لپاره د اضافي حجرو یا موډلونو سره د اکریولوژیکي ځانګړتیاو لپاره اړتیا وي. ریزولوشن. د ناروغ څخه ترلاسه شوي معافیت حجرې د داخلي معافیت غبرګون ښودلو لپاره هم اړین دي، د انټيجن پریزنټشن، د انتاناتو د ناروغۍ د نقل کولو په شرایطو کې د نسج ځانګړي معافیت، طبیعي تطبیقي معافیت کراسټالک.
د هایبرډ چپس کارول د ګټ-آن-چپ په پرتله خورا ساده دي ځکه چې د وسیلې تنظیم کول خورا ساده دي او د ټرانس ویل انسرټونو کارول د کولمو اپیتیلیم د توزیع وړ کلتور ته اجازه ورکوي. په هرصورت، د پولیسټر جھلیو سره په سوداګریزه توګه شتون لرونکي ټرانسویل داخلونه لچک وړ ندي او نشي کولی د پیریسټالټیک په څیر د thersert ټیپ حرکتونو کې د ټرانسویل په څیر د کمپیوتر حرکتونو کې نقل کړي. d چپ د apical اړخ کې د هیڅ شییر فشار پرته ثابت پاتې شو. په ښکاره ډول، په apical compartment کې جامد ملکیتونه په ندرت سره په هایبرډ چپس کې د اوږدمهاله باکتریا شریک کلتور فعالوي. په داسې حال کې چې موږ کولی شو په ټرانس ویل کې د 3D مورفوګینسیس په قوي توګه هڅوو کله چې د هایبریډ فلوژیکي شارټ فیلوژیکي انفلوژیکي کارول. د ID جریان ممکن د احتمالي غوښتنلیکونو لپاره د هایبرډ چپ پلیټ فارمونو امکانات محدود کړي.
د انسان د کریپټو-ویلس محور بشپړ پیمانه بیا رغونه په کولمو کې په چپ او هایبرډ-آن-چپ کلتورونو کې په بشپړ ډول ندي رامینځته شوي. څنګه چې مورفوګینیسیس د اپیتیلیل مونویلیر څخه پیل کیږي ، د 3D مایکرو آرکیټیکچرونه اړین ندي چې موږ ته نږدې د کریپټوولوژیکي ځانګړتیاوو سره نږدې د کریپټوولوژیکي ځانګړتیاوو سره ورته والی چمتو کړو. په مایکرو انجینیر شوي 3D اپیتیلیم کې د بیسال کریپټ ډومین ، کریپټ او ویلس سیمې په روښانه ډول نه دي مشخص شوي. که څه هم په چپ کې لوړ پورتنۍ چینلونه د مایکرو انجینر شوي اپیتیلیم لوړوالي لامل کیږي ، اعظمي لوړوالی لاهم د ~ 300-400 پورې محدود دی د لویو کریپټینټ په مینځ کې. es په ترتیب سره ~ 135 µm او ~ 400 µm دی، او د کوچني کولمو لوړوالی ~ 600 µm41 دی.
د عکس العمل له نظره، د 3D مایکرو آرکیټیکچرونو عالي ریزولوشن امیجنگ ممکن په چپ کې د کولمو پورې محدود وي ، ځکه چې د هدف لینز څخه د اپیتیلیل پرت ته اړین کاري فاصله د څو ملی مترو په ترتیب کې ده. د دې ستونزې د لرې کولو لپاره ، لرې هدف ته اړتیا لیدل کیدی شي. د PDMS. سربیره پردې، څرنګه چې په چپ کې د کولمو د پرت پرت مایکرو فابریکیشن د هر پرت تر مینځ دایمي چپک کول شامل دي، نو دا خورا ننګونه ده چې د اپیتیلیل پرت د سطحې جوړښت معاینه کولو لپاره د پورتنۍ طبقې خلاص یا لرې کړئ. د مثال په توګه، د سکینګ الکترون مایکروسکوپ (SEM) په کارولو سره.
د PDMS هایدروفوبیکیت د مایکرو فلوایډیک پر بنسټ مطالعاتو کې یو محدود فاکتور دی چې د هایدروفوبیک کوچني مالیکولونو سره معامله کوي، ځکه چې PDMS کولی شي په غیر مشخص ډول دا ډول هایدروفوبیک مالیکولونه جذب کړي. د PDMS بدیل ممکن د نورو پولیمیریک موادو سره په پام کې ونیول شي. په بدیل سره، د موادو سره د PDMS 2، د سطحې colipophi، د سطحي ترمیم سره ene glycol) 43) د هایدروفوبیک مالیکولونو جذب کمولو لپاره په پام کې نیول کیدی شي.
په نهایت کې، زموږ طریقه د لوړې کچې سکرینینګ یا "یو-سایز-فټ-ټول" کاروونکي دوستانه تجربوي پلیټ فارم چمتو کولو له مخې ښه نه ده مشخص شوې. اوسنی پروتوکول په هر مایکرو وسیلو کې د سرنج پمپ ته اړتیا لري چې د CO2 انکیوبټر کې ځای نیسي او د لوی کچې تجربو مخه نیسي. ، یا 384-څاه لرونکی داخلونه چې د دوامداره ډکولو او د باسولټرل میډیا لرې کولو ته اجازه ورکوي).
