د Nature.com لیدلو لپاره مننه.د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ وړاندې کړو.
د باور وړ ان ویټرو سیسټم ته اړتیا شتون لري چې د درملو ازموینې لپاره د زړه فزیولوژیکي چاپیریال په سمه توګه تولید کړي.د انسان د زړه د نسج کلتور سیسټمونو محدود شتون د زړه د درملو اغیزو ناسم تفسیر لامل شوی.دلته، موږ د زړه د نسج کلتور ماډل (CTCM) رامینځته کړی چې په الکترو میخانیک ډول د زړه ټوټې هڅوي او د زړه د دورې د سیسټولیک او ډیسټولیک مرحلو په جریان کې فزیولوژیکي فشار څخه تیریږي.د 12 ورځو کلتور څخه وروسته، دې طریقې په جزوي توګه د زړه د برخو فعالیت ښه کړی، مګر د دوی ساختماني بشپړتیا یې په بشپړه توګه نه ده ساتلې.له همدې امله، د کوچنیو مالیکولونو سکرینینګ وروسته، موږ وموندله چې زموږ په منځ کې د 100 nM triiodothyronine (T3) او 1 μM dexamethasone (Dex) اضافه کول د 12 ورځو لپاره د برخو مایکرو جوړښت ساتلی و.د T3/Dex درملنې سره په ترکیب کې، د CTCM سیسټم د 12 ورځو لپاره د زړه د تازه نسج په څیر د انتقالي پروفایل، وړتیا، میټابولیک فعالیت، او ساختماني بشپړتیا ساتل.برسېره پردې، په کلتور کې د زړه د نسج ډیر پراخیدل د هایپرټروفیک د زړه سیګنال هڅوي، د CTCM وړتیا لپاره شواهد چمتو کوي چې د زړه د فشار له امله د هایپرټروفیک شرایطو نقل کړي.په پایله کې، CTCM کولی شي د اوږدې مودې په اوږدو کې په کلتور کې د زړه فزیولوژي او رنځپوهنه ماډل کړي، د معتبر مخدره توکو سکرینینګ وړ کړي.
د کلینیکي څیړنې دمخه، د ویټرو سیسټمونو کې د باور وړ اړتیا ده چې کولی شي د انسان د زړه فزیولوژیکي چاپیریال په سمه توګه بیا تولید کړي.دا ډول سیسټمونه باید بدل شوي میخانیکي جریان، د زړه ضربان، او الکترو فزیولوژیکي ملکیتونه نقل کړي.د څارویو ماډلونه معمولا د زړه د فزیولوژی لپاره د سکرینینګ پلیټ فارم په توګه کارول کیږي چې د انسان په زړه کې د درملو اغیزې منعکس کولو کې محدود اعتبار سره 1,2.په نهایت کې، د زړه د نسج کلتور تجربه لرونکي ماډل (CTCM) یو ماډل دی چې خورا حساس او د مختلفو معالجوي او فارماسولوژیکي مداخلو لپاره ځانګړی دی، په سمه توګه د انسان د زړه فزیولوژي او رنځپوهنه بیا تولیدوي.د داسې سیسټم نشتوالی د زړه د ناکامۍ لپاره د نوي درملنې کشف محدودوي 4,5 او د بازار څخه د وتلو لوی دلیل په توګه د درملو کارتیوټوکسیت لامل شوی.
په تیره لسیزه کې، اته غیر زړه پورې درمل له کلینیکي کارونې څخه ایستل شوي ځکه چې دوی د QT وقفې اوږدوالی لامل کیږي چې د وینټریکولر اریتیمیا او ناڅاپي مړینې لامل کیږي7.په دې توګه، د زړه د اغیزمنتوب او زهرجنیت ارزولو لپاره د باور وړ پری کلینیکي سکرینینګ ستراتیژیو ته اړتیا لیدل کیږي.د مخدره توکو په سکرینینګ او زهرجن ازموینې کې د انسان لخوا هڅول شوي pluripotent سټیم سیل څخه ترلاسه شوي cardiomyocytes (hiPS-CM) وروستي کارول دې ستونزې ته یو اړخیز حل وړاندې کوي.په هرصورت، د hiPS-CMs ناپاک طبیعت او د زړه د نسج د څو سیلولر پیچلتیا نشتوالی د دې میتود لوی محدودیتونه دي.وروستیو څیړنو ښودلې چې دا محدودیت د وخت په تیریدو سره د ناڅاپي انقباض له پیل څخه لږ وروسته د زړه د نسج هایدروجیلونو رامینځته کولو لپاره د لومړني hiPS-CM په کارولو سره له مینځه وړل کیدی شي او په تدریجي ډول د بریښنا محرک زیاتوي.په هرصورت، دا hiPS-CM مایکروټیسسونه د بالغ مایوکارډیم بالغ الیکٹرو فزیولوژیکي او قراردادي ملکیتونه نلري.برسېره پردې، د انسان د زړه نسج ډیر پیچلي جوړښت لري، چې د مختلفو حجرو ډولونو د متفاوت مخلوط څخه جوړ دی، پشمول د Endothelial حجرو، نیورونونو، او stromal fibroblasts، د خارجي حجرو میټریکس پروټینونو د ځانګړو سیټونو په واسطه یو بل سره وصل شوي.د 11,12,13 غیر کارتیو مایسایټ نفوس دا متفاوتیت د بالغ تی لرونکي زړه کې د انفرادي حجرو ډولونو په کارولو سره د زړه د نسجونو ماډل کولو لپاره لوی خنډ دی.دا لوی محدودیتونه د فیزولوژیکي او رنځپوهنې شرایطو لاندې د باثباته مایوکارډیل نسج د کلتور لپاره د میتودونو رامینځته کولو اهمیت باندې ټینګار کوي.
د انسان د زړه کلتوري پتلي (300 µm) برخې ثابته شوې ده چې د انسان د باثباته مایوکارډیم امید لرونکی ماډل دی.دا میتود د انسان د زړه نسج ته ورته بشپړ 3D ملټي سیلولر سیسټم ته لاسرسی چمتو کوي.په هرصورت، تر 2019 پورې، د کلتوري زړه برخو کارول د لنډ (24 h) کلتور بقا لخوا محدود و.دا د یو شمیر فکتورونو له امله دی پشمول د فزیکي - میخانیکي جریان نشتوالی ، د هوا مایع انٹرفیس ، او د ساده میډیا کارول چې د زړه د نسج اړتیاو ملاتړ نه کوي.په 2019 کې، ډیری څیړنیزو ډلو وښودله چې د زړه د نسج کلتور سیسټمونو کې د میخانیکي فکتورونو شاملول کولی شي د کلتور ژوند پراخ کړي، د زړه بیان ښه کړي، او د زړه رنځپوهنه نقل کړي.دوه په زړه پورې مطالعې 17 او 18 ښیې چې غیر محیط میخانیکي بار کول د کلتور په جریان کې د زړه فینوټائپ باندې مثبت اغیزه لري.په هرصورت، دې مطالعاتو د زړه د دورې متحرک درې اړخیز فزیکو - میخانیکي بار کولو څخه کار نه دی اخیستی، ځکه چې د زړه برخې د اسومیټریک تناسلي ځواکونو 17 یا لینیر آکسوټونک بار کولو 18 سره بار شوي.د نسجونو د غځولو دا میتودونه د ډیری زړه جینونو د فشار او یا د غیر معمولي اوږد غبرګون سره تړلي جینونو د زیاتوالي لامل شوي.د پام وړ، Pitoulis et al.19 د ځواک د لیږدونکي فیډبیک او تشنج ډرایو په کارولو سره د زړه د دورې بیارغونې لپاره د متحرک زړه سلائس کلتور حمام رامینځته کړی.که څه هم دا سیسټم د ویټرو کارتیک دورې ماډلینګ کې د لا دقیقو لپاره اجازه ورکوي، د میتود پیچلتیا او ټیټ انډول د دې سیسټم پلي کول محدودوي.زموږ لابراتوار پدې وروستیو کې د بریښنایی محرک او غوره شوي میډیا په کارولو سره د کلتور ساده سیسټم رامینځته کړی ترڅو د 6 ورځو پورې د پورسین او د انسان د زړه نسجونو برخو ته دوام ورکړي 20,21.
په اوسني نسخه کې، موږ د زړه د نسج کلتور ماډل (CTCM) تشریح کوو د پورسین زړه برخې په کارولو سره چې د زړه د دورې په جریان کې د درې اړخیزه زړه فزیولوژی او پیتوفیزیولوژیکي اضطراب د بیاکتنې لپاره مزاحي نښې پکې شاملې دي.دا CTCM کولی شي د کلینیکي درملو دمخه وړاندوینې دقت هغه کچې ته لوړ کړي چې مخکې یې هیڅکله د ارزانه مؤثره ، مینځنۍ لارې پوټ کارتیک سیسټم چمتو کولو سره نه و ترلاسه کړی چې د کلینیکي درملو دمخه ازموینې لپاره د تی لرونکي زړه فیزیولوژي/پاتوفیزیولوژي تقلید کوي.
د هیموډینامیک میخانیکي سیګنالونه په ویټرو 22,23,24 کې د کارتیو مایوسایټ فعالیت ساتلو کې مهم رول لوبوي.په اوسني نسخه کې، موږ یو CTCM (شکل 1a) رامینځته کړی چې کولی شي د فزیولوژیکي فریکونسۍ (1.2 Hz، 72 بیټس په یوه دقیقه کې) کې د بریښنایی او میخانیکي محرک په هڅولو سره د بالغ زړه چاپیریال تقلید وکړي.د دې لپاره چې د ډیسټول په جریان کې د نسجونو د زیاتیدو مخنیوی وشي، د 3D چاپ کولو وسیله کارول شوې ترڅو د نسج اندازه 25٪ زیاته کړي (1b انځور).د C-PACE سیسټم لخوا هڅول شوی بریښنایی پیینګ د ډیټا ترلاسه کولو سیسټم په کارولو سره د سیسټول څخه 100 ms دمخه د زړه د دورې په بشپړ ډول تولید کولو لپاره وخت ټاکل شوی و.د نسج کلتور سیسټم د برنامه وړ نیوماتیک عمل کونکي (LB انجینرۍ ، آلمان) کاروي ترڅو په سایکل ډول د انعطاف وړ سیلیکون غشا پراخه کړي ترڅو په پورتنۍ خونه کې د زړه ټوټې پراخیدو لامل شي.سیسټم د فشار لیږدونکي له لارې د بهرني هوایی کرښې سره وصل شوی و ، کوم چې دا ممکنه کړې چې فشار (± 1 mmHg) او وخت (± 1 ms) (انځور 1c) په سمه توګه تنظیم کړي.
د نسج برخه د 7 ملي میتر ملاتړ حلقې سره وصل کړئ، په نیلي کې ښودل شوي، د وسیلې د کلتور په خونه کې دننه.د کلتور خونه د هوا له خونې څخه د پتلي انعطاف وړ سیلیکون جھلی په واسطه جلا شوې.د هرې خونې په مینځ کې ګازکیټ ځای په ځای کړئ ترڅو د لیکونو مخه ونیسي.د وسیلې پوښ د ګرافیت الیکټروډونه لري چې بریښنایی محرک چمتو کوي.b د لوی نسج وسیلې سکیمیک نمایش ، لارښود حلقه او ملاتړ حلقه.د نسج برخې (نصواري) د وسیلې په بهرنۍ څنډه کې په نالی کې د لارښود حلقې سره ځای په ځای شوي.د لارښود په کارولو سره ، د ملاتړ حلقه په احتیاط سره د زړه نسج برخې ته د نسج اکریلیک چپکونکي سره پوښ ​​​​کړئ.c ګراف د بریښنایی محرک وخت ښیي د هوایی چیمبر فشار د فعالیت په توګه چې د برنامه وړ نیوماتیک عمل کونکي (PPD) لخوا کنټرول کیږي.د فشار سینسرونو په کارولو سره د بریښنایی محرک ترکیب کولو لپاره د معلوماتو ترلاسه کولو وسیله کارول شوې.کله چې د کلتور په خونه کې فشار ټاکل شوي حد ته ورسیږي، د نبض سیګنال C-PACE-EM ته لیږل کیږي ترڅو بریښنایی محرک رامینځته کړي.د څلورو CTCMs عکس چې د انکیوبټر شیلف کې ایښودل شوی.څلور وسیلې د یو PPD سره د نیوماتیک سرکټ له لارې وصل شوي ، او د فشار سینسرونه د نیوماتیک سرکټ کې فشار نظارت کولو لپاره هیموسټاټیک والو ته داخل شوي.هر وسیله د نسج شپږ برخې لري.
