د Nature.com لیدلو لپاره مننه.د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ وړاندې کړو.
د مایع بایپسي (LB) یو مفهوم دی چې په چټکۍ سره د بایو میډیکل ساحه کې شهرت ترلاسه کوي.مفهوم په عمده توګه د بهر حجرو DNA (ccfDNA) د ټوټو د کشف پر بنسټ والړ دی، کوم چې په عمده توګه په مختلفو نسجونو کې د حجرو له مړینې وروسته د کوچنیو ټوټو په توګه خوشې کیږي.د دې ټوټو یوه کوچنۍ برخه د بهرنیو (بهرنیو) نسجونو یا ژوندی موجوداتو څخه سرچینه اخلي.په اوسني کار کې، موږ دا مفکوره په mussels کې پلي کړې، یو لیږل شوی ډول چې د دوی د لوړ سمندري اوبو فلټر کولو ظرفیت لپاره پیژندل کیږي.موږ د میوز وړتیا څخه کار اخلو ترڅو د طبیعي فلټرونو په توګه عمل وکړي ترڅو د مختلف سرچینو څخه د چاپیریال DNA ټوټې ترلاسه کړي ترڅو د سمندري ساحلي ایکوسیستمونو د حیاتي تنوع په اړه معلومات چمتو کړي.زموږ پایلې ښیي چې mussel hemolymph د DNA ټوټې لري چې په اندازې کې خورا توپیر لري، له 1 څخه تر 5 kb پورې.د شاټګن ترتیب ښودلې چې د DNA ډیری ټوټې د بهرني مایکروبیل اصل څخه دي.د دوی په منځ کې، موږ د باکتریا، لرغونو آثارو او ویروسونو څخه د DNA ټوټې وموندلې، په شمول د ویروسونو په شمول چې په ساحلي سمندري اکوسیستمونو کې موندل شوي یو شمیر کوربه اخته کوي.په پایله کې، زموږ څیړنه ښیي چې د LB مفکوره چې په میوز باندې پلي کیږي د بډایه مګر تر اوسه پورې د سمندري ساحلي ایکوسیستمونو کې د مایکروبیل تنوع په اړه د پوهې یوه نا معلومه سرچینه استازیتوب کوي.
د سمندري ایکوسیستم په حیاتي تنوع باندې د اقلیم بدلون (CC) اغیزې د څیړنې ګړندۍ وده کونکي ساحه ده.نړیواله تودوخه نه یوازې د مهمو فزیولوژیکي فشارونو لامل کیږي، بلکې د سمندري ژوندی موجوداتو د تودوخې ثبات ارتقاء محدودیتونه هم فشار راوړي، د یو شمیر ډولونو په استوګنځي اغیزه کوي، دوی هڅوي چې د نورو مناسبو شرایطو لټون وکړي [1, 2].د میټازوانو په حیاتي تنوع باندې د تاثیر سربیره ، CC د کوربه - مایکروبیل تعاملاتو نازک توازن ګډوډوي.دا مایکروبیل ډیسباکټریوسس د سمندري ایکوسیستم لپاره جدي ګواښ رامینځته کوي ځکه چې دا سمندري ارګانیزمونه د ساري ناروغیو لپاره ډیر حساس کوي [3, 4].داسې انګیرل کیږي چې SS په ډله ایزو مړینو کې مهم رول لوبوي، کوم چې د نړیوال سمندري ایکوسیستم مدیریت لپاره یوه جدي ستونزه ده [5, 6].دا یوه مهمه مسله ده چې د ډیری سمندري ډولونو اقتصادي ، ایکولوژیکي او تغذیه اغیزو ته په پام سره.دا په ځانګړې توګه په قطبي سیمو کې د ژوند کولو دوه اړخیزو لپاره ریښتیا ده، چیرې چې د CK اغیزې ډیر فوري او شدید دي [6, 7].په حقیقت کې، bivalves لکه Mytilus spp.په پراخه کچه په سمندري ایکوسیستمونو کې د CC اغیزې څارلو لپاره کارول کیږي.د حیرانتیا خبره نده، د دوی د روغتیا د څارنې لپاره نسبتا لوی شمیر بایومارکرونه رامینځته شوي، ډیری وختونه د دوه درجې طریقې کاروي چې د انزیماتیک فعالیت یا سیلولر فعالیتونو لکه د حجرو وړتیا او فاګوسیتیک فعالیت پراساس فعال بایومارکرونه پکې شامل دي [8].پدې میتودونو کې د ځانګړي فشار شاخصونو غلظت اندازه کول هم شامل دي چې په نرم نسجونو کې د سمندر د اوبو لوی مقدار جذبولو وروسته راټولیږي.په هرصورت، د لوړ فلټریشن ظرفیت او د بایوالوز نیمه خلاص دوراني سیسټم د مایع بایپسي (LB) مفهوم په کارولو سره د نوي هیمولیمف بایومارکرونو رامینځته کولو فرصت چمتو کوي ، د ناروغ مدیریت لپاره یو ساده او لږترلږه برید کونکی چلند.د وینې نمونې [9، 10].که څه هم په انساني LB کې د دوراني مالیکولونو ډیری ډولونه موندل کیدی شي، دا مفهوم په اصل کې په پلازما کې د خارجي حجرو DNA (ccfDNA) ټوټو گردش کولو DNA ترتیب تحلیل پراساس دی.په حقیقت کې، د انسان په پلازما کې د DNA د گردش کولو شتون د شلمې پیړۍ له نیمایي راهیسې پیژندل شوی [11]، مګر دا یوازې په وروستیو کلونو کې دی چې د ccfDNA پر بنسټ د کلینیکي تشخیص المل شوی.د دې گردشي DNA ټوټې شتون د حجرو له مړینې وروسته د جینومیک DNA (اټومي او مایټوکونډریل) غیر فعال خوشې کیدو له امله دی. په صحي اشخاصو کې، د ccfDNA غلظت په نورمال ډول ټیټ وي (<10 ng/mL) مګر په هغه ناروغانو کې چې په مختلفو رنځپوهنه اخته وي یا د فشار سره مخ وي 5-10 ځله زیاتوالی موندلی شي چې پایله یې نسج ته زیان رسوي. په صحي اشخاصو کې، د ccfDNA غلظت په نورمال ډول ټیټ وي (<10 ng/mL) مګر په هغه ناروغانو کې چې په مختلفو رنځپوهنه اخته وي یا د فشار سره مخ وي 5-10 ځله زیاتوالی موندلی شي چې پایله یې نسج ته زیان رسوي. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больныпойтовичнох вккДНК ергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. په صحي خلکو کې، د cccDNA غلظت په نورمال ډول ټیټ وي (<10 ng/mL)، مګر دا په هغو ناروغانو کې چې مختلف رنځپوهنه لري یا د فشار لاندې وي چې د نسجونو د زیان لامل کیدی شي 5-10 ځله زیاتوالی ومومي.在健康个体中，ccfDNA کې د 浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂受受度通从而导致组织损伤.在 健康个体中，ccfdna 的浓度较低（（<10 ng/ml） 但 在各种病理或承受受受抢叀叀承受厗5-10 倍, 从而 组织。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павципанчмистологимотого в павцентрации или стрессом, что приводит к повреждению тканей. د ccfDNA غلظت معمولا په صحي اشخاصو کې ټیټ (<10 ng/ml) وي، مګر په ناروغانو کې د مختلفو رنځپوهنې یا فشار سره 5-10 چنده زیاتوالی موندلی شي، چې په پایله کې د نسج زیان رسوي.د ccfDNA ټوټو اندازه په پراخه کچه توپیر لري، مګر معمولا د 150 څخه تر 200 bp پورې وي.[۱۲] .د ځان څخه ترلاسه شوي ccfDNA تحلیل، د بیلګې په توګه، د نورمال یا بدل شوي کوربه حجرو څخه ccfDNA، په اټومي او/یا مایټوکونډریال جینوم کې د جینیاتي او ایپیګینیک بدلونونو موندلو لپاره کارول کیدی شي، په دې توګه د کلینیکانو سره مرسته کوي چې ځانګړي مالیکولر - هدف شوي درملنې غوره کړي [13].په هرصورت، ccfDNA د بهرنیو سرچینو څخه ترلاسه کیدی شي لکه ccfDNA د امیندوارۍ پرمهال د جنین حجرو څخه یا د انتقال شوي ارګانونو څخه [14,15,16,17].ccfDNA د انفیکشن اجنټ (بهرني) د نیوکلیک اسیدونو شتون کشف کولو لپاره د معلوماتو یوه مهمه سرچینه هم ده ، کوم چې د پراخه انتاناتو غیر انتفاعي کشف ته اجازه ورکوي چې د وینې کلتورونو لخوا ندي پیژندل شوي ، د اخته نسج د برید کونکي بایپسي مخنیوی کوي [18].وروستیو څیړنو په حقیقت کې ښودلې چې د انسان وینه د معلوماتو بډایه سرچینه لري چې د ویروس او باکتریایی ناروغیو پیژندلو لپاره کارول کیدی شي، او دا چې د انسان په پلازما کې موندل شوي ccfDNA شاوخوا 1٪ بهرني اصل دی [19].دا مطالعات ښیې چې د ژوندی موجوداتو د جریان مایکروبیوم حیاتی تنوع د ccfDNA تحلیل په کارولو سره ارزول کیدی شي.په هرصورت، تر دې وروستیو پورې، دا مفهوم په ځانګړې توګه په انسانانو کې کارول کیده او تر یوې اندازې پورې، په نورو فقرو کې [20، 21].