په ویټرو کې د انسان د کولمو اپیتیلیم د 3D مورفوګینسیس هڅولو لپاره، موږ د مایکرو فلوایډیک چپ کولمو وسیله کارولې چې دوه موازي مایکرو چینلونه او په مینځ کې یو لچک لرونکي پورس جھلی لري ترڅو د لیمین - کیپلیري انٹرفیس رامینځته کړي. موږ همدارنګه د یو واحد چینل کارول په ډاګه کوو چې د دوامداره مایکرو فلوایډیک وسیلې څخه کار اخلي. قطبي اپیتیلیل پرتونه چې په Transwell inserts کې کرل شوي دي. په دواړو پلیټ فارمونو کې، د مختلفو انساني کولمو اپیتیلیل حجرو مورفوګینیزس د جریان د سمتي تخریب په پلي کولو سره ښودل کیدی شي ترڅو د باسولټرل کمپارټمینټ څخه د مورفوګین مخالفان لرې کړي. ټوله تجربه پروسیجر (شکل 1) د 5 مایکرو فیلډیټ برخو څخه جوړه ده. چپ (مرحلې 1-5؛ بکس 1)، (ii) د کولمو اپیتیلیل حجرو چمتو کول (Caco-2 حجرې) یا د انسان د کولمو ارګانایډونه؛بکسونه 2-5)، (iii) د کولمو په چپسونو یا هایبرډ چپسونو کې د کولمو اپیتیلیل حجرو کلتور (6-9 مرحلې)، (iv) په ویټرو کې د 3D مورفوګینسیس داخلول (10 ګام) او (v) ) د 3D اپیتیلیل ځانګړتیاو مشخص کولو لپاره (د 3D اپیتیلیل کنټرول لاندې د مایکروسټرکچر) 1-2 په لاندې ډول مناسب مایکروسټرکچر (د 3D د کنټرول لپاره) د ځایی، لنډمهاله، مشروط، یا طرزالعمل کنټرولونو سره د اپیتیلیل مورفوګینیسیس پرتله کولو سره د ویټرو مورفوګینیسیس اغیزمنتوب تایید کولو لپاره ډیزاین شوی.
موږ دوه مختلف کلتوري پلیټ فارمونه کارولي دي: د مستقیم چینلونو یا غیر خطي کنولوټ شوي چینلونو سره د ګیټ-آن-ا-چپ یا هایبرډ چپس چې ټرانس ویل (TW) په مایکرو فلوایډیک وسیله کې داخلوي، لکه څنګه چې په 1 بکس کې بیان شوي، او د 1-5 ګام "د وسیلې جوړونه" د یو واحد هوچیپپایډي انچیپیټیپلیمین جوړونې اصلي ګامونه ښیې. lial Cells" د حجرو سرچینه (Caco-2 یا د انسان د کولمو ارګانایډز) او د کلتور طرزالعمل تشریح کوي چې پدې پروتوکول کې کارول کیږي. "In vitro morphogenesis" ټول هغه مرحلې ښیي چې په کوم کې د Caco-2 یا organoid څخه ترلاسه شوي اپیتیلیل حجرې د کولمو په چپ یا د Transwell 3 inserts of morphogenes inserted by transwelled. د یو مشخص اپیتیلیل جوړښت رامینځته کول. د پروګرام مرحله شمیره یا د بکس شمیره د هر تیر تیر لاندې ښودل کیږي. غوښتنلیک مثالونه وړاندې کوي چې څنګه د کولمو اپیتیلیل پرتونه کارول کیدی شي، د بیلګې په توګه، د حجرو توپیر ځانګړتیا، د کولمو فزیولوژي مطالعات، د کوربه مایکروبیوم اکوسیستم تاسیس کول، او د ناروغۍ ماډلینګ "Flus-Microbiome" عکس العمل ښودل. actin او MUC2 په 3D Caco-2 اپیتیلیل طبقه کې څرګند شوي چې د کولمو په چپ کې رامینځته شوي. MUC2 سیګنال په ګوبلیټ حجرو او بلغم کې شتون لري چې د مغز له سطحې څخه پټیږي. د کولمو فزیولوژي کې د فلوروسینټ عکسونه د سیلیک اسید او N-Acetic Acidslugglucosentiglusentiglusentiglucosentiglusentiglusiteglusiteglusiteglusiteglus لپاره د داغونو په واسطه تولید شوي بلغم ښیي. in.په "Host-Microbe Co-Cultures" کې دوه متقابل عکسونه په یوه چپه کولتور کې د کوربه مایکروبیوم شریک کلتورونه ښیي. کیڼ تخته د E. coli شریک کلتور ښیي چې د مایکرو انجینر شوي 3D Caco-2 سره د شنه فلوروسینټ پروټین (GFP) څرګندونه کوي. د 3D Caco-2 epithelial حجرې، د F-actin (سور) او نیوکلی (نیلي) سره د immunofluorescence داغ تعقیبوي. د ناروغۍ ماډلینګ د باکتریا انټيجنونو سره د فزیولوژیکي ننګونې لاندې د کولمو التهاب چپس کې صحي بمقابله لیکي کول روښانه کوي (د بیلګې په توګه، لیپوپولیسیاکرایډ حجرې (لپوپولیسیاکرایډ، PMCB حجرې)شنه) د Caco-2 حجرې د 3D اپیتیلیل پرت رامینځته کولو لپاره کلتور شوي. سکیل بار، 50 µm. په لاندې قطار کې انځورونه: "د حجرو توپیر" د حوالې په اجازې سره تطبیق شوی. 2.د اکسفورډ پوهنتون مطبوعاتي؛د Ref.5 په اجازې سره بیا تولید شوی.NAS;"میزبان - مایکروب ګډ کلتور" د ref.3 په اجازې سره تطبیق شوی.NAS;د "ناروغۍ ماډلینګ" د حوالې په اجازې سره تطبیق شوی.5.NAS.