د یو واحد نیوماتیک عمل کونکي په کارولو سره، موږ د 4 CTCM وسیلو کنټرول کولی شو، چې هر یو یې د 6 نسج برخې ساتلی شي (انځور 1d).په CTCM کې، د هوا په چیمبر کې د هوا فشار د مایع په خونه کې په همغږي فشار بدلیږي او د زړه د ټوټې فزیولوژیکي توسع رامینځته کوي (شکل 2a او ضمیمه فلم 1).په 80 mm Hg کې د نسج اوږدوالی ارزونه.هنر.د نسجونو برخو 25٪ پراخوالی ښودلی (2b انځور).د دې سلنې پراخوالی د 2.2-2.3 µm د فزیولوژیکي سرکومیر اوږدوالی سره د زړه د نورمال برخې انقباض لپاره 17,19,25 ښودل شوی.د نسج حرکت د دودیز کیمرې ترتیباتو په کارولو سره ارزول شوی (اضافی شکل 1).د نسجونو د حرکت اندازه او سرعت (انځور 2c، d) د زړه د دورې په اوږدو کې او د سیسټول او ډیسټول (انځور 2b) په وخت کې د اوږدیدو سره مطابقت لري.د انقباض او آرامۍ په وخت کې د زړه د نسجونو فشار او سرعت په کلتور کې د 12 ورځو لپاره ثابت پاتې شو (2f انځور).د کلتور په جریان کې د تړون کولو په اړه د بریښنایی محرک اغیز ارزولو لپاره، موږ د سیډینګ الګوریتم (اضافي شکل 2a،b) په کارولو سره د فعال خرابوالي د ټاکلو لپاره یوه طریقه جوړه کړه او د بریښنا محرک سره او پرته د اخترونو ترمنځ توپیر کولو توان درلود.د زړه ورته برخه (انځور 2f).د کټ په حرکت وړ سیمه کې (R6-9)، د بریښنایی محرک په وخت کې ولتاژ د بریښنایی محرک د نشتوالي په پرتله 20٪ لوړ و، کوم چې د قراردادي فعالیت لپاره د بریښنا محرک ونډه په ګوته کوي.
د هوا چیمبر فشار نمایشي نښې، د مایع چیمبر فشار، او د نسج حرکت اندازه کول تاییدوي چې د چیمبر فشار د مایع چیمبر فشار بدلوي، چې د نسج سلائس د ورته حرکت لامل کیږي.b د نسج برخې د سلنې اوږدوالي (نیلي) نمایندګي نښې چې د سلنې اوږدوالي (نارنج) سره مطابقت لري.c د زړه د ټوټې اندازه شوي حرکت د اندازه شوي حرکت سرعت سره مطابقت لري.(d) د زړه په یوه ټوټه کې د سایکلیک حرکت (نیلي کرښه) او سرعت (نارنج نقطه کرښه) نمایندګي.د دورې وخت اندازه کول (n = 19 سلائسونه په هر ګروپ کې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د انقباض وخت (n = 19 سلائسونه په هر ګروپ کې)، د آرام وخت (n = 19 سلائسونه په هر ګروپ کې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د نسج حرکت (n = 25).سلائسونه)/گروپ د مختلفو خنزیرونو څخه)، د لوړ سیسټولیک سرعت (n = 24(D0)، 25 (D12) سلائسونه / د مختلفو خنزیرونو څخه ډله) او د آرامۍ کچه (n = 24 (D0)، 25 (D12) سلائسونه / د مختلف خنزیر څخه ګروپ).د دوه مخی زده کونکي ټ-ټیسټ په هیڅ پیرامیټر کې کوم مهم توپیر ندی ښودلی.f د نمایشي فشار تحلیل د نسجونو برخو نښانونه د (سرخ) سره او پرته د (نیلي) بریښنایی محرک سره ، د ورته برخې څخه د نسج برخې لس سیمه ایزې ساحې.لاندې تختې د بیلابیلو برخو څخه په لسو برخو کې د بریښنایی محرک سره او پرته د نسج برخو کې د فشار د فیصدي توپیر اندازه کول ښیې. (n = 8 ټوټې/ډلې د مختلفو خنزیرونو څخه، د دوه لکۍ زده کونکي ټیسټ ازموینه ترسره کیږي؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05). (n = 8 ټوټې/ډلې د مختلفو خنزیرونو څخه، د دوه لکۍ زده کونکي ټیسټ ازموینه ترسره کیږي؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,00, *p<0,001). (n = 8 برخې/ډلې د مختلفو خنزیرونو څخه، د دوه لکۍ زده کونکي ټیسټ؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 برخې/ډله، د مختلفو خنزیرونو څخه، د دوه لکۍ زده کونکي ټیسټ ازموینه؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05).د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
زموږ په پخوانی جامد بایومیمیټیک د زړه سلائس کلتور سیسټم [20, 21] کې، موږ د بریښنا محرک پلي کولو او د منځني جوړښت اصلاح کولو له لارې د 6 ورځو لپاره د زړه د ټوټو وړتیا، فعالیت، او ساختماني بشپړتیا ساتلې.په هرصورت، د 10 ورځو وروسته، دا ارقام په چټکۍ سره راټیټ شول.موږ به هغه برخې ته مراجعه وکړو چې زموږ په پخواني جامد بایومیمیټیک کلتور سیسټم 20، 21 کنټرول شرایطو (Ctrl) کې راټول شوي او موږ به زموږ پخوانۍ غوره شوي میډیم د MC شرایطو او کلتور په توګه په یو وخت میخانیکي او بریښنایی محرک (CTCM) کې وکاروو.نومول شویلومړی، موږ معلومه کړه چې د بریښنایی محرک پرته میخانیکي محرک د 6 ورځو لپاره د نسج د وړتیا ساتلو لپاره کافي نه و (اضافی شکل. 3a،b).په زړه پورې خبره دا ده چې د STCM په کارولو سره د فزیو میخانیکي او بریښنایی محرک په معرفي کولو سره، د 12 ورځو د زړه د برخو وړتیا د MS شرایطو لاندې د زړه د تازه برخو په څیر پاتې شوه، مګر د Ctrl شرایطو لاندې نه، لکه څنګه چې د MTT تحلیل (انځور 1) ښودلې.3a).دا وړاندیز کوي چې د زړه د دورې میخانیکي محرک او سمول کولی شي د نسج برخې دوه ځله د اعتبار وړ وساتي لکه څنګه چې زموږ په پخواني جامد کلتور سیسټم کې راپور شوي.په هرصورت، د زړه د ټراپونین T او connexin 43 د امیونولابلینګ په واسطه د نسجونو برخو ساختماني بشپړتیا ارزونه وښودله چې د 12 په ورځ د MC نسجونو کې د connexin 43 څرګندونه د ورته ورځې کنټرولونو په پرتله د پام وړ لوړه وه.په هرصورت، یونیفورم کونیکسین 43 بیان او د Z-disc جوړښت په بشپړه توګه ساتل شوی نه و (انځور 3b).موږ د نسج جوړښت بشپړتیا اندازه کولو لپاره د مصنوعي استخباراتو (AI) چوکاټ څخه کار اخلو 26، د انځور پر بنسټ ژورې زده کړې پایپ لاین چې د ټراپونین-T او کنیکسین سټینګ 43 پر بنسټ والړ دی ترڅو په اتوماتيک ډول د محلي کولو د ځواک له مخې د زړه د ټوټې جوړښت بشپړتیا او فلوروسینس اندازه کړي.دا طریقه د Convolutional Neural Network (CNN) او د ژورې زده کړې چوکاټ کاروي ترڅو د زړه د نسج ساختماني بشپړتیا په اتوماتیک او بې طرفه توګه اندازه کړي، لکه څنګه چې په حواله کې تشریح شوي.26. د MC نسج د جامد کنټرول برخو په پرتله د ورځې 0 ته ښه جوړښتي ورته والی ښودلی.برسېره پردې، د میسن د ټرایکروم داغ د کلتور په 12 ورځ کې د کنټرول شرایطو په پرتله د MS شرایطو لاندې د فایبرروسس د پام وړ ټیټ فیصده څرګنده کړه (انځور 3c).پداسې حال کې چې CTCM د زړه د نسجونو برخو کې د 12 په ورځ کې د زړه د تازه نسجونو سره ورته کچې ته وده ورکړه، دا د زړه د برخو ساختماني بشپړتیا کې د پام وړ پرمختګ ندی کړی.
