Obrigado por visitar Nature.com.A versão do navegador que você está usando tem suporte limitado para CSS.Para uma melhor experiência, recomendamos que você use um navegador atualizado (ou desative o modo de compatibilidade no Internet Explorer).Enquanto isso, para garantir o suporte contínuo, exibiremos o site sem estilos e JavaScript.
A morfogênese intestinal humana estabelece características de cripta-vilosidade de microarquitetura epitelial 3D e organização espacial. Essa estrutura única é necessária para manter a homeostase intestinal, protegendo o nicho de células-tronco na cripta basal de antígenos microbianos exógenos e seus metabólitos. Além disso, as vilosidades intestinais e o muco secretor apresentam células epiteliais funcionalmente diferenciadas com uma barreira protetora na superfície da mucosa intestinal. Notavelmente, o intestino em um chip mimético orgânico pode induzir a morfogênese 3D espontânea do epitélio intestinal com funções fisiológicas e biomecânicas aprimoradas.Aqui, fornecemos um protocolo reproduzível para induzir de forma robusta a morfogênese intestinal no intestino em um chip microfluídico, bem como em um chip híbrido incorporado Transwell. produção de morfogênese 3D e caracterização de epitélio 3D estabelecido usando várias modalidades de imagem. Este protocolo alcança a regeneração da microarquitetura intestinal funcional controlando o fluxo de fluido basolateral por 5 dias. camadas liais in vitro para aplicações biomédicas, clínicas e farmacêuticas.
Experimentos demonstram que as células Caco-2 epiteliais intestinais cultivadas em intestino em um chip1,2,3,4,5 ou dispositivos microfluídicos de duas camadas6,7 podem sofrer morfogênese 3D espontânea in vitro sem uma compreensão clara do mecanismo subjacente. organoides intestinais derivados.Células epiteliais foram validadas. Neste estudo, focamos especificamente na produção celular e na distribuição da concentração de um potente antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), em dispositivos microfluídicos modificados contendo inserções Transwell, denominados "Chip Híbrido". chip gut inibe a morfogênese ou interrompe a camada epitelial 3D pré-estruturada, sugerindo que o estresse antagônico durante a cultura é responsável pela morfogênese intestinal in vitro. , de inserções Transwell em grandes reservatórios basolaterais em poços).
Neste protocolo, fornecemos um método detalhado para fabricar microdispositivos de intestino em um chip e chips híbridos inseríveis Transwell (etapas 1-5) para cultivar células epiteliais intestinais em membranas porosas à base de polidimetilsiloxano (PDMS) (etapas 6A, 7A, 8, 9) ou membranas de poliéster de inserções Transwell (etapas 6B, 7B, 8, 9) e morfogênese 3D induzida in vitro (etapa 10). Também identificamos características celulares e moleculares indicativas de histogênese específica de tecido e diferenciação celular dependente de linhagem, aplicando várias modalidades de imagem (etapas 11-24). D morfogênese de monocamadas epiteliais 2D, removemos antagonistas de morfogênio em ambas as formas de cultura, fluindo o meio para o compartimento basolateral da cultura. Finalmente, fornecemos uma representação da utilidade de uma camada epitelial 3D regenerável que pode ser usada para modelar o crescimento epitelial dependente de morfogênio, co-culturas hospedeiro-microbioma longitudinais, infecção por patógenos, lesão inflamatória, disfunção da barreira epitelial e terapias baseadas em probióticos Exemplo.influências.
Nosso protocolo pode ser útil para uma ampla gama de cientistas em pesquisa básica (por exemplo, biologia da mucosa intestinal, biologia de células-tronco e biologia do desenvolvimento) e pesquisa aplicada (por exemplo, testes pré-clínicos de drogas, modelagem de doenças, engenharia de tecidos e gastroenterologia) de amplo impacto. , nosso protocolo é útil para interrogar a infecção sob vários agentes infecciosos, como Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ou Vibrio cholerae.Audiências de patologia e patogênese da doença também são úteis. O uso de um sistema de microfisiologia intestinal no chip pode permitir a cocultura longitudinal 10 e a avaliação subsequente da defesa do hospedeiro, respostas imunes e reparo de lesões relacionadas a patógenos no trato gastrointestinal (GI) 11 . Camadas epiteliais intestinais 3D , essas doenças incluem atrofia das vilosidades, encurtamento das criptas, dano da mucosa ou barreira epitelial prejudicada. Biópsia ou organoides intestinais derivados de células-tronco12,13.células imunes específicas do tecido, 5.