په اوسنۍ لیکنه کې، موږ د LB پوټینشن څخه کار اخلو ترڅو د Aulacomya atra ccfDNA تجزیه کړو، یو سویلي ډول چې معمولا د سبانټارټیک کرګولین ټاپوګانو کې موندل کیږي، د ټاپوګانو یوه ډله چې 35 ملیون کاله دمخه رامینځته شوې.آتش فشاند ویټرو تجربوي سیسټم په کارولو سره، موږ وموندله چې د سمندر په اوبو کې د DNA ټوټې په چټکۍ سره د میوز لخوا نیول کیږي او د هیمولیمف برخې ته ننوځي.د شاټګن ترتیب ښودلې چې د mussel hemolymph ccfDNA د خپل ځان او غیر ځان اصلي DNA ټوټې لري، په شمول د سمبیوټیک باکتریا او د DNA ټوټې د بایوومونو څخه چې د ساړه آتش فشاني سمندري ساحلي اکوسیستمونو ځانګړي دي.Hemolymph ccfDNA د ویروس لړۍ هم لري چې د مختلف کوربه رینجونو سره د ویروسونو څخه اخیستل شوي.موږ د څو سیلولر حیواناتو څخه د DNA ټوټې هم وموندلې لکه هډوکي کب، سمندري انیمون، الګا او حشرات.په پایله کې، زموږ څیړنه ښیي چې د LB مفهوم په بریالیتوب سره په سمندري غیر فقرات کې پلي کیدی شي ترڅو په سمندري اکوسیستمونو کې بډایه جینومیک ریپرټویر رامینځته کړي.
لويان (55-70 ملي متره اوږده) Mytilus platensis (M. platensis) او Aulacomya atra (A. atra) د پورت-او-فرانسې له سمندري ډبرينو څنډو څخه راټول شوي وو (049°21.235 S, 070°13.490 E.).د 2018 په ډسمبر کې کیرګولین ټاپوګان. نور بالغ نیلي میوزونه (Mytilus spp.) له سوداګریز عرضه کونکي (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) څخه ترلاسه شوي او د تودوخې کنټرول شوي (4°C) هوا لرونکي ټانک کې ځای په ځای شوي چې د 10-20 L 32‰ مصنوعي برین لري.(مصنوعي سمندري مالګې ریف کرسټال، فوري سمندر، ویرجینیا، امریکا).د هرې تجربې لپاره، د انفرادي ګولیو اوږدوالی او وزن اندازه شوی.
د دې پروګرام لپاره د وړیا خلاص لاسرسي پروتوکول آنلاین شتون لري (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).په لنډه توګه، LB هیمولیمف د تښتونکي عضلاتو څخه راټول شوي لکه څنګه چې تشریح شوي [22].هیمولیمف د 1200xg په 3 دقیقو کې د سینټرفیوګریشن په واسطه روښانه شوی و، سپرناټینټ تر کارولو پورې منجمد شوی (-20 ° C).د cfDNA د جلا کولو او پاکولو لپاره، نمونې (1.5-2.0 ml) د جوړونکي لارښوونو سره سم د NucleoSnap cfDNA کټ (Macherey-Nagel، Bethlehen، PA) په کارولو سره تصفیه شوي او پروسس شوي.ccfDNA تر نورو تحلیلونو پورې په -80 ° C کې زیرمه شوی و.په ځینو تجربو کې، ccfDNA د QIAamp DNA تحقیقاتي کټ (QIAGEN، ټورنټو، اونټاریو، کاناډا) په کارولو سره جلا او پاک شوی و.پاک شوی DNA د معیاري پیکو ګرین ارزونې په کارولو سره اندازه شوی.د جلا شوي ccfDNA ټوټه توزیع د کیپیلري الیکټروفورسیس لخوا د Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) په کارولو سره د لوړ حساسیت DNA کټ په کارولو سره تحلیل شوې.ارزونه د جوړونکي لارښوونو سره سم د ccfDNA نمونې 1 µl په کارولو سره ترسره شوې.
د hemolymph ccfDNA ټوټې د ترتیب لپاره، Génome Québec (مونټریال، کیوبیک، کاناډا) د Illumina MiSeq PE75 کټ د Illumina DNA مکس کټ په کارولو سره د شاټګن کتابتونونه چمتو کړل.یو معیاري اډاپټر (BioO) کارول شوی و.د خام ډیټا فایلونه د NCBI ترتیب لوستل آرشیف (SRR8924808 او SRR8924809) څخه شتون لري.د لومړني لوستلو کیفیت د FastQC په کارولو سره ارزول شوی [23].تریموماتیک [24] د کلپ کولو اډاپټرونو او ضعیف کیفیت لوستلو لپاره کارول شوی.د شاټګن لوستل د جوړه پایونو سره فلش په اوږده واحد لوستلو کې ضمیمه شوي و چې لږترلږه د 20 bp سره یوځای شوي ترڅو د بې توپیره کیدو مخه ونیسي [25]. یوځای شوي لوستونه د BLASTN سره د دوه اړخیزو NCBI مالیاتو ډیټابیس (e ارزښت <1e−3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره تشریح شوي ، او د ټیټ پیچلتیا ترتیبونو ماسک کول د DUST [26] په کارولو سره ترسره شوي. یوځای شوي لوستونه د BLASTN سره د دوه اړخیزو NCBI مالیاتو ډیټابیس (e ارزښت <1e−3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره تشریح شوي ، او د ټیټ پیچلتیا ترتیبونو ماسک کول د DUST [26] په کارولو سره ترسره شوي. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии << и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. راټول شوي لوستل د BLASTN سره د NCBI bivalve ټیکونومي ډیټابیس (e ارزښت <1e-3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره تشریح شوي ، او د ټیټ پیچلتیا ترتیب ماسکینګ د DUST [26] په کارولو سره ترسره شوی.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读俶释合并的读买]复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合并读湰 dust 分类复杂度 序列 的. . . .掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных -3 и 90% гомологии)، а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. راټول شوي لوستل د BLASTN سره د NCBI bivalve ټیکونومیک ډیټابیس (e ارزښت <1e-3 او 90٪ هومولوژي) په کارولو سره تشریح شوي ، او د ټیټ پیچلتیا ترتیب ماسکینګ د DUST [26] په کارولو سره ترسره شوی.لوستل په دوه ډلو ویشل شوي: د دوه اړخیزو ترتیبونو پورې اړه لري (دلته د ځان لوستل ویل کیږي) او غیر اړونده (د ځان لوستل).دوه ګروپونه په جلا توګه د MEGAHIT په کارولو سره راټول شوي ترڅو کانټیګونه رامینځته کړي [27].په ورته وخت کې، د اجنبی مایکروبیوم لوستلو ټیکونومیک توزیع د کریکن 2 په کارولو سره طبقه بندي شوې [28] او په ګرافیکي ډول په ګیلیکسي کې د کرونا پای چارټ لخوا نمایش شوی [29, 30].زموږ د لومړنیو تجربو څخه غوره کیمرونه د kmers-59 ټاکل شوي. بیا وروسته د وروستي تشریح لپاره د BLASTN (bivalve NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e−10 او 60% homology) سره د سمون په واسطه ځان کانټیګونه وپیژندل شول. بیا وروسته د وروستي تشریح لپاره د BLASTN (bivalve NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e−10 او 60% homology) سره د سمون په واسطه ځان کانټیګونه وپیژندل شول. د Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN омология 60%) для окончательной аннотации. بیا د وروستي تشریح لپاره د BLASTN (NCBI bivalve ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) سره د سمون په واسطه د ځان کانټیګونه پیژندل شوي.