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A barreira hematoencefálica e a barreira hematoencefálica impedem que os bioterapêuticos atinjam seus alvos no sistema nervoso central, dificultando o tratamento eficaz de doenças neurológicas.Para descobrir novos transportadores cerebrais in vivo, introduzimos uma biblioteca de peptídeos de fago T7 e coletamos sangue e líquido cefalorraquidiano (LCR) em série usando um modelo de grande pool consciente canulado de ratos.Clones de fagos específicos foram altamente enriquecidos em CSF após quatro rodadas de seleção.O teste de peptídeos candidatos individuais revelou um enriquecimento de mais de 1.000 vezes no CSF.A bioatividade da entrega mediada por peptídeo ao cérebro foi confirmada por uma redução de 40% no nível de amilóide-β no líquido cefalorraquidiano usando um inibidor de peptídeo BACE1 ligado ao novo peptídeo de trânsito identificado.Estes resultados sugerem que os péptidos identificados por métodos de selecção de fagos in vivo podem ser veículos úteis para a entrega sistémica de macromoléculas ao cérebro com um efeito terapêutico.
A pesquisa de terapia direcionada ao sistema nervoso central (SNC) tem se concentrado amplamente na identificação de drogas e agentes otimizados que exibem propriedades de direcionamento ao SNC, com menos esforço em descobrir os mecanismos que impulsionam a entrega de drogas ativas ao cérebro.Isso está começando a mudar agora, pois a entrega de medicamentos, especialmente moléculas grandes, é parte integrante do desenvolvimento de medicamentos da neurociência moderna.O ambiente do sistema nervoso central é bem protegido pelo sistema de barreira cerebrovascular, que consiste na barreira hematoencefálica (BBB) ​​​​e na barreira hematoencefálica (BCBB)1, dificultando a entrega de drogas ao cérebro1,2.Estima-se que quase todas as drogas de moléculas grandes e mais de 98% das drogas de moléculas pequenas são eliminadas do cérebro3.Por isso é muito importante identificar novos sistemas de transporte cerebral que forneçam entrega eficiente e específica de drogas terapêuticas ao SNC 4,5.No entanto, o BBB e o BCSFB também apresentam uma excelente oportunidade para a administração de drogas, pois penetram e entram em todas as estruturas do cérebro por meio de sua extensa vasculatura.Assim, os esforços atuais para usar métodos não invasivos de entrega ao cérebro são amplamente baseados no mecanismo de transporte mediado por receptor (PMT) usando o receptor endógeno BBB6.Apesar dos recentes avanços importantes usando a via do receptor de transferrina7,8, é necessário um maior desenvolvimento de novos sistemas de entrega com propriedades aprimoradas.Para tanto, nosso objetivo foi identificar peptídeos capazes de mediar o transporte do LCR, pois poderiam, a princípio, ser usados ​​para entregar macromoléculas ao SNC ou abrir novas vias de receptores.Em particular, receptores e transportadores específicos do sistema cerebrovascular (BBB e BSCFB) podem servir como alvos potenciais para a entrega ativa e específica de drogas bioterapêuticas.O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um produto de secreção do plexo coróide (SC) e está em contato direto com o líquido intersticial do cérebro através do espaço subaracnóideo e espaço ventricular4.Recentemente, foi demonstrado que o líquido cefalorraquidiano subaracnóideo se difunde excessivamente no interstício do cérebro9.Esperamos acessar o espaço parenquimatoso por meio dessa via de entrada subaracnóidea ou diretamente pela BHE.Para conseguir isso, implementamos uma estratégia robusta de seleção de fagos in vivo que identifica idealmente peptídeos transportados por qualquer uma dessas duas vias distintas.
Descrevemos agora um método sequencial de triagem de exibição de fagos in vivo com amostragem de CSF juntamente com sequenciamento de alto rendimento (HTS) para monitorar rodadas de seleção inicial com a maior diversidade de biblioteca.A triagem foi realizada em ratos conscientes com uma cânula de cisterna grande permanentemente implantada (CM) para evitar a contaminação do sangue.É importante ressaltar que essa abordagem seleciona tanto o direcionamento cerebral quanto os peptídeos com atividade de transporte através da barreira cerebrovascular.Utilizamos fagos T7 devido ao seu pequeno tamanho (~60 nm)10 e sugerimos que são adequados para o transporte de vesículas que permitem o cruzamento transcelular da barreira endotelial e/ou epitelial-medular.Após quatro rodadas de seleção, as populações de fagos foram isoladas mostrando forte enriquecimento in vivo de CSF ​​e associação de microvasos cerebrais.É importante ressaltar que fomos capazes de confirmar nossas descobertas, demonstrando que os melhores peptídeos candidatos preferidos e quimicamente sintetizados são capazes de transportar carga proteica para o líquido cefalorraquidiano.Primeiro, os efeitos farmacodinâmicos do SNC foram estabelecidos pela combinação de um peptídeo de trânsito líder com um inibidor do peptídeo BACE1.Além de demonstrar que as estratégias de triagem funcional in vivo podem identificar novos peptídeos de transporte cerebral como transportadores de carga proteica eficazes, esperamos que abordagens de seleção funcional semelhantes também se tornem importantes na identificação de novas vias de transporte cerebral.