Como a microestrutura epitelial 3D pode ser corrigida e visualizada sem o processo de corte, os visualizadores que trabalham com transcriptômica espacial e imagens de alta ou super resolução podem se interessar por nosso mapeamento da dinâmica espaço-temporal de genes e proteínas em nichos epiteliais.Interessado em tecnologia. Resposta a estímulos microbianos ou imunológicos. Além disso, crosstalk hospedeiro-microbioma longitudinal 10, 14 que coordena a homeostase intestinal pode ser estabelecido na camada mucosa intestinal 3D por co-cultura de várias espécies microbianas, comunidades microbianas ou microbiota fecal, especialmente no intestino em um chip.na plataforma. Essa abordagem é particularmente atraente para o público que estuda imunologia mucosa, gastroenterologia, microbioma humano, culturômica e microbiologia clínica que buscam cultivar microbiota intestinal previamente não cultivada em laboratório. Se nosso protocolo de morfogênese in vitro puder ser adaptado a formatos de cultura escalonáveis, como inserções de poços múltiplos em placas de 24, 96 ou 384 poços que reabastecem continuamente os compartimentos basolaterais, o protocolo também pode ser disseminado para aqueles que desenvolvem triagem farmacêutica, biomédica ou de alto rendimento ou plataformas de validação para a indústria de alimentos. Como prova de princípio, demonstramos recentemente a viabilidade de um sistema de morfogênese multiplex de alto rendimento escalável para um formato de placa de 24 poços. Além disso, vários produtos organ-on-a-chip foram comercializados16,17,18. nível transcriptômico para testar medicamentos ou bioterapêuticos A absorção e o transporte de candidatos a medicamentos foram avaliados usando substitutos intestinais 3D ou usando modelos de órgãos em um chip personalizados ou comerciais para avaliar a reprodutibilidade do processo de morfogênese intestinal.
Um número limitado de modelos experimentais relevantes para humanos foi usado para estudar a morfogênese epitelial intestinal, principalmente devido à falta de protocolos implementáveis ​​para induzir a morfogênese 3D in vitro. também muito limitados em sua capacidade de serem testados de maneira escalável multidirecional. Portanto, nosso protocolo para regenerar estruturas de tecido 3D in vitro supera modelos animais in vivo, bem como outros modelos estáticos tradicionais de cultura de células 2D. em resposta a fatores do hospedeiro (por exemplo, camadas de muco interno versus externo, secreção de IgA e peptídeos antimicrobianos). Além disso, a morfologia epitelial 3D pode nos permitir entender como a microbiota intestinal estrutura suas comunidades e produz sinergicamente metabólitos microbianos (por exemplo, ácidos graxos de cadeia curta) que moldam a organização celular e os nichos de células-tronco nas criptas basais. Essas características só podem ser demonstradas quando as camadas epiteliais 3D são estabelecidas in vitro.
Além do nosso método de criação de estruturas epiteliais intestinais 3D, existem vários métodos in vitro.A cultura de organoides intestinais é uma técnica de engenharia de tecidos de última geração baseada no cultivo de células-tronco intestinais sob condições morfogênicas específicas23,24,25.No entanto, o uso de modelos de organoides 3D para análise de transporte ou coculturas do microbioma hospedeiro é muitas vezes desafiador porque o lúmen intestinal é encerrado no organoide e, portanto, a introdução de componentes luminais, como células microbianas ou ex antígenos ógenos é limitado.O acesso aos lúmens de organoides pode ser melhorado usando um microinjetor,26,27 mas esse método é invasivo e trabalhoso e requer conhecimento especializado para ser executado.
Outras abordagens empregadas por vários grupos de pesquisa utilizam andaimes de hidrogel 3D pré-estruturados para imitar a estrutura epitelial do intestino, cultivando células intestinais humanas isoladas na superfície do gel.Fabrique andaimes de hidrogel usando moldes impressos em 3D, microfresados ​​ou fabricados litograficamente. falar incluindo células estromais no andaime. No entanto, a natureza dos andaimes pré-estruturados pode impedir a exibição do próprio processo morfogenético espontâneo. padrões para formar estruturas tubulares intestinais e o fluxo de fluido intraluminal pode ser recapitulado usando um módulo de microfluídica. No entanto, este modelo não exibe processos morfogenéticos espontâneos nem inclui movimentos mecanobiológicos do intestino. Técnicas de impressão 3D do mesmo grupo foram capazes de criar tubos intestinais em miniatura com processos morfogenéticos espontâneos. Apesar da fabricação complexa de diferentes segmentos intestinais dentro do tubo, este modelo também carece de fluxo de fluido luminal e deformação mecânica. Além disso, a operabilidade do modelo pode ser limitada, especialmente após a bioimpressão o processo está completo, perturbando as condições experimentais ou as interações célula a célula. Em vez disso, nosso protocolo proposto fornece morfogênese intestinal espontânea, estresse de cisalhamento fisiologicamente relevante, biomecânica que imita a motilidade intestinal, acessibilidade de compartimentos apicais e basolaterais independentes e recriação de microambientes biológicos complexos de modularidade. Portanto, nosso protocolo de morfogênese 3D in vitro pode fornecer uma abordagem complementar para superar os desafios dos métodos existentes.