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）毹齐来识壳贝类NCBI终注释然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值<1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). بیا د BLASTN (NCBI bivalve ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) سره د سمون کولو له لارې د وروستي توضیحاتو لپاره د ځان کانټیګونه پیژندل شوي. په موازي توګه، د غیر ځاني ګروپونو کنټیګونه د BLASTN سره تشریح شوي (nt NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e−10 او 60٪ هومولوژي). په موازي توګه، د غیر ځاني ګروپونو کنټیګونه د BLASTN سره تشریح شوي (nt NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e−10 او 60٪ هومولوژي). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI، значение e <1e-10%06могоим). په موازي توګه، د بهرنیو ګروپونو کنټیګونه د BLASTN (NT NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) سره تشریح شوي.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, e.g.1. 60%). په موازي ډول، د غیر ځان ګروپ کنټیګونه د BLASTN سره تشریح شوي (nt NCBI ډیټابیس، e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي). BLASTX د nr او RefSeq پروټین NCBI ډیټابیسونو (e ارزښت <1e−10 او 60% homology) په کارولو سره په غیر ځاني کانټیګونو کې هم ترسره شوی. BLASTX د nr او RefSeq پروټین NCBI ډیټابیسونو (e ارزښت <1e−10 او 60% homology) په کارولو سره په غیر ځاني کانټیګونو کې هم ترسره شوی. د BLASTX ټیکژ был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI BLASTX د nr او RefSeq NCBI پروټین ډیټابیسونو (e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) په کارولو سره په غیر ځان کانټیګونو کې هم ترسره شوی.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e<10мог1 e<10могиолных). BLASTX د nr او RefSeq NCBI پروټین ډیټابیسونو (e ارزښت <1e-10 او 60٪ هومولوژي) په کارولو سره په غیر ځان کانټیګونو کې هم ترسره شوی.د BLASTN او BLASTX حوضونه د غیر سیلف کانټیګز وروستي کانټیګ استازیتوب کوي (اضافی فایل وګورئ).
د PCR لپاره کارول شوي پرائمرونه په جدول S1 کې لیست شوي دي.د تاق DNA پولیمریز (Bio Basic Canada, Markham, ON) د ccfDNA هدف جینونو پراخولو لپاره کارول شوی و.لاندې د عکس العمل شرایط کارول شوي: د 3 دقیقو لپاره په 95 ° C کې ویجاړول، د 1 دقیقې لپاره 95 ° C، د 1 دقیقې لپاره د انیل کولو تودوخه ټاکل، د 1 دقیقو لپاره په 72 ° C کې اوږدوالی، 35 دورې، او په پای کې په 10 دقیقو کې 72 ° C..د PCR محصولات د الیکټروفورسیس لخوا په اګرز جیلونو کې جلا شوي (1.5٪) چې د SYBRTM سیف DNA جیل سټین (انویټروجن، برلینګټن، آن، کاناډا) په 95 V کې لري.
موسلې (Mytilus spp.) په 500 ملی لیتر اکسیجن شوي سمندري اوبو (32 PSU) کې د 24 ساعتونو لپاره په 4 درجې سانتي ګراد کې عادی شوي.پلاسمیډ DNA چې د انسان ګالیکټین-7 cDNA ترتیب کوډ کولو کې داخلیږي (NCBI د لاسرسي شمیره L07769) د 190 μg/μl په وروستي غلظت کې شیشې ته اضافه شوی.د DNA اضافه کولو پرته په ورته شرایطو کې د پوټکي مینځل کنټرول وو.په دریم کنټرول ټانک کې DNA پرته له مغز څخه شتون لري.په سمندري اوبو کې د DNA کیفیت څارلو لپاره، د سمندري اوبو نمونې (20 μl؛ درې تکرارونه) په ټاکل شوي وخت کې د هر ټانک څخه اخیستل شوي.د پلازمیډ DNA د موندلو وړتیا لپاره، د LB میوز په ټاکل شوي وخت کې راټول شوي او د qPCR او ddPCR لخوا تحلیل شوي.د سمندر په اوبو کې د مالګې د لوړې کچې له امله، الکوټس د PCR کیفیت لرونکي اوبو (1:10) کې د ټولو PCR ارزونو دمخه حل شوي.
ډیجیټل څاڅکي PCR (ddPCR) د BioRad QX200 پروتوکول (میسیسوګا، اونټاریو، کاناډا) په کارولو سره ترسره شو.د مطلوب تودوخې معلومولو لپاره د تودوخې پروفایل وکاروئ (جدول S1).څاڅکي د QX200 ډراپ جنریټر (BioRad) په کارولو سره تولید شوي.ddPCR په لاندې ډول ترسره شو: د 5 دقیقو لپاره 95 °C، د 95 ° C 50 دوره د 30 s لپاره او د 1 دقیقو لپاره د انیل کولو تودوخه او د 30 s لپاره 72 ° C، د 5 دقیقو لپاره 4 ° C او 90 ° C د 5 دقیقو لپاره.د څاڅکو او مثبت عکس العملونو شمیر (د کاپيونو شمیر/µl) د QX200 ډراپ ریډر (BioRad) په کارولو سره اندازه شوی.د 10,000 څاڅکو څخه کم نمونې رد شوي.د نمونې کنټرول هرکله چې ddPCR چلول شوی نه و.
qPCR د Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) او LGALS7 مشخص پریمرونو په کارولو سره ترسره شوی.ټول کمیتي PCRs د QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) په کارولو سره په 20 μl کې ترسره شوي.qPCR په 95°C کې د 15 دقیقو انکیوبیشن سره پیل شو، ورپسې 40 دورې په 95°C کې د 10 ثانیو لپاره او په 60°C کې د 60 ثانیو لپاره د معلوماتو راټولولو سره.خټکي منحني د پرله پسې اندازه کولو په کارولو سره د 5 s لپاره 95 ° C ، د 60 s لپاره 65 ° C ، او 97 ° C د qPCR په پای کې تولید شوي.هر qPCR د کنټرول نمونو پرته په درې اړخیزه توګه ترسره شوی.
څرنګه چې مچان د دوی د لوړ فلټریشن نرخ لپاره پیژندل شوي، موږ لومړی تحقیق وکړ چې ایا دوی کولی شي د سمندر په اوبو کې د DNA ټوټې فلټر او وساتي.موږ پدې کې هم علاقه درلوده چې ایا دا ټوټې د دوی په نیمه خلاص لیمفاټیک سیسټم کې راټولیږي.موږ دا مسله په تجربوي ډول د محلول شوي DNA ټوټو برخلیک په موندلو سره حل کړه چې د نیلي میوسل ټانکونو کې اضافه شوي.د DNA ټوټې تعقیب اسانه کولو لپاره، موږ بهرني (نه پخپله) پلازمیډ DNA کارولی چې د انسان ګلیکټین -7 جین لري.ddPCR د سمندري اوبو او میوو کې د پلازمیډ DNA ټوټې تعقیبوي.زموږ پایلې ښیي چې که د سمندر په اوبو کې د DNA ټوټې اندازه د وخت په تیریدو سره (تر 7 ورځو پورې) په نسبي ډول ثابته پاتې شي (تر 7 ورځو پورې)، نو د مرغانو په شتون کې دا کچه تقریبا په 8 ساعتونو کې په بشپړ ډول ورکه شوه (انځور 1a،b).د خارجي DNA ټوټې په اسانۍ سره په 15 دقیقو کې د انټروالولر مایع او هیمولیمف (انځور 1c) کې کشف شوي.دا ټوټې لاهم د افشا کیدو وروسته تر 4 ساعتونو پورې کشف کیدی شي.د DNA ټوټې په اړه د فلټر کولو فعالیت د باکتریا او الګا د فلټر کولو فعالیت سره پرتله کیږي [31].دا پایلې وړاندیز کوي چې میوز کولی شي بهرني DNA په خپلو مایع برخو کې فلټر او راټول کړي.