Com base em unidades formadoras de placas (PFU), após a etapa de empacotamento de fagos, uma biblioteca de peptídeos de fago T7 lineares aleatórios de 12 meros com uma diversidade de aproximadamente 109 foi projetada e criada (consulte Materiais e métodos).É importante notar que analisamos cuidadosamente esta biblioteca antes da seleção in vivo.A amplificação por PCR de amostras da biblioteca de fagos usando primers modificados gerou amplicons que foram diretamente aplicáveis ​​ao HTS (Suplementar Fig. 1a).Devido a a) erros de sequenciamento HTS11, b) impacto na qualidade dos primers (NNK)1-12, ec) a presença de fago de tipo selvagem (wt) (inserções de esqueleto) na biblioteca de espera, um procedimento de filtragem de sequência foi implementado para extrair apenas informações de sequência verificadas (Fig. 1b complementar).Essas etapas de filtro se aplicam a todas as bibliotecas de sequenciamento HTS.Para a biblioteca padrão, foi obtido um total de 233.868 leituras, das quais 39% passaram nos critérios do filtro e foram usadas para análise e seleção da biblioteca para rodadas subsequentes (Figura complementar 1c–e).As leituras eram predominantemente múltiplas de 3 pares de bases de comprimento com um pico de 36 nucleotídeos (Fig. 1c complementar), confirmando o design da biblioteca (NNK) 1-12.Notavelmente, aproximadamente 11% dos membros da biblioteca continham uma inserção PAGISRELVDKL de estrutura selvagem de 12 dimensões (wt) e quase metade das sequências (49%) continham inserções ou deleções.O HTS da biblioteca da biblioteca confirmou a alta diversidade de peptídeos na biblioteca: mais de 81% das sequências peptídicas foram encontradas apenas uma vez e apenas 1,5% ocorreram em ≥4 cópias (Suplementar Fig. 2a).As frequências de aminoácidos (aa) em todas as 12 posições no repertório correlacionaram-se bem com as frequências esperadas para o número de códons gerados pelo repertório NKK degenerado (Suplementar Fig. 2b).A frequência observada de resíduos aa codificados por essas inserções correlacionou-se bem com a frequência calculada (r = 0,893) (Fig. 2c complementar).A preparação das bibliotecas de fagos para injeção inclui as etapas de amplificação e remoção da endotoxina.Foi demonstrado anteriormente que isso reduz potencialmente a diversidade de bibliotecas de fagos12,13.Portanto, sequenciamos uma biblioteca de fagos amplificada em placa que sofreu remoção de endotoxina e a comparamos com a biblioteca original para estimar a frequência de AA.Uma forte correlação (r = 0,995) foi observada entre o pool original e o pool amplificado e purificado (Fig. 2d complementar), indicando que a competição entre clones amplificados em placas usando o fago T7 não causou grande viés.Esta comparação é baseada na frequência de motivos tripeptídicos em cada biblioteca, uma vez que a diversidade de bibliotecas (~109) não pode ser totalmente capturada mesmo com HTS.A análise de frequência de aa em cada posição revelou um pequeno viés dependente da posição nas últimas três posições do repertório inserido (Fig. 2e complementar).Em conclusão, concluímos que a qualidade e a diversidade da biblioteca eram aceitáveis ​​e apenas pequenas alterações na diversidade foram observadas devido à amplificação e preparação de bibliotecas de fagos entre várias rodadas de seleção.
Amostragem seriada do líquido cefalorraquidiano pode ser realizada implantando cirurgicamente uma cânula no CM de ratos conscientes para facilitar a identificação do fago T7 injetado por via intravenosa (iv) via BBB e/ou BCSFB (Fig. 1a-b).Usamos dois braços de seleção independentes (braços A e B) nas três primeiras rodadas de seleção in vivo (Fig. 1c).Aumentamos gradualmente o rigor da seleção diminuindo a quantidade total de fagos introduzidos nas três primeiras rodadas de seleção.Para a quarta rodada de panning, combinamos amostras dos ramos A e B e realizamos três seleções independentes adicionais.Para estudar as propriedades in vivo das partículas de fago T7 neste modelo, o fago de tipo selvagem (PAGISRELVDKL master insert) foi injetado em ratos através da veia da cauda.A recuperação de fagos do líquido cefalorraquidiano e do sangue em diferentes momentos mostrou que fagos icosaédricos T7 relativamente pequenos tiveram uma rápida fase inicial de depuração do compartimento sanguíneo (Fig. 3 complementar).Com base nos títulos administrados e no volume de sangue dos ratos, calculamos que apenas aproximadamente 1% em peso.o fago da dose administrada foi detectado no sangue 10 minutos após a injeção intravenosa.Após este rápido declínio inicial, foi medida uma depuração primária mais lenta com uma meia-vida de 27,7 minutos.É importante ressaltar que apenas poucos fagos foram recuperados do compartimento de CSF, indicando um fundo baixo para a migração de fagos de tipo selvagem para o compartimento de CSF (Fig. 3 complementar).Em média, apenas cerca de 1 x 10-3% de títulos de fago T7 no sangue e 4 x 10-8% de fagos inicialmente infundidos foram detectados no líquido cefalorraquidiano durante todo o período de amostragem (0-250 min).Notavelmente, a meia-vida (25,7 min) do fago de tipo selvagem no líquido cefalorraquidiano foi semelhante à observada no sangue.Esses dados demonstram que a barreira que separa o compartimento de CSF do sangue está intacta em ratos canulados com CM, permitindo a seleção in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clones que são prontamente transportados do sangue para o compartimento de CSF.
(a) Estabelecer um método para reamostragem de líquido cefalorraquidiano (CSF) de um grande pool.(b) Diagrama mostrando a localização celular da barreira do sistema nervoso central (SNC) e a estratégia de seleção utilizada para identificar peptídeos que atravessam a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira hematoencefálica.(c) Fluxograma de triagem de exibição de fagos in vivo.Em cada rodada de seleção, fagos (identificadores de animais dentro das setas) foram injetados por via intravenosa.Dois ramos alternativos independentes (A, B) são mantidos separadamente até a 4ª rodada de seleção.Para as rodadas de seleção 3 e 4, cada clone de fago extraído do CSF ​​foi sequenciado manualmente.(d) Cinética do fago isolado do sangue (círculos vermelhos) e líquido cefalorraquidiano (triângulos verdes) durante a primeira rodada de seleção em dois ratos canulados após injeção intravenosa da biblioteca de peptídeos T7 (2 x 1012 fagos/animal).Os quadrados azuis indicam a concentração inicial média de fago no sangue, calculada a partir da quantidade de fago injetado, levando em consideração o volume total de sangue.Os quadrados pretos indicam o ponto de interseção da linha y extrapolada das concentrações de fagos no sangue.(e,f) Apresentar a frequência relativa e a distribuição de todos os possíveis motivos tripeptídicos sobrepostos encontrados no peptídeo.O número de motivos encontrados em 1000 leituras é mostrado.Motivos significativamente (p < 0,001) enriquecidos são marcados com pontos vermelhos.(e) Gráfico de dispersão de correlação comparando a frequência relativa do motivo tripeptídico da biblioteca injetada com fago derivado do sangue dos animais #1.1 e #1.2.(f) Gráfico de dispersão de correlação comparando as frequências relativas dos motivos tripeptídicos de fagos animais #1.1 e #1.2 isolados no sangue e líquido cefalorraquidiano.(g, h) Representação de ID de sequência de fago enriquecido em sangue (g) versus bibliotecas injetadas e fago enriquecido em CSF (h) versus sangue após uma rodada de seleção in vivo em ambos os animais.O tamanho do código de uma letra indica com que frequência esse aminoácido ocorre nessa posição.Verde = polar, roxo = neutro, azul = básico, vermelho = ácido e preto = aminoácidos hidrofóbicos.A Figura 1a, b foi projetada e produzida por Eduard Urich.
