د Nature.com د لیدنې لپاره مننه. هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ). په عین حال کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه وړاندې کړو.
د جوارو په سټور کې د دوامداره اولیګوساکرایډونو پیچلي تحلیل لپاره نوي معافیتي او ډله ایز سپیکٹرومیټریک میتودونه چې د AFEX سره مخکې درملنه شوي. لیګنوسیلوزیک بایوماس د فوسیل سونګ توکو لپاره یو دوامداره بدیل دی او په پراخه کچه د خواړو، خواړو، سونګ توکو او کیمیاوي موادو په څیر محصولاتو تولید لپاره د بایو ټیکنالوژیو پراختیا لپاره کارول کیږي. د دې ټیکنالوژیو کلیدي د نباتاتو د حجرو دیوالونو کې موجود پیچلي کاربوهایډریټونه په ساده شکرو لکه ګلوکوز، زایلوز او عربینوز بدلولو لپاره د لګښت سیالۍ پروسو پراختیا ده. ځکه چې لیګنوسیلوزیک بایوماس خورا ضد دی، دا باید د مطلوب محصول ترلاسه کولو لپاره د ترمو کیمیکل درملنې (د مثال په توګه، د امونیا فایبر ایکسفولیشن (AFEX)، ډیلویټ اسیدونه (DA)، ایونیک مایعات (IL)) او بیولوژیکي درملنې (د مثال په توګه، انزیماتیک هایدرولیسس او مایکروبیل تخمر) سره په ترکیب کې مخ شي. . په هرصورت، کله چې سوداګریز فنګسي انزایمونه د هایدرولیسس پروسې کې کارول کیږي، یوازې 75-85٪ محلول شوي شکرونه مونوساکرایډونه دي، او پاتې 15-25٪ محلول شوي، غیر فعال اولیګوساکرایډونه دي، کوم چې تل د مایکرو ارګانیزمونو لپاره شتون نلري. مخکې، موږ په بریالیتوب سره د کاربن او ډایټوماسیوس ځمکې جلا کولو او د اندازې جلا کولو کروماتګرافي ترکیب په کارولو سره محلول ضد اولیګوساکرایډونه جلا او پاک کړي دي، او د دوی د انزایم مخنیوي ملکیتونه هم څیړلي دي. موږ موندلي چې اولیګوساکرایډونه چې د پولیمرائزیشن (DP) میتیلیټ شوي یورونیک اسید بدیلونه لري د ټیټ DP او غیر جانبدار اولیګوساکرایډونو په پرتله د سوداګریز انزایم مخلوطونو سره پروسس کول خورا ستونزمن دي. دلته موږ د څو اضافي میتودونو کارولو راپور ورکوو، پشمول د ګلایکان پروفایل کول د مونوکلونل انټي باډیز (mAbs) په کارولو سره چې د نبات بایوماس ګلایکانونو لپاره ځانګړي دي ترڅو د نبات حجرو دیوالونو او انزیماتیک هایدرولیسیټونو کې ګلایکان بانډونه مشخص کړي، د میټریکس په مرسته لیزر ډیسورپشن آیونیزیشن، د الوتنې وخت ډله ایز سپیکٹرومیټري. (MALDI-TOF-MS) د منفي ایونونو، ګاز کروماتګرافي او ډله ایز سپیکٹرومیټري (GC-MS) د ثانوي تخریب وروسته د سپیکٹروسکوپي لخوا ترلاسه شوي جوړښت-معلوماتي تشخیصي چوټې کاروي ترڅو د مشتق کولو سره او پرته له دې د اولیګوساکرایډ بانډونو ځانګړتیا وکړي. د اولیګوساکرایډونو کوچنۍ اندازې (DP 4-20) له امله، دا مالیکولونه د mAb تړلو او ځانګړتیا لپاره کارول ستونزمن دي. د دې ستونزې د لرې کولو لپاره، موږ د بایوټین کنجوګیشن پر بنسټ د اولیګوساکرایډ غیر متحرک کولو نوې طریقه پلي کړه چې په بریالیتوب سره د مایکروپلیټ سطحې باندې د ټیټ DP محلول شوي اولیګوساکرایډونو اکثریت لیبل کړ، کوم چې بیا د ځانګړي تړلو تحلیل لپاره د لوړ تروپټ mAb سیسټم کې کارول کیده. دا نوې طریقه به په راتلونکي کې د ډیرو پرمختللي لوړ تروپټ ګلایکوم ازموینو پراختیا اسانه کړي چې د تشخیصي موخو لپاره په بایومارکرونو کې موجود اولیګوساکرایډونو جلا کولو او ځانګړتیا لپاره کارول کیدی شي.
لیګنوسیلوزیک بایوماس، چې د کرنې، ځنګلونو، واښو او لرګیو موادو څخه جوړ شوی، د بایو پر بنسټ محصولاتو تولید لپاره یو احتمالي تغذیه ده، پشمول د خوړو، خواړو، سونګ او کیمیاوي مخکینیو محصولاتو تولید لپاره. د نباتاتو د حجرو دیوالونو کې موجود کاربوهایډریټ (لکه سیلولوز او هیمی سیلولوز) د کیمیاوي پروسس او بایوټرانسفارمیشن (لکه انزیماتیک هایدرولیسس او مایکروبیل تخمر) له لارې په مونوساکرایډونو کې ډیپولیمر کیږي. عام مخکې درملنې کې د امونیا فایبر توسیع (AFEX)، پتلی اسید (DA)، ایونیک مایع (IL)، او د بخار چاودنه (SE) شامل دي، کوم چې د کیمیاوي موادو او تودوخې ترکیب کاروي ترڅو د نباتاتو د حجرو دیوالونو خلاصولو سره د لیګنوسیلوز تولید کم کړي. د موادو ضد، 5. انزیماتیک هایدرولیسس د لوړ جامد بار کې د سوداګریز فعال کاربوهایډریټ لرونکي انزایمونو (CAZymes) او مایکروبیل تخمر په کارولو سره د بایو پر بنسټ سونګ او کیمیاوي موادو تولید لپاره د ټرانسجینک خمیر یا باکتریا په کارولو سره ترسره کیږي 6.