Nosso protocolo é totalmente focado na morfogênese epitelial 3D, com apenas células epiteliais em cultura e nenhum outro tipo de células circundantes, como células mesenquimais, células endoteliais e células imunes. Para recriar a camada epitelial 3D ondulante, complexidades biológicas adicionais, como interações epitelial-mesenquimais33,34, deposição de matriz extracelular (MEC)35 e, em nosso modelo, recursos de cripta-vilosidade que transmitem nichos de células-tronco em criptas basais ainda precisam ser considerados. ,38.A adição de células mesenquimais ao nosso modelo melhorou o processo morfogenético e a eficiência da ligação celular.A camada endotelial (ou seja, capilares ou linfáticos) desempenha um papel importante na regulação do transporte molecular39 e no recrutamento de células imunes40 no microambiente intestinal.Além disso, os componentes vasculares que podem ser conectados entre os modelos de tecido são um pré-requisito quando os modelos de tecido são projetados para demonstrar interações de vários órgãos. Portanto, as células endoteliais podem precisar ser incluídas para modelar características fisiológicas mais precisas com resolução em nível de órgão. As células imunes derivadas do paciente também são essenciais para exibir respostas imunes inatas, apresentação de antígenos, crosstalk imune adaptativo inato e imunidade específica de tecido no contexto de imitar doenças intestinais.
O uso de chips híbridos é mais direto do que intestino em um chip porque a configuração do dispositivo é mais simples e o uso de insertos Transwell permite a cultura escalável do epitélio intestinal. No entanto, os insertos Transwell disponíveis comercialmente com membranas de poliéster não são elásticos e não podem simular movimentos peristálticos. Além disso, o compartimento apical do inserto Transwell colocado no chip híbrido permaneceu estacionário sem tensão de cisalhamento no lado apical. Claramente, as propriedades estáticas no compartimento apical raramente permitem co-cultura bacteriana de longo prazo em chips híbridos. Embora possamos induzir morfogênese 3D de forma robusta em pastilhas Transwell ao usar chips híbridos, a escassez de biomecânica fisiologicamente relevante e fluxo de fluido apical pode limitar a viabilidade de plataformas de chip híbrido para aplicações potenciais.
As reconstruções em escala real do eixo cripta-vilosidade humana em culturas de intestino em um chip e híbridas em um chip não foram totalmente estabelecidas. Uma vez que a morfogênese começa a partir de uma monocamada epitelial, as microarquiteturas 3D não fornecem necessariamente similaridade morfológica com as criptas in vivo. demarcada.Embora os canais superiores superiores no chip levem ao aumento da altura do epitélio de microengenharia, a altura máxima ainda é limitada a ~300–400 µm.A profundidade real das criptas intestinais humanas nos intestinos delgado e grosso é ~135 µm e ~400 µm, respectivamente, e a altura das vilosidades do intestino delgado é ~600 µm41.
Do ponto de vista da imagem, imagens de super-resolução in situ de microarquiteturas 3D podem ser limitadas ao intestino em um chip, uma vez que a distância de trabalho necessária da lente objetiva à camada epitelial é da ordem de alguns milímetros. Para superar esse problema, pode ser necessária uma objetiva distante. cada camada, é extremamente desafiador abrir ou remover a camada superior para examinar a estrutura da superfície da camada epitelial. Por exemplo, usando um microscópio eletrônico de varredura (SEM).
A hidrofobicidade do PDMS tem sido um fator limitante em estudos microfluídicos que lidam com pequenas moléculas hidrofóbicas, uma vez que o PDMS pode adsorver inespecificamente essas moléculas hidrofóbicas. Alternativas ao PDMS podem ser consideradas com outros materiais poliméricos. Alternativamente, a modificação da superfície do PDMS (por exemplo, revestimento com materiais lipofílicos 42 ou poli(etileno glicol) 43) pode ser considerada para minimizar a adsorção de moléculas hidrofóbicas.
