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A evolução dos parasitas microbianos envolve uma ação contrária entre a seleção natural, que faz com que os parasitas melhorem, e a deriva genética, que faz com que os parasitas percam genes e acumulem mutações deletérias.Aqui, para entender como essa ação contrária ocorre na escala de uma única macromolécula, descrevemos a estrutura crio-EM do ribossomo de Encephalitozoon cuniculi, um organismo eucariótico com um dos menores genomas da natureza.A redução extrema de rRNA nos ribossomos de E. cuniculi é acompanhada por mudanças estruturais sem precedentes, como a evolução de ligantes de rRNA fundidos anteriormente desconhecidos e rRNA sem protuberâncias.Além disso, o ribossomo de E. cuniculi sobreviveu à perda de fragmentos de rRNA e proteínas, desenvolvendo a capacidade de usar moléculas pequenas como imitadores estruturais de fragmentos e proteínas de rRNA degradados.No geral, mostramos que as estruturas moleculares que se pensava serem reduzidas, degeneradas e sujeitas a mutações debilitantes têm vários mecanismos compensatórios que as mantêm ativas, apesar das contrações moleculares extremas.
Como a maioria dos grupos de parasitas microbianos possui ferramentas moleculares exclusivas para explorar seus hospedeiros, muitas vezes temos que desenvolver diferentes terapias para diferentes grupos de parasitas1,2.No entanto, novas evidências sugerem que alguns aspectos da evolução do parasita são convergentes e amplamente previsíveis, indicando uma base potencial para amplas intervenções terapêuticas em parasitas microbianos3,4,5,6,7,8,9.
Trabalhos anteriores identificaram uma tendência evolutiva comum em parasitas microbianos chamada redução do genoma ou degradação do genoma10,11,12,13.Pesquisas atuais mostram que, quando os microorganismos desistem de seu estilo de vida livre e se tornam parasitas intracelulares (ou endossimbiontes), seus genomas sofrem metamorfoses lentas, mas surpreendentes, ao longo de milhões de anos9,11.Em um processo conhecido como degradação do genoma, os parasitas microbianos acumulam mutações deletérias que transformam muitos genes anteriormente importantes em pseudogenes, levando à perda gradual de genes e ao colapso mutacional14,15.Esse colapso pode destruir até 95% dos genes nos organismos intracelulares mais antigos em comparação com espécies de vida livre intimamente relacionadas.Assim, a evolução dos parasitas intracelulares é um cabo de guerra entre duas forças opostas: a seleção natural darwiniana, levando ao aperfeiçoamento dos parasitas, e o colapso do genoma, jogando os parasitas no esquecimento.Ainda não está claro como o parasita conseguiu emergir desse cabo de guerra e reter a atividade de sua estrutura molecular.
Embora o mecanismo de decaimento do genoma não seja totalmente compreendido, parece ocorrer principalmente devido à frequente deriva genética.Como os parasitas vivem em populações pequenas, assexuadas e geneticamente limitadas, eles não podem eliminar com eficácia as mutações deletérias que às vezes ocorrem durante a replicação do DNA.Isso leva ao acúmulo irreversível de mutações prejudiciais e à redução do genoma do parasita.Com isso, o parasita não perde apenas genes que não são mais necessários para sua sobrevivência no ambiente intracelular.É a incapacidade das populações de parasitas de eliminar efetivamente mutações deletérias esporádicas que faz com que essas mutações se acumulem em todo o genoma, incluindo seus genes mais importantes.
Muito do nosso conhecimento atual sobre a redução do genoma é baseado apenas em comparações de sequências genômicas, com menos atenção às mudanças em moléculas reais que desempenham funções de manutenção e servem como potenciais alvos de drogas.Estudos comparativos mostraram que a carga de mutações microbianas intracelulares deletérias parece predispor proteínas e ácidos nucleicos a se dobrarem e se agregarem, tornando-os mais dependentes de acompanhantes e hipersensíveis ao calor19,20,21,22,23.Além disso, vários parasitas - evolução independente às vezes separados por até 2,5 bilhões de anos - experimentaram uma perda semelhante de centros de controle de qualidade em sua síntese de proteínas5,6 e mecanismos de reparo de DNA24.No entanto, pouco se sabe sobre o impacto do estilo de vida intracelular em todas as outras propriedades das macromoléculas celulares, incluindo a adaptação molecular a uma carga crescente de mutações deletérias.
Neste trabalho, para melhor compreender a evolução de proteínas e ácidos nucléicos de microrganismos intracelulares, determinamos a estrutura de ribossomos do parasita intracelular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi é um organismo semelhante a um fungo pertencente a um grupo de microsporídios parasitas que possuem genomas eucarióticos incomumente pequenos e, portanto, são usados ​​como organismos modelo para estudar a degradação do genoma25,26,27,28,29,30.Recentemente, a estrutura do ribossomo crio-EM foi determinada para genomas moderadamente reduzidos de Microsporidia, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (genoma de ~3,2 Mb).Essas estruturas sugerem que alguma perda de amplificação do rRNA é compensada pelo desenvolvimento de novos contatos entre proteínas ribossomais vizinhas ou pela aquisição de novas proteínas ribossomais msL131,32.As espécies Encephalitozoon (genoma ~2,5 milhões de pb), juntamente com seu parente mais próximo Ordospora, demonstram o grau máximo de redução do genoma em eucariotos - eles têm menos de 2.000 genes codificadores de proteínas, e espera-se que seus ribossomos não sejam apenas desprovidos de fragmentos de expansão de rRNA (fragmentos de rRNA que distinguem ribossomos eucarióticos de ribossomos bacterianos) também tenham quatro proteínas ribossômicas devido à falta de homólogos no E. cuniculi genoma26,27,28.Portanto, concluímos que o ribossomo de E. cuniculi pode revelar estratégias previamente desconhecidas para a adaptação molecular ao decaimento do genoma.