په سمندري اوبو کې د پلاسمید DNA نسبي غلظت د (A) یا د میوو په نه شتون کې (B) د ddPCR لخوا اندازه کیږي.په A کې، پایلې د فیصدو په توګه ښودل شوي، د بکسونو سرحدونه د 75 او 25 سلنې استازیتوب کوي.نصب شوی لوګاریتمیک وکر په سور کې ښودل شوی، او هغه ساحه چې په خړ کې سیوري شوې د 95٪ باور وقفه استازیتوب کوي.په B کې، سور کرښه د منځني استازیتوب کوي او نیلي کرښه د تمرکز لپاره د 95٪ باور وقفه استازیتوب کوي.C د پلازمیډ DNA جمع کول په هیمولیمف او والوولر مایع کې د پلازمیډ DNA له اضافه کولو وروسته په مختلف وختونو کې.پایلې د مطلق کاپي موندلو/mL (±SE) په توګه وړاندې کیږي.
بیا، موږ د ccfDNA اصلیت په کیرګولین ټاپوګانو کې د میوسل بسترونو څخه راټول شوي په غوښو کې وڅیړل، د ټاپوګانو یوه لیرې ډله چې محدود انتھروپجنیک نفوذ لري.د دې هدف لپاره، د mussel hemolymphs څخه cccDNA د میتودونو په واسطه جلا او پاک شوی و چې معمولا د انسان cccDNA پاکولو لپاره کارول کیږي [32, 33].موږ وموندله چې په میوز کې د اوسط هیمولیمف ccfDNA غلظت په هر ملی لیتر هیمولیمف حد کې ټیټ مایکروګرامونو کې دی (جدول S2 وګورئ، اضافي معلومات).د غلظت دا سلسله د صحي خلکو په پرتله خورا لوی دی (په هر ملی لیټر کې ټیټ نانوګرام)، مګر په نادره مواردو کې، د سرطان په ناروغانو کې، د ccfDNA کچه کولی شي څو مایکرو ګرامو هر ملی لیتر ته ورسیږي [34, 35].د hemolymph ccfDNA د اندازې ویش یوه تحلیل ښودلې چې دا ټوټې په اندازې کې خورا توپیر لري، د 1000 bp څخه تر 1000 bp پورې.تر 5000 bp پورې (انځور 2).ورته پایلې د سیلیکا پر بنسټ د QIAamp تحقیقاتي کټ په کارولو سره ترلاسه شوي، یو میتود چې معمولا په عدلي ساینس کې کارول کیږي ترڅو د ټیټ غلظت DNA نمونو څخه جینومیک DNA په چټکۍ سره جلا او پاک کړي، په شمول د ccfDNA [36].
د mussel hemolymph استازی ccfDNA الیکٹروفورگرام.د NucleoSnap پلازما کټ (پورته) او QIAamp DNA تفتیش کونکي کټ سره استخراج شوی.B وایلین پلاټ د هیمولیمف ccfDNA غلظت (±SE) په پوټکي کې ویش ښیې.تور او سور کرښې په ترتیب سره د منځنۍ او لومړۍ او دریم ربع استازیتوب کوي.
په انسانانو او پریمیټ کې د ccfDNA نږدې 1٪ بهرنۍ سرچینه لري [21, 37].د bivalves نیمه خلاص دوراني سیسټم، مایکروبیل بډایه سمندري اوبو، او د mussel ccfDNA اندازه ویش ته په پام سره، موږ داسې انګیرله چې د mussel hemolymph ccfDNA کیدای شي د مایکروبیل DNA بډایه او متنوع حوض ولري.د دې فرضیې ازموینې لپاره، موږ د کیرګولین ټاپوګانو څخه راټول شوي د Aulacomya atra نمونو څخه hemolymph ccfDNA ترتیب کړ، چې له 10 ملیون څخه ډیر لوستل یې ترلاسه کړل، چې 97.6٪ یې د کیفیت کنټرول څخه تېر شو.بیا لوستل د BLASTN او NCBI دوه اړخیز ډیټابیسونو په کارولو سره د ځان او غیر ځان سرچینو له مخې طبقه بندي شوي (انځور S1، اضافي معلومات).
په انسانانو کې، اټومي او مایټوکونډریال DNA دواړه د وینې جریان ته خوشې کیدی شي [38].په هرصورت، په اوسنۍ څیړنه کې، دا ممکنه نه وه چې د عضلاتو اټومي جینومیک DNA په تفصیل سره تشریح کړي، په دې شرط چې د A. atra جینوم ترتیب یا تشریح شوی نه وي.په هرصورت، موږ وتوانیدو چې د بایوال کتابتون (انځور S2، اضافي معلومات) په کارولو سره د خپل اصلي ccfDNA ډیری ټوټې وپیژنو.موږ د A. atra جینونو د لارښود PCR پراخولو له لارې زموږ د خپل اصلي DNA ټوټې شتون هم تایید کړ چې ترتیب شوي وو (انځور 3).په ورته ډول، د دې په پام کې نیولو سره چې د A. atra mitochondrial جینوم په عامه ډیټابیسونو کې شتون لري، یو څوک کولی شي د A. atra په هیمولیمف کې د مایټوکونډریال ccfDNA ټوټې شتون لپاره شواهد ومومي.د مایټوکونډریال DNA ټوټو شتون د PCR امپلیفیکیشن (انځور 3) لخوا تایید شوی.
مختلف مایتوکونډریال جینونه د A. atra په هیمولیمف کې موجود وو (سرخ نقطې - د سټاک شمیره: SRX5705969) او M. platensis (نیلي نقطې - د سټاک شمیره: SRX5705968) د PCR لخوا پراخ شوي.انځور د بریتون او نور څخه جوړ شوی، 2011 B د A. atra څخه د هیمولیمف سپرناټینټ پراخول په FTA کاغذ کې ذخیره شوي.په مستقیم ډول د PCR ټیوب ته اضافه کولو لپاره د 3 ملي میتر پنچ وکاروئ چې د PCR مخلوط لري.