په سوداګریزو انزایمونو کې CAZymes د انزایمونو د پیچلي مخلوط څخه جوړ شوي دي چې په همغږۍ سره پیچلي کاربوهایډریټ-شکر بانډونه ماتوي ترڅو مونوساکریډونه 2,7 جوړ کړي. لکه څنګه چې موږ مخکې راپور ورکړ، د کاربوهایډریټونو سره د لیګنین د اروماتیک پولیمرونو پیچلي شبکه دوی خورا پیچلي کوي، کوم چې د شکر نیمګړي بدلون لامل کیږي، د 15-25٪ جنسي اولیګوساکرایډونه راټولوي چې د مخکې درملنې شوي بایوماس د انزیماتیک هایدرولیسس په جریان کې نه تولیدیږي. دا د بایوماس دمخه درملنې مختلفو میتودونو سره یوه عامه ستونزه ده. د دې خنډ لپاره ځینې دلیلونه د هایدرولیسس په جریان کې د انزایم مخنیوی، یا د اړینو اړینو انزایمونو نشتوالی یا ټیټه کچه شامل دي چې د نبات بایوماس کې د شکر بانډونو ماتولو لپاره اړین دي. د شکرو جوړښت او جوړښتي ځانګړتیاو پوهیدل، لکه په اولیګوساکرایډونو کې د شکر بانډونه، به موږ سره د هایدرولیسس په جریان کې د شکر بدلون ښه کولو کې مرسته وکړي، د بایو ټیکنالوژیکي پروسې د پټرولیم څخه ترلاسه شوي محصولاتو سره ارزانه سیالي کوي.
د کاربوهایډریټونو جوړښت ټاکل یو ننګونکی کار دی او د مایع کروماتګرافي (LC)11,12، اټومي مقناطیسي ریزونانس سپیکٹروسکوپي (NMR)13، کیپلیري الیکټروفوریسس (CE)14,15,16 او ډله ایز سپیکٹرومیټري (MS)17 په څیر میتودونو ترکیب ته اړتیا لري. اتلس. د MS میتودونه لکه د الوتنې وخت ډله ایز سپیکٹرومیټري د لیزر ډیسورپشن سره او د میټریکس (MALDI-TOF-MS) په کارولو سره د آیونیزیشن د کاربوهایډریټ جوړښتونو پیژندلو لپاره یو څو اړخیز میتود دی. پدې وروستیو کې، د سوډیم آیون اضافه کونکو ټکر-انډیوسډ ډیسوسی ایشن (CID) ټنډیم MS په پراخه کچه د ګوتو نښې پیژندلو لپاره کارول شوی چې د اولیګوساکرایډ ضمیمه موقعیتونو، انومریک ترتیبونو، ترتیبونو، او شاخ کولو موقعیتونو سره مطابقت لري 20, 21.
د ګلایکان تحلیل د کاربوهایډریټ بانډونو د ژورې پیژندنې لپاره یوه غوره وسیله ده 22. دا طریقه د پیچلي کاربوهایډریټ اړیکو د پوهیدو لپاره د مونوکلونل انټي باډیز (mAbs) کاروي چې د نبات حجرو دیوال ګلایکان ته لارښوونه کیږي ترڅو د پیچلي کاربوهایډریټ اړیکو پوه شي. په ټوله نړۍ کې له 250 څخه ډیر mAbs شتون لري، چې د مختلفو ساکرایډونو په کارولو سره د مختلفو خطي او شاخه شوي اولیګوساکرایډونو په وړاندې ډیزاین شوي 24. ډیری mAbs په پراخه کچه د نبات د حجرو دیوال جوړښت، جوړښت، او تعدیلاتو ځانګړتیا لپاره کارول شوي، ځکه چې د نبات د حجرو ډول، ارګان، عمر، پراختیایي مرحلې، او د ودې چاپیریال پورې اړه لري 25,26. په دې وروستیو کې، دا طریقه د نباتاتو او حیواناتو سیسټمونو کې د ویزیکل نفوس او د ګلایکان ټرانسپورټ کې د دوی اړوند رولونو پوهیدو لپاره کارول شوې لکه څنګه چې د فرعي حجرو نښه کونکو، پراختیایي مرحلو، یا چاپیریالي محرکاتو لخوا ټاکل کیږي، او د انزایمیک فعالیت ټاکلو لپاره. د ګلایکان او زایلان ځینې مختلف جوړښتونه چې پیژندل شوي دي عبارت دي له پیکټین (P)، زایلان (X)، مانان (M)، زایلګلوکان (XylG)، مخلوط بانډ ګلوکان (MLG)، اربینوکسیلان (ArbX)، ګالکټومانان (GalG)، ګلوکورونیک اسید-ارابینوکسیلان (GArbX) او اربینو-ګالیکتان (ArbG)29.
په هرصورت، د دې ټولو څیړنیزو هڅو سره سره، یوازې څو مطالعاتو د لوړ جامد بار (HSL) هایدرولیسس په جریان کې د اولیګوساکرایډ راټولیدو طبیعت باندې تمرکز کړی دی، پشمول د اولیګوساکرایډ خوشې کول، د هایدرولیسس په جریان کې د اولیګومیریک زنځیر اوږدوالی بدلونونه، د DP مختلف ټیټ پولیمرونه، او د دوی منحني. ویشونه 30,31,32. په ورته وخت کې، که څه هم د ګلایکان تحلیل د ګلایکان جوړښت د جامع تحلیل لپاره ګټور وسیله ثابته شوې، د انټي باډي میتودونو په کارولو سره د اوبو محلول ټیټ DP اولیګوساکرایډونو ارزونه ستونزمنه ده. کوچني DP اولیګوساکرایډونه چې د 5-10 kDa څخه کم مالیکولر وزن لري د ELISA پلیټونو 33,34 سره نه تړل کیږي او د انټي باډي اضافه کولو دمخه مینځل کیږي.
دلته، د لومړي ځل لپاره، موږ د مونوکلونل انټي باډیز په کارولو سره د ایویډین پوښل شوي پلیټونو کې د ELISA ازموینه ښیې، د حل کېدونکي ریفراکټري اولیګوساکرایډونو لپاره د یو ګام بایوټینیلیشن پروسیجر د ګلایکوم تحلیل سره یوځای کوي. د ګلایکوم تحلیل لپاره زموږ چلند د MALDI-TOF-MS او GC-MS پر بنسټ د بشپړونکي اولیګوساکرایډ لینکونو تحلیل لخوا تایید شو چې د هایدرولیس شوي شکر ترکیبونو trimethylsilyl (TMS) مشتق کولو په کارولو سره. دا نوښتګر چلند په راتلونکي کې د لوړ تروپټ میتود په توګه رامینځته کیدی شي او په بایو میډیکل څیړنه کې پراخه غوښتنلیک ومومي.
د انزایمونو او انټي باډیزونو د ژباړې وروسته بدلونونه، لکه ګلایکوسیلیشن، 36 د دوی بیولوژیکي فعالیت اغیزمن کوي. د مثال په توګه، د سیرم پروټینونو ګلایکوسیلیشن کې بدلونونه د التهابي مفصلونو کې مهم رول لوبوي، او ګلایکوسیلیشن کې بدلونونه د تشخیصي نښو په توګه کارول کیږي 37. په ادبیاتو کې مختلف ګلایکانونه په اسانۍ سره په مختلفو ناروغیو کې څرګندیږي، پشمول د معدې او ځيګر د اوږدمهاله التهابي ناروغیو، ویروسي انتاناتو، تخمدان، سینې، او پروستات سرطانونو 38,39,40. د انټي باډي پر بنسټ ګلایکان ELISA میتودونو په کارولو سره د ګلایکانونو جوړښت پوهیدل به د پیچلو MS میتودونو کارولو پرته د ناروغۍ تشخیص کې اضافي باور چمتو کړي.