Nossa estrutura crio-EM representa o menor ribossomo citoplasmático eucariótico a ser caracterizado e fornece informações sobre como o grau final de redução do genoma afeta a estrutura, montagem e evolução da maquinaria molecular que é parte integrante da célula.Descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi viola muitos dos princípios amplamente conservados de dobramento de RNA e montagem de ribossomo e descobrimos uma nova proteína ribossômica anteriormente desconhecida.Inesperadamente, mostramos que os ribossomos de microsporídios desenvolveram a capacidade de se ligar a pequenas moléculas e levantamos a hipótese de que truncamentos em rRNA e proteínas desencadeiam inovações evolutivas que podem, em última análise, conferir qualidades úteis ao ribossomo.
Para melhorar nossa compreensão da evolução de proteínas e ácidos nucléicos em organismos intracelulares, decidimos isolar esporos de E. cuniculi de culturas de células de mamíferos infectadas para purificar seus ribossomos e determinar a estrutura desses ribossomos.É difícil obter um grande número de microsporídios parasitas porque os microsporídios não podem ser cultivados em meio nutriente.Em vez disso, eles crescem e se reproduzem apenas dentro da célula hospedeira.Portanto, para obter biomassa de E. cuniculi para purificação de ribossomos, infectamos a linha celular de rim de mamífero RK13 com esporos de E. cuniculi e cultivamos essas células infectadas por várias semanas para permitir que E. cuniculi crescesse e se multiplicasse.Usando uma monocamada de células infectadas de cerca de meio metro quadrado, conseguimos purificar cerca de 300 mg de esporos de Microsporidia e usá-los para isolar ribossomos.Em seguida, interrompemos os esporos purificados com esferas de vidro e isolamos os ribossomos brutos usando fracionamento gradual de polietileno glicol dos lisados.Isso nos permitiu obter aproximadamente 300 µg de ribossomos brutos de E. cuniculi para análise estrutural.
Em seguida, coletamos imagens cryo-EM usando as amostras de ribossomos resultantes e processamos essas imagens usando máscaras correspondentes à subunidade ribossômica grande, cabeça da subunidade pequena e subunidade pequena.Durante este processo, coletamos imagens de cerca de 108.000 partículas ribossômicas e computamos imagens crio-EM com uma resolução de 2,7 Å (Figuras complementares 1-3).Em seguida, usamos imagens cryoEM para modelar rRNA, proteína ribossomal e fator de hibernação Mdf1 associado a ribossomos de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estrutura do ribossomo de E. cuniculi em complexo com o fator de hibernação Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa do fator de hibernação Mdf1 associado ao ribossomo de E. cuniculi.c Mapa de estrutura secundária comparando o rRNA recuperado em espécies de Microsporidian com estruturas ribossômicas conhecidas.Os painéis mostram a localização dos fragmentos de rRNA amplificados (ES) e locais ativos de ribossomos, incluindo o local de decodificação (DC), o loop de sarcinicina (SRL) e o centro de peptidil transferase (PTC).d A densidade eletrônica correspondente ao centro da peptidil transferase do ribossomo de E. cuniculi sugere que este sítio catalítico tem a mesma estrutura no parasita E. cuniculi e seus hospedeiros, incluindo H. sapiens.e, f A densidade eletrônica correspondente do centro de decodificação (e) e a estrutura esquemática do centro de decodificação (f) indicam que E. cuniculi tem resíduos U1491 em vez de A1491 (numeração de E. coli) em muitos outros eucariotos.Essa alteração sugere que E. cuniculi pode ser sensível a antibióticos que visam esse local ativo.
Em contraste com as estruturas previamente estabelecidas dos ribossomos de V. necatrix e P. locustae (ambas as estruturas representam a mesma família de microsporídios Nosematidae e são muito semelhantes entre si), 31,32 os ribossomos de E. cuniculi sofrem numerosos processos de rRNA e fragmentação de proteínas.Desnaturação adicional (Figuras complementares 4-6).No rRNA, as alterações mais marcantes incluíram a perda completa do fragmento de rRNA 25S amplificado ES12L e a degeneração parcial das hélices h39, h41 e H18 (Fig. 1c, Fig. 4 complementar).Entre as proteínas ribossômicas, as alterações mais marcantes incluíram a perda completa da proteína eS30 e o encurtamento das proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 e eS7 (Figuras complementares 4, 5).
Assim, a extrema redução dos genomas das espécies de Encephalotozoon/Ordospora se reflete em sua estrutura de ribossomos: os ribossomos de E. cuniculi experimentam a perda mais dramática de conteúdo proteico em ribossomos citoplasmáticos eucarióticos sujeitos a caracterização estrutural, e eles nem mesmo possuem aqueles fragmentos de rRNA e proteínas que são amplamente conservados não apenas em eucariotos, mas também nos três domínios da vida.A estrutura do ribossomo de E. cuniculi fornece o primeiro modelo molecular para essas mudanças e revela eventos evolutivos que foram negligenciados tanto pela genômica comparativa quanto pelos estudos da estrutura biomolecular intracelular (Fig. 7 complementar).Abaixo, descrevemos cada um desses eventos, juntamente com suas prováveis ​​origens evolutivas e seu impacto potencial na função do ribossomo.