د بحر په اوبو کې د مایکروبیل پراخه مینځپانګې ته په پام سره ، موږ په پیل کې په هیمولیمف کې د مایکروبیل DNA ترتیبونو ځانګړتیا باندې تمرکز وکړ.د دې کولو لپاره، موږ دوه مختلف ستراتیژۍ کاروو.په لومړۍ ستراتیژۍ کې Kraken2 کارول شوی، د الګوریتم پر بنسټ د ترتیب طبقه بندي پروګرام چې کولی شي د مایکروبیل ترتیبونه د BLAST او نورو وسیلو سره پرتله کولو دقت سره وپیژني [28].د 6719 څخه ډیر لوستل د باکتریایی اصل څخه ټاکل شوي، پداسې حال کې چې 124 او 64 په ترتیب سره د لرغونو او ویروسونو څخه وو (4 شکل).د باکتریا د DNA تر ټولو زیاتې برخې د فیرمیکیوټس (46٪)، پروټوباکتیریا (27٪)، او باکټروایډیټس (17٪) (انځور 4a) وې.دا ویش د سمندري نیلي میوسل مایکروبیوم پخوانیو مطالعاتو سره مطابقت لري [39, 40].Gammaproteobacteria د پروټوباکټریا (44٪) اصلي طبقه وه، په شمول ډیری Vibrionales (4b انځور).د ddPCR میتود د A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] په ccfDNA کې د Vibrio DNA ټوټې شتون تایید کړ.د ccfDNA د باکتریایی اصل په اړه د نورو معلوماتو ترلاسه کولو لپاره، یو اضافي طریقه اخیستل شوې (انځور. S2، اضافي معلومات). په دې حالت کې، هغه لوستل چې اوورلیپ شوي د جوړه پای لوستلو په توګه راټول شوي او د BLASTN په کارولو سره د ځان (bivalves) یا غیر ځان اصل په توګه طبقه بندي شوي او د 1e−3 e ارزښت او د 90٪ هومولوژي سره کټ آف. په دې حالت کې، هغه لوستل چې اوورلیپ شوي د جوړه پای لوستلو په توګه راټول شوي او د BLASTN په کارولو سره د ځان (bivalves) یا غیر ځان اصل په توګه طبقه بندي شوي او د 1e−3 e ارزښت او د 90٪ هومولوژي سره کټ آف. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны ски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90٪. په دې حالت کې، اوورلپینګ لوستل د جوړ شوي پای لوستلو په توګه راټول شوي او د BLASTN او e ارزښت 1e-3 په کارولو سره د اصلي (bivalve) یا غیر اصلي په توګه طبقه بندي شوي او د >90٪ هومولوژي سره کټ آف.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 值和>为自身（双壳类）或非自身来源.在 这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用 的使用的0e %0e>使用 blastn和和1和1> د ‏‎源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身.. . . . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы классифицированы чтения были или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90٪. په دې حالت کې، اوورلپینګ لوستل د جوړه شوي پای لوستلو په توګه راټول شوي او د e BLASTN او 1e-3 ارزښتونو او د هومولوژي حد > 90٪ په کارولو سره د خپل (بایوالوز) یا غیر اصلي په توګه طبقه بندي شوي.څرنګه چې د A. اترا جینوم تر اوسه نه دی ترتیب شوی، موږ د MEGAHIT د راتلونکي نسل ترتیب (NGS) راټولونکي د نوي اسمبلۍ ستراتیژي کارولې.په ټولیز ډول 147,188 کانټیګونه د اصلي پورې تړلو (بیوالوز) په توګه پیژندل شوي.دا کانټیګونه بیا د BLASTN او BLASTX په کارولو سره د 1e-10 e-values ​​سره چاودلي.دې ستراتیژۍ موږ ته اجازه راکړه چې په A. atra ccfDNA کې موجود 482 غیر دوه اړخیز ټوټې وپیژنو.د دې DNA ټوټې له نیمایي څخه ډیر (57٪) د باکتریا څخه ترلاسه شوي، په عمده توګه د ګیل سمبیونټونو څخه، په شمول د سلفوټروفیک سمبیونټونو، او د ګیل سمبیونټس Solemya velum (5 شکل).
د ډول په کچه نسبي کثرت.د دوه اصلي فیلا (Firmicutes او Proteobacteria) د مایکروبیل تنوع.د ddPCR C Vibrio spp نمایندګي پراخول.A. د 16S rRNA جین (نیلي) ټوټې په دریو ایټرا هیمولیفونو کې.
ټولټال 482 راټول شوي کانټیګونه تحلیل شوي.د میټاګینومیک کانټیګ تشریحاتو د ټیکونومیک ویش عمومي پروفایل (پروکاریوټس او یوکاریوټس).B د BLASTN او BLASTX لخوا پیژندل شوي د باکتریا DNA ټوټو تفصيلي ویش.
د Kraken2 تحلیل دا هم وښودله چې mussel ccfDNA د لرغوني DNA ټوټې لري، په شمول د Euryarchaeota (65٪)، Crenarchaeota (24٪)، او Thaurmarcheota (11٪) (Fig. 6a).د Euryarchaeota او Crenarchaeota څخه اخیستل شوي د DNA ټوټو شتون، چې مخکې د کالیفورنیا د مچیو په مایکروبیل ټولنه کې موندل شوي، باید د حیرانتیا وړ نه وي [42].که څه هم Euryarchaeota اکثرا د سختو شرایطو سره تړاو لري، اوس دا پیژندل شوي چې Euryarchaeota او Crenarcheota دواړه په سمندري کریوجنیک چاپیریال کې ترټولو عام پروکاریوټس څخه دي [43, 44].په مغزو کې د میتانوجینک مایکرو ارګانیزمونو شتون د حیرانتیا خبره نه ده، د کرګولین په پلیټو کې د لاندې لیکونو څخه د پراخو میتان لیکونو وروستي راپورونو ته په پام سره [45] او د کیرګولین ټاپوګانو په ساحل کې د مایکروبیل میتان احتمالي تولید لیدل شوي [46].
زموږ پاملرنه بیا د DNA ویروسونو لوستلو ته واړوله.زموږ د غوره پوهې لپاره، دا د ګولیو د ویروس مینځپانګې لومړنۍ بې هدفه مطالعه ده.لکه څنګه چې تمه کیده، موږ د باکتریوفیجز (Caudovirales) د DNA ټوټې وموندلې (شکل 6b).په هرصورت، ترټولو عام ویروس DNA د نیوکلیوسایټو ویروسونو د فیلم څخه راځي، چې د اټومي سایټوپلاسمیک لوی DNA ویروس (NCLDV) په نوم هم پیژندل کیږي، کوم چې د هر ویروس ترټولو لوی جینوم لري.په دې فیلم کې، د DNA ډیری سلسلې د Mimimidoviridae (58٪) او Poxviridae (21٪) کورنیو پورې اړه لري، چې طبیعي کوربه یې فقرات او ارتروپډونه شامل دي، پداسې حال کې چې د دې DNA سلسلې لږه برخه د پېژندل شوي ویرولوژیکي الګا سره تړاو لري.د سمندري یوکریوټیک الګا په ناروغۍ اخته کوي.ترتیبونه د پانډورا ویروس څخه هم ترلاسه شوي، یو لوی ویروس دی چې د هر پیژندل شوي ویروس نسل ترټولو لوی جینوم اندازه لري.په زړه پورې خبره دا ده چې د کوربه توب لړۍ چې په ویروس اخته شوي پیژندل شوي، لکه څنګه چې د هیمولیمف ccfDNA ترتیب لخوا ټاکل شوي، نسبتا لوی و (شکل S3، اضافي معلومات).پدې کې هغه ویروسونه شامل دي چې حشرات اخته کوي لکه Baculoviridae او Iridoviridae، او همدارنګه هغه ویروسونه چې امیبا، الګا او فقرات اخته کوي.موږ د Pithovirus sibericum جینوم سره سمون لرونکي ترتیبونه هم وموندل.پیټو ویروسونه (د زومبي ویروسونو په نوم هم پیژندل شوي) په لومړي ځل په سایبریا کې د 30,000 کلن پرمافروسټ څخه جلا شوي وو [47].په دې توګه، زموږ پایلې د پخوانیو راپورونو سره مطابقت لري چې ښیي چې د دې ویروسونو ټول عصري ډولونه له منځه تللي نه دي [48] او دا چې دا ویروسونه ممکن په لیرې پرتو سمندري اکوسیستمونو کې شتون ولري.
په نهایت کې ، موږ ازموینه وکړه ترڅو وګورو چې ایا موږ د نورو څو سیلولر څارویو څخه د DNA ټوټې موندلی شو.د BLASTN او BLASTX لخوا د nt, nr او RefSeq کتابتونونو (جینومیک او پروټین) سره ټولټال 482 بهرني کانټیګونه پیژندل شوي.زموږ پایلې ښیي چې د څو سیلولر حیواناتو ccfDNA د بهرنیو ټوټو په مینځ کې د هډوکو د هډوکو DNA غالب دی (5 شکل).د حشراتو او نورو ډولونو څخه د DNA ټوټې هم موندل شوي.د DNA ټوټې نسبتا لویه برخه نه ده پیژندل شوې، ممکن د ځمکې د ډولونو په پرتله د جینومیک ډیټابیسونو کې د لوی شمیر سمندري ډولونو د کم استازیتوب له امله [49].