Nós injetamos uma biblioteca de peptídeos de fago em dois ratos de instrumento CM (clados A e B) e isolamos o fago do líquido cefalorraquidiano e do sangue (Figura 1d).A eliminação rápida inicial da biblioteca foi menos pronunciada em comparação com o fago de tipo selvagem.A meia-vida média da biblioteca injetada em ambos os animais foi de 24,8 minutos no sangue, semelhante ao fago de tipo selvagem, e 38,5 minutos no LCR.Amostras de fagos de sangue e líquido cefalorraquidiano de cada animal foram submetidas a HTS e todos os peptídeos identificados foram analisados ​​quanto à presença de um motivo tripeptídico curto.Os motivos tripeptídicos foram escolhidos porque fornecem uma base mínima para a formação da estrutura e interações peptídeo-proteína14,15.Encontramos uma boa correlação na distribuição de motivos entre a biblioteca de fagos injetados e clones extraídos do sangue de ambos os animais (Fig. 1e).Os dados indicam que a composição da biblioteca é apenas marginalmente enriquecida no compartimento sanguíneo.As frequências de aminoácidos e as sequências de consenso foram posteriormente analisadas em cada posição usando uma adaptação do software Weblogo16.Curiosamente, encontramos um forte enriquecimento em resíduos de glicina no sangue (Fig. 1g).Quando o sangue foi comparado com clones selecionados de CSF, forte seleção e alguma desseleção de motivos foram observadas (Fig. 1f), e certos aminoácidos estavam preferencialmente presentes em posições predeterminadas nos 12 membros (Fig. 1h).Notavelmente, os animais individuais diferiram significativamente no líquido cefalorraquidiano, enquanto o enriquecimento de glicina no sangue foi observado em ambos os animais (Fig. 4a-j).Após filtragem rigorosa dos dados de sequência no líquido cefalorraquidiano dos animais #1.1 e #1.2, um total de 964 e 420 peptídeos únicos de 12 meros foram obtidos (Fig. 1d-e).Os clones de fago isolados foram amplificados e submetidos a uma segunda rodada de seleção in vivo.Os fagos extraídos da segunda rodada de seleção foram submetidos a HTS em cada animal e todos os peptídeos identificados foram usados ​​como entrada para um programa de reconhecimento de motivos para analisar a ocorrência de motivos tripeptídicos (Fig. 2a, b, ef).Em comparação com o primeiro ciclo do fago recuperado do CSF, observamos mais seleção e desseleção de muitos motivos no CSF ​​nos ramos A e B (Fig. 2).Um algoritmo de identificação de rede foi aplicado para determinar se elas representavam diferentes padrões de sequência consistente.Uma clara semelhança foi observada entre as sequências de 12 dimensões recuperadas por CSF no clado alternativo A (Fig. 2c, d) e clado B (Fig. 2g, h).A análise agrupada em cada ramificação revelou diferentes perfis de seleção para peptídeos de 12 meros (Fig. 5c, d) e um aumento na razão de título CSF/sangue ao longo do tempo para clones agrupados após a segunda rodada de seleção em comparação com a primeira rodada de seleção (Fig. 5e suplementar).).
Enriquecimento de motivos e peptídeos no líquido cefalorraquidiano por duas rodadas sucessivas de seleção de exibição funcional de fagos in vivo.
Todos os fagos do líquido cefalorraquidiano recuperados da primeira rodada de cada animal (animais #1.1 e #1.2) foram agrupados, amplificados, sequenciados por HT e reinjetados juntos (2 x 1010 fagos/animal) 2 ratos canulados SM (#1.1 → #).2.1 e 2.2, 1.2 → 2.3 e 2.4).(a,b,e,f) Gráficos de dispersão de correlação comparando a frequência relativa de motivos tripeptídicos de todos os fagos derivados de CSF na primeira e segunda rodadas de seleção.Frequência relativa e distribuição de motivos representando todos os possíveis tripeptídeos sobrepostos encontrados em peptídeos em ambas as orientações.O número de motivos encontrados em 1000 leituras é mostrado.Motivos que foram significativamente (p < 0,001) selecionados ou excluídos em uma das bibliotecas comparadas são destacados com pontos vermelhos.(c, d, g, h) Representação do logotipo da sequência de todas as sequências longas de 12 aminoácidos ricas em CSF com base nas rodadas 2 e 1 da seleção in vivo.O tamanho do código de uma letra indica com que frequência esse aminoácido ocorre nessa posição.Para representar o logotipo, a frequência de sequências de CSF extraídas de animais individuais entre duas rodadas de seleção é comparada e as sequências enriquecidas na segunda rodada são mostradas: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4.Os aminoácidos mais enriquecidos em uma determinada posição em (c, d) animais não.2.1 e nº.2.2 ou (g, h) em animais no.2.3 e n.2.4 são mostrados em cores.Verde = polar, roxo = neutro, azul = básico, vermelho = ácido e preto = aminoácidos hidrofóbicos.