دواړه ګټ آن چپ او هایبرډ چپس د PDMS نقلونو په کارولو سره جوړ شوي چې د نرم لیتوګرافي 1,44 پواسطه د سیلیکون مولډونو څخه تخریب شوي او د SU-8 سره نمونه شوي. په هر چپ کې د مایکرو چینلونو ډیزاین د هایدروډینامیکونو په پام کې نیولو سره ټاکل کیږي لکه د شییر فشار او د هایدروډینا 1.2 اصلي ډیزاین. د ډیټا انځور 1a) چې د دوه متوازی مستقیم مایکرو چینلونو څخه جوړ شوی و، په یو پیچلي غوټ-آن-چپ (توسیع شوي ډیټا انځور. 1b) کې وده کړې چې په کې د منحني مایکرو چینلونو جوړه شامله ده ترڅو د مایع د استوګنې وخت زیات کړي، د غیر خطي جریان نمونې، او د ملټي اکسیل حجرو جوړښت، او د ډبلیو فلو 2 ډیفارمیشن. ډیر پیچلي د کولمو بایو میخانیک بیا جوړیدو ته اړتیا لري، پیچلي ګیټ-آن-چپس غوره کیدی شي. موږ وښودله چې قانع شوي Gut-Chip هم په ورته وخت کې د 3D مورفوګینسیس په کلکه هڅوي چې د اصلي ګوت چپ په پرتله د اپیتیلیل وده ورته درجې سره په پام کې نیسي، پرته له دې چې د کلتوري حجرو لپاره پیچلي او د 3D حجرو لپاره د پیچلي حجرو د ډولونو په پام کې نیولو سره. د چپ کولمو ډیزاینونه د تبادلې وړ دي. د PDMS نقلونه په سیلیکون مولډونو کې د SU-8 نمونو سره سم شوي چې د ډیمول کولو وروسته منفي ځانګړتیاوې وړاندې کوي (انځور.2a) په چپ باندې د کولمو د جوړولو لپاره، چمتو شوی پورتنۍ PDMS طبقه په ترتیب سره د PDMS فلم سره تړل شوې وه او بیا د PDMS ښکته طبقې سره د نه بدلیدونکي بانډنګ په واسطه د کورونا ټریټر (انځور 2b-f) په کارولو سره تنظیم شوې وه. idic وسایل چې کولی شي د Transwell inserts ځای په ځای کړي (Fig. 2h او Extended Data Fig. 2). د تړلو پروسه د PDMS نقل او شیشې سطحې د اکسیجن پلازما یا کورونا درملنې سره ترسره کیږي. د مایکرو فابریکټ شوي وسیلې له تعقیم وروسته د سیلیکون ټیوب ټیوب سره وصل شوي مایکرو فابریکټ ټیوب ته چمتو شوی و. هیلیم (شکل 2g).
الف، د SU-8 نمونو لرونکي سیلیکون مولډونو څخه د PDMS برخو چمتو کولو سکیماتیکه بیلګه. د PDMS محلول په سیلیکون مولډ (کیڼ اړخ) کې اچول شوی و، په 60 ° C (منځنۍ) کې جوړ شوی او ښي (ښي) ته اچول شوی. تخریب شوی PDMS ټوټې ټوټې شوی او د PDMS د عکس اخیستلو لپاره پاک شوی دی، د PDMS پرت د عکس العمل لپاره کارول کیږي. د سیلیکون مولډ چې د PDMS پورس جھلی د جوړولو لپاره کارول کیږي. د پورتنۍ او ښکته PDMS اجزاو عکسونو لړۍ او په چپ آن چپ کولمو کې راټول شوي وسیلې. د پورتنۍ ، غشا او ښکته PDMS اجزاو د تنظیم کولو سکیمیټیک. هر پرت د پلاسبونیک یا غیر بدلیدونکي درملنې لخوا بدل شوی دی. د ut-on-a-chip وسیله د سوپر امپوز شوي مایکرو چینلونو او ویکیوم چیمبرونو سره. د مایکرو فلوایډیک حجرو کلتور لپاره د ګیټ-آن-ا-چپ تنظیم کول. په چپ باندې جوړ شوی ګیټ د سیلیکون ټیوب او سرنج سره راټول شوی و په پوښلیپ کې ځای پرځای شوی و. د سیلیکون ټیوب بندولو لپاره کارول کیږي، د هایبرډ چپس جوړونې بصری عکسونه او د هایبرډ چپس په کارولو سره د 3D مورفوګینسیس. د ټرانس ویل داخل کول په خپلواکه توګه د کولتور 2D monolayers د کولتور اپیتیلیل حجرو ته داخل شوي د هایبرډ چپس انډیټیم انډیټیم انډیټیم 3D 3D monolayers ته داخل شوي. د مایکرو چینلونو له لارې د حجرې پرت لاندې چې په Transwell insert.scale bar کې رامینځته شوی ، 1 cm.h د حوالې په اجازې سره بیا چاپ شوی.4.ایلسیویر.