زموږ پخوانۍ مطالعې ښودلې چې ضد اولیګوساکرایډونه د پری درملنې او انزایمیک هایدرولیسس وروسته غیر هایدرولیس پاتې شوي (شکل 1). زموږ په مخکې خپاره شوي کار کې، موږ د فعال چارکول جامد پړاو استخراج میتود رامینځته کړ ترڅو د AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8 څخه اولیګوساکرایډونه جلا کړي. د لومړني استخراج او جلا کولو وروسته، اولیګوساکرایډونه د اندازې جلا کولو کروماتګرافي (SEC) لخوا نور هم ویشل شوي او د مالیکولر وزن په ترتیب سره راټول شوي. د شکر مونومرونه او اولیګومرونه چې د مختلفو پری درملنې څخه خوشې شوي د شکر ترکیب تحلیل لخوا تحلیل شوي. کله چې د مختلفو پری درملنې میتودونو لخوا ترلاسه شوي د شکر اولیګومرونو مینځپانګه پرتله کول، د ضد اولیګوساکرایډونو شتون د بایوماس مونوساکرایډونو ته د بدلون په برخه کې یوه عامه ستونزه ده او کولی شي د بورې حاصلات لږترلږه 10-15٪ او حتی تر 18٪ پورې کم کړي. US. دا طریقه د اولیګوساکرایډ کسرونو د لوی پیمانه تولید لپاره کارول کیږي. پایله لرونکي ACH او د هغې وروسته برخې د مختلف مالیکولر وزنونو سره پدې کار کې د اولیګوساکرایډونو ځانګړتیا لپاره د تجربوي موادو په توګه کارول شوي.
د درملنې دمخه او انزایمیک هایدرولیسس وروسته، دوامداره اولیګوساکرایډونه غیر هایدرولیسس پاتې شول. دلته (A) د اولیګوساکرایډ جلا کولو طریقه ده چې پکې اولیګوساکرایډونه د AFEX-مخکې درملنې شوي جوار سټوور هایدرولیسیټ (ACSH) څخه د فعال کاربن او ډایټوماسیوس ځمکې بسته شوي بستر په کارولو سره جلا کیږي؛ (B) د اولیګوساکرایډونو جلا کولو طریقه. اولیګوساکرایډونه د اندازې جلا کولو کروماتګرافي (SEC) لخوا نور جلا شوي؛ (C) د سیکرایډ مونومرونه او اولیګومرونه د مختلفو پری درملنې څخه خوشې شوي (رقیق شوي اسید: DA، ایونیک مایع: IL او AFEX). د انزایمیک هایدرولیسس شرایط: د 25٪ لوړ جامد بار کول (w/w) (تقریبا 8٪ ګلوکان بار کول)، 96 ساعته هایدرولیسس، 20 ملی ګرامه / ګرامه سوداګریز انزایم بار کول (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 تناسب) او (D) د ګلوکوز، زایلوز او عربینوز شکر مونومرونه او اولیګومرونه د AFEX دمخه درملنې شوي جوار سټوور (ACS) څخه خوشې شوي.
د ګلایکان تحلیل د جامد بایوماس پاتې شونو څخه جلا شوي استخراجونو کې د ګلایکانونو جامع جوړښتي تحلیل لپاره ګټور وسیله ثابته شوې ده. په هرصورت، د دې دودیز میتود په کارولو سره په اوبو کې محلول شوي ساکریډونه کم استازیتوب کیږي41 ځکه چې د ټیټ مالیکولر وزن اولیګوساکریډونه د ELISA پلیټونو کې غیر فعال کول ستونزمن دي او د انټي باډي اضافه کولو دمخه مینځل کیږي. له همدې امله، د انټي باډي تړلو او ځانګړتیا لپاره، د یو ګام بایوټینیلیشن میتود د ایویډین پوښل شوي ELISA پلیټونو کې د محلول شوي، غیر مطابقت لرونکي اولیګوساکرایډونو پوښلو لپاره کارول شوی و. دا میتود زموږ د مخکې تولید شوي ACSH او د هغې د مالیکولر وزن (یا د پولیمرائزیشن درجې، DP) پراساس د یوې برخې په کارولو سره ازمول شوی و. د کاربوهایډریټ کمولو پای ته د بایوټین-LC-هایډرایزایډ اضافه کولو سره د اولیګوساکرایډ پابندۍ زیاتولو لپاره یو ګام بایوټینیلیشن کارول شوی و (شکل 2). په محلول کې، د کمولو پای کې هیمیاسیټل ګروپ د بایوټین-LC-هایډرایزایډ هایډرازایډ ګروپ سره عکس العمل ښیې ترڅو هایډرازون بانډ جوړ کړي. د کمولو اجنټ NaCNBH3 په شتون کې، د هایدروزون بانډ یو باثباته بایوټینیلیټ شوي پای محصول ته راټیټیږي. د شکر کمولو پای تعدیل سره، د ټیټ DP اولیګوساکرایډونو تړل د ELISA پلیټونو سره ممکن شول، او زموږ په څیړنه کې دا د ګلایکان په نښه شوي mAbs په کارولو سره د ایویډین لیپت شوي پلیټونو کې ترسره شو.
د بایوټینیلیټ شوي اولیګوساکرایډونو لپاره د ELISA پر بنسټ د مونوکلونل انټي باډیز سکرینینګ. دلته (A) د اولیګوساکرایډونو بایوټینیلیشن او وروسته د نیوټرایوډین لیپت شوي پلیټونو کې د ګلایکان په نښه شوي mAbs سره د ELISA سکرینینګ ګډ شوی او (B) د عکس العمل محصولاتو بایوټینیلیشن لپاره یو ګام پروسیجر ښیې.
د اولیګوساکرایډ سره کنجوګیټ شوي انټي باډیز سره د ایوډین پوښل شوي پلیټونه بیا په لومړني او ثانوي انټي باډیز کې اضافه شول او په رڼا او وخت حساس میډیم کې مینځل شول. وروسته له دې چې د انټي باډی تړل بشپړ شي، د پلیټ د مینځلو لپاره TMB سبسټریټ اضافه کړئ. تعامل په پای کې د سلفوریک اسید سره ودرول شو. انکیوبیټ شوي پلیټونه د ELISA لوستونکي په کارولو سره تحلیل شوي ترڅو د هر انټي باډی د تړلو ځواک وټاکي ترڅو د انټي باډي ځانګړي کراس لینکینګ کشف کړي. د تجربې د جزیاتو او پیرامیټرو لپاره، اړونده برخه "مواد او میتودونه" وګورئ.