Descobrimos então que, além de grandes truncamentos de rRNA, os ribossomos de E. cuniculi apresentam variações de rRNA em um de seus sítios ativos.Embora o centro da peptidil transferase do ribossomo de E. cuniculi tenha a mesma estrutura de outros ribossomos eucarióticos (Fig. 1d), o centro de decodificação difere devido à variação da sequência no nucleotídeo 1491 (numeração de E. coli, Fig. 1e, f).Essa observação é importante porque o local de decodificação dos ribossomos eucarióticos normalmente contém os resíduos G1408 e A1491 em comparação com os resíduos do tipo bacteriano A1408 e G1491.Essa variação está por trás da sensibilidade diferente dos ribossomos bacterianos e eucarióticos à família dos aminoglicosídeos de antibióticos ribossomais e outras pequenas moléculas que têm como alvo o local de decodificação.No local de decodificação do ribossomo de E. cuniculi, o resíduo A1491 foi substituído por U1491, criando potencialmente uma interface de ligação única para pequenas moléculas direcionadas a esse local ativo.A mesma variante A14901 também está presente em outros microsporídios, como P. locustae e V. necatrix, sugerindo que é comum entre as espécies de microsporídios (Fig. 1f).
Como nossas amostras de ribossomos de E. cuniculi foram isoladas de esporos metabolicamente inativos, testamos o mapa crio-EM de E. cuniculi para a ligação de ribossomos descrita anteriormente sob condições de estresse ou fome.Fatores de hibernação 31,32,36,37, 38. Comparamos a estrutura previamente estabelecida do ribossomo em hibernação com o mapa crio-EM do ribossomo de E. cuniculi.Para o docking, foram utilizados ribossomos de S. cerevisiae em complexo com fator de hibernação Stm138, ribossomos de gafanhoto em complexo com fator Lso232 e ribossomos de V. necatrix em complexo com fatores Mdf1 e Mdf231.Ao mesmo tempo, encontramos a densidade crio-EM correspondente ao fator de repouso Mdf1.Semelhante à ligação de Mdf1 ao ribossomo de V. necatrix, o Mdf1 também se liga ao ribossomo de E. cuniculi, onde bloqueia o sítio E do ribossomo, possivelmente ajudando a disponibilizar ribossomos quando os esporos do parasita tornam-se metabolicamente inativos após a inativação do corpo (Figura 2).).
Mdf1 bloqueia o sítio E do ribossomo, o que parece ajudar a inativar o ribossomo quando os esporos do parasita se tornam metabolicamente inativos.Na estrutura do ribossomo de E. cuniculi, descobrimos que o Mdf1 forma um contato até então desconhecido com a haste do ribossomo L1, a parte do ribossomo que facilita a liberação do tRNA desacilado do ribossomo durante a síntese de proteínas.Esses contatos sugerem que o Mdf1 se dissocia do ribossomo usando o mesmo mecanismo do tRNA desacetilado, fornecendo uma possível explicação de como o ribossomo remove o Mdf1 para reativar a síntese de proteínas.
No entanto, nossa estrutura revelou um contato desconhecido entre Mdf1 e a perna do ribossomo L1 (a parte do ribossomo que ajuda a liberar o tRNA desacilado do ribossomo durante a síntese de proteínas).Em particular, Mdf1 usa os mesmos contatos que o segmento de cotovelo da molécula desacilada de tRNA (Fig. 2).Essa modelagem molecular até então desconhecida mostrou que o Mdf1 se dissocia do ribossomo usando o mesmo mecanismo do tRNA desacetilado, o que explica como o ribossomo remove esse fator de hibernação para reativar a síntese de proteínas.
Ao construir o modelo de rRNA, descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi possui fragmentos de rRNA anormalmente dobrados, que chamamos de rRNA fundido (Fig. 3).Nos ribossomos que abrangem os três domínios da vida, o rRNA se dobra em estruturas nas quais a maioria das bases do rRNA forma pares de bases e se dobra entre si ou interage com proteínas ribossomais38,39,40.No entanto, nos ribossomos de E. cuniculi, os rRNAs parecem violar esse princípio de dobramento, convertendo algumas de suas hélices em regiões de rRNA desdobradas.
Estrutura da hélice H18 25S rRNA em S. cerevisiae, V. necatrix e E. cuniculi.Normalmente, nos ribossomos que abrangem os três domínios da vida, esse ligante se enrola em uma hélice de RNA que contém de 24 a 34 resíduos.Em Microsporidia, ao contrário, esse ligante de rRNA é gradualmente reduzido a dois ligantes ricos em uridina de fita simples contendo apenas 12 resíduos.A maioria desses resíduos é exposta a solventes.A figura mostra que os microsporídios parasitas parecem violar os princípios gerais do dobramento do rRNA, onde as bases do rRNA são geralmente acopladas a outras bases ou envolvidas nas interações rRNA-proteína.Nos microsporídios, alguns fragmentos de rRNA assumem um dobramento desfavorável, no qual a antiga hélice de rRNA torna-se um fragmento de fita simples alongado quase em linha reta.A presença dessas regiões incomuns permite que o microsporídio rRNA se ligue a fragmentos distantes de rRNA usando um número mínimo de bases de RNA.