د بار ګراف د 12 ورځو لپاره د تازه زړه سلائسونو (D0) یا د زړه سلیز کلتور د MTT وړتیا اندازه ښیي یا په جامد کلتور (D12 Ctrl) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0) کې (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 Ctrl)، 12 (D12 / D12 ټیسټ ترسره کیږي، د A # s 12 / 12 ټیسټ څخه مختلف دي. ##p <0.0001 د D0 په پرتله او **p <0.01 د D12 Ctrl په پرتله). د بار ګراف د 12 ورځو لپاره د تازه زړه ټوټې (D0) یا د زړه سلائس کلتور د MTT وړتیا اندازه ښیي یا په جامد کلتور (D12 Ctrl) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0) کې (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 Ctrl)، 12 (D12/D12 ټیستونه مختلف دي؛ د #sNOVA ټیسټ څخه مختلف دي. ###p <0.0001 د D0 په پرتله او **p <0.01 د D12 Ctrl په پرتله).هسټوګرام د MTT تازه زړه برخو (D0) یا د زړه د برخو کلچر د 12 ورځو لپاره د جامد کلتور (D12 کنټرول) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 کنټرول)، 12 (D12 MC) د مختلفو برخو څخه ترسره کیږي، 12 (D12 MC) د مختلفو برخو څخه ترسره کیږي؛ د Agro/NOV ازموینې مختلفې برخې.####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 د D0 په پرتله او **p <0.01 د D12 Ctrl په پرتله). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA，进行单向ANOVA ，D0r0p0#0#00000 l 相比,**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0) , 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心的 切片 (D12) 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p <0.0001,与D12 Ctrl 相比，**p.)هسټوګرام د زړه د تازه برخو (D0) یا د زړه په برخو کې د 12 ورځو لپاره د جامد کلچر (D12 کنټرول) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 کنټرول))، 12 (D12 MC) برخې / ګروپ / ANOVA ازموینه؛ د ANOVA ازموینه####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 د D0 په پرتله، **p <0.01 د D12 Ctrl په پرتله).b Troponin-T (شنه)، connexin 43 (سور) او DAPI (نیلي) د زړه په تازه جلا جلا برخو کې (D0) یا د زړه په برخو کې د 12 ورځو لپاره د جامد شرایطو (Ctrl) یا CTCM شرایطو (MC) لاندې کلتور شوي) د نمایندګیو امونو فلوروسینس عکسونو (خالي پیمانه = 100 µm). د زړه د نسج ساختماني بشپړتیا (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ ګروپ هر یو د مختلف سور څخه د مصنوعي هوښیارتیا اندازه کول، د یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p <0.0001 د D0 او D0r 0.0001 په پرتله د D0 او D01***1 په پرتله. د زړه د نسج ساختماني بشپړتیا (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ ګروپ له مختلفو خنزیرونو څخه د مصنوعي هوښیارتیا اندازه کول، د یو طرفه ANOVA ټیسټ ترسره کیږي؛ ####p <0.0001 د D0 او D0 r*0001 په پرتله د D0 او ***01 په پرتله. Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl) , 5/12 MC5/15 х свиней, проводится однофакторный тест ANOVA؛ ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Crl D12). د مصنوعي هوښیارتیا (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برخې / ګروپونو په واسطه د مختلف خنزیرونو په واسطه د زړه د نسجونو ساختماني بشپړتیا اندازه کول، د یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره شوې؛ ####p <0.0001 vs. D0t001 سره پرتله کول.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ ګروپ هر یو مختلف سور، یو طرفه ANOVA 0 # # 0 # 0 # 0 # 0 # D0p.比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ هر یو د مختلف سورونو ګروپ比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0) , 7 (D12 Ctrl/D12MC) , й из разных свиней, односторонний тест ANOVA؛ ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). مصنوعي هوښیارتیا د زړه د نسجونو جوړښتي بشپړتیا اندازه کولو لپاره (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برخې / ګروپ هر یو مختلف خنزیر، یو طرفه ANOVA ازموینه؛ ####p<0.0001 vs .D0 د پرتله کولو لپاره. c نمایشي عکسونه (کیڼ لور ته) او اندازه کول (ښي) د زړه د ټوټې لپاره چې د میسن ټرایکروم داغ سره داغ شوي (سکیل بیئر = 500 µm) (n = 10 سلائسونه / ګروپ هر یو له مختلف سور څخه ، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p <1 0 سره پرتله کیږي. rl). c د زړه د ټوټو لپاره نمایشي انځورونه (کیڼ اړخ ته) او اندازه کول (ښي) د میسن د ټرایکروم داغ سره داغ شوي (سکیل بییر = 500 µm) (n = 10 سلائسونه / ګروپ هر یو د مختلف خنزیرونو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ #### p <1 <0 d.0.201 سره پرتله کیږي. rl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибатебаслева тия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA؛ #### p < 0,00001 поив, п000p *** د D12 Ctrl سره равнению). c د زړه د برخو نمایشي عکسونه (کیڼ اړخ ته) او اندازه کول (ښي) د میسن د ټرایکروم داغ سره داغ شوي (بې کوت شوي پیمانه = 500 µm) (n = 10 برخې/ډله د مختلف خنزیرونو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره شوې؛ #### p <0 .0001 د D001 په پرتله د D001 په پرتله د C. c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0¼n0m0片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比,***p <0.001 C.D.L.2. د ‏‎C 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性 （左左）量化（右）裸尺度度度带裸度度带裸度500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 انووا 测试） 单向 单向 单向 انووا 测试） 0## 0#0D. ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) км) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного дисперсионного , #10p0p0p0; нию с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c د زړه د برخو نمایشي انځورونه (کیڼ اړخ ته) او مقدار (ښي) د میسن د ټرایکروم داغ (خال = 500 µm) سره داغ شوي (n = 10 برخې/ډله، هر یو د مختلف سور څخه، د توپیر د یو طرفه تحلیل په واسطه ازمول شوی؛ ### # p <0 200 <1 <0 سره پرتله کول. rl).د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
موږ داسې انګیرله چې د کلتور په مینځ کې د کوچنیو مالیکولونو په اضافه کولو سره، د کارتیو مایوسایټ بشپړتیا ښه کیدی شي او د CTCM کلتور په جریان کې د فایبروسس پراختیا کمه شوې.له همدې امله موږ د کوچني مالیکولونو لپاره زموږ د جامد کنټرول کلتورونو 20,21 په کارولو سره د لږ شمیر ګډوډونکي فکتورونو له امله سکرین شو.Dexamethasone (Dex)، triiodothyronine (T3)، او SB431542 (SB) د دې سکرین لپاره غوره شوي.دا کوچني مالیکولونه دمخه د hiPSC-CM کلتورونو کې کارول شوي ترڅو د سرکومیر اوږدوالي ، T-ټیوبونو ، او لیږد سرعت په زیاتولو سره د کاردیو مایوسایټس میټریشن هڅوي.برسېره پردې، دواړه ډیکس (یو ګلوکوکورټیکایډ) او SB د 29,30 سوزش د فشار لپاره پیژندل شوي.له همدې امله، موږ ازموینه وکړه چې ایا د یو یا د دې کوچني مالیکولونو ترکیب به د زړه برخو جوړښت بشپړتیا ته وده ورکړي.د ابتدايي سکرینینګ لپاره، د هر مرکب خوراک د هغه غلظت پر بنسټ وټاکل شو چې معمولا د حجرو کلتور ماډلونو کې کارول کیږي (1 μM Dex27، 100 nM T327، او 2.5 μM SB31).د 12 ورځو کلتور څخه وروسته، د T3 او Dex ترکیب په پایله کې د غوره کارتیو مایوسایټ ساختماني بشپړتیا او لږترلږه فایبروس بیا جوړونې (اضافي شکل 4 او 5).برسېره پردې، د T3 او Dex د دې غلظت دوه چنده یا دوه چنده کارول د نورمال غلظت په پرتله ناوړه اغیزې رامینځته کوي (اضافی شکل 6a،b).
د ابتدايي سکرینینګ وروسته، موږ د 4 کلتور شرایطو (4a شکل) سر په سر کې پرتله کول ترسره کړل: Ctrl: د زړه برخې زموږ د غوره شوي وسیلې په کارولو سره زموږ دمخه بیان شوي جامد کلتور کې کلتور شوي؛20.21 TD: T3 او Ctrl د چهارشنبه په ورځ اضافه شوی ډیکس؛MC: د زړه برخې په CTCM کې زموږ د مخکینۍ غوره شوي وسیلې په کارولو سره کلتور شوي؛او MT: CTCM د T3 او Dex سره مینځ ته اضافه شوي.د 12 ورځو د کښت څخه وروسته، د MS او MT نسجونو وړتیا د تازه نسجونو په څیر د MTT معاینې لخوا ارزول شوي (4b انځور).په زړه پورې خبره دا ده چې د ټرانس ویل کلتورونو (TD) کې د T3 او Dex اضافه کول د Ctrl شرایطو په پرتله د وړتیا په برخه کې د پام وړ پرمختګ لامل نه شو، چې د زړه د برخو د پایښت ساتلو کې د میخانیکي محرک مهم رول په ګوته کوي.
د تجربوي ډیزاین ډیاګرام چې څلور کلتوري شرایط په ګوته کوي چې د میخانیکي محرک اغیزې ارزولو لپاره کارول کیږي او د 12 ورځو لپاره په منځني ډول د T3/Dex ضمیمه. د بار ګراف د 12 ورځو وروسته د کلتور په ټولو 4 شرایطو (Ctrl, TD, MC، او MT) کې د تازه زړه د ټوټې (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD او D12 MT)، 12 (D12 Ctrl، D12 TD او D12 MT)، د 12 (D12 pigs/MCV # ټیسټ څخه توپیر لري؛ 12 (D12 pigs/MCV # ازمایښت مختلف دی) ##p <0.0001، ###p <0.001 د D0 په پرتله او **p <0.01 د D12 Ctrl په پرتله). د بار ګراف د 12 ورځو وروسته د کلتور په ټولو 4 شرایطو (Ctrl, TD, MC، او MT) کې د تازه زړه د ټوټې (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD او D12 MT)، 12 (D12 Ctrl، D12 TD او D12 MT)، د 12 (D12 pigs/MCV # ټیسټ څخه توپیر لري؛ 12 (D12 pigs/MCV # ازمایښت مختلف دی) ##p <0.0001، ###p <0.001 د D0 په پرتله او **p <0.01 د D12 ctrl په پرتله). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) й. b د بار ګراف د زړه د تازه برخو (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD، او D12 MT)، 12 (D12، D12 MT)، 12 (D12 MT)، 12 (D12 MT)، 12 (D12 MT، 12 (D12 MT)، 12. 0.0001، ###p <0.001 vs. D0 او **p <0.01 د D12 Ctrl په پرتله). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D1R1D2)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001,###p <0.0001，###p <0.0001,D01**D010 2 控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограма, показывающая все 4 условия культивирования (controll, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (со свежими со свежими) срезами (=1D0D) 2 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA؛ ####p <0,0001, ###p <0,0,0001, ###p <0,0,00,000** по сравнению с контролем D12). b هسټوګرام د زړه د تازه برخو (D0) (n = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl, D12 TD او D12 MT) په پرتله د ټولو 4 کلتور شرایط (کنټرول, TD, MC او MT) ښیې, د مختلف سور 12 (D12 MC) برخې/ډله, یو طرفه ANOVA ازموینه, #0p<#0p<#0p<#0p<#0p. 0, **p<0.01 vs. کنټرول D12). c بار ګراف د ګلوکوز فلوکس اندازه ښیي د 12 ورځو وروسته کلتور په ټولو 4 کلتور شرایطو کې (Ctrl, TD, MC, او MT) د تازه زړه ټوټې (D0) په پرتله (n = 6 ټوټې/ډله د مختلفو خنزیرونو څخه، د یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ###p <0.00.0.001***1 <0.001 په پرتله Ctrl. ). c بار ګراف د ګلوکوز فلوکس اندازه ښیي د 12 ورځو وروسته کلتور په ټولو 4 کلتور شرایطو کې (Ctrl, TD, MC, او MT) د تازه زړه ټوټې (D0) په پرتله (n = 6 ټوټې/ډله د مختلفو خنزیرونو څخه، د یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ###p <0.00.0.001***1 <0.001 په پرتله Ctrl. ). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех , 4 усех , усех , MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний свиней, односторонний со свежими срезами сердца (D0) по сравнению с D0 او ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c هسټوګرام د ټولو 4 کلتور شرایطو (کنټرول، TD، MC او MT) لاندې د کلچر څخه وروسته 12 ورځو کې د ګلوکوز فلوکس مقدار ښیي د تازه زړه برخو (D0) په پرتله (n = 6 برخې/ډله د مختلف خنزیرونو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره شوې؛ ###p <0.001 د D0 او ***1 0001 په پرتله د D0 او 001 په پرتله. 4通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001, 与D0 相比 0.001.0000000000000D0 ). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片切片心脏切片切片切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行 ，. 0 相比, ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховирования для всеховирования TD. 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c هسټوګرام د ټولو 4 کلتور شرایطو (کنټرول، TD، MC، او MT) لپاره د کلتور څخه وروسته په 12 ورځو کې د ګلوکوز جریان اندازه کول ښیې د تازه زړه برخو (D0) په پرتله (n = 6 برخې/ډله، د مختلف خنزیرونو څخه، یو اړخیزه ANOVA ازموینې ترسره شوي، ###p <0.000، ***1p <0.000 په پرتله د D001 په پرتله).d د تازه (نیلي)، د ورځې 12 MC (شنه) او د ورځې 12 MT (سرخ) نسجونو د لس سیمه ایز نسج برخې نقطو کې د فشار تحلیل پلاټونه (n = 4 ټوټې/ډله، یو طرفه ANOVA ازموینه؛ د ګروپونو ترمنځ کوم مهم توپیر شتون نلري).د آتش فشاني پلاټ د زړه په تازه برخو (D0) کې د 10-12 ورځو لپاره د جامد شرایطو (Ctrl) یا د MT شرایطو لاندې کرل شوي د زړه برخو په پرتله توپیر لرونکي جینونه ښیې.د زړه د برخو لپاره د سارکومیر جین تودوخې نقشه د هر کلتور شرایطو لاندې کلتور شوي.د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
د میټابولیک انحصار د فایټ اسید اکسیډیشن څخه ګلایکولوسیس ته بدلول د کاردیو مایوسیټ توپیر نښه ده.نابالغ کارتیو مایوسایټس په عمده توګه د ATP تولید لپاره ګلوکوز کاروي او د لږ شمیر کریسټای 5,32 سره هایپوپلاستیک مایتوکونډریا لري.د ګلوکوز کارولو تحلیلونو ښودلې چې د MC او MT شرایطو لاندې، د ګلوکوز کارول د ورځې په 0 نسجونو کې ورته وو (شکل 4c).په هرصورت، د Ctrl نمونې د تازه نسج په پرتله د ګلوکوز کارولو کې د پام وړ زیاتوالی ښودلی.دا په ګوته کوي چې د CTCM او T3/Dex ترکیب د نسج وړتیا لوړوي او د 12 ورځو کلتور شوي زړه برخو میټابولیک فینوټایپ ساتي.برسېره پردې، د فشار تحلیل وښودله چې د فشار کچه د MT او MS شرایطو لاندې د 12 ورځو لپاره د زړه په تازه نسج کې ورته پاتې وه (انځور 4d).