Após a terceira rodada de seleção, identificamos 124 sequências peptídicas únicas (#3.1 e #3.2) de 332 clones de fagos reconstituídos com CSF isolados de dois animais (Suplementar Fig. 6a).A sequência LGSVS (18,7%) teve a maior proporção relativa, seguida pelas inserções do tipo selvagem PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) e SARGSWREIVSLS (2,2%).Na quarta rodada final, reunimos dois ramos selecionados independentemente de três animais separados (Fig. 1c).Dos 925 clones de fagos sequenciados recuperados do LCR, na quarta rodada encontramos 64 sequências peptídicas únicas (Fig. 6b suplementar), entre as quais a proporção relativa de fagos do tipo selvagem caiu para 0,8%.Os clones de LCR mais comuns na quarta rodada foram LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) e RLSSVDSDLSGC (3,2%).%)).A faixa de comprimento dos peptídeos selecionados é devido a inserções/exclusões de nucleotídeos ou códons de parada prematuros nos primers da biblioteca ao usar códons degenerados para o design da biblioteca NNK.Os códons de parada prematuros geram peptídeos mais curtos e são selecionados porque contêm o motivo aa favorável.Peptídeos mais longos podem resultar de inserções/deleções nos primers das bibliotecas sintéticas.Isso posiciona o códon de parada projetado fora do quadro e o lê até que um novo códon de parada apareça a jusante.Em geral, calculamos os fatores de enriquecimento para todas as quatro rodadas de seleção comparando os dados de entrada com os dados de saída da amostra.Para a primeira rodada de triagem, usamos títulos de fagos de tipo selvagem como uma referência de fundo não específica.Curiosamente, a seleção negativa de fagos foi muito forte no primeiro ciclo do LCR, mas não no sangue (Fig. 3a), o que pode ser devido à baixa probabilidade de difusão passiva da maioria dos membros da biblioteca de peptídeos no compartimento do LCR ou fagos relativos tendem a ser retidos ou removidos com mais eficiência da corrente sanguínea do que os bacteriófagos.No entanto, na segunda rodada de seleção, uma forte seleção de fagos no CSF ​​foi observada em ambos os clados, sugerindo que a rodada anterior foi enriquecida em fagos exibindo peptídeos que promovem a absorção de CSF (Fig. 3a).Novamente, sem enriquecimento sanguíneo significativo.Também na terceira e quarta rodadas, os clones de fago foram significativamente enriquecidos em CSF.Comparando a frequência relativa de cada sequência peptídica única entre as duas últimas rodadas de seleção, descobrimos que as sequências foram ainda mais enriquecidas na quarta rodada de seleção (Fig. 3b).Um total de 931 motivos tripeptídicos foram extraídos de todas as 64 sequências peptídicas únicas usando ambas as orientações peptídicas.Os motivos mais enriquecidos na quarta rodada foram examinados mais de perto quanto aos seus perfis de enriquecimento em todas as rodadas em comparação com a biblioteca injetada (corte: 10% de enriquecimento) (Fig. 6c complementar).Padrões gerais de seleção mostraram que a maioria dos motivos estudados foram enriquecidos em todas as rodadas anteriores de ambos os ramos de seleção.No entanto, alguns motivos (por exemplo, SGL, VSG, LGS GSV) eram predominantemente do clado alternativo A, enquanto outros (por exemplo, FGW, RTN, WGF, NTR) eram enriquecidos no clado alternativo B.
Validação do transporte de CSF de peptídeos exibidos em fagos enriquecidos com CSF e peptídeos líderes biotinilados conjugados com cargas úteis de estreptavidina.
(a) Proporções de enriquecimento calculadas em todas as quatro rodadas (R1-R4) com base em títulos de fagos (PFU) injetados (entrada = I) e títulos de fagos CSF determinados (saída = O).Os fatores de enriquecimento para as últimas três rodadas (R2-R4) foram calculados por comparação com a rodada anterior e a primeira rodada (R1) com dados de peso.As barras abertas são líquido cefalorraquidiano, as barras sombreadas são plasma.(***p<0,001, com base no teste t de Student).(b) Lista dos peptídeos de fago mais abundantes, classificados de acordo com sua proporção relativa a todos os fagos coletados no CSF ​​após a rodada 4 de seleção.Os seis clones de fago mais comuns são destacados em cores, numerados e seus fatores de enriquecimento entre as rodadas 3 e 4 de seleção (inserções).(c,d) Os seis clones de fagos mais enriquecidos, fagos vazios e bibliotecas de peptídeos de fagos parentais da rodada 4 foram analisados ​​individualmente em um modelo de amostragem de CSF.Amostras de CSF e sangue foram coletadas nos pontos de tempo indicados.(c) Quantidades iguais de 6 clones de fagos candidatos (2 x 1010 fagos/animais), fagos vazios (nº 1779) (2 x 1010 fagos/animais) e bibliotecas de peptídeos de fago estoque (2 x 1012 fagos/animais) Injetar pelo menos 3 CM é administrado ao animal canulado separadamente através da veia da cauda.A farmacocinética CSF de cada clone de fago injetado e biblioteca de peptídeos de fago ao longo do tempo é mostrada.(d) mostra a proporção média de CSF/sangue para todos os fagos recuperados/mL durante o tempo de amostragem.(e) Quatro peptídeos líderes sintéticos e um controle embaralhado foram ligados com biotina à estreptavidina através de seu terminal N (exibição de tetrâmero) seguido por injeção (veia da cauda iv, 10 mg de estreptavidina/kg).Pelo menos três ratos intubados (N = 3).).As amostras de CSF foram coletadas nos pontos de tempo indicados e as concentrações de estreptavidina foram medidas por ELISA antiestreptavidina no CSF ​​(nd = não detectado).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, com base no teste ANOVA).(f) Comparação da sequência de aminoácidos do clone de peptídeo de fago mais enriquecido #2002 (roxo) com outros clones de peptídeo de fago selecionados da 4ª rodada de seleção.Fragmentos de aminoácidos idênticos e semelhantes são codificados por cores.