Finalmente, nosso método não foi bem caracterizado em termos de fornecer uma triagem de alto rendimento ou uma plataforma experimental amigável de tamanho único. O protocolo atual requer uma bomba de seringa por microdispositivo, que ocupa espaço em uma incubadora de CO2 e evita experimentos em grande escala.
Para induzir a morfogênese 3D do epitélio intestinal humano in vitro, usamos um dispositivo intestinal de chip microfluídico contendo dois microcanais paralelos e uma membrana porosa elástica entre eles para criar uma interface lúmen-capilar. fluxo para remover os antagonistas morfogênicos do compartimento basolateral. Todo o procedimento experimental (Figura 1) consiste em cinco partes: (i) microfabricação do chip intestinal ou chip híbrido inserível Transwell (etapas 1-5; Caixa 1), (ii) preparação de células epiteliais intestinais (células Caco-2) ou organoides intestinais humanos;caixas 2-5), (iii) cultura de células epiteliais intestinais em chips intestinais ou chips híbridos (etapas 6-9), (iv) indução de morfogênese 3D in vitro (etapa 10) e (v)) para caracterizar a microestrutura epitelial 3D (etapas 11-24). controles temporais, condicionais ou processuais.
Usamos duas plataformas de cultura diferentes: gut-on-a-chip com canais retos ou canais convolutos não lineares, ou chips híbridos contendo inserções Transwell (TW) em um dispositivo microfluídico, fabricado conforme descrito na Caixa 1 e etapa 1 -5. morfogênese in vitro" mostra as etapas gerais nas quais células epiteliais Caco-2 ou derivadas de organoides são cultivadas em um chip intestinal ou em inserções Transwell de um chip híbrido, seguidas pela indução da morfogênese 3D e a formação de uma estrutura epitelial caracterizada. O número da etapa do programa ou o número da caixa é exibido abaixo de cada seta. s e modelagem de doenças. Imagens de imunofluorescência em "Diferenciação Celular" mostrando núcleos, F-actina e MUC2 expressos na camada epitelial 3D Caco-2 gerada no chip intestinal. A sinalização MUC2 está presente em células caliciformes e muco secretado de superfícies mucosas. em "Host-Microbe Co-Cultures" mostram co-culturas representativas do hospedeiro-microbioma no intestino em um chip. O painel esquerdo mostra a co-cultura de E. coli expressando proteína fluorescente verde (GFP) com células epiteliais 3D Caco-2 microengenhadas. i (azul). A modelagem da doença ilustra o intestino saudável versus permeável em chips de inflamação intestinal sob desafio fisiológico com antígenos bacterianos (por exemplo, lipopolissacarídeo, LPS) e células imunes (por exemplo, PBMC;verde). Células Caco-2 foram cultivadas para estabelecer uma camada epitelial 3D. Barra de escala, 50 µm. Imagens na linha inferior: “Diferenciação de células” adaptada com permissão da referência.2.Imprensa da Universidade de Oxford;Reproduzido com permissão de Ref.5.NAS;“Host-Microbe Co-Culture” adaptado com permissão de ref.3.NAS;“Modelagem de doenças” adaptado com permissão de referência.5.NAS.
Os chips gut-on-chip e híbridos foram fabricados usando réplicas de PDMS que foram desmoldadas de moldes de silício por litografia macia1,44 e padronizadas com SU-8. O projeto dos microcanais em cada chip é determinado considerando a hidrodinâmica, como tensão de cisalhamento e pressão hidrodinâmica1,4,12. -a-chip (dados estendidos Fig. 1b) que inclui um par de microcanais curvos para induzir maior tempo de residência de fluido, padrões de fluxo não lineares e deformação multiaxial de células cultivadas (Fig. 2a–f) 12. Quando biomecânicas intestinais mais complexas precisam ser recriadas, o complexo gut-on-a-chips pode ser escolhido. grau de crescimento epitelial em comparação com o Gut-Chip original, independentemente do tipo de célula cultivada. Portanto, para induzir a morfogênese 3D, designs de intestino em chip lineares e complexos são intercambiáveis. Réplicas de PDMS curadas em moldes de silício com padrões SU-8 forneceram características negativas após a desmoldagem (Fig.2a). Para fabricar o intestino em um chip, a camada superior preparada de PDMS foi ligada sequencialmente a um filme poroso de PDMS e, em seguida, alinhada com a camada inferior de PDMS por ligação irreversível usando um tratador de coroa (Fig. 2b-f). Para fabricar chips híbridos, réplicas de PDMS curadas foram ligadas a lâminas de vidro para criar dispositivos microfluídicos de canal único que podem acomodar inserções Transwell (Fig. 2h e dados estendidos Fig. 2). O processo de ligação é realizado por tratamento as superfícies da réplica do PDMS e vidro com plasma de oxigênio ou tratamento corona. Após a esterilização do dispositivo microfabricado acoplado ao tubo de silicone, a configuração do dispositivo estava pronta para realizar a morfogênese 3D do epitélio intestinal (Figura 2g).