په دې پروتوکول کې، د Caco-2 حجرو کرښه او د کولمو ارګانایډونه د اپیتیلیل سرچینو په توګه کارول شوي (انځور 3a). دواړه ډوله حجرې په خپلواکه توګه کرل شوي (بکس 2 او بکس 5) او د ECM-کوټ شوي مایکرو چینلونو د تخم کولو لپاره کارول شوي چې آن چپ کول یا Transwell inserts، کله چې د حجرو پوښښ په سلو کې 9 (Caco-2) د حجرو پوښښ (Rofluent-5) حجرې پوښل شوي. (د 10 او 50 په منځ کې) په T-flasks کې راټول شوي ترڅو د ټریپسینائزیشن مایع (بکس 2) پواسطه جلا شوي حجرې تعلیق چمتو کړي. د انسان کولمو ارګانایډونه د کولمو بایوپسي یا جراحي ریسیکشنونو څخه په میټریګل سکافولډ ډومونو کې کرل شوي ترڅو د 24-میکرو سټرایکیمویل مالتړ کونکي پلاسیکونو لازمي پلاستيکونه ولري. لکه Wnt، R-spondin، او Noggin) او د ودې فکتورونه لکه څنګه چې په 3 بکس کې تشریح شوي چمتو شوي هره بله ورځ بشپړ شوي تر هغه چې ارګانایډونه ~ 500 µm قطر ته وده ورکړي. په بشپړ ډول وده شوي ارګانایډونه راټول شوي او په کولمو کې د تخم د کرلو لپاره په واحد حجرو کې جلا شوي یا د مخکینۍ ناروغۍ په اړه د Transwell instills (5 سره د مختلف ناروغۍ راپور ورکول کیدی شي). ټایپ 12,13 (د بیلګې په توګه د کولتیک کولیټس، د کرون ناروغي، د کولوریکټال سرطان، یا نورمال ډونر)، د زخم سایټ (د بیلګې په توګه، د زخم په مقابل کې د غیر زخم ساحه) او د معدې موقعیت (د بیلګې په توګه، duodenum، jejunum، ileum، cecum، کولون، یا rectum) موږ د انکولولوډز یا انکولولوډکس لپاره غوره کول چمتو کوو. معمولا د کوچني کولمو ارګانایډونو په پرتله د مورفوګین لوړ غلظت ته اړتیا لري.
a، د کولمو په چپ کې د کولمو مورفوګینسیس د شاملولو لپاره کاري فلو. Caco-2 د انسان د کولمو اپیتیلیم او د کولمو ارګانایډونه په دې پروتوکول کې د 3D مورفوګینیزس ښودلو لپاره کارول کیږي. جلا شوي اپیتیلیل حجرې په چمتو شوي کولمو کې تخم شوي. ) په 0 (D0) ورځ PDMS پورس جھلی ته، apical (AP) جریان پیل کیږي او د لومړیو 2 ورځو لپاره ساتل کیږي (flow, AP, D0-D2). د باسولیټریل (BL) جریان هم د سایکلیک سټرچنګ حرکتونو سره پیل کیږي (تعدیل، جریان، AP او BL) کله چې د بشپړیدو په صورت کې د 2 په شکل کې رامینځته کیږي. سور په ناڅاپه توګه د مایکرو فلوډیک کلتور (morphogenesis, D5) څخه د 5 ورځو وروسته. د پړاو برعکس انځورونه د کاکو-2 حجرو نمایندګي مورفولوژي په هر تجربوي مرحله یا وخت نقطه کې ښیي (بار ګراف، 100 µm). څلور سکیماټیک ډیاګرامونه په ګوته کوي چې اړونده cascades د ګوتوسچیګین ښي خوا ته د آرمورفوګین سمت څرګندوي. د مایع جریان.b، د SEM انځور د تاسیس شوي 3D Caco-2 اپیتیلیوم سطحي ټوپولوژي ښیي (کیڼ اړخ ته). هغه انسیټ چې پراخه شوې ساحه روښانه کوي (سپین ډیش شوي بکس) د 3D Caco-2 پرت (ښي) کې بیا جوړ شوی مایکرویلی ښیي. c، د تاسیس شوي کاکو-2 افقی مخکینۍ لید، پرله پسې کلاډبیلډ او لابریډ بیډ ریډ) -اکټین (شنه) او نیوکلی (نیلي) د کولمو په چپسونو کې د اپیتیلیل حجرو د امونو فلوروسینس کنفوکل لید لید. منځني سکیمیټ ته اشاره کوي تیر د هر کنفوکل لید لپاره د فوکل الوتکې موقعیت په ګوته کوي. 13. انسیټ (پورته ښۍ خوا ته) د چمتو شوي عکس لوړ میګنیفیکیشن ښیې. د 7.f په ورځ اخیستل شوي په کولمو کې د عضوي 3D اپیتیلیم DIC فوتو مایکروګراف رامینځته شوی ، د امونو فلوروسینس پوښل شوي عکسونه د سټیم