په اوسنۍ لیکنه کې، موږ د LB مفهوم په mussels پلي کوو، دا استدلال کوي چې د hemolymph ccfDNA شاټ ترتیب کولی شي د سمندري ساحلي ایکوسیستم جوړښت ته بصیرت چمتو کړي.په ځانګړې توګه، موږ وموندله چې 1) mussel hemolymph د نسبتا لوی (~ 1-5 kb) د DNA ټوټو گردش کولو نسبتا لوړ غلظت (د مایکروګرام کچه) لري؛2) دا د DNA ټوټې دواړه خپلواک او غیر خپلواک دي 3) د دې DNA ټوټې د بهرنیو سرچینو په مینځ کې، موږ باکتریا، آرکییل او ویروس DNA، او همدارنګه د نورو څو حجرو حیواناتو DNA وموندل؛4) په هیمولیمف کې د دې بهرنیو ccfDNA ټوټو راټولول په چټکۍ سره پیښیږي او د عضلاتو داخلي فلټر کولو فعالیت کې مرسته کوي.په پایله کې، زموږ څیړنه ښیي چې د LB مفهوم، چې تر اوسه پورې په عمده توګه د بایو میډیسین په ساحه کې پلي شوی، د پوهې بډایه مګر ناپیل شوي سرچینې کوډ کوي چې د لیږل شوي ډولونو او د دوی چاپیریال ترمنځ د تعامل ښه پوهیدو لپاره کارول کیدی شي.
د پریمیټس سربیره، په تی لرونکو حیواناتو کې د ccfDNA انزوا راپور شوي، په شمول موږکان، سپي، پیشوګانې او اسونه [50, 51, 52].په هرصورت، زموږ پوهه ته، زموږ څیړنه لومړی ده چې د خلاص گردش سیسټم سره په سمندري ډولونو کې د ccfDNA کشف او ترتیب راپور ورکوي.دا اناتوميکي ځانګړنه او د مچيو د فلټر کولو وړتيا ښايي لږ تر لږه په يوه برخه کې د نورو ډولونو په پرتله د DNA د ټوټو د دوران د مختلف اندازې ځانګړتیاوې تشریح کړي.په انسانانو کې، د DNA ډیری ټوټې په وینه کې گردش کوي کوچنۍ ټوټې دي چې د 150 څخه تر 200 bp پورې اندازه لري.د 167 bp اعظمي لوړوالي سره [34, 53].د DNA ټوټې یوه کوچنۍ مګر د پام وړ برخه د 300 او 500 bp په اندازه ده، او شاوخوا 5٪ د 900 bp څخه اوږده دي.[۵۴] .د دې اندازې توزیع دلیل دا دی چې په پلازما کې د ccfDNA اصلي سرچینه د حجرو د مړینې په پایله کې رامینځته کیږي، یا د حجرو مړینې یا په صحي اشخاصو کې د هیماتپوایټیک حجرو د نیکروسیس له امله یا د سرطان ناروغانو کې د تومور حجرو د اپوپټوسس له امله (د گردش تومور DNA په نوم پیژندل کیږي).، ctDNA).د hemolymph ccfDNA د اندازې ویش چې موږ په میوز کې موندلی د 1000 څخه تر 5000 bp پورې دی، دا وړاندیز کوي چې د mussel ccfDNA یو بل اصل لري.دا یو منطقي فرضیه ده، ځکه چې میوزونه نیم خلاص عصبي سیسټم لري او په سمندري آبي چاپیریال کې ژوند کوي چې د مایکروبیل جینومیک DNA لوړ غلظت لري.په حقیقت کې، زموږ د لابراتوار تجربو د exogenous DNA په کارولو سره ښودلې چې میوزونه د سمندر په اوبو کې د DNA ټوټې راټولوي، لږترلږه د څو ساعتونو وروسته دوی د حجرو له پورته کیدو وروسته تخریب کیږي او / یا خوشې کیږي او / یا په مختلفو سازمانونو کې زیرمه کیږي.د حجرو د نشتوالي په پام کې نیولو سره (دواړه پروکاریوټیک او یوکریوټیک)، د انټراوالولر برخو کارول به د ccfDNA مقدار له ځانه سرچینو او همدارنګه د بهرنیو سرچینو څخه کم کړي.د bivalve طبیعي معافیت اهمیت او د دوراني فاګوسایټونو لوی شمیر په پام کې نیولو سره، موږ نور اټکل وکړ چې حتی بهرني ccfDNA د فاګوسایټونو په جریان کې بډایه کیږي چې د مایکروجنیزمونو او/یا سیلولر کثافاتو په جذبولو سره بهرني DNA راټولوي.یوځای اخیستل شوي، زموږ پایلې ښیي چې bivalve hemolymph ccfDNA د مالیکولر معلوماتو یو ځانګړی ذخیره ده او د لیږل شوي ډولونو په توګه د دوی حیثیت پیاوړی کوي.
زموږ معلومات په ګوته کوي چې د باکتریا څخه ترلاسه شوي هیمولیمف ccfDNA ټوټو ترتیب او تحلیل کولی شي د کوربه باکتریا فلورا او د شاوخوا سمندري ایکوسیستم کې موجود بکتیریا په اړه کلیدي معلومات چمتو کړي.د شاټ ترتیب کولو تخنیکونو د کمنسل باکتریا A. atra gill سلسلې په ګوته کړې چې که چیرې د 16S rRNA پیژندنې دودیز میتودونه کارول شوي وای ، د حوالې کتابتون تعصب له امله به له لاسه ورکړل شوي وای.په حقیقت کې، زموږ د LB ډیټا کارول چې د M. platensis څخه په ورته mussel طبقه کې په Kerguelen کې راټول شوي وښودله چې د ګیل پورې تړلي باکتریا سمبولونو ترکیب د دواړو mussel ډولونو لپاره یو شان و (انځور. S4، اضافي معلومات).د دوو جنیټیکي پلوه د مختلف مغزونو دا ورته والی ممکن د کیرګولین په ساړه ، سلفر او آتش فشاني زیرمو کې د باکتریایی ټولنو ترکیب منعکس کړي [55, 56, 57, 58].د سلفر کمولو مایکرو ارګانیزمونو لوړه کچه په ښه توګه تشریح شوي کله چې د بایوټربیټ ساحلي سیمو څخه د میوو راټولول [59] لکه د پورټ او فرانس ساحل.بل احتمال دا دی چې د commensal mussel flora کیدای شي د افقی لیږد لخوا اغیزمن شي [60, 61].د سمندري چاپېریال، د سمندري سطحې سطحې، او په غوزانو کې د سمبیوټیک باکتریا د جوړښت تر منځ د ارتباط معلومولو لپاره لا زیاتو څیړنو ته اړتیا ده.دا څیړنې اوس مهال روانې دي.
د hemolymph ccfDNA اوږدوالی او غلظت، د پاکولو اسانتیا، او لوړ کیفیت چې د ګړندۍ شاټګون ترتیب ته اجازه ورکوي د سمندري ساحلي ایکوسیستمونو کې د حیاتي تنوع ارزولو لپاره د mussel ccfDNA کارولو ډیری ګټې دي.دا طریقه په ځانګړي ډول په یو ورکړل شوي ایکوسیستم کې د ویروس ټولنو (ویرومونو) ځانګړتیا لپاره مؤثره ده [62, 63].د باکتریا، لرغونو اثارو، او یوکریوټس په څیر، ویروس جینومونه د فایولوژیکي پلوه ساتل شوي جینونه نلري لکه د 16S ترتیبونه.زموږ پایلې ښیي چې د شاخص ډولونو څخه د مایع بایپسي لکه mussels د نسبتا لوی شمیر ccfDNA ویروس ټوټې پیژندلو لپاره کارول کیدی شي چې د کوربه اخته کولو لپاره پیژندل شوي چې په عمومي ډول د ساحل سمندري ایکوسیستمونو کې اوسیږي.پدې کې هغه ویروسونه شامل دي چې د پروټوزوا، آرتروپډز، حشراتو، نباتاتو، او باکتریا ویروسونو (د بیلګې په توګه، باکتریوفیجز) د اخته کیدو لپاره پیژندل شوي.ورته توزیع وموندل شوه کله چې موږ د نیلي میوسلونو هیمولیمف ccfDNA ویروس معاینه کړه (M. platensis) په ورته میوسل طبقه کې په Kerguelen (جدول S2، اضافي معلومات).د ccfDNA د شاټګن ترتیب کول په حقیقت کې د انسانانو یا نورو ډولونو د ویروم په مطالعې کې یوه نوې طریقه ده [21, 37, 64].دا طریقه په ځانګړې توګه د دوه اړخیزو DNA ویروسونو مطالعې لپاره ګټوره ده، ځکه چې هیڅ یو جین د ټولو دوه اړخیزو DNA ویروسونو په منځ کې نه ساتل کیږي، چې په بالتیمور کې د ویروسونو خورا متنوع او پراخه طبقه استازیتوب کوي [65].که څه هم ډیری دا ویروسونه غیر طبقه بندي پاتې دي او ممکن د ویروس نړۍ د بشپړ نامعلوم برخې څخه ویروسونه پکې شامل وي [66]، موږ وموندله چې د A. atra او M. platensis د mussels ویروسونه او کوربه سلسلې د دوو ډولونو تر منځ راوتلي.په ورته ډول (شکل S3 وګورئ، اضافي معلومات).دا ورته والی د حیرانتیا خبره نده، ځکه چې دا ممکن په چاپیریال کې د DNA په جذب کې د انتخاب نشتوالی منعکس کړي.د پاک شوي RNA په کارولو سره راتلونکي مطالعات اوس مهال د RNA ویروم ځانګړتیا لپاره اړین دي.