O exemplo mais notável dessa transição evolutiva pode ser observado na hélice H18 25S rRNA (Fig. 3).Em espécies de E. coli a humanos, as bases dessa hélice de rRNA contêm 24-32 nucleotídeos, formando uma hélice ligeiramente irregular.Em estruturas ribossômicas previamente identificadas de V. necatrix e P. locustae,31,32 as bases da hélice H18 são parcialmente desenroladas, mas o pareamento das bases nucleotídicas é preservado.No entanto, em E. cuniculi este fragmento de rRNA torna-se os ligantes mais curtos 228UUUGU232 e 301UUUUUUUUU307.Ao contrário dos fragmentos de rRNA típicos, esses ligantes ricos em uridina não se enrolam ou fazem contato extenso com as proteínas ribossomais.Em vez disso, eles adotam estruturas abertas em solvente e totalmente desdobradas nas quais as fitas de rRNA são estendidas quase retas.Essa conformação esticada explica como E. cuniculi usa apenas 12 bases de RNA para preencher a lacuna de 33 Å entre as hélices de rRNA H16 e H18, enquanto outras espécies requerem pelo menos o dobro de bases de rRNA para preencher a lacuna.
Assim, podemos demonstrar que, através do dobramento energeticamente desfavorável, os microsporídios parasitas desenvolveram uma estratégia para contrair até mesmo aqueles segmentos de rRNA que permanecem amplamente conservados entre as espécies nos três domínios da vida.Aparentemente, ao acumular mutações que transformam hélices de rRNA em pequenos ligantes poli-U, E. cuniculi pode formar fragmentos de rRNA incomuns contendo o menor número possível de nucleotídeos para ligação de fragmentos de rRNA distais.Isso ajuda a explicar como os microsporídios conseguiram uma redução drástica em sua estrutura molecular básica sem perder sua integridade estrutural e funcional.
Outra característica incomum de E. cuniculi rRNA é o aparecimento de rRNA sem espessamentos (Fig. 4).Protuberâncias são nucleotídeos sem pares de bases que se torcem para fora da hélice de RNA em vez de se esconder nela.A maioria das saliências de rRNA atuam como adesivos moleculares, ajudando a ligar proteínas ribossomais adjacentes ou outros fragmentos de rRNA.Algumas das protuberâncias agem como dobradiças, permitindo que a hélice do rRNA se flexione e dobre de maneira ideal para a síntese produtiva de proteínas 41 .
a Uma protuberância de rRNA (numeração de S. cerevisiae) está ausente da estrutura do ribossomo de E. cuniculi, mas está presente na maioria dos outros eucariotos b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens e ribossomos internos de E. cuniculi.os parasitas carecem de muitas das antigas protuberâncias de rRNA altamente conservadas.Esses espessamentos estabilizam a estrutura do ribossomo;portanto, sua ausência nos microsporídios indica uma estabilidade reduzida do enovelamento do rRNA nos parasitas dos microsporídios.A comparação com os caules P (hastes L7/L12 em bactérias) mostra que a perda de protuberâncias de rRNA às vezes coincide com o aparecimento de novas protuberâncias próximas às protuberâncias perdidas.A hélice H42 no rRNA 23S/28S tem uma protuberância antiga (U1206 em Saccharomyces cerevisiae) estimada em pelo menos 3,5 bilhões de anos devido à sua proteção em três domínios da vida.Nos microsporídios, essa protuberância é eliminada.No entanto, uma nova protuberância apareceu ao lado da protuberância perdida (A1306 em E. cuniculi).
Surpreendentemente, descobrimos que os ribossomos de E. cuniculi carecem da maioria das protuberâncias de rRNA encontradas em outras espécies, incluindo mais de 30 protuberâncias conservadas em outros eucariotos (Fig. 4a).Essa perda elimina muitos contatos entre as subunidades ribossomais e as hélices de rRNA adjacentes, às vezes criando grandes vazios ocos no ribossomo, tornando o ribossomo de E. cuniculi mais poroso em comparação com os ribossomos mais tradicionais (Fig. 4b).Notavelmente, descobrimos que a maioria dessas protuberâncias também foi perdida nas estruturas de ribossomos de V. necatrix e P. locustae previamente identificadas, que foram negligenciadas por análises estruturais anteriores31,32.
Às vezes, a perda de protuberâncias de rRNA é acompanhada pelo desenvolvimento de novas protuberâncias próximas à protuberância perdida.Por exemplo, a haste P ribossomal contém uma protuberância U1208 (em Saccharomyces cerevisiae) que sobreviveu de E. coli para humanos e, portanto, é estimada em 3,5 bilhões de anos.Durante a síntese de proteínas, essa protuberância ajuda a haste P a se mover entre as conformações aberta e fechada para que o ribossomo possa recrutar fatores de tradução e entregá-los ao sítio ativo.Nos ribossomos de E. cuniculi, esse espessamento está ausente;no entanto, um novo espessamento (G883) localizado apenas em três pares de bases pode contribuir para a restauração da flexibilidade ótima da haste P (Fig. 4c).
Nossos dados sobre rRNA sem protuberâncias sugerem que a minimização de rRNA não se limita à perda de elementos de rRNA na superfície do ribossomo, mas também pode envolver o núcleo do ribossomo, criando um defeito molecular específico do parasita que não foi descrito em células de vida livre.espécies vivas são observadas.