a, Ilustração esquemática da preparação de peças de PDMS a partir de moldes de silício com padrão SU-8. A solução de PDMS não curada foi derramada em um molde de silício (esquerda), curada a 60 °C (meio) e desmoldada (direita). componentes PDMS superiores e inferiores e o dispositivo intestinal no chip montado.e, Esquema do alinhamento dos componentes PDMS superior, membrana e inferior.Cada camada é irreversivelmente ligada por plasma ou tratamento corona.f, Esquema do dispositivo de intestino em um chip fabricado com microcanais contorcidos sobrepostos e câmaras de vácuo.g, Configuração de intestino em um chip para cultura de células microfluídicas. O intestino fabricado em um chip montado com um tubo de silicone e seringa foi colocado em uma tampa lábio.O dispositivo de chip foi colocado na tampa de uma placa de Petri de 150 mm para processamento.O aglutinante é usado para fechar o tubo de silicone.h, Instantâneos visuais da fabricação do chip híbrido e morfogênese 3D usando chips híbridos.Inserções Transwell preparadas independentemente para cultivar monocamadas 2D de células epiteliais intestinais foram inseridas no chip híbrido para induzir a morfogênese 3D intestinal.O meio é perfundido através de microcanais abaixo da camada celular estabelecida na inserção Transwell.Barra de escala, 1 cm. h Reimpresso com permissão de reference.4.Elsevier.
Neste protocolo, a linha celular Caco-2 e os organoides intestinais foram usados ​​como fontes epiteliais (Fig. 3a). Ambos os tipos de células foram cultivados independentemente (Caixa 2 e Caixa 5) e usados ​​para semear os microcanais revestidos com ECM de intestino no chip ou inserções Transwell. ed para preparar suspensões de células dissociadas por fluido de tripsinização (caixa 2). Organoides intestinais humanos de biópsias intestinais ou ressecções cirúrgicas foram cultivados em cúpulas de estrutura de Matrigel em placas de 24 poços para suportar o microambiente estrutural. O meio contendo morfogênios essenciais (como Wnt, R-spondina e Noggin) e fatores de crescimento preparados conforme descrito na Caixa 3 foi suplementado a cada dois dias até que os organoides crescessem para ~ 500 µm de diâmetro. Fu organoides totalmente crescidos são colhidos e dissociados em células únicas para semeadura no intestino ou inserções Transwell em um chip (Caixa 5). protocolo otimizado na caixa 5 para cultivar organoides do cólon (coloides) que normalmente requerem concentrações mais altas de morfogênios do que organoides do intestino delgado.
a, Fluxo de trabalho para a indução da morfogênese intestinal no chip intestinal. O epitélio intestinal humano Caco-2 e os organoides intestinais são usados ​​neste protocolo para demonstrar a morfogênese 3D. As células epiteliais isoladas foram semeadas no dispositivo gut-on-a-chip preparado (preparação do chip). Uma vez que as células são semeadas (semeadas) e fixadas (anexadas) à membrana porosa de PDMS no dia 0 (D0), o fluxo apical (AP) é iniciado e mantido por os primeiros 2 dias (fluxo, AP, D0-D2). O fluxo basolateral (BL) também é iniciado junto com movimentos de alongamento cíclico (alongamento, fluxo, AP e BL) quando uma monocamada 2D completa é formada. A morfogênese 3D intestinal ocorreu espontaneamente após 5 dias de cultura microfluídica (morfogênese, D5). Imagens de contraste de fase mostram a morfologia representativa das células Caco-2 em cada etapa experimental ou ponto de tempo (gráfico de barras, 100 µm).F nossos diagramas esquemáticos ilustrando as cascatas correspondentes da morfogênese intestinal (canto superior direito). As setas tracejadas no esquema representam a direção do fluxo de fluido.b, imagem SEM mostrando a topologia da