زموږ په مطالعې کې، موږ د کووارسکي او همکارانو له کار څخه تطابق یو خورا سخت پایپ لاین کارولی [37]، چا چې د اصلي ccfDNA راټولولو دمخه او وروسته د پول شوي لوستلو او کانټیګونو دوه مرحلې ړنګولو کارولې، چې په پایله کې د غیر نقشه شوي لوستلو لوړه تناسب.له همدې امله، موږ نشو کولی دا رد کړو چې د دې بې نقشه لوستلو څخه ځینې ممکن لا هم خپل اصل ولري، په عمده توګه ځکه چې موږ د دې میوز ډولونو لپاره د حوالې جینوم نه لرو.موږ دا پایپ لاین هم کارولی ځکه چې موږ د ځان او غیر ځان لوستلو ترمینځ د چیمیرا په اړه اندیښمن یو او د لوستلو اوږدوالی د Illumina MiSeq PE75 لخوا رامینځته شوی.د ډیری ناڅرګندو لوستلو بل دلیل دا دی چې ډیری سمندري میکروبونه په ځانګړي توګه په لیرې پرتو سیمو کې لکه کیرګولین کې ندي تشریح شوي.موږ د Illumina MiSeq PE75 څخه کار واخیست، د ccfDNA ټوټې اوږدوالی د انسان ccfDNA سره ورته دی.د راتلونکو مطالعاتو لپاره، زموږ پایلو ته په پام سره چې ښیي چې هیمولیمف ccfDNA د انسانانو او/یا تی لرونکو حیواناتو په پرتله اوږده لوستل لري، موږ وړاندیز کوو چې د ccfDNA د اوږدې ټوټو لپاره مناسب ترتیب پلیټ فارم وکاروو.دا تمرین به د ژور تحلیل لپاره د نورو نښو پیژندلو لپاره خورا اسانه کړي.اوس مهال شتون نلري بشپړ A. atra اټومي جینوم ترتیب ترلاسه کول به د ځان او غیر ځان سرچینو څخه د ccfDNA تبعیض هم خورا اسانه کړي.د دې په پام کې نیولو سره چې زموږ څیړنې د مایع بایپسي مفکورې د تطبیق په امکاناتو تمرکز کړی دی، موږ هیله لرو چې دا مفهوم په راتلونکو څیړنو کې کارول کیږي، نوي وسایل او پایپ لاینونه به رامینځته شي ترڅو د دې میتود احتمال زیات کړي ترڅو د مچیو مایکروبیل تنوع مطالعه کړي.سمندري ایکوسیستم
د غیر برید کونکي کلینیکي بایومارکر په توګه، د ccfDNA لوړ شوي انساني پلازما کچه د مختلفو ناروغیو، نسجونو زیان، او فشار شرایطو سره تړاو لري [67,68,69].دا زیاتوالی د نسج زیان وروسته د خپل اصلي DNA ټوټې خوشې کولو سره تړاو لري.موږ دا مسله د تودوخې د شدید فشار په کارولو سره حل کړه، په کوم کې چې میوه په لنډه توګه د 30 سانتي ګراد د تودوخې سره مخ شوي.موږ دا تحلیل په دریو خپلواکو تجربو کې په دریو بیلابیلو ډولونو کې ترسره کړ.په هرصورت، موږ د شدید تودوخې فشار وروسته د ccfDNA په کچه کې کوم بدلون ندی موندلی (شکل S5 وګورئ، اضافي معلومات).دا کشف ممکن لږ تر لږه په یوه برخه کې دا حقیقت تشریح کړي چې ګولۍ نیمه خلاص دوراني سیسټم لري او د دوی د لوړ فلټر کولو فعالیت له امله په پراخه کچه بهرني DNA راټولوي.له بلې خوا، پوټکي، لکه د ډیری غیر فقاريانو په څیر، کیدای شي د فشار هڅول شوي نسجونو زیانونو په وړاندې مقاومت ولري، په دې توګه د دوی په هیمولیمف کې د ccfDNA خوشې کول محدودوي [70, 71].
تر نن نیټې پورې، په آبی اکوسیستمونو کې د جیو تنوع DNA تحلیل په عمده توګه د چاپیریال DNA (eDNA) میټابارکوډینګ باندې تمرکز کړی.په هرصورت، دا طریقه معمولا د حیاتي تنوع تحلیل کې محدود وي کله چې پریمر کارول کیږي.د شاټګن تسلسل کارول د PCR محدودیتونه او د پریمر سیټونو متعصب انتخاب مخنیوی کوي.په دې توګه، په یوه معنی، زموږ طریقه په دې وروستیو کې کارول شوي د لوړ-throughput eDNA شاټګن ترتیب کولو میتود ته نږدې ده، کوم چې د دې توان لري چې په مستقیم ډول ټوټه شوي DNA ترتیب کړي او نږدې ټول ارګانیزمونه تحلیل کړي [72, 73].په هرصورت، یو شمیر بنسټیز مسلې شتون لري چې LB د معیاري eDNA میتودونو څخه توپیر کوي.البته، د eDNA او LB ترمنځ اصلي توپیر د طبیعي فلټر کوربه کارول دي.د eDNA مطالعې لپاره د طبیعي فلټر په توګه د سمندري ډولونو کارول لکه سپنجونه او بایوالوز (Dresseina spp.) راپور شوي [74, 75].په هرصورت، د Dreissena مطالعې د نسج بایوپسي کارولې چې له هغې څخه DNA استخراج شوی.د LB څخه د ccfDNA تحلیل د نسج بایپسي ته اړتیا نلري، ځانګړي او ځینې وختونه ګران تجهیزات او لوژستیک چې د eDNA یا نسج بایپسي سره تړاو لري.په واقعیت کې، موږ په دې وروستیو کې راپور ورکړ چې د LB څخه ccfDNA د FTA مالتړ سره د سړې زنځیر ساتلو پرته ذخیره او تحلیل کیدی شي، کوم چې په لیرې پرتو سیمو کې د څیړنې لپاره لویه ننګونه ده [76].د مایع بایوپسی څخه د ccfDNA استخراج هم ساده دی او د شاټګن ترتیب او PCR تحلیل لپاره لوړ کیفیت DNA چمتو کوي.دا یوه لویه ګټه ده چې ځینې تخنیکي محدودیتونه چې د EDNA تحلیل سره تړاو لري [77].د نمونې اخیستلو طریقه سادگي او ټیټ لګښت هم په ځانګړې توګه د اوږدې مودې څارنې پروګرامونو لپاره مناسب دی.د دوی د لوړ فلټر کولو وړتیا سربیره، د بایوالوز یو بل پیژندل شوی ځانګړتیا د دوی د بلغم کیمیاوي میوکوپولیساکریډ جوړښت دی، کوم چې د ویروسونو جذب هڅوي [78, 79].دا bivalves د حیاتي تنوع ځانګړتیا او په ورکړل شوي آبي ایکوسیستم کې د اقلیم بدلون اغیزې لپاره یو مثالی طبیعي فلټر جوړوي.که څه هم د کوربه څخه ترلاسه شوي DNA ټوټو شتون د eDNA په پرتله د میتود محدودیت په توګه لیدل کیدی شي، د eDNA په پرتله د داسې اصلي ccfDNA درلودلو لګښت په ورته وخت کې د روغتیا مطالعاتو لپاره د معلوماتو پراخه مقدار لپاره د پوهیدو وړ دی.کوربه کوربه.پدې کې د ویروس ترتیب شتون شامل دی چې د کوربه کوربه جینوم کې مدغم شوي.دا په ځانګړې توګه د میوز لپاره مهم دی، په bivalves [80, 81] کې د افقی ډول لیږد شوي لیوکیمیک ریټرو ویروسونو شتون ته په پام سره.د EDNA په پرتله د LB بله ګټه دا ده چې دا په هیمولیمف کې د وینې حجرو گردش کولو فاګوسیتیک فعالیت څخه ګټه پورته کوي، کوم چې مایکرو ارګانیزمونه (او د دوی جینومونه) پوښي.Phagocytosis په bivalves کې د وینې حجرو اصلي دنده ده [82].