حجرو لپاره مارکر ښیې (LGR5;میګینټا)، د ګوبلټ حجرې (MUC2؛ شنه)، F-actin (خړ) او نیوکلی (سیان) د کولمو په چپس کې د 3 ورځو لپاره په ترتیب سره (کیڼ اړخ) او 13-ورځ (منځنی) ارګانایډونه په اپیتیلیل طبقه کې وده کوي. د پراخ شوي ډیټا شکل 3 هم وګورئ، کوم چې د LGR5 نښې نښانې پرته د LGR5 نښې څرګندوي. د 3D organoid epithelium ایتیلیل مایکروسټرکچر (ښي) د کلتور په 13 ورځ د CellMask رنګ (ښي) سره د پلازما جھلی داغ په چپه کول په کولمو کې رامینځته شوی. د سکیل بار 50 μm دی پرته لدې چې بل ډول وویل شي.b د حوالې له اجازې سره بیا چاپ شوی.2.د اکسفورډ پوهنتون مطبوعاتي؛c د حوالې په اجازې سره تطبیق شوی.2.د اکسفورډ پوهنتون مطبوعاتي؛e او f د حوالې له لارې د اجازې سره تطبیق شوي.
په کولمو کې په یوه چپ کې، دا اړینه ده چې د بریالي ECM کوټینګ لپاره د PDMS پورس جھلی د هایدروفوبیک سطح تعدیل شي. په دې پروتوکول کې، موږ د PDMS جھلی د هایدروفوبیکیت د تعدیل لپاره دوه مختلف میتودونه پلي کوو. د Caco-2 حجرو د کرلو لپاره، د سطحې فعالول یوازې د UV/Hydrophob د سطحې فعالول د UV/Hydrophob د سطحې درملنې لپاره د هایدروفوبیک سطح کمول وو. د ECM پوښ کړئ او د Caco-2 حجرې د PDMS جھلی سره ضمیمه کړئ. په هرصورت، د organoid epithelium مایکرو فلویډیک کلتور د کیمیاوي سطحې فعالیت ته اړتیا لري ترڅو د ECM پروټینونو مؤثره زیرمه په ترتیب سره د پولی ایتیلینیمین (PEI) او ګلوټرالډیهایډ پلي کولو سره ترلاسه کړي. سطحه او بیا په جلا شوي ارګانایډ اپیتیلیم کې معرفي کیږي. وروسته له دې چې حجرې وصل شي ، د مایکرو فلوایډیک حجرو کلتور یوازې د پورتنۍ مایکرو چینل ته د مینځلو په واسطه پیل کیږي تر هغه چې حجرې بشپړ مونو لییر رامینځته کړي ، پداسې حال کې چې ټیټ مایکرو چینل جامد شرایط ساتي. د PDMS سطحه.
د ټرانس ویل کلتورونه د حجرو تخم کولو دمخه د ECM پوښاک ته اړتیا لري؛په هرصورت، د ټرانسویل کلتورونه د پورس انسرټونو د سطحې فعالولو لپاره پیچلي دمخه درملنې مرحلو ته اړتیا نلري. د ټرانسویل داخلونو کې د Caco-2 حجرو وده کولو لپاره، په سورویل داخلونو کې د ECM پوښښ د جلا شوي Caco-2 حجرو ضمیمه ګړندۍ کوي (<1 ساعت) او د سخت جنکشن خنډ جوړونه (<1-2 ورځو کې د Transoloids کلچر یا 1-2 ورځو کې لیدل کیږي). د ECM لیپت شوي داخلونه، د غشا په سطحه (<3 h) پورې تړل شوي او ساتل کیږي تر هغه چې ارګانایډونه د خنډ بشپړتیا سره یو بشپړ مونویلیر جوړ کړي. د ټرانس ویل کلتورونه د هایبرډ چپس کارولو پرته په 24 ښه پلیټونو کې ترسره کیږي.
د ویټرو 3D مورفوګینسیس د تاسیس شوي اپیتیلیل پرت بیسولټرال اړخ ته د مایع جریان پلي کولو سره پیل کیدی شي. په کولمو کې په چپ کې ، اپیتیلیل مورفوګینسیس هغه وخت پیل شو کله چې متوسط ​​​​په پورتنۍ او ښکته مایکرو چینلونو کې عطر شوی و (انځور 3a ،) . د سمتي پټو مورفوګین انابیټرونو د دوامداره لرې کولو لپاره کمپارټ. د دې لپاره چې په سوري غشا باندې تړل شوي حجرو ته کافي مغذي مواد او سیرم چمتو کړي او د لومینل شییر فشار رامینځته کړي ، موږ په عمومي ډول په کولمو کې دوه ګونی جریان پلي کوو په چپس کې. متوسطه د مايکرو چينل په ذريعه د سوري ټرانسويل داخل د باسولټرل اړخ الندې تطبيق شوه. د کولتور په دواړو پلاتفورمونو کې د باسولټرل جريان له پيل څخه 3-5 ورځې وروسته د کولمو مورفوجنيسس رامنځته شو.