De todos os fagos enriquecidos na quarta rodada (Fig. 3b), seis clones candidatos foram selecionados para posterior análise individual no modelo de amostragem de CSF.Quantidades iguais de seis fagos candidatos, fagos vazios (sem inserção) e bibliotecas de peptídeos profágicos foram injetadas em três animais CM canulados, e a farmacocinética foi determinada em ensaios de CSF (Fig. 3c) e sangue (Fig. 7 suplementar).Todos os clones de fago testados atingiram o compartimento de CSF em um nível 10-1000 vezes maior que o do fago de controle vazio (#1779).Por exemplo, os clones #2020 e #2077 tinham títulos de CSF cerca de 1000 vezes maiores do que o fago de controle.O perfil farmacocinético de cada peptídeo selecionado é diferente, mas todos eles têm uma alta capacidade de retorno ao LCR.Observamos uma diminuição constante ao longo do tempo para os clones #1903 e #2011, enquanto para os clones #2077, #2002 e #2009 um aumento durante os primeiros 10 minutos pode indicar transporte ativo, mas precisa ser verificado.Os clones #2020, #2002 e #2077 estabilizaram em níveis elevados, enquanto a concentração de CSF do clone #2009 diminuiu lentamente após o aumento inicial.Em seguida, comparamos a frequência relativa de cada candidato CSF ​​com sua concentração no sangue (Fig. 3d).A correlação do título médio de cada candidato de CSF com seu título de sangue em todos os tempos de amostragem mostrou que três dos seis candidatos foram significativamente enriquecidos em CSF de sangue.Curiosamente, o clone #2077 apresentou maior estabilidade sanguínea (Figura Complementar 7).Para confirmar que os próprios peptídeos são capazes de transportar ativamente carga diferente de partículas de fago para o compartimento do LCR, sintetizamos quatro peptídeos líderes derivados com biotina no terminal N, onde os peptídeos se ligam à partícula de fago.Peptídeos biotinilados (nos. 2002, 2009, 2020 e 2077) foram conjugados com estreptavidina (SA) para obter formas multiméricas que imitam a geometria do fago.Este formato também nos permitiu medir a exposição SA no sangue e líquido cefalorraquidiano como peptídeos de proteína de transporte de carga.É importante ressaltar que os dados de fagos muitas vezes podem ser reproduzidos quando peptídeos sintéticos foram administrados neste formato conjugado com SA (Fig. 3e).Os peptídeos embaralhados tiveram menos exposição inicial e eliminação mais rápida do LCR com níveis indetectáveis ​​em 48 horas.Para obter informações sobre as vias de entrega desses clones de fagos peptídicos no espaço do CSF, analisamos a localização de acertos de peptídeos fagos individuais usando imuno-histoquímica (IHC) para detectar diretamente partículas de fago 1 hora após a injeção intravenosa in vivo.Notavelmente, os clones #2002, #2077 e #2009 puderam ser detectados por forte coloração nos capilares cerebrais, enquanto o fago de controle (#1779) e o clone #2020 não foram detectados (Figura 8 complementar).Isso sugere que esses peptídeos contribuem para o efeito no cérebro precisamente cruzando o BBB.Uma análise mais detalhada é necessária para testar essa hipótese, pois a rota BSCFB também pode estar envolvida.Ao comparar a sequência de aminoácidos do clone mais enriquecido (#2002) com outros peptídeos selecionados, notou-se que alguns deles possuem extensões de aminoácidos semelhantes, o que pode indicar um mecanismo de transporte semelhante (Fig. 3f).
Devido ao seu perfil plasmático único e aumento significativo no CSF ​​ao longo do tempo, o clone de exibição de fagos #2077 foi mais explorado por um período mais longo de 48 horas e foi capaz de reproduzir o rápido aumento no CSF ​​observado em associação com níveis sustentados de SA (Fig. 4a).Em relação a outros clones de fagos identificados, #2077 corou fortemente para capilares cerebrais e mostrou colocalização significativa com lectina marcadora capilar quando visualizada em resolução mais alta e possivelmente alguma coloração no espaço parenquimatoso (Figura 4b).Para investigar se os efeitos farmacológicos mediados por peptídeos poderiam ser obtidos no SNC, realizamos um experimento no qual versões biotiniladas de i) o peptídeo de trânsito #2077 e ii) o peptídeo inibidor de BACE1 foram misturados com SA em duas proporções diferentes.Para uma combinação, usamos apenas o inibidor do peptídeo BACE1 e, para a outra, usamos uma proporção de 1:3 do inibidor do peptídeo BACE1 para o peptídeo #2077.Ambas as amostras foram administradas por via intravenosa e os níveis de sangue e líquido cefalorraquidiano de peptídeo beta-amilóide 40 (Abeta40) foram medidos ao longo do tempo.Abeta40 foi medido no LCR, pois reflete a inibição de BACE1 no parênquima cerebral.Como esperado, ambos os complexos reduziram significativamente os níveis sanguíneos de Abeta40 (Fig. 4c, d).No entanto, apenas amostras contendo uma mistura de peptídeo no.2077 e um inibidor do peptídeo BACE1 conjugado com SA causaram uma diminuição significativa de Abeta40 no líquido cefalorraquidiano (Fig. 4c).Os dados mostram que o peptídeo no.2077 é capaz de transportar a proteína SA de 60 kDa para o SNC e também induz efeitos farmacológicos com inibidores conjugados com SA do peptídeo BACE1.