Depois de modelar proteínas ribossomais canônicas e rRNA, descobrimos que os componentes ribossomais convencionais não podem explicar as três partes da imagem crio-EM.Dois desses fragmentos são moléculas pequenas em tamanho (Fig. 5, Suplementar Fig. 8).O primeiro segmento é colocado entre as proteínas ribossômicas uL15 e eL18 em uma posição geralmente ocupada pelo terminal C de eL18, que é encurtado em E. cuniculi.Embora não possamos determinar a identidade dessa molécula, o tamanho e a forma dessa ilha de densidade são bem explicados pela presença de moléculas de espermidina.Sua ligação ao ribossomo é estabilizada por mutações específicas de microsporídios nas proteínas uL15 (Asp51 e Arg56), que parecem aumentar a afinidade do ribossomo por essa pequena molécula, pois permitem que o uL15 envolva a pequena molécula em uma estrutura ribossomal.Figura suplementar 2).8, dados adicionais 1, 2).
Imagem Cryo-EM mostrando a presença de nucleotídeos fora da ribose ligada ao ribossomo de E. cuniculi.No ribossomo de E. cuniculi, este nucleotídeo ocupa o mesmo lugar que o nucleotídeo 25S rRNA A3186 (numeração de Saccharomyces cerevisiae) na maioria dos outros ribossomos eucarióticos.b Na estrutura ribossômica de E. cuniculi, esse nucleotídeo está localizado entre as proteínas ribossômicas uL9 e eL20, estabilizando assim o contato entre as duas proteínas.análise de conservação da sequência cd eL20 entre espécies de microsporídios.A árvore filogenética das espécies de Microsporidia (c) e o alinhamento múltiplo de sequência da proteína eL20 (d) mostram que os resíduos de ligação a nucleotídeos F170 e K172 são conservados na maioria dos Microsporidia típicos, com exceção de S. lophii, com exceção dos Microsporidia de ramificação precoce, que retiveram a extensão ES39L rRNA.e Esta figura mostra que os resíduos de ligação a nucleotídeos F170 e K172 estão presentes apenas em eL20 do genoma de microsporídios altamente reduzido, mas não em outros eucariotos.No geral, esses dados sugerem que os ribossomos de Microsporidian desenvolveram um sítio de ligação de nucleotídeo que parece ligar moléculas de AMP e usá-las para estabilizar as interações proteína-proteína na estrutura ribossômica.A alta conservação deste sítio de ligação em Microsporidia e sua ausência em outros eucariotos sugere que este sítio pode fornecer uma vantagem de sobrevivência seletiva para Microsporidia.Assim, o bolso de ligação de nucleotídeos no ribossomo microsporidia não parece ser uma característica degenerada ou forma final de degradação do rRNA como descrito anteriormente, mas sim uma inovação evolutiva útil que permite que o ribossomo microsporidia se ligue diretamente a pequenas moléculas, usando-as como blocos de construção molecular.blocos de construção dos ribossomos.Esta descoberta torna o ribossomo microsporidia o único ribossomo conhecido por usar um único nucleotídeo como seu bloco de construção estrutural.f Via evolutiva hipotética derivada da ligação de nucleotídeos.
A segunda densidade de baixo peso molecular está localizada na interface entre as proteínas ribossômicas uL9 e eL30 (Fig. 5a).Essa interface foi previamente descrita na estrutura do ribossomo de Saccharomyces cerevisiae como um sítio de ligação para o nucleotídeo 25S do rRNA A3186 (parte da extensão ES39L rRNA)38.Foi demonstrado que em ribossomos degenerados ES39L de P. locustae, esta interface se liga a um único nucleotídeo desconhecido 31, e assume-se que este nucleotídeo é uma forma final reduzida de rRNA, na qual o comprimento do rRNA é de ~ 130-230 bases.ES39L é reduzido a um único nucleotídeo 32.43.Nossas imagens cryo-EM suportam a ideia de que a densidade pode ser explicada por nucleotídeos.No entanto, a maior resolução de nossa estrutura mostrou que este nucleotídeo é uma molécula extraribossomal, possivelmente AMP (Fig. 5a, b).
Perguntamos então se o sítio de ligação do nucleotídeo aparecia no ribossomo de E. cuniculi ou se existia anteriormente.Como a ligação de nucleotídeos é mediada principalmente pelos resíduos Phe170 e Lys172 na proteína ribossomal eL30, avaliamos a conservação desses resíduos em 4396 eucariotos representativos.Como no caso de uL15 acima, descobrimos que os resíduos Phe170 e Lys172 são altamente conservados apenas em Microsporidia típicos, mas ausentes em outros eucariotos, incluindo Microsporidia atípicos Mitosporidium e Amphiamblys, nos quais o fragmento ES39L rRNA não é reduzido 44, 45, 46 (Fig. 5c).-e).
Tomados em conjunto, esses dados suportam a ideia de que E. cuniculi e possivelmente outros microsporídios canônicos desenvolveram a capacidade de capturar eficientemente um grande número de pequenos metabólitos na estrutura do ribossomo para compensar o declínio nos níveis de rRNA e proteína.Ao fazer isso, eles desenvolveram uma capacidade única de ligar nucleotídeos fora do ribossomo, mostrando que as estruturas moleculares parasitárias compensam capturando pequenos metabólitos abundantes e usando-os como imitadores estruturais de fragmentos degradados de RNA e proteínas..