موږ د دې نوي رامینځته شوي میتود ګټورتوب د ځانګړو غوښتنلیکونو لپاره د ACSH کې موجود محلول شوي اولیګوساکرایډونو او همدارنګه د لیګنو سیلولوزیک هایدرولیسیټونو څخه جلا شوي خام او پاک شوي اولیګوساکرایډ برخو کې مشخص کولو سره ښیو. لکه څنګه چې په شکل 3 کې ښودل شوي، د بایواسیلیټ شوي ګلایکوم ازموینې میتودونو په کارولو سره په ACSH کې پیژندل شوي ترټولو عام ایپیټوپ بدیل شوي زایلان معمولا یورونیک (U) یا میتیلورونیک (MeU) او پیکټیک عربینوګالیکتان دي. ډیری یې زموږ په تیرو مطالعاتو کې د غیر هایدرولیس شوي جامدونو (UHS)43 د ګلایکان تحلیل په اړه هم وموندل شول.
د حجرو دیوال ګلایکان ته د لارښود شوي مونوکلونل انټي باډي په کارولو سره د ریکالسیټرنټ اولیګوساکرایډ ایپیټوپونو کشف. "بې طرفه" کسر د ACN کسر دی او "تیزابي" کسر د FA کسر دی. د تودوخې نقشې کې روښانه سور رنګونه د لوړ ایپیټوپ مینځپانګې ښودنه کوي، او روښانه نیلي رنګونه خالي شالید ښیې. په پیمانه کې د رنګ ارزښتونه د فورمول N=2 لپاره د خام OD ارزښتونو پراساس دي. د انټي باډیز لخوا پیژندل شوي اصلي ایپیټوپونه په ښي خوا کې ښودل شوي.
دا غیر سیلولوز جوړښتونه د ازمول شوي سوداګریز انزایم مخلوط کې د خورا عام سیلولوز او هیمیسیلوز لخوا نه شي ماتیدلی، کوم چې ترټولو عام کارول شوي سوداګریز انزایمونه پکې شامل دي. له همدې امله، د دوی د هایدرولیسس لپاره نوي مرستندویه انزایمونو ته اړتیا ده. د اړین غیر سیلولوز اضافي انزایمونو پرته، دا غیر سیلولوز بانډونه مونوساکرایډونو ته د بشپړ بدلون مخه نیسي، حتی که د دوی اصلي شکر پولیمرونه په پراخه کچه په لنډو ټوټو کې هایدرولیس شوي وي او د سوداګریز انزایم مخلوط په کارولو سره منحل شي.
د سیګنال ویش او د هغې د تړلو ځواک نورې مطالعې ښودلې چې تړلو ایپیټوپونه د لوړ DP شکر برخو (A، B، C، DP تر 20+ پورې) کې د ټیټ DP برخو (D، E، F، DP) په پرتله په ډیمرونو کې ټیټ وو (انځور 1). د تیزاب ټوټې په غیر سیلولوز ایپیټوپونو کې د غیر جانبدار ټوټو په پرتله ډیر عام دي. دا پدیده زموږ په تیرو مطالعاتو کې لیدل شوي نمونې سره مطابقت لري، چیرې چې لوړ DP او اسید برخې د انزایمیک هایدرولیسس په وړاندې ډیر مقاومت درلود. له همدې امله، د غیر سیلولوز ګلایکان ایپیټوپونو او U او MeU بدیلونو شتون کولی شي د اولیګوساکرایډونو ثبات کې خورا مرسته وکړي. دا باید په یاد ولرئ چې د تړلو او کشف موثریت د ټیټ DP اولیګوساکرایډونو لپاره ستونزمن کیدی شي، په ځانګړي توګه که ایپیټوپ یو ډیمریک یا ټریمیریک اولیګوساکرایډ وي. دا د مختلفو اوږدوالي سوداګریزو اولیګوساکرایډونو په کارولو سره ازمول کیدی شي، هر یو یوازې یو ایپیټوپ لري چې د یو ځانګړي mAb سره تړلی دی.
په دې توګه، د جوړښت پورې اړوند انټي باډي کارولو د بیا تکرارونکي بانډونو ځینې ډولونه څرګند کړل. د کارول شوي انټي باډي ډول، مناسب تړلو نمونې، او د هغه سیګنال ځواک پورې اړه لري چې دا تولیدوي (ډیری او لږترلږه ډیر)، نوي انزایمونه پیژندل کیدی شي او د بشپړ ګلایکو کنورژن لپاره د انزایم مخلوط ته په نیمه کمیت سره اضافه کیدی شي. د مثال په توګه د ACSH اولیګوساکرایډونو تحلیل اخیستل، موږ کولی شو د هر بایوماس موادو لپاره د ګلایکان بانډونو ډیټابیس جوړ کړو. دلته باید یادونه وشي چې د انټي باډیز مختلف تړاو باید په پام کې ونیول شي، او که د دوی تړاو نامعلوم وي، دا به د مختلفو انټي باډیز سیګنالونو پرتله کولو پرمهال ځینې ستونزې رامینځته کړي. سربیره پردې، د ګلایکان بانډونو پرتله کول ممکن د ورته انټي باډي لپاره د نمونو ترمنځ غوره کار وکړي. دا ضد بانډونه بیا د CAZyme ډیټابیس سره وصل کیدی شي، له کوم ځای څخه موږ کولی شو انزایمونه وپیژنو، د نوماند انزایمونه غوره کړو او د بانډ ماتونکي انزایمونو لپاره ازموینه وکړو، یا د بایو ریفینریو کې د کارولو لپاره د دې انزایمونو څرګندولو لپاره مایکروبیل سیسټمونه رامینځته کړو 44.
د دې ارزولو لپاره چې څنګه د معافیتي میتودونو سره د لیګنو سیلولوزیک هایدرولیسیټونو کې د ټیټ مالیکولر وزن اولیګوساکرایډونو ځانګړتیا لپاره بدیل میتودونه بشپړیږي، موږ د MALDI (شکل 4، S1-S8) او د TMS څخه اخیستل شوي ساکرایډونو تحلیل د GC-MS پر بنسټ په ورته پینل (شکل 5) اولیګوساکرایډ برخه کې ترسره کړ. MALDI د دې پرتله کولو لپاره کارول کیږي چې ایا د اولیګوساکرایډ مالیکولونو ډله ایز ویش د مطلوب جوړښت سره سمون لري. په شکل 4 کې د بې طرفه اجزاو ACN-A او ACN-B MC ښیې. د ACN-A تحلیل د DP 4-8 (شکل 4) څخه تر DP 22 (شکل S1) پورې د پینټوز شکرو لړۍ تایید کړه، چې وزن یې د MeU-xylan اولیګوساکرایډونو سره مطابقت لري. د ACN-B تحلیل د پینټوز او ګلوکوکسیلان لړۍ د DP 8-15 سره تایید کړه. په اضافي موادو لکه شکل S3 کې، د FA-C اسیدیک مایع ډله ایز ویش نقشې د (Me)U بدیل شوي پینټوز شکرو لړۍ ښیې چې د 8-15 DP سره چې د ELISA پر بنسټ mAb سکرینینګ کې موندل شوي بدیل شوي زایلان سره مطابقت لري. ایپیټوپونه مطابقت لري.