(a) Injeção clonal (2 × 10 fagos/animal) de fago T7 mostrando perfis farmacocinéticos de longo prazo do peptídeo CSF ​​#2077 (RLSSVDSDLSGC) e fago controle não injetado (#1779) em pelo menos três ratos intubados com CM.(b) Imagem microscópica confocal de microvasos corticais representativos em ratos injetados com fagos (2 × 10 10 fagos/animal) mostrando contracoloração do peptídeo #2077 e vasos (lectina).Esses clones de fagos foram administrados a 3 ratos e deixados em circulação por 1 hora antes da perfusão.Os cérebros foram seccionados e corados com anticorpos policlonais marcados com FITC contra o capsídeo do fago T7.Dez minutos antes da perfusão e subsequente fixação, lectina marcada com DyLight594 foi administrada por via intravenosa.Imagens fluorescentes mostrando coloração de lectina (vermelho) do lado luminal de microvasos e fagos (verde) no lúmen de capilares e tecido cerebral perivascular.A barra de escala corresponde a 10 µm.(c, d) O peptídeo inibidor BACE1 biotinilado sozinho ou em combinação com o peptídeo de trânsito biotinilado #2077 foi acoplado a estreptavidina seguido por injeção intravenosa de pelo menos três ratos CM canulados (10 mg de estreptavidina/kg).A redução mediada pelo inibidor do peptídeo BACE1 em Aβ40 foi medida por Aβ1-40 ELISA no sangue (vermelho) e líquido cefalorraquidiano (laranja) nos pontos de tempo indicados.Para melhor clareza, uma linha pontilhada é desenhada no gráfico em uma escala de 100%.(c) Redução percentual de Aβ40 no sangue (triângulos vermelhos) e líquido cefalorraquidiano (triângulos laranja) em ratos tratados com estreptavidina conjugada ao peptídeo de trânsito #2077 e peptídeo inibidor BACE1 em uma proporção de 3:1.(d) Redução percentual no sangue Aβ40 (círculos vermelhos) e líquido cefalorraquidiano (círculos laranja) de ratos tratados com estreptavidina acoplada a um peptídeo inibidor BACE1 apenas.A concentração de Aβ no controle foi de 420 pg/ml (desvio padrão = 101 pg/ml).
A exibição de fagos tem sido aplicada com sucesso em diversas áreas da pesquisa biomédica17.Este método tem sido utilizado para estudos de diversidade vascular in vivo18,19, bem como estudos direcionados aos vasos cerebrais20,21,22,23,24,25,26.Neste estudo, estendemos a aplicação deste método de seleção não apenas para a identificação direta de peptídeos direcionados aos vasos cerebrais, mas também para a descoberta de candidatos com propriedades de transporte ativo para atravessar a barreira hematoencefálica.Descrevemos agora o desenvolvimento de um procedimento de seleção in vivo em ratos intubados com CM e demonstramos seu potencial para identificar peptídeos com propriedades de homing no CSF.Usando o fago T7 exibindo uma biblioteca de peptídeos aleatórios de 12 meros, fomos capazes de demonstrar que o fago T7 é pequeno o suficiente (aproximadamente 60 nm de diâmetro)10 para ser adaptado à barreira hematoencefálica, atravessando diretamente a barreira hematoencefálica ou o plexo coróide.Observamos que a colheita de CSF de ratos CM canulados foi um método de triagem funcional in vivo bem controlado e que o fago extraído não apenas se ligou à vasculatura, mas também funcionou como um transportador através da barreira hematoencefálica.Além disso, ao coletar sangue simultaneamente e aplicar HTS ao CSF ​​​​e a fagos derivados do sangue, confirmamos que nossa escolha de CSF não foi influenciada pelo enriquecimento de sangue ou aptidão para expansão entre as rodadas de seleção.No entanto, o compartimento sanguíneo faz parte do processo de seleção, pois os fagos capazes de atingir o compartimento liquórico devem sobreviver e circular na corrente sanguínea por tempo suficiente para se enriquecerem no cérebro.Para extrair informações de sequência confiáveis ​​de dados HTS brutos, implementamos filtros adaptados a erros de sequenciamento específicos da plataforma no fluxo de trabalho de análise.Ao incorporar parâmetros cinéticos no método de triagem, confirmamos a farmacocinética rápida de fagos T7 de tipo selvagem (t½ ~ 28 min) no sangue24, 27, 28 e também determinamos sua meia-vida no líquido cefalorraquidiano (t½ ~ 26 min) por minuto).Apesar dos perfis farmacocinéticos semelhantes no sangue e no LCR, apenas 0,001% da concentração sanguínea do fago pode ser detectada no LCR, indicando baixa mobilidade de fundo do fago T7 de tipo selvagem através da barreira hematoencefálica.Este trabalho destaca a importância da primeira rodada de seleção ao usar estratégias de seleção in vivo, especialmente para sistemas de fagos que são rapidamente eliminados da circulação, pois poucos clones são capazes de atingir o compartimento do SNC.Assim, na primeira rodada, a redução na diversidade da biblioteca foi muito grande, pois apenas um número limitado de clones acabou sendo coletado neste modelo de CSF muito restrito.Esta estratégia de seleção in vivo incluiu várias etapas de seleção, como acúmulo ativo no compartimento de CSF, sobrevivência de clone no compartimento de sangue e remoção rápida de clones de fago T7 do sangue nos primeiros 10 minutos (Fig. 1d e Suplementar Fig. 4M).).Assim, após a primeira rodada, diferentes clones de fagos foram identificados no CSF, embora o mesmo pool inicial tenha sido usado para animais individuais.Isso sugere que várias etapas de seleção rigorosa para bibliotecas de origem com grande número de membros da biblioteca resultam em uma redução significativa na diversidade.Portanto, eventos aleatórios se tornarão parte integrante do processo de seleção inicial, influenciando muito o resultado.É provável que muitos dos clones na biblioteca original tivessem uma propensão de enriquecimento de CSF muito semelhante.No entanto, mesmo sob as mesmas condições experimentais, os resultados da seleção podem diferir devido ao pequeno número de cada clone em particular no pool inicial.