د مایکرو انجینر شوي 3D اپیتیلیل پرتونو مورفولوژیکي ځانګړتیاوې د مختلف عکس العمل میتودونو په پلي کولو سره تحلیل کیدی شي ، پشمول د مرحله برعکس مایکروسکوپي ، د توپیر مداخلې برعکس (DIC) مایکروسکوپي ، SEM ، یا امون فلوروسینس کنفوکال مایکروسکوپي (شکل 3 او 4)) په اسانۍ سره د هر ډول پروټرو او کلتور په وخت کې د مرحلې معاینه کول یا د پروټرو کولو په وخت کې کولی شي په اسانۍ سره نظارت وکړي. د 3D اپیتیلیل پرتونه. د PDMS او پالیسټر فلمونو د نظری شفافیت له امله، د ګیټ-آن-چپ او هایبرډ چپ پلیټ فارمونه کولی شي د وسیلې برخې کولو یا جلا کولو اړتیا پرته په ریښتیني وخت کې د سټیو امیجنگ چمتو کړي. % (wt/vol) paraformaldehyde (PFA)، ورپسې Triton X-100 او 2% (wt/vol)) د بووین سیروم البومین (BSA) په ترتیب سره. د حجرو ډول پورې اړه لري، مختلف فکسټیو، پرمیابیلائزر، او بلاک کولو اجنټ کارول کیدی شي. لومړني انټي باډونه د حجرو په نښه کولو کې د لوړ نښه کولو لپاره کارول کیږي. د ثانوي انټي باډي په واسطه د کاونټرسټین رنګ سره د نیوکلیوس (د مثال په توګه ، 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) یا F-actin (د بیلګې په توګه د فلوروسینټ لیبل شوي phalloidin) په نښه کولو سره. د فلوروسینس پر اساس ژوندی عکس العمل هم د تولید په حالت کې ترسره کیدی شي (د mufig کشف کولو لپاره.1، "د حجرو توپیر" او "د کولمو فزیولوژي")، د مایکروبیل حجرو تصادفي استعمار (انځور. 1، "د کوربه-میکروب شریک کلتور")، د معافیت حجرو استخدام (انځور. 1، د ناروغۍ ماډلینګ) یا د 3D epithelial epithelial modifying 3D epithelial modifying 3D. په چپ باندې د کولمو پورتنۍ طبقه د ښکته مایکرو چینل پرت څخه جلا کول، لکه څنګه چې په ریف کې تشریح شوي. لکه څنګه چې په 2 شکل کې ښودل شوي، د 3D اپیتیلیل مورفولوژي او همدارنګه د apical برش په پوله کې مایکرویلیل د SEM (انځور 3b) لخوا لیدل کیدی شي. د توپیر مارکرونو څرګندونه د RCRNA-Celling په واحد کې ترسره کیدی شي. د اپیتیلیل حجرو 3D پرتونه چې د کولمو په چپس یا هایبرډ چپس کې کرل شوي د ټریپسینائزیشن په واسطه راټولیږي او بیا د مالیکولر یا جنیټیک تحلیل لپاره کارول کیږي.
a، په هایبرډ چپ کې د کولمو مورفوګینسیس د شاملولو لپاره کاري فلو. Caco-2 او د کولمو ارګانایډونه په دې پروتوکول کې کارول کیږي ترڅو په هایبرډ چپ پلیټ فارم کې د 3D مورفوګینسیس څرګند کړي. جلا شوي اپیتیلیل حجرې په چمتو شوي ټرانس ویل کې تخم شوي او لاندې د حجرو سره ضمیمه شوي) وګوره. په Transwell inserts کې د پولیسټر غشا ټول حجرې د جامد شرایطو (TW کلتور) لاندې کلتور شوي. د 7 ورځو وروسته، یو واحد Transwell insert چې د اپیتیلیل حجرو 2D monolayer لري په هایبرډ چپ کې مدغم شو ترڅو د باسولټریل جریان (Flow, BL) معرفي کړي، چې په پایله کې د مایکرو لیټراس 3 پی ټیسټراجنجنریشن رامینځته کیږي. ګرافونه چې د انسان د عضوي اپیتیلیل حجرو مورفولوژیکي ځانګړتیاوې ښیي چې د عادي بسپنه ورکوونکي (C103 کرښې) څخه اخیستل شوي کولن په هر تجربوي مرحله یا وخت نقطه کې پورته کیږي. په پورتنۍ پرتونو کې سکیماتیک د هر ګام لپاره د تجربوي ترتیب روښانه کوي. b، هایبرډ چپس (کیڼ سکیماټیک) کولی شي د 3D لیدونو سره د مایکروفیلوګین 3D لیدلو سره مخ شي. په مختلف Z پوستونو کې (پورته، منځنی او ښکته؛سمه سکیمیک او اړونده نقطې کرښې وګورئ).ښکاره مورفولوژیکي ځانګړتیاوې وښودلې. F-actin (cyan)، نیوکلیوس (خړ).c، فلوروسینس کنفوکل مایکروګرافونه (3D زاویه لید) د ارګانایډ څخه اخیستل شوي اپیتیلیل حجرو په جامد ټرانس ویل کې کلتور شوي (TW؛ د سپینې ډش شوي بکس دننه) په مقابل کې د هایبرډ کمپوټرولوژی 2 (د هایبرډ کمپیوسس 3D مورفولوژی 3D) په ترتیب سره. د 2D عمودی کراس کټ لیدونو یوه جوړه (په پورتنۍ ښیې کونج کې نصب؛ "XZ") هم د 2D او 3D ځانګړتیاوې ښیې. سکیل بار، 100 µm.c د حوالې په اجازې سره بیا چاپ شوی.4.ایلسیویر.