په نهایت کې، دا طریقه د مچیو د لوړ فلټر کولو ظرفیت (په اوسط ډول د سمندري اوبو 1.5 l/h) او دوه ورځنی جریان څخه ګټه پورته کوي، کوم چې د سمندري اوبو د مختلفو طبقو مخلوط زیاتوي، د هیټرولوژس ای ډی این ای نیولو ته اجازه ورکوي.[۸۳، ۸۴].په دې توګه، د mussel ccfDNA تحلیل یو په زړه پورې لاره ده چې د میوو تغذیه، اقتصادي او چاپیریال اغیزو ته په پام سره.د LB تحلیل ته ورته چې د انسانانو څخه راټول شوي، دا طریقه د خارجي موادو په ځواب کې د کوربه DNA کې د جنیټیک او ایپیګینیټیک بدلونونو اندازه کولو امکان هم خلاصوي.د مثال په توګه، د دریم نسل ترتیب کولو ټیکنالوژۍ د نانوپور ترتیب په کارولو سره په اصلي ccfDNA کې د جینوم پراخه میتیلیشن تحلیل ترسره کولو لپاره تصور کیدی شي.دا پروسه باید د دې حقیقت په واسطه اسانه شي چې د فرعي لوستلو ترتیب شوي پلیټفارمونو سره مطابقت لري.له همدې امله، دا کولی شي د اقلیم بدلون یا ککړتیاو سره د مخامخ کیدو وروسته د غبرګون اداره کولو اصلي میکانیزمونو کې ارزښتناکه بصیرت چمتو کړي [87].په هرصورت، د LB کارول د محدودیتونو پرته ندي.د ویلو اړتیا نشته، دا په اکوسیستم کې د شاخص ډولونو شتون ته اړتیا لري.لکه څنګه چې پورته یادونه وشوه، د ورکړل شوي ایکوسیستم د بیولوژیکي تنوع ارزولو لپاره د LB کارول هم یو سخت بایو انفارماتیک پایپ لاین ته اړتیا لري چې د سرچینې څخه د DNA ټوټې شتون په پام کې نیسي.بله لویه ستونزه د سمندري ډولونو لپاره د حوالې جینومونو شتون دی.تمه کیږي چې نوښتونه لکه د سمندري تی لرونکو جینومونو پروژه او پدې وروستیو کې رامینځته شوې Fish10k پروژه [88] به په راتلونکي کې دا ډول تحلیلونه اسانه کړي.د سمندري فلټر تغذیه کونکي ارګانیزمونو ته د LB مفهوم پلي کول د ترتیب کولو ټیکنالوژۍ کې وروستي پرمختګونو سره هم مطابقت لري ، دا د څو اوهم بایومارکرونو پراختیا لپاره مناسب دی ترڅو د چاپیریال فشار په ځواب کې د سمندري استوګنځایونو روغتیا په اړه مهم معلومات چمتو کړي.
د جینوم ترتیب کولو ډاټا د NCBI ترتیب لوستلو آرشیف کې زیرمه شوي https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 د Bioprojects SRR8924808 لاندې.
بریرلي AS، کنگزفورډ MJ په سمندري ژوند او ایکوسیستمونو د اقلیم د بدلون اغیزې.کول بیولوژي.۲۰۰۹;19: P602-P614.
Gissi E، Manea E، Mazaris AD، Fraschetti S، Almpanidou V، Bevilacqua S، et al.په سمندري چاپیریال باندې د اقلیم د بدلون او نورو محلي فشارونو ګډې اغیزې په پام کې ونیسئ.عمومي ساینسي چاپیریال.2021755:142564
Carella F، Antuofermo E، Farina S، Salati F، Mandas D، Prado P، et al.).د مارچ په لومړۍ نیټه ساینس.۲۰۲۰؛ ۷:۴۸
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. د تودوخې د تکراري فشار په شرایطو کې د تودوخې زغم کمول د اوړي د اوړي لوړ مړینه روښانه کوي.ساینسي راپور 2019؛۹:۱۷۴۹۸
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.د څارویو د مړینې په فریکونسۍ، لاملونو او حد کې وروستي بدلونونه.Proc Natl Acad Sci USA.2015؛112:1083-8.
سکارپا ایف، سننا ډي، ایزینا I، موګیټي ډي، سیروتي ایف، حسیني ایس، او نور.ډیری غیر ډولونه - ځانګړي رنځجن ممکن د پینا نوبیلیس ډله ایز مړینې لامل شوي وي.ژوند.2020؛ 10:238
براډلي ایم، کوټس ایس جے، جینکنز ای، او هارا TM.د ارکټیک زونټیک ناروغیو باندې د اقلیم بدلون احتمالي اغیزې.د نړیوال سرکپولر روغتیا.۲۰۰۵;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.د ساحلي ککړتیا څارنې کې د سیګنال ارګانیزمونو په توګه نیلي میوز (Mytilus edulis spp.: یوه بیاکتنه.Mar Environ Res 2017;130:338-65
سیراویګنا جی، مارسوني ایس، سینا ایس، بارډیلي A. د سرطان په درملنه کې د مایع بایپسي ادغام.د نیټ ریو کلین آنکول.۲۰۱۷;14:531-48
وان JCM، Massie C، Garcia-Corbacho J، Mouliere F، Brenton JD، Caldas C، et al.د مایع بایپسي میټریشن: د تومور DNA جریان ته اجازه ورکوي.د نیټ ریو سرطان.2017؛17:223-38.
منډیل P.، Metais P. نیوکلیک اسیدونه د انسان په پلازما کې.د Soc Biol فرعي شرکتونو د غونډې دقیقې.۱۹۴۸;142:241-3
Bronkhorst AJ، Ungerer W، Holdenrieder S. د سرطان درملنې لپاره د مالیکول مارکر په توګه د حجرو څخه پاک DNA لپاره نوی رول.د بایومولر تحلیل اندازه کول.2019؛17:100087.
Ignatiadis M.، Sledge GW، Jeffrey SS Liquid بایپسي کلینیک ته ننوځي - د پلي کولو مسلې او راتلونکي ننګونې.نیټ ریو کلین آنکول.۲۰۲۱;18:297-312
Lo YM، Corbetta N.، Chamberlain PF، Rai W.، Sargent IL، Redman CW او نور.د جنین DNA د میندو پلازما او سیرم کې شتون لري.لانسیټ۱۹۹۷;350:485-7.
Mufarray MN، Wong RJ، Shaw GM، Stevenson DK، Quake SR د امیندوارۍ د کورس مطالعه او د امیندوارۍ په جریان کې د میرمنو په وینه کې د خارجي حجرو RNA په کارولو سره د هغې پیچلتیاوې.دوپيډياټريک.2020؛ 8:605219
اولیریچ ایم، شیروډ K، کیون پی، Schütz E، Beck J، Stegbauer J، et al.مایع بایپسي: د ډونر حجرو څخه پاک DNA د پښتورګو په ګراف کې د الولوجینک زخمونو موندلو لپاره کارول کیږي.Nat Rev Nephrol.۲۰۲۱;17:591-603
جوآن FC، د زیږون دمخه تشخیص کې Lo YM نوښتونه: د میندو پلازما جینوم ترتیب.انا MD.2016؛67:419-32.
Gu W، Deng X، Lee M، Sucu YD، Arevalo S، Stryke D، et al.د اخته شوي بدني مایعاتو د راتلونکي نسل میټاجینومیک ترتیب سره د ګړندۍ رنځجن کشف.د نیټ درمل.2021؛27:115-24.