Os motivos enriquecidos em CSF diferem daqueles no sangue.Curiosamente, notamos a primeira mudança para peptídeos ricos em glicina no sangue de animais individuais.(Fig. 1g, Figs suplementares. 4e, 4f).Fagos contendo peptídeos de glicina podem ser mais estáveis ​​e menos propensos a serem retirados de circulação.No entanto, esses peptídeos ricos em glicina não foram detectados nas amostras de líquido cefalorraquidiano, sugerindo que as bibliotecas selecionadas passaram por duas etapas de seleção diferentes: uma no sangue e outra que se acumulou no líquido cefalorraquidiano.Os clones enriquecidos com CSF resultantes da quarta rodada de seleção foram extensivamente testados.Quase todos os clones testados individualmente foram confirmados como enriquecidos em CSF em comparação com o fago de controle em branco.Um hit de peptídeo (#2077) foi examinado com mais detalhes.Ele mostrou uma meia-vida plasmática mais longa em comparação com outros hits (Figura 3d e Figura Complementar 7) e, curiosamente, esse peptídeo continha um resíduo de cisteína no terminal C.Recentemente, foi demonstrado que a adição de cisteína a peptídeos pode melhorar suas propriedades farmacocinéticas por ligação à albumina 29 .Isso é atualmente desconhecido para o peptídeo #2077 e requer mais estudos.Alguns peptídeos mostraram uma dependência de valência no enriquecimento de CSF (dados não mostrados), o que pode estar relacionado à geometria de superfície exibida do capsídeo T7.O sistema T7 que usamos mostrou 5-15 cópias de cada peptídeo por partícula de fago.A IHC foi realizada em clones de fagos de chumbo candidatos injetados por via intravenosa no córtex cerebral de ratos (Fig. 8 complementar).Os dados mostraram que pelo menos três clones (No. 2002, No. 2009 e No. 2077) interagiram com o BBB.Resta determinar se essa interação BBB resulta no acúmulo de CSF ou no movimento desses clones diretamente para o BCSFB.É importante ressaltar que mostramos que os peptídeos selecionados retêm sua capacidade de transporte de CSF quando sintetizados e ligados à carga proteica.A ligação de peptídeos biotinilados N-terminal a SA repete essencialmente os resultados obtidos com seus respectivos clones de fago no sangue e líquido cefalorraquidiano (Fig. 3e).Por fim, mostramos que o peptídeo líder #2077 é capaz de promover a ação cerebral de um inibidor peptídeo biotinilado de BACE1 conjugado com SA, causando efeitos farmacodinâmicos pronunciados no SNC ao reduzir significativamente os níveis de Abeta40 no LCR (Fig. 4).Não foi possível identificar nenhum homólogo no banco de dados realizando uma pesquisa de homologia de sequência peptídica de todos os resultados.É importante observar que o tamanho da biblioteca T7 é de aproximadamente 109, enquanto o tamanho teórico da biblioteca para 12-meros é 4 x 1015. Portanto, selecionamos apenas uma pequena fração do espaço de diversidade da biblioteca de peptídeos de 12-meros, o que pode significar que peptídeos mais otimizados podem ser identificados avaliando o espaço de sequência adjacente desses acertos identificados.Hipoteticamente, uma das razões pelas quais não encontramos nenhum homólogo natural desses peptídeos pode ser a desseleção durante a evolução para evitar a entrada descontrolada de certos motivos peptídicos no cérebro.
Tomados em conjunto, nossos resultados fornecem uma base para trabalhos futuros para identificar e caracterizar os sistemas de transporte da barreira cerebrovascular in vivo com mais detalhes.A configuração básica deste método é baseada em uma estratégia de seleção funcional que não apenas identifica clones com propriedades de ligação vascular cerebral, mas também inclui uma etapa crítica na qual clones bem-sucedidos têm atividade intrínseca para atravessar barreiras biológicas in vivo no compartimento do SNC.é elucidar o mecanismo de transporte desses peptídeos e sua preferência de ligação à microvasculatura específica da região cerebral.Isso pode levar à descoberta de novas vias para o transporte do BBB e receptores.Esperamos que os peptídeos identificados possam se ligar diretamente a receptores cerebrovasculares ou a ligantes circulantes transportados através do BBB ou BCSFB.Os vetores peptídicos com atividade de transporte de CSF descobertos neste trabalho serão investigados posteriormente.Atualmente, estamos investigando a especificidade cerebral desses peptídeos quanto à sua capacidade de cruzar o BBB e/ou o BCSFB.Esses novos peptídeos serão ferramentas extremamente valiosas para a potencial descoberta de novos receptores ou vias e para o desenvolvimento de novas plataformas altamente eficientes para a entrega de macromoléculas, como os biológicos, ao cérebro.
Canule a grande cisterna (CM) usando uma modificação do método descrito anteriormente.Ratos Wistar anestesiados (200-350 g) foram montados em um aparelho estereotáxico e uma incisão mediana foi feita sobre o couro cabeludo raspado e preparado assepticamente para expor o crânio.Faça dois furos na zona da folha superior e aperte os parafusos de fixação nos furos.Um orifício adicional foi feito na crista occipital lateral para orientação estereotáxica de uma cânula de aço inoxidável no CM.Aplique cimento dental ao redor da cânula e prenda com parafusos.Após fotopolimerização e endurecimento do cimento, a ferida cutânea foi fechada com fio supramídeo 4/0.A colocação adequada da cânula é confirmada pelo vazamento espontâneo de líquido cefalorraquidiano (LCR).Remova o rato do aparelho estereotáxico, receba cuidados pós-operatórios adequados e controle da dor e permita que ele se recupere por pelo menos uma semana até que sejam observados sinais de sangue no líquido cefalorraquidiano.Ratos Wistar (Crl:WI/Han) foram obtidos de Charles River (França).Todos os ratos foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos.Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Departamento Veterinário da Cidade de Basel, Suíça, e foram realizados de acordo com a Licença Animal No. 2474 (Avaliação do Transporte Ativo do Cérebro por Medição dos Níveis de Candidatos Terapêuticos no Líquido Cefalorraquidiano e Cérebro de Rato).
Com cuidado, mantenha o rato consciente com a cânula CM na mão.Remova Datura da cânula e colete 10 µl de líquido cefalorraquidiano de fluxo espontâneo.Uma vez que a patência da cânula foi finalmente comprometida, apenas amostras claras de líquido cefalorraquidiano sem evidência de contaminação sanguínea ou descoloração foram incluídas neste estudo.Paralelamente, aproximadamente 10–20 μl de sangue foram retirados de uma pequena incisão na ponta da cauda em tubos com heparina (Sigma-Aldrich).CSF e sangue foram coletados em vários momentos após a injeção intravenosa do fago T7.Aproximadamente 5–10 μl de fluido foram descartados antes de cada amostra de LCR ser coletada, o que corresponde ao volume morto do cateter.