د CTCM او T3/Dex د ټولیز اغیزې تحلیل کولو لپاره د زړه د سلائس نسج په نړیواله لیږدونې منظره کې، موږ RNAseq د ټولو څلورو مختلفو کلتور شرایطو څخه د زړه په ټوټو کې ترسره کړ (اضافی ډاټا 1).په زړه پورې خبره دا ده چې د MT برخې د زړه د تازه نسجونو سره لوړ انتقالي ورته والی ښودلی، د 13,642 جینونو څخه یوازې 16 په توپیر سره څرګند شوي.که څه هم، لکه څنګه چې موږ مخکې ښودلې، د Ctrl ټوټې په کلتور کې د 10-12 ورځو وروسته 1229 توپیر لرونکي جینونه ښکاره کړل (انځور 4e).دا معلومات د زړه او فایبروبلاسټ جینونو qRT-PCR لخوا تایید شوي (اضافي شکل. 7a-c).په زړه پورې خبره دا ده چې د Ctrl برخو د زړه او حجرو دورې جینونو کمولو او د التهابي جین پروګرامونو فعالیت ښودلی.دا ډاټا وړاندیز کوي چې توپیر، چې معمولا د اوږدې مودې کلتور څخه وروسته واقع کیږي، په بشپړ ډول د MT شرایطو لاندې کم شوی (اضافی شکل. 8a،b).د sarcomere جینونو په احتیاط سره مطالعې ښودلې چې یوازې د MT په شرایطو کې هغه جینونه دي چې د sarcomere (Fig. 4f) او د آیون چینل (ضمیمي شکل 9) کوډ کوي، د Ctrl، TD، او MC شرایطو لاندې د فشار څخه ساتنه کوي.دا معلومات ښیي چې د میخانیکي او انساني محرک (T3/Dex) ترکیب سره، د زړه ټوټه ټرانسکریټوم کولی شي په کلتور کې د 12 ورځو وروسته د زړه تازه ټوټې ته ورته پاتې شي.
دا انتقالي موندنې د دې حقیقت لخوا مالتړ کیږي چې د زړه په برخو کې د کاردیو مایسایټس جوړښت بشپړتیا د MT شرایطو لاندې د 12 ورځو لپاره غوره ساتل کیږي، لکه څنګه چې د ثابت او محلي کنیکسین 43 (انځور 5a) لخوا ښودل شوي.برسېره پردې، د MT شرایطو لاندې د زړه په برخو کې فایبروسس د Ctrl په پرتله د پام وړ کم شوی او د زړه تازه برخو ته ورته دی (انځور 5b).دا معلومات ښیي چې د میخانیکي محرک او T3/Dex درملنې ترکیب په کلتور کې د زړه په برخو کې د زړه جوړښت په مؤثره توګه ساتي.
د troponin-T (شنه)، connexin 43 (سرخ) او DAPI (نیلي) نمایندګي د زړه په تازه جلا شویو برخو (D0) کې یا د زړه د څلورو برخو کلتوري شرایطو کې د 12 ورځو لپاره کلتور شوي (پیمانه بار = 100 µm).). د زړه د نسج ساختماني بشپړتیا (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) د مختلف خنزیرونو څخه د مصنوعي استخباراتو اندازه کول، د یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p <0.000 او ****0001 <*000 او <*000 سره پرتله کیږي. 01 د D12 Ctrl په پرتله). د زړه د نسج ساختماني بشپړتیا (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) د مختلف خنزیرونو څخه د مصنوعي استخباراتو اندازه کول، د یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ #### p <0.000 او ****0001 <*000 او <*000 سره پرتله کیږي. 01 د D12 Ctrl په پرتله). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl12MT) , DMCTD12 , DMCTD12 резов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест انووا؛ #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,005, D0015 2 Ctrl). د مصنوعي استخباراتو په کارولو سره د زړه د نسج جوړښت بشپړتیا اندازه کول (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) برخې/ډله د مختلف خنزیرونو څخه، د یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره شوې؛ #### p <0.0001 <0.0001 ****0001 <p 0.0001 پرتله د D12 Ctrl په پرتله).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 C且比 Ct.对 不同 猪的心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc（d12 td、d12 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比0p <0.05 د .د زړه د نسجونو د جوړښت بشپړتیا اندازه کول په مختلفو سورونو کې د مصنوعي استخباراتو په کارولو سره (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) برخې / ګروپ) د یو طرفه ANOVA ازموینې سره؛#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 یا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 د D0 په پرتله او *p <0.05 یا ****p <0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). b د زړه د ټوټو لپاره نمایشي عکسونه او اندازه کول چې د میسن د ټریکروم داغ سره داغ شوي (د سکیل بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, and D12 MC)، 9 (D12 MT) سلائسونه ترسره شوي د A #pgs/group څخه مختلف دي. 0001 د D0 په پرتله او ***p <0.001، یا ****p <0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). b د زړه د ټوټو لپاره نمایشي عکسونه او اندازه کول چې د میسن د ټریکروم داغ سره داغ شوي (د سکیل بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, and D12 MC)، 9 (D12 MT) سلائسونه ترسره شوي د A #pgs/group څخه مختلف دي. 0001 د D0 په پرتله او ***p <0.001، یا ****p <0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масбанка) = ۱۰ (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC) D0 او ***p < 0,001 یا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b نمایشي انځورونه او د زړه د برخو اندازه کول چې د میسن د ټرایکروم داغ سره داغ شوي (پیمانه بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD او D12 MC)، 9 (D12 MT) برخې/ډله د یو مختلف خنزیر څخه ترسره شوي. 0 او ***p <0.001 یا ****p <0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10D10D2和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.000p <0.001**或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性和量化 （比例尺尼尺 = 500 µm） 1d0ct = 500 µm） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片切片切片‎‏ پاڼې اړوند نور معلومات په فسبوک کې اوګورئ د 001،或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =10md) Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA؛ ####p < 0,0001 по <сравней, ***p <0,0001 по <сравней, ***0p <0,0001 0001 по сравнению с D12 Ctrl). b نمایشي انځورونه او د زړه د برخو اندازه کول چې د میسن ټرایکروم سره داغ شوي (پیمانه بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD او D12 MC)، 9 (D12 MT) برخې د مختلف خنزیر/ګروپ څخه؛ *** #0p0 << ###0 میتود سره پرتله کول. .001 یا ****p <0.0001 د D12 Ctrl په پرتله).د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
په نهایت کې، د CTCM وړتیا د زړه د هایپرټروفي نقل کولو لپاره د زړه د نسجونو د زیاتوالي له لارې ارزول شوې.په CTCM کې، د لوړ هوا چیمبر فشار له 80 mmHg څخه 80 mmHg ته لوړ شوی.هنر.(نورمال سټرچ) تر 140 mmHg آرټ پورې.(انځور 6a).دا په اوږدوالي کې د 32٪ زیاتوالي سره مطابقت لري (انځور 6b)، کوم چې مخکې د زړه د برخو لپاره د سرکومیر اوږدوالی ترلاسه کولو لپاره د ورته فیصدي په توګه ښودل شوی و چې په هایپرټروفي کې لیدل شوي.د انقباض او استراحت په وخت کې د زړه د نسجونو سرعت او سرعت د کلتور په شپږو ورځو کې ثابت پاتې و (انځور 6c).د MT شرایطو څخه د زړه نسج د شپږو ورځو لپاره نورمال اوږدوالی (MT (نورمال)) یا د ډیر فشار شرایطو (MT (OS)) تابع و.دمخه په کلتور کې د څلورو ورځو وروسته، د هایپرټروفیک بایومارکر NT-ProBNP د MT (OS) شرایطو لاندې د MT (نورمال) شرایطو (انځور 7a) په پرتله د پام وړ لوړ شوی و.برسېره پر دې، د کرنې شپږ ورځې وروسته، په MT (OS) (Fig. 7b) کې د حجرو اندازه د MT زړه (نورمال) برخو په پرتله د پام وړ لوړه شوې.برسېره پر دې، د NFATC4 اټومي لیږد په پراخه کچه په نسجونو کې د پام وړ زیاتوالی موندلی (انځور 7c).دا پایلې د هایپرډیسټریشن وروسته د رنځپوهنې بیا جوړونې پرمختللی پرمختګ ښیې او د دې مفکورې ملاتړ کوي چې د CTCM وسیله د سټرچ - هڅول شوي زړه هایپرټروفي سیګنالینګ مطالعې لپاره د پلیټ فارم په توګه کارول کیدی شي.