A terceira parte não simulada do nosso mapa crio-EM, encontrada na grande subunidade ribossômica.A resolução relativamente alta (2,6 Å) do nosso mapa sugere que essa densidade pertence a proteínas com combinações únicas de grandes resíduos de cadeia lateral, o que nos permitiu identificar essa densidade como uma proteína ribossômica previamente desconhecida que identificamos como foi denominada msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (métodos, figura 6).Nossa pesquisa de homologia mostrou que msL2 é conservado no clado Microsporidia dos gêneros Encephaliter e Orosporidium, mas ausente em outras espécies, incluindo outros Microsporidia.Na estrutura ribossomal, msL2 ocupa uma lacuna formada pela perda do rRNA ES31L estendido.Nesse vazio, msL2 ajuda a estabilizar o dobramento do rRNA e pode compensar a perda de ES31L (Figura 6).
a Densidade eletrônica e modelo da proteína ribossomal específica de Microsporidia msL2 encontrada em ribossomos de E. cuniculi.b A maioria dos ribossomos eucarióticos, incluindo o ribossomo 80S de Saccharomyces cerevisiae, tem a amplificação do rRNA ES19L perdida na maioria das espécies de Microsporidian.A estrutura previamente estabelecida do ribossomo de V. necatrix microsporidia sugere que a perda de ES19L nestes parasitas é compensada pela evolução da nova proteína ribossomal msL1.Neste estudo, descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi também desenvolveu uma proteína mimetizadora de RNA ribossômico adicional como uma aparente compensação pela perda de ES19L.No entanto, msL2 (atualmente anotada como a hipotética proteína ECU06_1135) e msL1 têm diferentes origens estruturais e evolutivas.c Esta descoberta da geração de proteínas ribossômicas msL1 e msL2 não relacionadas evolutivamente sugere que, se os ribossomos acumularem mutações prejudiciais em seu rRNA, eles podem atingir níveis sem precedentes de diversidade de composição até mesmo em um pequeno subconjunto de espécies intimamente relacionadas.Essa descoberta pode ajudar a esclarecer a origem e a evolução do ribossomo mitocondrial, conhecido por seu rRNA altamente reduzido e pela variabilidade anormal na composição de proteínas entre as espécies.
Em seguida, comparamos a proteína msL2 com a proteína msL1 previamente descrita, a única proteína ribossômica específica de microsporídios conhecida encontrada no ribossomo de V. necatrix.Queríamos testar se msL1 e msL2 estão evolutivamente relacionados.Nossa análise mostrou que msL1 e msL2 ocupam a mesma cavidade na estrutura ribossomal, mas possuem diferentes estruturas primárias e terciárias, o que indica sua origem evolutiva independente (Fig. 6).Assim, nossa descoberta de msL2 fornece evidências de que grupos de espécies eucarióticas compactas podem evoluir independentemente proteínas ribossomais estruturalmente distintas para compensar a perda de fragmentos de rRNA.Esse achado é notável porque a maioria dos ribossomos eucarióticos citoplasmáticos contém uma proteína invariante, incluindo a mesma família de 81 proteínas ribossômicas.O aparecimento de msL1 e msL2 em vários clados de microsporídios em resposta à perda de segmentos estendidos de rRNA sugere que a degradação da arquitetura molecular do parasita faz com que os parasitas busquem mutações compensatórias, que podem eventualmente levar à sua aquisição em diferentes populações de parasitas.estruturas.
Finalmente, quando nosso modelo foi concluído, comparamos a composição do ribossomo de E. cuniculi com a prevista a partir da sequência do genoma.Várias proteínas ribossômicas, incluindo eL14, eL38, eL41 e eS30, foram anteriormente consideradas ausentes do genoma de E. cuniculi devido à aparente ausência de seus homólogos do genoma de E. cuniculi.A perda de muitas proteínas ribossômicas também é prevista na maioria dos outros parasitas intracelulares altamente reduzidos e endossimbiontes.Por exemplo, embora a maioria das bactérias de vida livre contenha a mesma família de 54 proteínas ribossômicas, apenas 11 dessas famílias de proteínas têm homólogos detectáveis ​​em cada genoma analisado de bactérias restritas ao hospedeiro.Em apoio a essa noção, uma perda de proteínas ribossômicas foi observada experimentalmente em microsporídios de V. necatrix e P. locustae, que não possuem as proteínas eL38 e eL4131,32.
No entanto, nossas estruturas mostram que apenas eL38, eL41 e eS30 estão realmente perdidos no ribossomo de E. cuniculi.A proteína eL14 foi conservada e nossa estrutura mostrou porque esta proteína não pôde ser encontrada na busca de homologia (Fig. 7).Nos ribossomos de E. cuniculi, a maior parte do sítio de ligação eL14 é perdida devido à degradação do ES39L amplificado por rRNA.Na ausência de ES39L, eL14 perdeu a maior parte de sua estrutura secundária e apenas 18% da sequência de eL14 era idêntica em E. cuniculi e S. cerevisiae.Essa pobre preservação da sequência é notável porque até Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens – organismos que evoluíram com 1,5 bilhão de anos de diferença – compartilham mais de 51% dos mesmos resíduos em eL14.Esta perda anômala de conservação explica por que E. cuniculi eL14 é atualmente anotada como a proteína M970_061160 putativa e não como a proteína ribossômica eL1427.