په ACS کې د محلول غیر مطابقت لرونکي اولیګوساکرایډونو MALDI-MS سپیکٹرم شتون لري. دلته، (A) د ACN-A ټیټ وزن لرونکي برخې چې میتیلیټ شوي یورونیک اسید (DP 4-8) ځای په ځای شوي ګلوکوروکسیلان اولیګوساکرایډونه او (B) ACN-B زایلان او میتیلیټ شوي یورونیک اسید اولیګوساکرایډونه د ګلوکوروکسیلان (DP 8-15) سره ځای په ځای شوي.
د ریفراکټري اولیګوساکرایډونو د ګلایکان پاتې شونو د ترکیب تحلیل. دلته (الف) د GC-MS تحلیل په کارولو سره ترلاسه شوي د مختلفو اولیګوساکرایډ برخو TMS ساکرایډ ترکیب. (ب) په اولیګوساکرایډونو کې د مختلفو TMS څخه اخیستل شوي شکرو جوړښتونه. ACN - د اسیټونایټریل برخه چې بې طرفه اولیګوساکرایډونه لري او FA - د فیرولیک اسید برخه چې اسید اولیګوساکرایډونه لري.
د اولیګوساکرایډ برخې د LC-MS تحلیل څخه یوه بله په زړه پورې پایله ترلاسه شوه، لکه څنګه چې په شکل S9 کې ښودل شوي (میتودونه په بریښنایی ضمیمه موادو کې لیدل کیدی شي). د ACN-B برخې د تړلو پرمهال د هیکسوز او -OAc ګروپونو ټوټې په مکرر ډول لیدل شوي. دا موندنه نه یوازې د ګلایکوم او MALDI-TOF تحلیل کې لیدل شوي ټوټې کول تاییدوي، بلکه د مخکې درملنې شوي لیګنو سیلولوزیک بایوماس کې د احتمالي کاربوهایډریټ مشتقاتو په اړه نوي معلومات هم چمتو کوي.
موږ د TMS شکر مشتق کولو په کارولو سره د اولیګوساکرایډ برخې د شکر ترکیب هم تحلیل کړ. د GC-MS په کارولو سره، موږ د اولیګوساکرایډ برخې کې د عصبي (غیر مشتق) او تیزابي شکرو (GluA او GalA) ترکیب مشخص کړ (شکل 5). ګلوکورونیک اسید په تیزابي اجزاو C او D کې موندل کیږي، پداسې حال کې چې ګالیکټورونیک اسید په تیزابي اجزاو A او B کې موندل کیږي، چې دواړه د تیزابي شکرو لوړ DP اجزا دي. دا پایلې نه یوازې زموږ د ELISA او MALDI معلوماتو تاییدوي، بلکه زموږ د اولیګوساکرایډ راټولولو پخوانیو مطالعاتو سره هم مطابقت لري. له همدې امله، موږ باور لرو چې د اولیګوساکرایډونو بایوټینیلیشن او وروسته د ELISA سکرینینګ کارولو سره عصري معافیتي میتودونه په مختلفو بیولوژیکي نمونو کې د محلول شوي ریکالسیټرنټ اولیګوساکرایډونو کشف کولو لپاره کافي دي.
څرنګه چې د ELISA پر بنسټ د mAb سکرینینګ میتودونه د څو مختلفو میتودونو لخوا تایید شوي، موږ غوښتل چې د دې نوي کمیتي میتود احتمالي نور هم وپلټو. دوه سوداګریز اولیګوساکرایډونه، xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) او 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX)، د حجرو دیوال ګلایکان په نښه کولو لپاره د نوي mAb طریقې په کارولو سره پیرودل شوي او ازمول شوي. شکل 6 د بایوټینیلیټ شوي پابند سیګنال او د اولیګوساکرایډ غلظت د لاګ غلظت ترمنځ یو خطي اړیکه ښیې، چې د احتمالي لانګمویر جذب ماډل وړاندیز کوي. د mAbs په منځ کې، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148، او CCRC-M151 د XHE سره تړاو لري، او CCRC-M108، CCRC-M109، او LM11 د 1 nm څخه تر 100 نانو پورې د A2XX سره تړاو لري. د تجربې په جریان کې د انټي باډیز محدود شتون له امله، د هر اولیګوساکرایډ غلظت سره محدودې تجربې ترسره شوې. دلته باید یادونه وشي چې ځینې انټي باډیز د سبسټریټ په توګه ورته اولیګوساکرایډ ته خورا مختلف عکس العمل ښیې، احتمال لري ځکه چې دوی یو څه مختلف ایپیټوپونو سره تړلي دي او کولی شي خورا مختلف پابندۍ ولري. د دقیق ایپیټوپ پیژندنې میکانیزمونه او اغیزې به خورا پیچلې وي کله چې د نوي mAb طریقه په ریښتیني نمونو پلي شي.
د مختلفو ګلایکان په نښه کولو mAbs د کشف رینج ټاکلو لپاره دوه سوداګریز اولیګوساکرایډونه کارول شوي. دلته، د اولیګوساکرایډ غلظت د لاګ غلظت سره خطي اړیکې د (A) XHE لپاره د mAb سره او (B) A2XX د mAb سره د لانګمویر جذب نمونې په ګوته کوي. اړونده ایپیټوپونه د سوداګریز اولیګوساکرایډونو جوړښتونه په ګوته کوي چې په ازموینه کې د سبسټریټ په توګه کارول کیږي.
د ګلایکان په نښه شوي مونوکلونل انټي باډیز (ګلایکوکوميک تحلیل یا د ELISA پر بنسټ د mAb سکرینینګ) کارول د ډیری لوی حجروي دیوال ګلایکانونو ژور ځانګړتیا لپاره یو پیاوړی وسیله ده چې د نبات بایوماس جوړوي. په هرصورت، کلاسیک ګلایکان تحلیل یوازې د لوی حجروي دیوال ګلایکانونو ځانګړتیاوي کوي، ځکه چې ډیری اولیګوساکرایډونه په ELISA پلیټونو کې په مؤثره توګه غیر فعال ندي. پدې څیړنه کې، د AFEX-مخکې درملنه شوي جوار سټور په لوړ جامد موادو کې په انزایمیک ډول هایډرولیز شوی و. د شکر تحلیل د هایډرولیزیټ کې د ریکالسیټرنټ حجروي دیوال کاربوهایډریټونو ترکیب ټاکلو لپاره کارول شوی و. په هرصورت، په هایډرولیزیټ کې د کوچنیو اولیګوساکرایډونو mAb تحلیل کم اټکل شوی، او اضافي وسیلو ته اړتیا ده چې په ELISA پلیټونو کې په مؤثره توګه د اولیګوساکرایډونو غیر فعال کړي.