superfície do epitélio 3D Caco-2 estabelecido (esquerda). A inserção destacando a área ampliada (caixa tracejada branca) mostra as microvilosidades regeneradas na camada 3D Caco-2 (direita).c, visão frontal horizontal do Caco-2 3D estabelecido, claudina (ZO-1 , vermelho) e membranas de borda em escova contínua rotuladas como F-actina (verde) e núcleos (azul) Visualização confocal de imunofluorescência de células epiteliais em chips intestinais. Setas apontando para o esquema do meio indicam a localização do plano focal para cada visualização confocal. ificação da imagem fornecida.e, fotomicrografia DIC de epitélio 3D organoide estabelecido no intestino em corte obtido no dia 7.f, imagens de imunofluorescência sobrepostas mostrando marcadores para células-tronco (LGR5;magenta), células caliciformes (MUC2; verde), F-actina (cinza) e núcleos (ciano) cultivados em lascas intestinais por 3 dias, respectivamente (esquerda) e organoides de 13 dias (meio) na camada epitelial. Consulte também Dados Estendidos Figura 3, que destaca a sinalização LGR5 sem sinalização MUC2. Imagens de fluorescência mostrando a microestrutura epitelial (direita) do epitélio organoide 3D estabelecido no intestino em um chip por mancha ing a membrana plasmática com corante CellMask (à direita) no dia 13 da cultura. A barra de escala é de 50 μm, salvo indicação em contrário.b Reimpresso com permissão da referência.2.Imprensa da Universidade de Oxford;c Adaptado com permissão de Reference.2.Imprensa da Universidade de Oxford;eef adaptados com permissão por referência.12 Sob licença Creative Commons CC BY 4.0.
No intestino em um chip, é necessário modificar a superfície hidrofóbica da membrana porosa de PDMS para revestimento de ECM bem-sucedido. Neste protocolo, aplicamos dois métodos diferentes para modificar a hidrofobicidade de membranas de PDMS. funcionalização da superfície para alcançar a deposição eficiente de proteínas ECM aplicando sequencialmente polietilenoimina (PEI) e glutaraldeído aos microcanais PDMS. Após a modificação da superfície, as proteínas ECM foram depositadas para cobrir a superfície funcionalizada do PDMS e, em seguida, introduzidas no epitélio organoide isolado. O revestimento ECM permite a fixação do epitélio organoide para induzir a morfogênese 3D na superfície do PDMS.
As culturas Transwell também requerem revestimento ECM antes da semeadura celular;no entanto, as culturas Transwell não requerem etapas complexas de pré-tratamento para ativar a superfície de inserções porosas. Para o cultivo de células Caco-2 em inserções Transwell, o revestimento ECM em inserções porosas acelera a fixação de células Caco-2 dissociadas (<1 hora) e a formação de barreira de junção compacta (<1-2 dias). com integridade de barreira. As culturas transwell são realizadas em placas de 24 poços sem o uso de chips híbridos.
A morfogênese 3D in vitro pode ser iniciada pela aplicação de fluxo de fluido ao aspecto basolateral de uma camada epitelial estabelecida. No intestino em um chip, a morfogênese epitelial começou quando o meio foi perfundido nos microcanais superiores e inferiores (Fig. 3a). Conforme descrito anteriormente, é fundamental introduzir fluxo de fluido no compartimento inferior (basolateral) para remoção contínua de inibidores de morfogênio secretados direcionais. estresse, normalmente aplicamos fluxo duplo no intestino em um chip.Em chips híbridos, insertos Transwell contendo monocamadas epiteliais foram inseridos nos chips híbridos. Em seguida, o meio foi aplicado sob o lado basolateral do inserto Transwell poroso através do microcanal. A morfogênese intestinal ocorreu 3-5 dias após o início do fluxo basolateral em ambas as plataformas de cultura.