د هوا چیمبر فشار نمایشي نښې، د مایع چیمبر فشار، او د نسج حرکت اندازه کول تاییدوي چې د چیمبر فشار د مایع چیمبر فشار بدلوي، چې د نسج سلائس د ورته حرکت لامل کیږي.b د نمایندګي سلنې سلنې او د پراخیدو نرخ منحني په نورمال ډول پراخه شوي (نارنج) او پراخه (نیلي) نسج برخو لپاره.c بار ګراف د دورې وخت ښیي (n = 19 ټوټې په هر ګروپ کې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د انقباض وخت (n = 18-19 سلائسونه په هر ګروپ کې، د مختلف خنزیر څخه)، د آرام وخت (n = 19 سلائسونه په هر ګروپ کې، د مختلف خنزیر څخه)، د نسج حرکت اندازه (n = 14 سلائسونه، د مختلفو سورونو څخه n = 14 سلائسونه، مختلف pigstocn4) es/group، د مختلفو خنزیرونو څخه) او د آرامۍ کچه (n = 14 (D0)، 15 (D6) ) برخې / ګروپونه) د مختلفو خنزیرونو څخه)، د دوه لکۍ زده کونکي ټیسټ په هیڅ پیرامیټر کې کوم مهم توپیر ندی ښودلی، دا په ګوته کوي چې دا پیرامیټرې د 6 ورځو کلتور په اوږدو کې د زیاتوالي سره ثابت پاتې دي.د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
د بار ګراف اندازه کول په کلتور میډیا کې د NT-ProBNP غلظت د زړه سلائسونو څخه چې د MT نورمال سټریچ (نورم) یا اوورسټریچنګ (OS) شرایطو لاندې کلتور شوي (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، او D4 MTOS) سلائسونه د Apgs/group 2 سره پرتله کیږي. د نورمال اوږدوالي لپاره). په کلتور میډیا کې د NT-ProBNP غلظت د بار ګراف اندازه کول د زړه سلائسونو څخه چې د MT نورمال سټریچ (نورم) یا اوورسټریچنګ (OS) شرایطو لاندې کلتور شوي (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS ، D4 MTNorm ، او D4 MTOS) د دوه ټوټو څخه ترسره کیږي. د نورمال جریان په پرتله).د NT-ProBNP غلظت مقداري هسټوګرام د زړه د ټوټو څخه د کلچر په منځ کې د نورمال MT stretch (نورم) یا overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، او D4) MTOS) سلائسونه د دوه ډوله ټوټو څخه ترسره کیږي، د پیکټورانس / ګروپونو څخه توپیر لري.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 د نورمال اوږدوالي په پرتله). a 在MT 正常拉伸(نورم) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離 4 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析＋渉有0p0p. ). د زړه په ټوټو کې د NT-ProBNP غلظت اندازه کول د MT نورمال سټریچ (نورم) یا اوورسټریچ (OS) شرایطو لاندې کلتور شوي (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) له مختلف 猪的切切片湄湄滥則片发发动؛ **د نورمال اوږدوالي سره پرتله کول، p <0.01).هسټوګرام د زړه په ټوټو کې د NT-ProBNP غلظت اندازه کول د نورمال MT سټرچ (نورم) یا overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) او D4 MTOS) سلائسونه / ګروپونه د مختلف خنزیرونو څخه دوه ډوله - ګروپونه.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 د نورمال اوږدوالي په پرتله). b د زړه د ټوټو لپاره نمایشي عکسونه چې د troponin-T او WGA (کیڼ اړخ) سره داغ شوي او د حجرو اندازه اندازه کول (ښي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) حجرې/ ګروپ له 10 مختلف خنزیرونو څخه ، دوه پونډه زده کونکي د t-test0 سره پرتله کوي. b د زړه د ټوټو لپاره نمایشي عکسونه چې د troponin-T او WGA (کیڼ اړخ) سره داغ شوي او د حجرو اندازه اندازه کول (ښي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) حجرې/ ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه د 10 مختلف سلائسونو څخه، دوه پونډه زده کونکي د t-t-0 په پرتله ترسره کیږي. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий ; ению с нормальным растяжением). b د زړه د برخو نمایشي عکسونه چې د troponin-T او AZP (کیڼ اړخ) سره داغ شوي او د حجرو اندازه اندازه کول (ښي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) حجرې / ګروپ د مختلف خنزیرونو څخه 10 مختلف برخو څخه، دوه لکۍ لرونکي زده کونکي د t-test 0 سره پرتله شوي. b.来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 尾学生t 01). b د زړه د ټوټو نمایشي عکسونه چې د Calcarein-T او WGA (کیڼ اړخ) سره داغ شوي او د حجرو اندازه (ښي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 د 10 مختلف سلائسو څخه (D6 MTNorm)) حجرې/组，两方法有 《 د نورمال ازموینې سره مخ < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размественная оценка (30MT)، разменка (30MT) 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0, 0,00,000 стяжением). b د زړه د برخو نمایشي عکسونه چې د troponin-T او AZP (کیڼ اړخ) سره داغ شوي او د حجرو اندازه (ښي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) له 10 مختلف خنزیرونو څخه) حجرې/ډله، د زده کونکو دوه ګونځې معیارونه؛****p <0.0001 د نورمال فشار په پرتله). c د ورځې 0 او 6 ورځې MTOS د زړه سلائسونو لپاره نمایشي عکسونه چې د troponin-T او NFATC4 لپاره معافیتي لیبل شوي او د CMs (n = 4 (D0) ، 3 (D6 MTOS) ټوټې / ګروپ د مختلف خنزیرونو څخه د NFATC4 د لیږد مقدار اندازه کول ترسره کیږي. c د ورځې 0 او 6 ورځې MTOS د زړه سلیزونو لپاره نمایشي عکسونه چې د troponin-T او NFATC4 لپاره معافیتي لیبل شوي او د NFATC4 د CMs (n = 4 (D0) ، 3 (D6 MTOS) ټوټې / ګروپ ته د NFATC4 لیږد مقدار اندازه کول د مختلف خنزیرونو څخه ترسره شوي. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS، иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4 FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0) , 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонный ; c په 0 او 6 ورځو کې د زړه د برخو لپاره نمایشي عکسونه MTOS، د troponin-T او NFATC4 لپاره امیونولابل شوي، او د غار حجرو په مرکز کې د NFATC4 لیږد اندازه کول (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) ټوټې/ډلې د دوه مختلف سورونو څخه ترسره شوي زده کونکي.* مخ <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) 、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <.0. c د calcanin-T او NFATC4 امیونولابلینګ 第0天和第6天MTOS د زړه ټوټې، او د NFATC4 څخه د مختلف NFATC4 易位至CM حجرو نیوکلیوس کمیت 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 延3 滈礄 (D0)،间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента؛ *p < 0,05). c په 0 او 6 کې د MTOS د زړه د ټوټې نمایندګي انځورونه د troponin-T او NFATC4 امونولابلینګ لپاره او د NFATC4 لیږدونې مقدار د CM په نیوکلیوس کې د مختلفو سورونو څخه (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسونه/گروپ، دوه-pcriter's.د تېروتنې بارونه د ± معیاري انحراف معنی څرګندوي.
د زړه د ژباړې څیړنه د سیلولر ماډلونو ته اړتیا لري چې په سمه توګه د زړه چاپیریال بیا تولید کړي.په دې څیړنه کې، د CTCM وسیله جوړه شوې او مشخص شوې چې کولی شي د زړه الټراټین برخې هڅوي.د CTCM سیسټم کې د فیزولوژیکي پلوه همغږي شوي الیکټرو میخانیکي محرک او T3 او Dex مایع غني کول شامل دي.کله چې د خنزیر زړه برخې د دې فکتورونو سره مخ شوې، د دوی وړتیا، ساختماني بشپړتیا، میټابولیک فعالیت، او د نقل کولو بیان د 12 ورځو کلتور وروسته د زړه په تازه نسج کې ورته پاتې شو.برسېره پردې، د زړه د نسج ډیر پراخیدل کولی شي د زړه د هایپرټروفي سبب شي چې د هایپر ایکسټینشن سبب کیږي.په ټولیز ډول، دا پایلې د نورمال زړه فینوټایپ ساتلو کې د فزیولوژیکي کلتور شرایطو مهم رول ملاتړ کوي او د درملو سکرینینګ لپاره پلیټ فارم چمتو کوي.
ډیری فکتورونه د کاردیو مایسایټس فعالیت او بقا لپاره د غوره چاپیریال رامینځته کولو کې مرسته کوي.د دې فکتورونو تر ټولو څرګند د (1) د انټر سیلولر تعاملاتو، (2) الکترو میخانیکي محرک، (3) هومورال عوامل، او (4) میټابولیک سبسټریټ پورې اړه لري.فزیولوژیکي حجرو څخه تر حجرو پورې تعاملات د ډیری حجرو ډولونو پیچلي درې اړخیز شبکې ته اړتیا لري چې د بهر حجرو میټرکس لخوا ملاتړ کیږي.دا ډول پیچلي سیلولر تعاملات د انفرادي حجرو ډولونو د ګډ کلتور په واسطه په ویټرو کې بیا رغول ستونزمن دي، مګر د زړه د برخو د ارګانوټیک طبیعت په کارولو سره په اسانۍ سره ترلاسه کیدی شي.
د کارتیو مایوسایټس میخانیکي اوږدوالی او بریښنایی محرک د زړه د فینوټایپ 33,34,35 ساتلو لپاره مهم دي.پداسې حال کې چې میخانیکي محرک په پراخه کچه د hiPSC-CM کنډیشن کولو او میټریشن لپاره کارول شوی ، ډیری په زړه پورې مطالعاتو پدې وروستیو کې په کلتور کې د غیر محیطي بار کولو په کارولو سره د زړه ټوټې میخانیکي محرک هڅه کړې.دا مطالعات ښیې چې د 2D یونیکسیل میخانیکي بار کول د کلتور په جریان کې د زړه په فینوټایپ مثبت اغیزه لري.په دې مطالعاتو کې، د زړه برخې یا د اسومیټریک ټینسیل ځواک17، لینیر آکسوټونک بار کولو 18 سره بار شوي، یا د زړه دوره د ځواک لیږدونکي فیډبیک او فشار ډرائیو په کارولو سره بیا جوړه شوې.په هرصورت، دا میتودونه د چاپیریال اصلاح کولو پرته غیر محیطي نسجونه کاروي، چې په پایله کې د ډیری زړه جینونو فشار یا د غیر معمولي اوږد غبرګون سره تړلي جینونو ډیر فشار دی.دلته تشریح شوی CTCM د 3D الکترو میخانیکي محرک چمتو کوي چې د سایکل وخت او فیزولوژیکي جریان (25٪ سټرچ، 40٪ سیسټول، 60٪ ډیسټول، او 72 بیټس په یوه دقیقه کې) په شرایطو کې د زړه طبیعي دورې تقلید کوي.که څه هم دا درې اړخیز میخانیکي محرک یوازې د نسج بشپړتیا ساتلو لپاره کافي ندي، د T3/Dex په کارولو سره د انساني او میخانیکي محرک ترکیب ته اړتیا ده ترڅو په مناسب ډول د نسج فعالیت، فعالیت او بشپړتیا وساتي.
طنزیه عوامل د بالغ زړه فینوټایپ په تعدیل کې مهم رول لوبوي.دا د HiPS-CM مطالعاتو کې په ګوته شوي چې پکې T3 او Dex د کلتور میډیا ته اضافه شوي ترڅو د حجرو پختوالي ګړندي کړي.T3 کولی شي د حجرو په غشا کې د امینو اسیدونو، شکرو او کلسیم په لیږد اغیزه وکړي36.برسېره پردې، T3 د MHC-α بیان او د MHC-β ښکته کولو ته وده ورکوي، د جنین په CM کې د سست ټویچ مایو فایبریلونو په پرتله په بالغ کارتیو مایوسایټس کې د چټک ټویچ مایو فایبریلونو رامینځته کولو ته وده ورکوي.د هايپوتايرايډ په ناروغانو کې د T3 کمښت د مايو فايبرلر بانډونو له لاسه ورکولو او د ټون د ودې د کمښت په نتيجه کې 37.ډیکس د ګلوکوکورټیکایډ ریسیپټرو باندې عمل کوي او ښودل شوي چې په جلا شوي عطرو زړونو کې د مایوکارډیال انقباض زیاتوي؛داسې انګیرل کیږي چې دا پرمختګ د کلسیم د زیرمو له لارې د ننوتلو (SOCE) 39,40 اغیزې پورې اړه لري.برسېره پردې، ډیکس په خپلو ریسیپټرو پورې تړلی دی، د پراخ انټرا سیلولر غبرګون لامل کیږي چې د معافیت فعالیت او سوزش فشاروي.
زموږ پایلې ښیي چې فزیکي میخانیکي محرک (MS) د Ctrl په پرتله د کلتور عمومي فعالیت ښه کړی، مګر په کلتور کې د 12 ورځو په اوږدو کې د وړتیا، جوړښت بشپړتیا، او د زړه بیان ساتلو کې پاتې راغلی.د Ctrl په پرتله، د CTCM (MT) کلتورونو ته د T3 او Dex اضافه کولو وړتیا ښه کړه او د 12 ورځو لپاره د زړه تازه نسج سره ورته لیږد پروفایلونه، ساختماني بشپړتیا، او میټابولیک فعالیت ساتل.برسېره پردې، د نسجونو د کچې د کنټرول په واسطه، د STCM په کارولو سره د هایپر ایکسټینشن هڅول شوي زړه هایپرټروفي ماډل رامینځته شوی، چې د STCM سیسټم استقامت څرګندوي.دا باید په پام کې ونیول شي چې که څه هم د زړه د بیا جوړونې او فایبرروسس معمولا په منظمه ارګانونو کې شامل وي چې د دوران حجرې کولی شي مناسب سایټوکینونه چمتو کړي او همدارنګه د فاګوسیتوس او نور بیا جوړونکي فکتورونه، د زړه برخې بیا هم کولی شي د فشار او صدماتو په ځواب کې د فایبروټیک پروسې نقل کړي.myofibroblasts ته.دا دمخه د دې کارتیک سلائس ماډل کې ارزول شوی.دا باید په پام کې ونیول شي چې د CTCM پیرامیټونه د فشار / بریښنایی طول او فریکونسۍ په بدلولو سره تنظیم کیدی شي ترڅو ډیری شرایط لکه ټیکی کارډیا، بریډی کارډیا، او میخانیکي دوراني ملاتړ (میخانیکي انلوډ شوی زړه).دا سیسټم د مخدره توکو د ازموینې لپاره منځنۍ وسیله جوړوي.د CTCM وړتیا د overexertion-حوصلې شوي زړه هایپرټروفي ماډل کولو لپاره د شخصي درملنې لپاره د دې سیسټم ازموینې لپاره لاره هواره کوي.په پایله کې، اوسنۍ څیړنه ښیي چې د زړه د نسجونو برخو د کلتور ساتلو لپاره میخانیکي فشار او مزاحیه محرک مهم دي.