موږ دلته د mAb سکرینینګ لپاره د اولیګوساکرایډ بایوټینیلیشن سره یوځای کولو سره د اولیګوساکرایډ د غیر متحرک کولو یوه نوې او مؤثره طریقه راپور ورکوو چې وروسته د نیوټرایویډین ™ پوښل شوي پلیټونو کې د ELISA سکرینینګ تعقیبوي. غیر فعال بایوټینیلیټ شوي اولیګوساکرایډونو د انټي باډي لپاره کافي تړاو ښودلی ترڅو د ریکالسیټرنټ اولیګوساکرایډونو ګړندي او مؤثر کشف فعال کړي. د ډله ایز سپیکٹرومیټري پراساس د دې ضد اولیګوساکرایډونو ترکیب تحلیل د معافیت سکرینینګ لپاره د دې نوي چلند پایلې تایید کړې. په دې توګه، دا مطالعات ښیې چې د اولیګوساکرایډ بایوټینیلیشن او د ګلایکان په نښه شوي مونوکلونل انټي باډیز سره د ELISA سکرینینګ ترکیب په اولیګوساکرایډونو کې د کراس لینکونو کشف کولو لپاره کارول کیدی شي او په پراخه کچه په نورو بایو کیمیکل مطالعاتو کې پلي کیدی شي چې د اولیګوساکرایډونو جوړښت مشخص کوي.
دا د بایوټین پر بنسټ د ګلایکان پروفایل کولو طریقه لومړنی راپور دی چې د نباتاتو بایوماس کې د محلول شوي اولیګوساکرایډونو د ریکالسیټرنټ کاربوهایډریټ بانډونو د څیړنې وړتیا لري. دا مرسته کوي چې پوه شي چې ولې د بایوماس ځینې برخې د بایو سونګ تولید په وخت کې دومره سختې دي. دا طریقه د ګلایکوم تحلیل میتودونو کې یو مهم تشه ډکوي او د نبات اولیګوساکرایډونو هاخوا د فرعي برخو پراخه لړۍ ته یې پلي کول غځوي. په راتلونکي کې، موږ ممکن د بایوټینیلیشن لپاره روبوټیک وکاروو او هغه میتود وکاروو چې موږ د ELISA په کارولو سره د نمونو د لوړ-تروپټ تحلیل لپاره رامینځته کړی دی.
د جوارو واښه (CS) چې د پایونیر 33A14 هایبرډ تخمونو څخه کرل کیږي په 2010 کې د کولوراډو په ری کې د کرامر فارمونو څخه راټول شوي وو. د ځمکې د مالک په اجازې سره، دا بایوماس د څیړنې لپاره کارول کیدی شي. نمونې د خونې په تودوخه کې په زپ لاک کڅوړو کې د 6٪ څخه کم رطوبت سره وچې ساتل شوې وې. نمونې د خونې په تودوخه کې په زپ لاک کڅوړو کې د 6٪ څخه کم رطوبت سره وچې ساتل شوې وې. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. نمونې د خونې د تودوخې په زپ شوي کڅوړو کې د <6٪ رطوبت په وچه کې زیرمه شوي وې.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. نمونې د خونې په تودوخه کې د زپ کڅوړو کې د 6٪ څخه کم رطوبت سره ساتل کیږي.دا څېړنه د سیمه ییزو او ملي لارښوونو سره سم ترسره شوه. د ترکیب تحلیل د NREL پروتوکول په کارولو سره ترسره شو. وموندل شوه چې ترکیب یې 31.4٪ ګلوکان، 18.7٪ زایلان، 3.3٪ عربینان، 1.2٪ ګالکټان، 2.2٪ اسیتیل، 14.3٪ لیګنین، 1.7٪ پروټین او 13.4٪ ایش لري.
Cellic® CTec2 (۱۳۸ ملی ګرامه پروټین/ملی لیتر، ډېر VCNI 0001) د نووزایمونو (فرانکلینټن، NC، USA) څخه د سیلولیز، β-ګلوکوسیډیز او Cellic® HTec2 (۱۵۷ ملی ګرامه پروټین/ملی لیتر، ډېر VHN00001) یو پیچلی مخلوط دی. Multifect Pectinase® (۷۲ ملی ګرامه پروټین/ملی لیتر)، د پیکټین تخریب کونکي انزایمونو یو پیچلی ترکیب، د ډوپونټ صنعتي بایوسینس (پالو الټو، CA، USA) لخوا مرسته شوی. د انزایم پروټین غلظت د پروټین مینځپانګې اټکل کولو (او د غیر پروټین نایتروجن ونډې کمولو) د Kjeldahl نایتروجن تحلیل (AOAC میتود ۲۰۰۱.۱۱، Dairy One Cooperative Inc.، Ithaca، NY، USA) په کارولو سره ټاکل شوی. Diatomaceous Earth 545 د EMD Millipore (Billerica، MA) څخه اخیستل شوی. فعال کاربن (DARCO، 100 میش ګرینولونه)، Avicel (PH-101)، beech xylan، او نور ټول کیمیاوي مواد د سیګما-الډریچ (سینټ لوئس، MO) څخه اخیستل شوي وو.
د AFEX مخکې درملنه په GLBRC (د بایوماس تبادلې څیړنې لابراتوار، MSU، لانسینګ، MI، USA) کې ترسره شوه. مخکې درملنه په 140 درجو سانتي ګراد کې د 15 دقیقو لپاره ترسره شوه. د سټینلیس سټیل بینچ ټاپ بیچ ری ایکټر (پار انسټرومینټس شرکت) کې د 60٪ (w/w) بار کولو سره د انهایډروس امونیا او بایوماس د 1:1 تناسب کې د استوګنې وخت 46. دا 30 دقیقې وخت ونیو. ری ایکټر 140 درجو سانتي ګراد ته راوړل شو او امونیا په چټکۍ سره خوشې شوه، چې بایوماس ته اجازه ورکوي چې په چټکۍ سره د خونې تودوخې ته راستون شي. د AFEX مخکې درملنه شوي جوار سټور (ACS) ترکیب د غیر درملنې شوي جوار سټور (UT-CS) سره ورته و.