e O ribossomo de Microsporidia perdeu a extensão ES39L rRNA, que eliminou parcialmente o sítio de ligação da proteína ribossômica eL14.Na ausência de ES39L, a proteína do micrósporo eL14 sofre uma perda de estrutura secundária, na qual a antiga α-hélice de ligação ao rRNA degenera em um loop de comprimento mínimo.b O alinhamento múltiplo de sequência mostra que a proteína eL14 é altamente conservada em espécies eucarióticas (57% de identidade de sequência entre levedura e homólogos humanos), mas mal conservada e divergente em microsporídios (nos quais não mais de 24% dos resíduos são idênticos ao homólogo eL14).de S. cerevisiae ou H. sapiens).Esta pobre conservação de sequência e variabilidade de estrutura secundária explica porque o homólogo eL14 nunca foi encontrado em E. cuniculi e porque esta proteína foi perdida em E. cuniculi.Em contraste, E. cuniculi eL14 foi previamente anotado como uma proteína M970_061160 putativa.Esta observação sugere que a diversidade do genoma dos microsporídios está atualmente superestimada: alguns genes atualmente considerados perdidos nos microsporídios estão de fato preservados, embora em formas altamente diferenciadas;em vez disso, acredita-se que alguns codificam genes de microsporídios para proteínas específicas de vermes (por exemplo, a proteína hipotética M970_061160) na verdade codificam as proteínas muito diversas encontradas em outros eucariotos.
Esta descoberta sugere que a desnaturação de rRNA pode levar a uma perda dramática de conservação de sequência em proteínas ribossomais adjacentes, tornando essas proteínas indetectáveis ​​para pesquisas de homologia.Assim, podemos superestimar o grau real de degradação molecular em organismos de genoma pequeno, uma vez que algumas proteínas consideradas perdidas na verdade persistem, embora em formas altamente alteradas.
Como os parasitas podem manter a função de suas máquinas moleculares em condições de extrema redução do genoma?Nosso estudo responde a essa pergunta descrevendo a complexa estrutura molecular (ribossomo) de E. cuniculi, um organismo com um dos menores genomas eucarióticos.
Já se sabe há quase duas décadas que as moléculas de proteína e RNA em parasitas microbianos muitas vezes diferem de suas moléculas homólogas em espécies de vida livre porque carecem de centros de controle de qualidade, são reduzidas a 50% de seu tamanho em micróbios de vida livre, etc.muitas mutações debilitantes que prejudicam o dobramento e a função.Por exemplo, espera-se que os ribossomos de pequenos organismos de genoma, incluindo muitos parasitas intracelulares e endossimbiontes, careçam de várias proteínas ribossomais e até um terço dos nucleotídeos de rRNA em comparação com espécies de vida livre 27, 29, 30, 49.
Nosso estudo mostra que a estrutura das macromoléculas pode revelar muitos aspectos da evolução que são difíceis de extrair dos estudos genômicos comparativos tradicionais de parasitas intracelulares e outros organismos restritos ao hospedeiro (Fig. 7 complementar).Por exemplo, o exemplo da proteína eL14 mostra que podemos superestimar o real grau de degradação do aparato molecular em espécies parasitárias.Acredita-se agora que os parasitas encefalíticos tenham centenas de genes específicos de microsporídios.No entanto, nossos resultados mostram que alguns desses genes aparentemente específicos são, na verdade, apenas variantes muito diferentes de genes comuns em outros eucariontes.Além disso, o exemplo da proteína msL2 mostra como negligenciamos novas proteínas ribossômicas e subestimamos o conteúdo de máquinas moleculares parasitárias.O exemplo das pequenas moléculas mostra como podemos ignorar as inovações mais engenhosas em estruturas moleculares parasitárias que podem dar a elas uma nova atividade biológica.
Tomados em conjunto, esses resultados melhoram nossa compreensão das diferenças entre as estruturas moleculares de organismos restritos ao hospedeiro e suas contrapartes em organismos de vida livre.Mostramos que as máquinas moleculares, há muito consideradas reduzidas, degeneradas e sujeitas a várias mutações debilitantes, em vez disso têm um conjunto de características estruturais incomuns sistematicamente negligenciadas.
Por outro lado, os fragmentos de rRNA não volumosos e os fragmentos fundidos que encontramos nos ribossomos de E. cuniculi sugerem que a redução do genoma pode mudar até aquelas partes da maquinaria molecular básica que estão preservadas nos três domínios da vida – depois de quase 3,5 bilhões de anos.evolução independente das espécies.
Os fragmentos de rRNA sem protuberância e fundidos nos ribossomos de E. cuniculi são de particular interesse à luz de estudos anteriores de moléculas de RNA em bactérias endossimbióticas.Por exemplo, no endossimbionte do pulgão Buchnera aphidicola, foi demonstrado que as moléculas de rRNA e tRNA têm estruturas sensíveis à temperatura devido ao viés de composição A+T e uma alta proporção de pares de bases não canônicos20,50.Acredita-se que essas alterações no RNA, bem como nas moléculas de proteína, sejam responsáveis ​​pela dependência excessiva dos endossimbiontes em relação aos parceiros e pela incapacidade dos endossimbiontes de transferir calor 21, 23 .Embora o rRNA de microsporídios parasitários tenha mudanças estruturalmente distintas, a natureza dessas mudanças sugere que a estabilidade térmica reduzida e maior dependência de proteínas chaperonas podem ser características comuns de moléculas de RNA em organismos com genomas reduzidos.