که څه هم دلته وړاندې شوي معلومات وړاندیز کوي چې CTCM د انټیټ میوکارډیم ماډل کولو لپاره خورا امید لرونکی پلیټ فارم دی ، د کلتور دا میتود ځینې محدودیتونه لري.د CTCM کلتور اصلي محدودیت دا دی چې دا په سلیزو باندې دوامداره متحرک میخانیکي فشارونه تحمیلوي، کوم چې د هر دورې په جریان کې د زړه د ټوټې انقباض په فعاله توګه نظارت کولو وړتیا مخه نیسي.برسېره پردې، د زړه د برخو د کوچنۍ اندازې (7 ملي میتر) له امله، د دودیز ځواک سینسرونو په کارولو سره د کلتور سیسټمونو څخه بهر د سیسټولیک فعالیت ارزولو وړتیا محدوده ده.په اوسني نسخه کې، موږ په نسبي ډول د قراردادي فعالیت د شاخص په توګه د نظری ولتاژ ارزولو له لارې دا محدودیت له منځه یوسو.په هرصورت، دا محدودیت به نور کار ته اړتیا ولري او ممکن په راتلونکي کې په کلتور کې د زړه د ټوټې د فعالیت نظری نظارت لپاره میتودونو معرفي کولو سره حل شي، لکه د کلسیم او ولټاژ حساس رنګونو په کارولو سره نظری نقشه.د CTCM بل محدودیت دا دی چې کاري ماډل د فزیولوژیکي فشار (پریلوډ او وروسته بار) سره سمون نه خوري.په CTCM کې، فشار په مخالف لوري کې هڅول شوی و ترڅو په ډیرو لویو نسجونو کې ډیسټول (بشپړ سټرچ) او سیسټول (د بریښنایی محرک په وخت کې د انقباض اوږدوالی) کې 25٪ فیزولوژیکي سټرچ بیا تولید کړي.دا محدودیت باید په راتلونکي CTCM ډیزاینونو کې له دواړو خواوو څخه د زړه په نسج کې د کافي فشار او د فشار حجم دقیقو اړیکو پلي کولو سره چې د زړه په چیمبرونو کې پیښیږي لرې شي.
په دې نسخه کې راپور شوي overstretch-indused remodeling د هایپرټروفیک هایپرسټریچ سیګنالونو نقل کولو پورې محدود دی.په دې توګه، دا ماډل کولی شي د عصبي یا عصبي فکتورونو اړتیا پرته د اوږدمهاله هڅول شوي هایپرټروفیک سیګنال مطالعې کې مرسته وکړي (کوم چې پدې سیسټم کې شتون نلري).د CTCM ضرب الاجل زیاتولو لپاره نورو مطالعاتو ته اړتیا ده، د بیلګې په توګه، د معافیت حجرو سره ګډ کلتور، د پلازما هومورل فکتورونو گردش کول، او کله چې د عصبي حجرو سره ګډ کلتور کول به د CTCM سره د ناروغۍ ماډل کولو امکانات ښه کړي.
په دې څیړنه کې ديارلس خنزيرونه کارول شوي.د څارویو ټول پروسیجرونه د اداری لارښوونو سره سم ترسره شوي او د لوئس ویل پوهنتون لخوا د څارویو د پاملرنې او کارونې کمیټې لخوا تصویب شوي.د شریان محراب بند شوی و او زړه د 1 لیتر جراثیمي کارتیوپلجیا سره خوشبو شوی و (110 mM NaCl، 1.2 mM CaCl2، 16 mM KCl، 16 mM MgCl2، 10 mM NaHCO3، 5 U/mL هیپرین، pH تر 7 پورې)؛ زړونه د یخ په یخ دلال محلول کې ساتل شوي تر هغه چې لابراتوار ته په یخ کې لیږدول کیږي کوم چې معمولا <10 دقیقې وي. زړونه د یخ په یخ دلال محلول کې ساتل شوي تر هغه چې لابراتوار ته په یخ کې لیږدول کیږي کوم چې معمولا <10 دقیقې وي. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. زړونه د یخ په یخ کاردیولوجیک محلول کې زیرمه شوي ترڅو لابراتوار ته په یخ کې لیږدول شي، کوم چې معمولا <10 دقیقې وخت نیسي.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. زړونه په یخ کې وساتئ تر هغه چې لابراتوار ته په یخ کې لیږدول کیږي، معمولا <10 دقیقې.
د CTCM وسیله د سولیډ ورکس کمپیوټر په مرسته ډیزاین (CAD) سافټویر کې رامینځته شوې.د کلتور خونې، ویشونکي او هوایی چیمبرونه د CNC روښانه اکریلیک پلاستيک څخه جوړ شوي دي.د 7mm قطر بیک اپ حلقه په مرکز کې د لوړ کثافت پالیتیلین (HDPE) څخه جوړه شوې او د سیلیکون o-ring د ځای په ځای کولو لپاره د o-ring نالی لري چې د لاندې میډیا مهر کولو لپاره کارول کیږي.یو پتلی سیلیکا جھلی د کلتور چیمبر د جلا کولو پلیټ څخه جلا کوي.د سیلیکون جھلی د 0.02 انچ موټی سیلیکون شیټ څخه لیزر کټ شوی او د 35A سختی لري.لاندې او پورتنۍ سیلیکون ګاسکیټونه د 1/16 انچ موټی سیلیکون شیټ څخه لیزر کټ شوي او د 50A سختۍ لري.د 316L سټینلیس سټیل پیچونه او د وزر مغز د بلاک ګړندي کولو او د هوا بند مهر رامینځته کولو لپاره کارول کیږي.
یو وقف شوی چاپ شوی سرکټ بورډ (PCB) د C-PACE-EM سیسټم سره مدغم کولو لپاره ډیزاین شوی.په PCB کې د سویس ماشین نښلونکي ساکټونه د ګرافیت الکترودونو سره د سپینو زرو پلیټ شوي مسو تارونو او د برونزو 0-60 پیچونو سره وصل شوي دي چې په الکترودونو کې پیچل شوي.چاپ شوی سرکټ بورډ د 3D پرنټر پوښ کې ځای پرځای شوی.
د CTCM وسیله د برنامه وړ نیوماتیک عمل کونکي (PPD) لخوا کنټرول کیږي چې د زړه د دورې په څیر کنټرول شوي دوراني فشار رامینځته کوي.لکه څنګه چې د هوا په خونه کې دننه فشار زیاتیږي، د انعطاف وړ سیلیکون غشا پورته پراخیږي، د نسج سایټ لاندې منځنی مجبوروي.د نسج ساحه به بیا د مایع د دې اخراج په واسطه پراخه شي، د ډیسټول په جریان کې د زړه فزیولوژیکي پراخوالی نقل کوي.د آرامۍ په چوکۍ کې، بریښنایی محرک د ګرافیت الکترودونو له لارې تطبیق شوی و، کوم چې د هوا په خونه کې فشار کم کړ او د نسجونو برخو انقباض سبب شو.د پایپ دننه د فشار سینسر سره یو هیموسټاټیک والو دی ترڅو د هوا سیسټم کې فشار کشف کړي.د فشار سینسر لخوا احساس شوی فشار د لیپ ټاپ سره وصل شوي ډیټا راټولونکي باندې پلي کیږي.دا د ګاز چیمبر دننه د فشار دوامداره څارنې ته اجازه ورکوي.کله چې د چیمبر اعظمي فشار ته ورسید (معیاري 80 mmHg، 140 mmHg OS)، د معلوماتو ترلاسه کولو وسیلې ته امر شوی و چې د C-PACE-EM سیسټم ته سیګنال واستوي ترڅو د 2 ms لپاره د بایفاسیک ولټاژ سیګنال رامینځته کړي ، چې 4 V ته ټاکل شوی.
د زړه برخې ترلاسه شوي او په 6 څاګانو کې د کلتور شرایط په لاندې ډول ترسره شوي: د لیږد شوي کڅوړې څخه راټول شوي زړونه د یخ (4 درجې سانتي ګراد) کارتیوپلجیا سره یو ټری ته انتقال کړئ.کیڼ وینټریکل د جراثیمي تیغ سره جلا شوی او د 1-2 سانتي مترو په ټوټو کې پرې شوی.دا نسج بلاکونه د نسجونو ملاتړ سره د نسج چپکونکي سره وصل شوي او په یو متحرک مایکروټوم نسج حمام کې ځای په ځای شوي چې د Tyrode محلول لري او په دوامداره توګه اکسیجن شوی (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM)، 140 mM NaCl (8.18 g)، m.6M4-m.4g (m.18 g)، D.18 g. لوکوز (1.86 g)، 10 mM HEPES (2.38 g)، 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M محلول)، 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M محلول)، تر 1 L ddH2O).خوځنده مایکروټوم د 80 Hz په فریکونسۍ کې د 300 µm ضخامت ټوټې پرې کولو لپاره ټاکل شوی و ، د 2 mm افقی کمپن طول ، او د 0.03 mm/s مخکینۍ کچه.د نسج حمام د یخ په واسطه محاصره شوی ترڅو محلول یخ وساتي او تودوخه په 4 درجې سانتي ګراد کې وساتل شي.د نسجونو برخې د مایکروټوم حمام څخه یو انکیوبیشن حمام ته انتقال کړئ چې په یخ کې په دوامداره توګه اکسیجن شوي ټایرایډ محلول لري تر هغه چې د یو کلتور پلیټ لپاره کافي برخې ترلاسه نشي.د ټرانس ویل کلتورونو لپاره، د نسج برخې د جراثیمي 6 ملي میتر پراخ پولیوریتین ملاتړ سره وصل شوي او په 6 ملی لیتر مطلوب متوسط ​​​​کې ځای په ځای شوي (199 متوسطه، 1x ITS ضمیمه، 10٪ FBS، 5 ng/ml VEGF، 10 ng/ml FGF-alkaline او 2.بریښنایی محرک (10 V، فریکونسۍ 1.2 Hz) د C-Pace له لارې د نسج برخو کې پلي شوی.د TD شرایطو لپاره، تازه T3 او Dex په هر متوسط ​​​​بدلون کې په 100 nM او 1 μM کې اضافه شوي.منځنی په ورځ کې 3 ځله د بدلولو دمخه د اکسیجن سره ډک شوی.د نسج برخې په انکیوبیټر کې په 37 ° C او 5٪ CO2 کې کرل شوي.