کنټرولونه د دودیز جامد کلتور شرایطو لاندې د ورته حجرو (Caco-2 یا intestinal organoid epithelial حجرو) په دوه اړخیزه monolayers کې د کلتور په واسطه چمتو کیدی شي. د پام وړ، د غذايي موادو کمښت ممکن د مایکرو چینلونو د محدود حجم ظرفیت له امله پایله ولري (د بیلګې په توګه ~ 4 µL) د اصلي ډیزاین لپاره د geput-relith چینل د اصلي ډیزاین لپاره. د basolateral جریان د تطبیق وروسته هم پرتله کیدی شي.
د نرم لیتوګرافي پروسه باید په پاکه خونه کې ترسره شي. د هر پرت چپ (پورته او ښکته پرتونه او جھلی) او هایبرډ چپس لپاره، مختلف فوټوماسکونه کارول شوي او په جلا سیلیکون ویفرونو کې جوړ شوي ځکه چې د مایکرو چینلونو لوړوالی توپیر درلود. د پورتنۍ او ښکته مایکروچینلونو هدف لوړوالی g0µ0p0m0p0m m، په ترتیب سره. د هایبرډ چپ چینل هدف لوړوالی 200 µm دی.
د 3 انچ سیلیکون ویفر په یوه کڅوړه کې د اسیټون سره واچوئ. په نرمۍ سره د 30 ثانیو لپاره پلیټ وګرځوئ، بیا ویفر په هوا کې وچ کړئ. ویفر د IPA سره یو پلیټ ته انتقال کړئ، بیا د پاکولو لپاره د 30 ثانیو لپاره پلیټ ته واچوئ.
د پرانها محلول (د هایدروجن پیرو اکسایډ او متمرکز سلفوریک اسید مخلوط، 1:3 (vol/vol)) په اختیاري توګه د سیلیکون ویفر سطح څخه د عضوي پاتې شونو لرې کولو لپاره کارول کیدی شي.
د پرانها محلول خورا زیان رسونکی دی او تودوخه تولیدوي. اضافي خوندیتوب احتیاطي تدابیر اړین دي. د کثافاتو د ضایع کولو لپاره، محلول ته اجازه ورکړئ چې سړه شي او پاک، وچ کثافات کانټینر ته لیږدول شي. د ثانوي کانتینرونو څخه کار واخلئ او د فاضله موادو کانتینرونه په سمه توګه لیبل کړئ. مهرباني وکړئ د نورو مفصلو پروسیجرونو لپاره د تاسیساتو خوندیتوب لارښوونې تعقیب کړئ.
ویفر د 10 دقیقو لپاره د 200 سانتي ګراد تودوخې په تودوخې کې کېښودلو سره ډیهایډریټ کړئ. د ډیهایډریشن وروسته ، ویفر په هوا کې پنځه ځله وخوځئ ترڅو یخ شي.
د پاک شوي سیلیکون ویفر په مینځ کې ~ 10 ګرامه فوتوریزیسټ SU-8 2100 واچوئ. د ویفر په مساوي توګه د فوتوریزیسټ خپریدو لپاره ټیزر وکاروئ. کله ناکله ویفر په 65 درجې تودوخې تودوخې تودوخې کې ځای په ځای کړئ ترڅو فوتوریزیسټ لږ چپکونکی او د خپریدو لپاره اسانه وي.
SU-8 په مساوي ډول د سپن کوټینګ په چلولو سره په ویفر کې توزیع شوی. د 5-10 s لپاره د SU-8 راتلونکی گردش د 100 rpm/s سرعت سره په 500 rpm کې تبلیغ کولو لپاره برنامه کړئ. اصلي سپن د 200 µm ضخامت لپاره تنظیم کړئ یا د 1µ0m ضخامت نمونه یا 1µ0m 02 m 5 r 5 rpm ترلاسه کړئ په چپ کې د کولمو د پورتنۍ طبقې لپاره 500 µm لوړوالی؛ لاندې "مهم ګامونه" وګورئ) په 1,200 rpm کې د 300 rpm/s 30 ثانیو سرعت سره تنظیم شوی.
د اصلي سپن سرعت په سیلیکون ویفر کې د SU-8 نمونې د هدف ضخامت سره سم تنظیم کیدی شي.