Por outro lado, nossas estruturas mostram que os microsporídios do parasita desenvolveram uma capacidade única de resistir a rRNA e fragmentos de proteínas amplamente conservados, desenvolvendo a capacidade de usar pequenos metabólitos abundantes e prontamente disponíveis como imitadores estruturais de rRNA degenerado e fragmentos de proteínas.Degradação da estrutura molecular..Essa opinião é suportada pelo fato de que pequenas moléculas que compensam a perda de fragmentos proteicos no rRNA e nos ribossomos de E. cuniculi ligam-se a resíduos específicos de microsporídios nas proteínas uL15 e eL30.Isso sugere que a ligação de pequenas moléculas aos ribossomos pode ser um produto de seleção positiva, na qual mutações específicas de Microsporidia em proteínas ribossomais foram selecionadas por sua capacidade de aumentar a afinidade dos ribossomos por moléculas pequenas, o que pode levar a organismos ribossomais mais eficientes.A descoberta revela uma inovação inteligente na estrutura molecular dos parasitas microbianos e nos dá uma melhor compreensão de como as estruturas moleculares dos parasitas mantêm sua função apesar da evolução redutiva.
Atualmente, a identificação dessas pequenas moléculas permanece incerta.Não está claro por que a aparência dessas pequenas moléculas na estrutura ribossomal difere entre as espécies de microsporídios.Em particular, não está claro por que a ligação de nucleotídeos é observada nos ribossomos de E. cuniculi e P. locustae, e não nos ribossomos de V. necatrix, apesar da presença do resíduo F170 nas proteínas eL20 e K172 de V. necatrix.Essa deleção pode ser causada pelo resíduo 43 uL6 (localizado adjacente ao bolso de ligação do nucleotídeo), que é tirosina em V. necatrix e não treonina em E. cuniculi e P. locustae.A volumosa cadeia lateral aromática de Tyr43 pode interferir na ligação de nucleotídeos devido à sobreposição estérica.Alternativamente, a aparente deleção de nucleotídeos pode ser devida à baixa resolução da imagem crio-EM, o que dificulta a modelagem de fragmentos ribossomais de V. necatrix.
Por outro lado, nosso trabalho sugere que o processo de decaimento do genoma pode ser uma força inventiva.Em particular, a estrutura do ribossomo de E. cuniculi sugere que a perda de rRNA e fragmentos de proteínas no ribossomo de microsporídios cria uma pressão evolutiva que promove mudanças na estrutura do ribossomo.Essas variantes ocorrem longe do sítio ativo do ribossomo e parecem ajudar a manter (ou restaurar) a montagem ideal do ribossomo que, de outra forma, seria interrompida pelo rRNA reduzido.Isso sugere que uma grande inovação do ribossomo microsporidia parece ter evoluído para uma necessidade de tamponar a deriva gênica.
Talvez isso seja melhor ilustrado pela ligação de nucleotídeos, que nunca foi observada em outros organismos até agora.O fato de os resíduos de ligação de nucleotídeos estarem presentes em microsporídios típicos, mas não em outros eucariotos, sugere que os sítios de ligação de nucleotídeos não são apenas relíquias esperando para desaparecer, ou o sítio final para o rRNA ser restaurado na forma de nucleotídeos individuais.Em vez disso, este site parece um recurso útil que poderia ter evoluído ao longo de várias rodadas de seleção positiva.Os sítios de ligação de nucleotídeos podem ser um subproduto da seleção natural: uma vez que ES39L é degradado, os microsporídios são forçados a buscar compensação para restaurar a biogênese ideal do ribossomo na ausência de ES39L.Uma vez que este nucleótido pode imitar os contactos moleculares do nucleótido A3186 em ES39L, a molécula de nucleótido torna-se um bloco de construção do ribossoma, cuja ligação é ainda melhorada pela mutação da sequência eL30.
No que diz respeito à evolução molecular dos parasitas intracelulares, nosso estudo mostra que as forças da seleção natural darwiniana e a deriva genética da decadência do genoma não operam em paralelo, mas oscilam.Primeiro, a deriva genética elimina características importantes das biomoléculas, tornando a compensação extremamente necessária.Somente quando os parasitas satisfizerem essa necessidade por meio da seleção natural darwiniana, suas macromoléculas terão a chance de desenvolver suas características mais impressionantes e inovadoras.É importante ressaltar que a evolução dos sítios de ligação de nucleotídeos no ribossomo de E. cuniculi sugere que esse padrão de perda para ganho de evolução molecular não apenas amortiza mutações deletérias, mas às vezes confere funções inteiramente novas a macromoléculas parasitas.
Essa ideia é consistente com a teoria do equilíbrio móvel de Sewell Wright, que afirma que um sistema estrito de seleção natural limita a capacidade de inovação dos organismos51,52,53.No entanto, se a deriva genética interromper a seleção natural, essas derivas podem produzir mudanças que não são adaptativas em si (ou mesmo prejudiciais), mas levam a outras mudanças que fornecem maior aptidão ou nova atividade biológica.Nossa estrutura apóia essa ideia ao ilustrar que o mesmo tipo de mutação que reduz a dobra e a função de uma biomolécula parece ser o principal gatilho para sua melhoria.Alinhado com o modelo evolutivo ganha-ganha, nosso estudo mostra que a degradação do genoma, tradicionalmente vista como um processo degenerativo, também é um importante impulsionador da inovação, às vezes e talvez até permitindo que macromoléculas adquiram novas atividades parasitárias.pode usá-los.