لوړ جامد مواد ACSH 25٪ (w/w) (تقریبا 8٪ ډیکسټران بار کول) د اولیګوساکرایډونو د لوی پیمانه تولید لپاره د پیل کونکي موادو په توګه چمتو شوي. د ACS انزیماتیک هایدرولیسس د سوداګریز انزایم مخلوط په کارولو سره ترسره شو چې پکې Cellic® Ctec2 10 mg پروټین/g ګلوکان (په مخکې درملنه شوي بایوماس کې)، Htec2 (نووزایمونه، فرانکلینټن، NC)، 5 mg پروټین/g ګلوکان، او ملټيفیکٹ پیکټینیز (جینکور شرکت، امریکا) شامل دي. )، 5 mg پروټین/g ډیکسټران. انزیماتیک هایدرولیسس په 5 لیټره بایوریکټر کې د 3 لیټرو، pH 4.8، 50 ° C او 250 rpm کاري حجم سره ترسره شو. د 96 ساعتونو لپاره د هایدرولیسس وروسته، هایدرولیسس د 30 دقیقو لپاره د 6000 rpm په کاري حجم او بیا د 30 دقیقو لپاره په 14000 rpm کې د غیر هایدرولیس شوي جامد موادو لرې کولو لپاره راټول شو. بیا هایدرولیزیټ د 0.22 ملي میتر فلټر بیکر له لارې د جراثیمي فلټریشن سره مخ شو. فلټر شوی هایدرولیزیټ په جراثیمي بوتلونو کې په 4 درجو سانتی ګراد کې زیرمه شو او بیا په کاربن باندې ټوټه ټوټه شو.
د NREL لابراتوار تحلیلي پروسیجرونو سره سم د استخراج پر بنسټ د بایوماس نمونو د ترکیب تحلیل: د ترکیب تحلیل لپاره د نمونو چمتو کول (NREL/TP-510-42620) او په بایوماس کې د ساختماني کاربوهایډریټ او لیګنین ټاکل (NREL/TP-510 – 42618) 47.
د هایدرولیسیټ جریان د اولیګوساکرایډ تحلیل د آټوکلیو پر بنسټ د اسید هایدرولیسس میتود په کارولو سره د 2 ملی لیتر پیمانه ترسره شو. د هایدرولیسیټ نمونه د 10 ملی لیتر سکرو کیپ کلچر ټیوب کې د 72٪ سلفوریک اسید 69.7 µl سره مخلوط کړئ او د 1 ساعت لپاره په بینچ ټاپ کې په 121 °C کې واچوئ، په یخ کې یخ کړئ او د لوړ فعالیت مایع کروماتګرافي (HPLC) وایل کې فلټر کړئ. د اولیګوساکرایډونو غلظت د غیر هایدرولیس شوي نمونې کې د مونوساکرایډونو غلظت د اسید هایدرولیس شوي نمونې کې د شکر ټول غلظت څخه کمولو سره ټاکل شوی.
د تیزاب هایدرولیس شوي بایوماس کې د ګلوکوز، زایلوز او عربینوز غلظت د شیمازو HPLC سیسټم په کارولو سره تحلیل شو چې د بایو-راډ امینیکس HPX-87H ستون کې د آټوسمپلر، ستون هیټر، اسوکراتیک پمپ، او انعکاسي شاخص کشف کونکي سره سمبال و. ستون په 50 درجو سانتي ګراد کې ساتل شوی و او د 0.6 ملی لیتر/ دقیقې 5 ملی میتر H2SO4 په اوبو کې د جریان سره خارج شوی و.
هایدرولیزیټ سوپرناټینټ د مونومر او اولیګوساکرایډ مینځپانګې لپاره حل او تحلیل شو. د انزایمیک هایدرولیسز وروسته ترلاسه شوي مونومیریک شکرونه د HPLC لخوا تحلیل شوي چې د بایو راډ (هرکولس، CA) امینیکس HPX-87P ستنې او د ایش ساتونکي ستنې سره سمبال شوي. د ستنې تودوخه په 80 درجو سانتي ګراد کې ساتل شوې وه، اوبه د 0.6 ملی لیتر/دقیقې جریان سره د ګرځنده مرحلې په توګه کارول شوې وې. اولیګوساکرایډونه د 121 درجو سانتي ګراد کې د هایدرولیسز لخوا په رفرونو کې تشریح شوي میتودونو سره سم ټاکل شوي. 41، 48، 49.
د ساکرایډ تحلیل په خامو، AFEX مخکې له درملنې شوي او ټولو غیر هایدرولیس شوي بایوماس پاتې شونو (د سیریل حجرو دیوال استخراج تولید او د دوی mAb سکرینینګ په شمول) باندې د مخکې تشریح شوي پروسیجرونو 27، 43، 50، 51 په کارولو سره ترسره شو. د ګلایکوم تحلیل لپاره، د نبات د حجرو دیوال موادو الکول نه حل کیدونکي پاتې شونه د بایوماس پاتې شونو څخه چمتو کیږي او د زیاتیدونکي تیریدونکي ریجنټونو لکه امونیم آکسالټ (50 mM)، سوډیم کاربونیټ (50 mM او 0.5٪ w/v)، CON سره سریال استخراج کیږي. (1M او 4M، دواړه د 1٪ w/v سوډیم بوروهایډرایډ سره) او اسید کلورایټ لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي 52,53. استخراج بیا د mAb50s پیچلي پینل پروړاندې ELISA ته تابع شوي چې د حجرو دیوال ګلایکان ته لارښود شوي، او د mAb پابندۍ عکس العملونه د تودوخې نقشې په توګه وړاندې شوي. د نبات د حجرو دیوال ګلایکان په نښه کولو mAbs د لابراتوار سټاکونو (CCRC، JIM او MAC لړۍ) څخه اخیستل شوي.
د اولیګوساکرایډونو یو ګام بایوټینیلیشن. د کاربوهایډریټونو د بایوټین-LC-هایډرایزایډ سره یوځای کول د لاندې پروسې په کارولو سره ترسره شول. بایوټین-LC-هایډرایزایډ (4.6 mg/12 μmol) په ډایمیتیل سلفوکسایډ (DMSO، 70 μl) کې د قوي هڅولو او د 1 دقیقو لپاره په 65 ° C کې د تودوخې له لارې حل شو. ګلیشیل اسیتیک اسید (30 μl) اضافه شو او مخلوط په سوډیم سیانوبوروهایډرایډ (6.4 mg/100 μmol) کې واچول شو او د 65 ° C کې د شاوخوا 1 دقیقو لپاره د تودوخې وروسته په بشپړ ډول حل شو. بیا، د تعامل مخلوط له 5 څخه تر 8 μl پورې وچ شوي اولیګوساکرایډ (1-100 nmol) ته اضافه شو ترڅو د کمولو پای په اوږدو کې د لیبل څخه 10 ځله یا ډیر مولر اضافه ترلاسه کړي. تعامل د 2 ساعتونو لپاره په 65 ° C کې ترسره شو، وروسته له هغه چې نمونې سمدلاسه پاکې شوې. د لیبل کولو په تجربو کې د کمولو پرته هیڅ سوډیم سیانوبوروهایډرایډ نه دی کارول شوی، او نمونې د 2.5 ساعتونو لپاره په 65 درجو سانتي ګراد کې غبرګون ښودل شوي.