په چپ باندې د کولمو د پورتنۍ طبقې لپاره د 500 µm لوړوالي SU-8 نمونې جوړولو لپاره، د دې بکس سپین پوښ او نرم بیک مرحلې (7 او 8 مرحلې) په پرله پسې ډول تکرار شوي (مرحله 9 وګورئ) ترڅو د 250 µm دوه پرتونه تولید کړي، یو موټی پرت چې د SUV1 پرت سره یوځای کیدی شي د SUV1 پرت سره یوځای شي. 500 µm لوړ پرت جوړوي.
د SU-8 لیپت شوي ویفرونه په احتیاط سره په ګرم پلیټ کې د 5 دقیقو لپاره په 65 ° C کې کېښودلو سره نرم کړئ ، بیا ترتیب 95 ° C ته واړوئ او د اضافي 40 دقیقو لپاره سینګار کړئ.
په پورتنۍ مایکرو چینل کې د SU-8 نمونې 500 μm لوړوالی ترلاسه کولو لپاره ، 7 او 8 مرحلې تکرار کړئ ترڅو دوه 250 μm ضخامت SU-8 پرتونه رامینځته کړي.
د UV ماسک الینر په کارولو سره، د جوړونکي لارښوونو سره سم د څراغ ازموینه ترسره کړئ ترڅو د ویفر د افشا کیدو وخت محاسبه کړي.
د افشا کولو وخت ټاکلو وروسته، د عکس ماسک د UV ماسک الینر په ماسک هولډر کې ځای په ځای کړئ او فوټوماسک د SU-8 لیپت شوي ویفر کې ځای په ځای کړئ.
د فوټوماسک چاپ شوی سطح مستقیم د سیلیکون ویفر په SU-8 لیپت شوي اړخ کې ځای په ځای کړئ ترڅو د UV خپریدو کم شي.
SU-8 لیپت شوی ویفر او فوټوماسک په عمودي توګه د 260 mJ/cm2 UV رڼا ته د مخکینۍ ټاکل شوي وخت لپاره ښکاره کړئ (د دې بکس 10 ګام وګورئ).
د UV افشا کیدو وروسته، SU-8 لیپت شوي سیلیکون ویفرونه په 65°C کې د 5 دقیقو لپاره او په 95°C کې د 15 دقیقو لپاره په هر ګرم پلیټ کې پخه شوي ترڅو نمونې د 200 μm لوړوالی سره جوړ کړي. د پخیدو وروسته وخت له 95 °C څخه تر 30 دقیقو پورې د فابریکټ 5µ00 مترو پورې وغځوي.
پرمخ وړونکی په شیشې ډش کې اچول کیږي، او پخه شوی ویفر په ډش کې کیښودل کیږي. د SU-8 پراختیا کونکي حجم ممکن د شیشې پلیټ اندازې پورې اړه ولري. ډاډ ترلاسه کړئ چې کافي SU-8 جوړونکی وکاروئ ترڅو په بشپړ ډول غیر ښکاره شوي SU-8 لرې کړي. د مثال په توګه ، کله چې د 150 ملی میتر قطر څخه کار واخلئ ، د 150 ملي میتر قطر ظرفیت سره د SU-8 ډیولپر L0 3 150 ملی لیتر ډیسک استعمال کړئ. مولډ د 25 دقیقو لپاره کله ناکله په نرمه گردش سره.
جوړ شوی مولډ د ~ 10 ملی لیتر تازه جوړونکي سره ومینځئ او وروسته IPA د پایپټ په کارولو سره محلول سپری کړئ.
ویفر په پلازما کلینر کې کیږدئ او د 1.5 دقیقو لپاره د اکسیجن پلازما (د اتموسفیر ګاز، هدف فشار 1 × 10-5 تور، بریښنا 125 W) ته ښکاره کړئ.
ویفر په ویکیوم ډیسیکیټر کې دننه د شیشې سلایډ سره ځای په ځای کړئ. ویفرونه او سلایډونه څنګ په څنګ کېښودل کیدی شي. که چیرې د ویکیوم ډیسیکیټر د پلیټ په واسطه په څو طبقو ویشل شوي وي ، سلایډونه په ښکته خونې کې او ویفرونه په پورتنۍ خونه کې ځای په ځای کړئ. fluorooctyl) silane محلول په شیشې سلایډ کې واچوئ او د سیلانیزیشن لپاره ویکیوم تطبیق کړئ.
د منجمد Caco-2 حجرو یوه شیشې د 37 درجې سانتي ګراد د اوبو په حمام کې وغورځوئ، بیا د 37 درجې سانتي ګراد د 15 ملی لیتره د 37 درجې سانتي ګراد څخه مخکې ګرم شوي Caco-2 متوسطه 15 ملی لیتر لرونکې T75 فلاسک ته تودې شوي حجرې انتقال کړئ.
د Caco-2 حجرو ته د ~ 90% په انفلاسیون کې د تېرېدو لپاره، لومړی ګرم Caco-2 متوسطه، PBS، او 0.25% ټریپسین/1 mM EDTA په 37 درجې د اوبو حمام کې.
د ویکیوم اسپیریشن په واسطه منځنی تشویق کړئ. حجرې دوه ځله د 5 ملی لیتر ګرم PBS سره د ویکیوم اسپیریشن تکرارولو او تازه PBS اضافه کولو سره وینځئ.