د CTCM کلتورونو لپاره، د نسج برخې په پیټري ډش کې په دودیز جوړ شوي 3D پرنټر کې ځای پرځای شوي چې د ترمیم شوي Tyrode محلول لري.وسیله ډیزاین شوې ترڅو د زړه د ټوټې اندازه د ملاتړ حلقې ساحې 25٪ ته لوړه کړي.دا د دې لپاره ترسره کیږي چې د زړه برخې د Tyrode محلول څخه منځني او د ډیسټول په جریان کې د لیږدولو وروسته پراخ نشي.د هسټو اکریلیک ګلو په کارولو سره ، برخې 300 µm ضخامت په ملاتړ حلقه کې 7 mm قطر کې تنظیم شوي.د ملاتړ حلقې ته د نسجونو برخې له نښلولو وروسته، د نسج اضافي برخې پرې کړئ او د نسج تړل شوي برخې بیرته په یخ (4°C) کې د تایروډ محلول حمام کې ځای په ځای کړئ تر هغه چې د یوې وسیلې لپاره کافي برخې چمتو شوي نه وي.د ټولو وسیلو لپاره د پروسس کولو ټول وخت باید له 2 ساعتونو څخه ډیر نه وي.وروسته له دې چې د 6 نسج برخې د دوی د ملاتړ حلقو سره وصل شوي، د CTCM وسیله راټول شوه.د CTCM کلتور خونه د 21 ملی لیتر پری اکسیجن شوي متوسط ​​​​سره دمخه ډکه شوې.د نسج برخې د کلتور خونې ته انتقال کړئ او په احتیاط سره د پایپټ سره هر ډول هوایی بلبلونه لرې کړئ.د نسج برخه بیا سوري ته لارښود کیږي او په نرمۍ سره په ځای کې فشار ورکول کیږي.په نهایت کې ، د الیکټروډ کیپ په وسیله کې ځای په ځای کړئ او وسیله انکیوبټر ته انتقال کړئ.بیا CTCM د هوا ټیوب او C-PACE-EM سیسټم سره وصل کړئ.نیوماتیک عمل کوونکی خلاصیږي او د هوا والو CTCM خلاصوي.د C-PACE-EM سیسټم د 2 ms لپاره د بایفاسیک پیینګ په جریان کې په 1.2 Hz کې 4 V وړاندې کولو لپاره ترتیب شوی و.منځنۍ په ورځ کې دوه ځله بدله شوې او الیکټروډونه په ورځ کې یو ځل بدل شوي ترڅو په الکترودونو کې د ګرافیت راټولیدو مخه ونیسي.که اړتیا وي، د نسج برخې د دوی د کلتور څاګانو څخه لیرې کیدی شي ترڅو هر هغه هوایی بلبلونه لرې کړي چې ممکن د دوی لاندې راوتلي وي.د MT درملنې شرایطو لپاره، T3/Dex د هر متوسط ​​​​بدلون سره د 100 nM T3 او 1 μM Dex سره تازه اضافه شوي.د CTCM وسایل په 37°C او 5% CO2 کې په انکیوبیټر کې کرل شوي.
د زړه د ټوټو د غځیدلو لارو ترلاسه کولو لپاره، یو ځانګړی کیمرې سیسټم رامینځته شوی.د SLR کیمره (کینن ریبل T7i، کینن، توکیو، جاپان) د Navitar زوم 7000 18-108mm میکرو لینز (Navitar، San Francisco, CA) سره کارول شوی.لید د خونې په تودوخې کې ترسره شو وروسته له دې چې د تازه متوسط ​​​​سره منځنۍ ځای پرځای شي.کیمره په 51 درجې زاویه کې موقعیت لري او ویډیو په 30 فریمونو کې په ثانیه کې ثبت کیږي.لومړی، د خلاصې سرچینې سافټویر (MUSCLEMOTION43) د انځور-J سره کارول شوی ترڅو د زړه ټوټې حرکت اندازه کړي.ماسک د MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) په کارولو سره رامینځته شوی ترڅو د شور څخه مخنیوي لپاره د زړه ټوټې وهلو لپاره د علاقې وړ سیمې تعریف کړي.په لاسي ډول قطع شوي ماسکونه په ټولو عکسونو کې د چوکاټ ترتیب کې پلي کیږي او بیا د MUSCLEMOTION پلگ ان ته لیږدول کیږي.د عضلاتو حرکت په هر چوکاټ کې د پکسل اوسط شدت کاروي ترڅو د حوالې چوکاټ سره د دې حرکت اندازه کړي.ډاټا ثبت شوي، فلټر شوي او د دورې وخت اندازه کولو لپاره کارول شوي او د زړه د دورې په جریان کې د نسجونو اندازه ارزوي.ثبت شوې ویډیو د لومړي ترتیب صفر مرحلې ډیجیټل فلټر په کارولو سره وروسته پروسس شوې.د نسجونو اندازه اندازه کولو لپاره (د چوټي څخه تر چوکۍ)، په ثبت شوي سیګنال کې د چوټیو او کنډونو ترمنځ توپیر کولو لپاره د چوکۍ څخه تر چوکۍ تحلیل ترسره شو.برسېره پردې، د سیګنال ډریف له مینځه وړلو لپاره د 6th ترتیب پولینومیل په کارولو سره مخنیوی ترسره کیږي.د پروګرام کوډ په MATLAB کې د نړیوال نسج حرکت، د سایکل وخت، د آرام کولو وخت، او د انقباض وخت ټاکلو لپاره رامینځته شوی و (د اضافي پروګرام کوډ 44).
د فشار تحلیل لپاره، د ورته ویډیوګانو په کارولو سره چې د میخانیکي پراخې ارزونې لپاره رامینځته شوي، موږ لومړی د MUSCLEMOTION سافټویر سره سم دوه عکسونه د حرکت چوکۍ (لوړ (پورته) او ټیټ (ټیټ) نقطې نمایندګي کړي.بیا مو د نسجونو سیمې طبقه کړې او د سیډینګ الګوریتم بڼه مو په قطع شوي نسج کې تطبیق کړه (اضافی شکل 2a).بیا منحل شوي نسج په لسو فرعي سطحونو ویشل شوي، او د هرې سطحې فشار د لاندې معادلو په کارولو سره محاسبه شوی: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown، چیرته چې Sup او Sdown په ترتیب سره د پوښاک د پورتنۍ او ښکته سیوري څخه د شکل فاصله ده (اضافی شکل. 2b).
د زړه برخې د ۴۸ ساعتونو لپاره په ۴٪ پارافارمالډیهایډ کې تنظیم شوې وې.ثابت نسجونه د 1 ساعت لپاره په 10٪ او 20٪ سوکروز کې ډیهایډریټ شوي، بیا د شپې په 30٪ سوکروز کې.هغه برخې بیا د غوره تودوخې د تودوخې مرکب (OCT مرکب) کې ځای په ځای شوي او په تدریجي ډول په اسوپنټین / وچ یخ حمام کې کنګل شوي.د OCT سرایت کولو بلاکونه تر جلا کیدو پورې په -80 ° C کې ذخیره کړئ.سلایډونه د 8 μm ضخامت سره د برخو په توګه چمتو شوي.
د زړه له برخو څخه د OCT لرې کولو لپاره ، سلایډونه د تودوخې بلاک کې په 95 ° C کې د 5 دقیقو لپاره ګرم کړئ.په هر سلایډ کې 1 ملی لیتر PBS اضافه کړئ او د خونې په حرارت کې د 30 دقیقو لپاره سینګار کړئ، بیا د خونې په حرارت کې د 15 دقیقو لپاره په PBS کې د 0.1% Triton-X په ترتیب کولو سره برخې پریمینټ کړئ.د دې لپاره چې غیر مشخص انټي باډي نمونې ته د پابندۍ مخه ونیسي، په سلایډونو کې 1 ملی لیتر 3٪ BSA محلول اضافه کړئ او د خونې په تودوخې کې د 1 ساعت لپاره انکیوب کړئ.بیا BSA لیرې شو او سلایډونه د PBS سره مینځل شوي.هر نمونه د پنسل سره نښه کړئ.لومړني انټي باډي (په 1% BSA کې 1:200 منحل شوي) (connexin 43 (Abcam؛ #AB11370)، NFATC4 (Abcam؛ #AB99431) او troponin-T (Thermo Scientific؛ #MA5-12960) د 90 دقیقو په اوږدو کې اضافه شوي، بیا د BSA په مقابل کې د دوهم انټي باډي کارول شوي (د 1% BSA په مقابل کې) Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079)، د خرگوش الیکسا فلور 594 (Thermo Scientific؛ #T6391) په وړاندې د 90 دقیقو لپاره د PBS سره 3 ځله مینځل شوی ترڅو د شالید څخه د هدف داغ توپیر وکړي، موږ یوازې ثانوي انټي باډي د کنټرول په توګه کارولې. په پای کې، د اتومي ویکټیډیا (Vindieldes) ځای په ځای شوی و. لابراتوارونه) او د نیل پالش سره مهر شوي. -x میګنیفیکیشن) او کیینس مایکروسکوپ د 40x لویوالي سره.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific؛ #W32464) په PBS کې په 5 μg/ml کې د WGA داغ لپاره کارول شوی او د خونې په حرارت کې د 30 دقیقو لپاره په ثابت برخو کې پلي شوی.سلایډونه بیا د PBS سره مینځل شوي او د سوډان تور په هر سلایډ کې اضافه شوي او د 30 دقیقو لپاره مینځل شوي.سلایډونه بیا د PBS سره مینځل شوي او د ویکټشیلډ امبیډینګ میډیم اضافه شوی.سلایډونه په کیینس مایکروسکوپ کې په 40x میګنیفیکیشن کې لیدل شوي.
OCT د نمونو څخه لیرې شوی لکه څنګه چې پورته تشریح شوي.د OCT لرې کولو وروسته ، سلایډونه د شپې په بوین محلول کې ډوب کړئ.بیا سلایډونه د 1 ساعت لپاره د مینځلو اوبو سره مینځل شوي او بیا د 10 دقیقو لپاره د ببریچ ایلو اسید فوچسین محلول کې کیښودل شوي.بیا سلایډونه د منحل شویو اوبو سره مینځل شوي او د 5٪ فاسفومولیبډینم / 5٪ فاسفوتنګسټیک اسید په محلول کې د 10 دقیقو لپاره کیښودل شوي.پرته له مینځلو څخه، سلایډونه د 15 دقیقو لپاره مستقیم انلین نیلي محلول ته انتقال کړئ.بیا سلایډونه د مینځلو اوبو سره مینځل شوي او د 1٪ اسټیک اسید محلول کې د 2 دقیقو لپاره کیښودل شوي.سلایډونه په 200 N ایتانول کې وچ شوي او xylene ته لیږدول شوي.داغ شوي سلایډونه د کیینس مایکروسکوپ په کارولو سره د 10x هدف سره لیدل شوي.د فایبروسیس ساحې سلنه د کیینس تحلیل کونکي سافټویر په کارولو سره اندازه شوې.
CyQUANT™ د MTT حجرې د وړتیا ارزونه (انویټروجن، کارلسباد، CA)، د کتلاګ شمیره V13154، د ځینې بدلونونو سره د تولید کونکي پروتوکول مطابق.په ځانګړې توګه، د MTT تحلیل په جریان کې د یونیفورم نسج اندازه ډاډمن کولو لپاره د 6 ملي میتر قطر سره یو جراحي پنچ کارول شوی و.نسجونه په انفرادي ډول د جوړونکي پروتوکول سره سم د MTT سبسټریټ لرونکي 12 څاه پلیټ څاه ګانو کې اچول شوي.برخې د ۳ ساعتونو لپاره په ۳۷ درجو سانتي ګراد کې انبیل کیږي او ژوندی نسج د MTT سبسټریټ میټابولیز کوي ترڅو ارغواني فورمزان مرکب جوړ کړي.د MTT محلول د 1 ملی لیتر DMSO سره بدل کړئ او د 15 دقیقو لپاره په 37 سانتي ګراد کې د زړه له برخو څخه ارغواني فورمزان راوباسئ.نمونې 1:10 په DMSO کې په 96 ښه روښانه لاندې پلیټونو کې او د ارغواني رنګ شدت په 570 nm اندازه شوي د سایټیشن پلیټ ریډر (BioTek) په کارولو سره.لوستل د زړه د هرې ټوټې وزن ته نورمال شوي.