د بایوټینیلیټ شوي اولیګوساکرایډونو نمونو ELISA پوښ او مینځل. د بایوټینیلیټ شوي نمونو 25 μl (د هر متمرکز نمونې 100 μl د 0.1 M Tris بفر محلول (TBS) په 5 ملی لیتر کې حل شوي) د ایویډین پوښ شوي پلیټ هر څاه ته اضافه شوي. د کنټرول څاه ګانې د 0.1 M TBS کې د 10 μg/ml غلظت کې د 50 μl بایوټین سره پوښل شوي. د خالي اندازه کولو لپاره د پوښ په توګه د ډیونیز شوي اوبه کارول شوې. ټابلیټ د خونې په تودوخه کې د 2 ساعتونو لپاره په تیاره کې انکیوب شوی و. د ګرینیر فلیټ 3A لپاره د پروګرام نمبر 11 په کارولو سره پلیټ 3 ځله د 0.1 M TBS کې د 0.1٪ سکیم شوي شیدو سره ومینځئ.
د لومړنيو انټي باډيو اضافه کول او مينځل. په هر څاه کې 40 μl لومړني انټي باډي اضافه کړئ. مایکروپلیټ د خونې په تودوخه کې د 1 ساعت لپاره په تیاره کې واچوئ. بیا پلیټونه د ګرینیر فلیټ 3A لپاره د واش پروګرام #11 په کارولو سره په 0.1M TBS کې د 0.1٪ شیدو سره 3 ځله ومینځل شول.
دوهم انټي باډي اضافه کړئ او ومینځئ. په هر څاه کې د موږک/ موږک دوهم انټي باډي 50 μl (په 0.1٪ شیدو کې 1:5000 منحل شوی په 0.1 M TBS کې) اضافه کړئ. مایکروپلیټ د خونې په تودوخه کې د 1 ساعت لپاره په تیاره کې واچوئ. بیا مایکروپلیټونه د ګرینیر فلیټ 5A پلیټ واش پروګرام #12 په کارولو سره د 0.1٪ شیدو سره په 0.1 M TBS کې 5 ځله ومینځل شول.
د سبسټریټ اضافه کول. د 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 50 µl د اساس سبسټریټ ته اضافه کړئ (د بفر 2 څاڅکي، د TMB 3 څاڅکي، د هایدروجن پیرو اکسایډ 2 څاڅکي د 15 ملی لیتر ډیونیز شوي اوبو سره اضافه کولو سره). د TMB سبسټریټ چمتو کړئ. او د کارولو دمخه ورټیکس). مایکروپلیټ د خونې په تودوخه کې د 30 دقیقو لپاره واچوئ. په تیاره کې.
مرحله بشپړه کړئ او ټابلیټ ولولئ. هرې څاه ته د 1 N سلفوریک اسید 50 µl اضافه کړئ او د ELISA لوستونکي په کارولو سره د 450 څخه تر 655 nm پورې جذب ثبت کړئ.
د دې تحلیلونو ۱ ملی ګرامه/ملی لیتر محلولونه په ډیونیز شوي اوبو کې چمتو کړئ: عربینوز، رمونوز، فوکوز، زایلوز، ګالکټورونیک اسید (GalA)، ګلوکورونیک اسید (GlcA)، مانوز، ګلوکوز، ګالکټوز، لیکتوز، N-acetylmannosamine (manNAc)، N-acetylglucosamine. (glcNAc)، N-acetylgalactosamine (galNAc)، انوسیتول (داخلي معیار). دوه معیارونه د ۱ ملی ګرامه/ملی لیتر شکر محلولونو په اضافه کولو سره چمتو شوي چې په جدول ۱ کې ښودل شوي. نمونې په -۸۰ درجو سانتي ګراد کې کنګل کیږي او لیوفیلیز کیږي تر هغه چې ټولې اوبه لرې شي (معمولا شاوخوا ۱۲-۱۸ ساعته).
د تحلیلي توازن په برخه کې د سکرو کیپ ټیوبونو لپاره د نمونې ۱۰۰-۵۰۰ µg اضافه کړئ. اضافه شوي مقدار ثبت کړئ. غوره ده چې نمونه د محلول په ځانګړي غلظت کې حل کړئ او په ټیوب کې یې د مایع الکووټ په توګه اضافه کړئ. د هر نمونې ټیوب لپاره د داخلي معیار په توګه د ۲۰ µl ۱ mg/ml انوسیتول څخه کار واخلئ. د نمونې سره اضافه شوي داخلي معیار مقدار باید د معیاري ټیوب سره اضافه شوي داخلي معیار مقدار سره ورته وي.
د سکرو کیپ په بوتل کې ۸ ملی لیتره غیر هایدروس میتانول اضافه کړئ. بیا د ۳ نایتروجن میتانولیک HCl محلول ۴ ملی لیتره، پوښل شوی او ښورول شوی. دا پروسه اوبه نه کاروي.
د اولیګوساکرایډ نمونو او معیاري TMS ټیوبونو کې د 1 M HCl میتانول محلول 500 µl اضافه کړئ. نمونې د شپې (168 ساعته) په 80 درجو سانتی ګراد کې په تودوخې بلاک کې واچول شوې. د میتانولیز محصول د خونې په تودوخه کې د وچولو مینیفولډ په کارولو سره وچ کړئ. 200 µl MeOH اضافه کړئ او بیا وچ کړئ. دا پروسه دوه ځله تکرار کیږي. نمونې ته 200 µl میتانول، 100 µl پیریډین او 100 µl اسټیک انهایډرایډ اضافه کړئ او ښه مخلوط کړئ. نمونې د 30 دقیقو لپاره د خونې په تودوخه کې واچول شوې. او وچې شوې. 200 µl میتانول اضافه کړئ او بیا وچ کړئ.
۲۰۰ μl Tri-Sil اضافه کړئ او د ۲۰ دقیقو لپاره یې پوښل شوی ټیوب ګرم کړئ. ۸۰ درجې سانتي ګراد، بیا د خونې تودوخې ته یخ کړئ. د وچولو مینیفولډ وکاروئ ترڅو نمونه نوره هم وچه کړئ تر څو شاوخوا ۵۰ μl حجم ته ورسیږي. دا مهمه ده چې په یاد ولرئ چې موږ نمونې په بشپړه توګه وچې نه کړې.
۲ ملی لیتره هیکسین اضافه کړئ او د ورټیکس کولو له لارې ښه مخلوط کړئ. د پاستور پایپټونو (۵-۸ ملي میتر) سرونه د شیشې وړۍ د یوې ټوټې سره ډک کړئ او د شیشې وړۍ د ۵-۳/۴ انچه قطر پایپټ په سر کې دننه کړئ. نمونې د ۲ دقیقو لپاره په ۳۰۰۰ ګرامه کې سینټرفیوج شوې. هر ډول نه حل کیدونکي پاتې شوني له مینځه وړل کیږي. نمونه تر ۱۰۰-۱۵۰ µl پورې وچه کړئ. د نږدې ۱ μl حجم په GC-MS کې د ۸۰ °C په لومړني تودوخې او د ۲.۰ دقیقو په لومړني وخت کې داخل شو (جدول ۲).