As características morfológicas das camadas epiteliais 3D de microengenharia podem ser analisadas pela aplicação de várias modalidades de imagem, incluindo microscopia de contraste de fase, microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC), SEM ou microscopia confocal de imunofluorescência (Figuras 3 e 4). -on-a-chip e plataformas de chip híbrido podem fornecer imagens in situ em tempo real sem a necessidade de seccionar ou desmontar o dispositivo. Ao realizar imagens de imunofluorescência (Figuras 1, 3c, f e 4b, c), as células são normalmente fixadas com 4% (peso/vol) de paraformaldeído (PFA), seguido de Triton X-100 e 2% (peso/vol) de albumina de soro bovino (BSA), em ordem. Dependendo do tipo de célula , diferentes fixadores, permeabilizadores e agentes de bloqueio podem ser usados. Anticorpos primários direcionados a células dependentes de linhagem ou marcadores de região são usados ​​para destacar células imobilizadas in situ no chip, seguidos por anticorpos secundários juntamente com um corante de contraste direcionado a núcleo (por exemplo, 4',6-diamidino-2-fenileno) indol, DAPI) ou F-actina (por exemplo, faloidina marcada com fluorescência). Imagens ao vivo baseadas em fluorescência também podem ser realizadas in situ para detectar a produção de muco ( Fig.1, "Diferenciação celular" e "Fisiologia do intestino"), colonização aleatória de células microbianas (Fig. 1, "Cocultura hospedeiro-micróbio"), o recrutamento de células imunes (Fig. 1, 'Modelagem de doenças') ou os contornos da morfologia epitelial 3D (Fig. 3c,f e 4b,c). Ao modificar o intestino no chip para separar a camada superior da camada inferior do microcanal, conforme descrito na ref. Como mostrado na Fig. 2, a morfologia epitelial 3D, bem como as microvilosidades na borda em escova apical, podem ser visualizadas por SEM (Fig. 3b). A expressão de marcadores de diferenciação pode ser avaliada realizando PCR5 quantitativo ou sequenciamento de RNA de célula única.
a, Fluxo de trabalho para a indução da morfogênese intestinal em um chip híbrido. Caco-2 e organoides intestinais são usados ​​neste protocolo para demonstrar a morfogênese 3D em uma plataforma de chip híbrido. Células epiteliais dissociadas foram semeadas em inserções Transwell preparadas (preparação TW; veja a figura abaixo). Uma vez que as células foram semeadas (semeadas) e ligadas a membranas de poliéster em inserções Transwell, todas as células foram cultivadas sob condições estáticas (cultura TW). Após 7 dias, uma única inserção Transwell contendo um A monocamada 2D de células epiteliais foi integrada em um chip híbrido para introduzir um fluxo basolateral (Flow, BL), que levou à geração de uma camada epitelial 3D (morfogênese). Micrografias de contraste de fase mostrando características morfológicas de células epiteliais de órgãos humanos derivadas de doador normal (linha C103) do cólon ascendente em cada etapa experimental ou ponto de tempo. Os esquemas nas camadas superiores ilustram a configuração experimental para cada etapa.b, Chips híbridos (esquema esquerdo) podem levar a Morfogênese 3D de células epiteliais organóides com vistas de microscopia confocal de cima para baixo tomadas em diferentes posições Z (superior, médio e inferior;veja o esquema à direita e as linhas pontilhadas correspondentes).mostrou características morfológicas óbvias. F-actina (ciano), núcleo (cinza).c, micrografias confocais de fluorescência (visão angular 3D) de células epiteliais derivadas de organoides cultivadas em Transwell estático (TW; inserção dentro da caixa tracejada branca) versus chip híbrido (maior plano completo) comparando morfologia 2D versus 3D, respectivamente. features.Scale bar, 100 µm.c Reimpresso com permissão de reference.4.Elsevier.
Os controles podem ser preparados cultivando as mesmas células (Caco-2 ou células epiteliais organoides intestinais) em monocamadas bidimensionais sob condições convencionais de cultura estática. Notavelmente, a depleção de nutrientes pode resultar devido à capacidade de volume limitada dos microcanais (ou seja, ~4 µL no canal superior no design original do chip intestinal). Portanto, a morfologia epitelial antes e depois da aplicação do fluxo basolateral também pode ser comparada.
O processo de litografia macia deve ser realizado em uma sala limpa. Para cada camada no chip (camadas superiores e inferiores e membranas) e chips híbridos, diferentes fotomáscaras foram usadas e fabricadas em wafers de silício separados porque as alturas dos microcanais eram diferentes.
Coloque um wafer de silício de 3 polegadas em um prato com acetona. Agite suavemente o prato por 30 segundos, depois seque o wafer ao ar. Transfira o wafer para um prato com IPA e gire o prato por 30 s para limpar.
Uma solução de piranha (mistura de peróxido de hidrogênio e ácido sulfúrico concentrado, 1:3 (vol/vol)) pode opcionalmente ser usada para maximizar a remoção de resíduos orgânicos da superfície do wafer de silício.
A solução Piranha é extremamente corrosiva e gera calor. Precauções de segurança adicionais são necessárias. Para descarte de resíduos, deixe a solução esfriar e transfira para um recipiente de resíduos limpo e seco. Use recipientes secundários e rotule adequadamente os recipientes de resíduos. Siga as diretrizes de segurança da instalação para obter procedimentos mais detalhados.