د زړه ټوټې میډیا د میډیا سره بدله شوې چې 1 μCi/ml [5-3H] - ګلوکوز (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) د ګلوکوز کارولو ارزونې لپاره لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي.د انکیوبیشن 4 ساعته وروسته، 100 µl متوسطه په خلاص مایکرو سینټرفیوج ټیوب کې اضافه کړئ چې 100 µl 0.2 N HCl لري.بیا ټیوب په یوه سینټیلیشن ټیوب کې کیښودل شو چې 500 μl dH2O لري ترڅو د 37 درجې سانتي ګراد په حرارت کې د 72 ساعتونو لپاره [3H]2O بخار شي.بیا د مایکرو سینټریفوج ټیوب د سینټیلیشن ټیوب څخه لیرې کړئ او 10 ملی لیتر سکینټیلیشن مایع اضافه کړئ.د سکنټیلیشن شمیرې د Tri-Carb 2900TR مایع سکینټیلیشن تحلیل کونکي (پیکارډ بایوسینس شرکت، میرډین، CT، USA) په کارولو سره ترسره شوي.بیا د ګلوکوز کارول محاسبه شوي [5-3H] - د ګلوکوز ځانګړي فعالیت ، نامکمل توازن او شالید ، د [5-3H] کمول - د لیبل نه شوي ګلوکوز ته ، او د سینټیلیشن ضد موثریت.معلومات د زړه د برخو په ډله کې نورمال شوي دي.
په Trizol کې د نسجونو همغږي کولو وروسته، RNA د تولید کونکي پروتوکول مطابق د Qiagen miRNeasy مایکرو کټ #210874 په کارولو سره د زړه له برخو څخه جلا شو.د RNAsec کتابتون چمتو کول، ترتیب کول او د معلوماتو تحلیل په لاندې ډول ترسره شوي:
په هر نمونه کې 1 μg RNA د RNA کتابتون د چمتو کولو لپاره د پیل شوي موادو په توګه کارول کیده.د ترتیب کولو کتابتونونه د تولید کونکي وړاندیزونو په تعقیب د Illumina (NEB, USA) لپاره د NEBNext UltraTM RNA کتابتون چمتو کولو کټ په کارولو سره رامینځته شوي ، او د هرې نمونې لپاره د ځانګړتیاو ترتیبونو کې د شاخص کوډونه اضافه شوي.په لنډه توګه، mRNA له ټول RNA څخه پاک شوی و چې د پولی-T oligonucleotides سره نښلول شوي مقناطیسي موتی په کارولو سره.ټوټې کول په NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) کې په لوړه تودوخې کې د divalent cations په کارولو سره ترسره کیږي.لومړی سټینډ cDNA د تصادفي هیکسامر پریمرونو او M-MuLV ریورس ټرانسکریټیس (RNase H-) په کارولو سره ترکیب شوی و.دوهم سټرینډ cDNA بیا د DNA پولیمیریز I او RNase H په کارولو سره ترکیب کیږي. پاتې اوورنګونه د exonuclease/polymerase فعالیت په واسطه په بلنټ سرونو بدلیږي.د DNA ټوټې د 3′ پای ته رسیدو وروسته، د NEBNext اډاپټر د ویښتو لوپ جوړښت سره نښلول کیږي ترڅو دا د هایبرډیزیشن لپاره چمتو کړي.د غوره شوي اوږدوالی 150-200 bp د cDNA ټوټې انتخاب لپاره.د کتابتون ټوټې د AMPure XP سیسټم (بیکمن کولټر، بیورلي، USA) په کارولو سره پاکې شوې.بیا، 3 μl USER انزایم (NEB, USA) د اندازې ټاکل شوي cDNA سره د اډاپټر سره تړل شوي د 15 دقیقو لپاره په 37 درجې C او بیا د 5 دقیقو لپاره په 95 ° C کې د PCR دمخه کارول شوي.PCR بیا د Phusion High-Fidelity DNA پولیمریز، یونیورسل PCR پریمر، او Index (X) پریمرونو په کارولو سره ترسره شو.په نهایت کې، د PCR محصولات پاک شوي (AMPure XP سیسټم) او د کتابتون کیفیت د Agilent Bioanalyzer 2100 سیسټم کې ارزول شوی.د cDNA کتابتون بیا د نواسیک سیکوینسر په کارولو سره ترتیب شوی و.د Illumina څخه خام عکس فایلونه د CASAVA بیس کالینګ په کارولو سره خام لوستلو ته بدل شوي.خام معلومات د FASTQ (fq) فارمیټ فایلونو کې زیرمه شوي چې د لوستلو ترتیبونه او اړونده اساس خصوصیات لري.د Sscrofa11.1 حوالې جینوم ته د فلټر شوي ترتیب لوستلو سره سمون لپاره HISAT2 غوره کړئ.په عموم کې، HISAT2 د هرې اندازې جینومونو ملاتړ کوي، په شمول د 4 ملیارد اډو څخه لوی جینومونه، او د ډیری پیرامیټونو لپاره ډیفالټ ارزښتونه ټاکل شوي.د RNA Seq ډیټا څخه د لوستلو جلا کول د HISAT2 په کارولو سره په مؤثره توګه تنظیم کیدی شي ، چې اوس مهال موجود ترټولو ګړندی سیسټم دی ، د نورو میتودونو په پرتله ورته یا غوره دقت سره.
د نقلونو کثرت په مستقیم ډول د جین بیان کچه منعکس کوي.د جین د بیان کچه د جینوم یا exons سره تړلې د لیږدونو (د ترتیب شمیره) د کثرت له مخې ارزول کیږي.د لوستلو شمیر د جین بیان کچې، د جین اوږدوالی، او د ترتیب ژوروالی سره متناسب دی.FPKM (په هر ملیون بیس پیړۍ کې د ټرانسکریپټ ترتیب شوي هر زره بیس جوړه ټوټې) محاسبه شوي او د توپیر څرګندولو P-ارزښتونه د DESeq2 کڅوړې په کارولو سره ټاکل شوي.بیا موږ د هر P ارزښت لپاره د غلط کشف نرخ (FDR) محاسبه کړه چې د بینجمني-هوکبرګ میتود9 په کارولو سره د جوړ شوي R-فنکشن "p.adjust" پراساس.
د زړه له برخو څخه جلا شوی RNA د 200 ng/μl په غلظت کې د ترمو څخه د سوپر سکریپټ IV Vilo ماسټر مکس په کارولو سره cDNA ته بدل شو (Thermo, cat. no. 11756050).مقداري RT-PCR د اپل شوي بایو سیسټم انډورا پلیټ مایکرومپ 384-څاه لرونکي شفاف عکس العمل پلیټ (ترمو، بلی نمبر 4483319) او مایکرومپ آپټیکل چپکونکي (ترمو، بلی نمبر 4311971) په کارولو سره ترسره شوی.د عکس العمل مخلوط په هر څاه کې 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer او 3.5 µl H2O په هر څاه کې مخلوط شوي.د معیاري qPCR دورې چلول شوي او د CT ارزښتونه د اپل شوي بایو سیسټم Quantstudio 5 ریښتیني وخت PCR وسیلې په کارولو سره اندازه شوي (384 - ښه ماډل؛ محصول # A28135).د تاقمان پرائمر له Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1)، PARP12 (Ss06908795_m1)، PKDCC (Ss06903874_m1)، CYGB (Ss06900188_m1)، RGL1 (Ss0810188_m1)، RGL1 (Ss081019_ACT) څخه اخیستل شوي 8_mH)، GATA4 (Ss03383805_u1)، GJA1 (Ss03374839_u1)، COL1A2 (Ss03375009_u1)، COL3A1 (Ss04323794_m1)، ACTA2 (Ss042415) د ټولو نمونو کورونو ته د Ss042415 نمونې ارزښت ورکړل شوي. e GAPDH.
د NT-ProBNP میډیا خوشې کول د NT-ProBNP کټ (سور) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) په کارولو سره د تولید کونکي پروتوکول سره سم ارزول شوي.په لنډه توګه، د هرې نمونې 250 μl او معیار په نقل کې هرې څاه ته اضافه شوي.د نمونې له اضافه کولو سمدستي وروسته، هر څاه ته 50 µl Assay Reagent A اضافه کړئ.په نرمۍ سره پلیټ ووهئ او د سیلانټ سره مهر کړئ.بیا ټابلیټونه د یو ساعت لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې کیښودل شول.بیا محلول 4 ځله د 350 µl 1X واش محلول سره ومینځئ، هر ځل د 1-2 دقیقو لپاره د مینځلو محلول وینځئ.بیا په هر څاه کې 100 µl Assay Reagent B اضافه کړئ او د پلیټ سیلنټ سره مهر کړئ.ټابلیټ په نرمۍ سره په 37 درجې سانتي ګراد کې د 30 دقیقو لپاره کیښودل شو.محلول اسپریټ کړئ او څاه 5 ځله د 350 µl 1X واش محلول سره وینځئ.هر څاه ته 90 μl سبسټریټ محلول اضافه کړئ او پلیټ مهر کړئ.پلیټ د 10-20 دقیقو لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې وینځئ.هر څاه ته 50 μl Stop محلول اضافه کړئ.پلیټ سمدلاسه د Cytation (BioTek) پلیټ ریډر په کارولو سره اندازه شوی و چې په 450 nm کې ټاکل شوی.
د بریښنا تحلیلونه د ګروپ اندازې غوره کولو لپاره ترسره شوي کوم چې د 5٪ ډول I غلطۍ نرخ سره په پیرامیټر کې د 10٪ مطلق بدلون موندلو لپاره> 80٪ ځواک چمتو کوي. د بریښنا تحلیلونه د ګروپ اندازې غوره کولو لپاره ترسره شوي کوم چې د 5٪ ډول I غلطۍ نرخ سره په پیرامیټر کې د 10٪ مطلق بدلون موندلو لپاره> 80٪ ځواک چمتو کوي. اناالیز мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения для обнаружения 10% абнаружения с 5٪ частотой ошибок типа I. د بریښنا تحلیل د ګروپ اندازې غوره کولو لپاره ترسره شوی چې د 5٪ ډول I غلطۍ نرخ سره د 10٪ مطلق پیرامیټر بدلون موندلو لپاره > 80٪ ځواک چمتو کوي.دیدی Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% етров и 5% частоты ошибок типа I. د بریښنا تحلیل د یوې ډلې اندازې غوره کولو لپاره ترسره شوی چې د 10٪ مطلق پیرامیټر بدلون او 5٪ ډول I غلطۍ نرخ موندلو لپاره 80٪ ځواک چمتو کوي.د نسج برخې په تصادفي ډول د تجربې دمخه غوره شوي.ټول تحلیلونه ړوند حالت وو او نمونې یوازې وروسته له دې چې ټول معلومات تحلیل شوي و کوډ شوي.د ګراف پیډ پریزم سافټویر (سان ډیاګو، CA) د ټولو احصایوي تحلیلونو ترسره کولو لپاره کارول شوی و. د ټولو احصایو لپاره، p-values ​​په ارزښتونو <0.05 د پام وړ وګڼل شول. د ټولو احصایو لپاره، p-values ​​په ارزښتونو <0.05 کې د پام وړ ګڼل شوي. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. د ټولو احصایو لپاره، p-values ​​په ارزښتونو <0.05 کې د پام وړ ګڼل شوي.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. د ټولو احصایو لپاره، p-values ​​په ارزښتونو <0.05 کې د پام وړ ګڼل شوي.د دوه مخی زده کونکي ټیسټ په ډیټا کې یوازې د 2 پرتله کولو سره ترسره شوی.یو طرفه یا دوه طرفه ANOVA د څو ډلو ترمنځ د اهمیت معلومولو لپاره کارول کیده.کله چې د هاک پوسټ ازموینې ترسره کول، د توکی سمون د ډیری پرتله کولو حساب لپاره پلي شوی و.د RNAsec ډاټا ځانګړي احصایوي نظرونه لري کله چې د FDR او p.adjust محاسبه کول لکه څنګه چې د میتودونو برخه کې تشریح شوي.
د مطالعې ډیزاین په اړه د لا زیاتو معلوماتو لپاره، د دې مقالې سره تړلی د طبیعت څیړنې راپور لنډیز وګورئ.