Desidratar os wafers colocando-os em uma chapa aquecida a 200 °C por 10 min. Após a desidratação, o wafer foi agitado cinco vezes ao ar para resfriar.
Despeje ~10 g de fotorresiste SU-8 2100 no centro do wafer de silicone limpo. Use uma pinça para espalhar o fotorresiste uniformemente no wafer.
O SU-8 foi distribuído uniformemente no wafer executando o revestimento giratório. Programe uma rotação de entrada do SU-8 por 5 a 10 s para propagar a 500 rpm a uma aceleração de 100 rpm/s. Defina o giro principal para um padrão de espessura de 200 µm a 1.500 rpm ou atinja uma espessura de 250 µm (fazendo uma altura de 500 µm para a camada superior do intestino no chip; consulte “Etapas críticas” abaixo) definido em uma aceleração de 300 rpm/s 30 segundos a 1.200 rpm.
A velocidade de rotação principal pode ser ajustada de acordo com a espessura alvo do padrão SU-8 no wafer de silício.
Para fabricar padrões SU-8 de 500 µm de altura para a camada superior do intestino no chip, as etapas de revestimento giratório e cozimento suave desta caixa (etapas 7 e 8) foram repetidas sequencialmente (consulte a etapa 9) para produzir duas camadas de 250 µm Uma camada espessa de SU-8, que pode ser colocada em camadas e unida por exposição a UV na etapa 12 desta caixa, formando uma camada de 500 µm de altura.
Asse suavemente os wafers revestidos com SU-8 colocando cuidadosamente os wafers em uma placa quente a 65 ° C por 5 min, depois mude a configuração para 95 ° C e incube por mais 40 min.
Para atingir uma altura de 500 mm do padrão SU-8 no microcanal superior, repita as etapas 7 e 8 para gerar duas camadas SU-8 de 250 mm de espessura.
Usando o UV Mask Aligner, realize um teste de lâmpada de acordo com as instruções do fabricante para calcular o tempo de exposição do wafer. (tempo de exposição, ms) = (dose de exposição, mJ/cm2)/(potência da lâmpada, mW/cm2).
Depois de determinar o tempo de exposição, coloque a fotomáscara no suporte de máscara do alinhador de máscara UV e coloque a fotomáscara no wafer revestido com SU-8.
Coloque a superfície impressa da fotomáscara diretamente no lado revestido com SU-8 da pastilha de silício para minimizar a dispersão de UV.
Exponha o wafer revestido com SU-8 e a fotomáscara verticalmente a 260 mJ/cm2 de luz UV durante o tempo de exposição predeterminado (consulte a etapa 10 desta caixa).
Após a exposição aos raios UV, wafers de silício revestidos com SU-8 foram cozidos a 65°C por 5 min e 95°C por 15 min em cada placa quente para fabricar padrões com uma altura de 200 μm. Estenda o tempo pós-cozimento de 95 °C a 30 min para fabricar padrões com uma altura de 500 µm.
O revelador é despejado em um prato de vidro e o wafer assado é colocado no prato. O volume do revelador SU-8 pode variar dependendo do tamanho da placa de vidro. Certifique-se de usar revelador SU-8 suficiente para remover completamente o SU-8 não exposto.
Enxágue o molde desenvolvido com ~ 10 mL de revelador fresco seguido de IPA pulverizando a solução usando uma pipeta.
Coloque o wafer em um limpador de plasma e exponha ao plasma de oxigênio (gás atmosférico, pressão alvo 1 × 10−5 Torr, potência 125 W) por 1,5 min.
Coloque a bolacha em um dessecador a vácuo com uma lâmina de vidro dentro. Bolachas e lâminas podem ser colocadas lado a lado. Se o dessecador a vácuo for dividido em várias camadas por uma placa, coloque as lâminas na câmara inferior e as bolachas na câmara superior. Coloque 100 μL de solução de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil)silano em uma lâmina de vidro e aplique vácuo para silanização.
Descongele um frasco de células Caco-2 congeladas em banho-maria a 37°C, depois transfira as células descongeladas para um balão T75 contendo 15 mL de meio Caco-2 pré-aquecido a 37°C.
Para passar as células Caco-2 em ~ 90% de confluência, primeiro meio Caco-2 quente, PBS e 0,25% tripsina/1 mM EDTA em banho-maria a 37°C.
Aspire o meio por aspiração a vácuo. Lave as células duas vezes com 5 mL de PBS quente, repetindo a aspiração a vácuo e adicionando PBS fresco.