As bibliotecas foram geradas usando o vetor T7Select 10-3b conforme descrito no manual do sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Resumidamente, uma inserção aleatória de DNA de 12 meros foi sintetizada no seguinte formato:
O códon NNK foi usado para evitar códons de parada dupla e superexpressão de aminoácidos na inserção.N é uma proporção equimolar manualmente misturada de cada nucleotídeo e K é uma proporção equimolar manualmente misturada de nucleotídeos de adenina e citosina.As regiões de cadeia simples foram convertidas em ADN de cadeia dupla por incubação adicional com dNTP (Novagen) e enzima Klenow (New England Biolabs) em tampão Klenow (New England Biolabs) durante 3 horas a 37°C.Após a reação, o DNA de fita dupla foi recuperado por precipitação com EtOH.O DNA resultante foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII (ambas da Roche).A inserção clivada e purificada (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) foi então ligada em estrutura a um vetor T7 pré-clivado após o aminoácido 348 do gene do capsídeo 10B.As reações de ligação foram incubadas a 16°C por 18 horas antes da embalagem in vitro.O empacotamento de fagos in vitro foi realizado de acordo com as instruções fornecidas com o kit de clonagem T7Select 10-3b (Novagen) e a solução de empacotamento foi amplificada uma vez para lise usando Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Os lisados ​​foram centrifugados, titulados e congelados a -80°C como solução estoque de glicerol.
Amplificação por PCR direta de regiões variáveis ​​de fago amplificadas em caldo ou placa usando primers de fusão 454/Roche-amplicon proprietários.O iniciador de fusão direta contém sequências que flanqueiam a região variável (NNK) 12 (específica do modelo), Adaptador A de titânio GS FLX e uma sequência chave de biblioteca de quatro bases (TCAG) (Figura complementar 1a):
O iniciador de fusão reversa também contém biotina anexada a grânulos de captura e o GS FLX Titanium Adapter B necessário para amplificação clonal durante a PCR em emulsão:
Os amplicons foram então submetidos a pirosequenciamento 454/Roche de acordo com o protocolo 454 GS-FLX Titanium.Para o sequenciamento manual de Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), o DNA do fago T7 foi amplificado por PCR e sequenciado com os seguintes pares de primers:
Inserções de placas individuais foram submetidas a amplificação por PCR usando o kit Roche Fast Start DNA Polymerase (de acordo com as instruções do fabricante).Execute um arranque a quente (10 min a 95 ° C) e 35 ciclos de reforço (50 s a 95 ° C, 1 min a 50 ° C e 1 min a 72 ° C).
Fagos de bibliotecas, fagos de tipo selvagem, fagos resgatados de CSF e sangue, ou clones individuais foram amplificados em Escherichia coli BL5615 em caldo TB (Sigma Aldrich) ou em placas de 500 cm2 (Thermo Scientific) por 4 h a 37°C.Os fagos foram extraídos das placas enxaguando as placas com tampão Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou coletando as placas com pontas de pipetas estéreis.Os fagos foram isolados do sobrenadante da cultura ou tampão de extração com uma rodada de precipitação de polietilenoglicol (PEG 8000) (Promega) e ressuspensos em tampão Tris-EDTA.
O fago amplificado foi submetido a 2-3 rodadas de remoção de endotoxina usando grânulos de remoção de endotoxina (Miltenyi Biotec) antes da injeção intravenosa (IV) (500 μl/animal).Na primeira rodada, foram introduzidos 2×1012 fagos;no segundo, 2×1010 fagos;na terceira e quarta rodadas de seleção, 2×109 fagos por animal.O conteúdo de fagos em CSF e amostras de sangue coletadas nos pontos de tempo indicados foi determinado por contagem de placas de acordo com as instruções do fabricante (manual do sistema T7Select).A seleção de fagos foi realizada por injeção intravenosa de bibliotecas purificadas na veia da cauda ou por reinjeção de fagos extraídos do CSF ​​da rodada de seleção anterior, e colheitas subsequentes foram realizadas em 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min, respectivamente, CSF e amostras de sangue.Um total de quatro rodadas de seleção in vivo foram realizadas nas quais os dois ramos selecionados foram armazenados separadamente e analisados ​​durante as três primeiras rodadas de seleção.Todas as inserções de fago extraídas do CSF ​​das duas primeiras rodadas de seleção foram submetidas a pirosequenciamento 454/Roche, enquanto todos os clones extraídos do CSF ​​das duas últimas rodadas de seleção foram sequenciados manualmente.Todos os fagos sanguíneos da primeira rodada de seleção também foram submetidos a pirosequenciamento 454/Roche.Para injeção de clones de fagos, os fagos selecionados foram amplificados em E. coli (BL5615) em placas de 500 cm2 a 37°C por 4 horas.Clones selecionados individualmente e sequenciados manualmente foram propagados em meio TB.Após a extração do fago, purificação e remoção da endotoxina (como descrito acima), 2 × 1010 fagos/animal em 300 μl foram injetados por via intravenosa em uma veia da cauda.
Pré-processamento e filtragem qualitativa de dados sequenciais.Os dados brutos 454/Roche foram convertidos de um formato de mapa de fluxo padrão binário (sff) para um formato legível por humanos Pearson (fasta) usando software do fornecedor.O processamento adicional da sequência de nucleotídeos foi realizado usando programas C proprietários e scripts (pacote de software não lançado) conforme descrito abaixo.A análise de dados primários inclui procedimentos rígidos de filtragem em vários estágios.Para filtrar leituras que não continham uma sequência de DNA de inserção de 12mer válida, as leituras foram alinhadas sequencialmente para iniciar o rótulo (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), parar o rótulo (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) e inserir o plano de fundo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) usando o teste global de Needleman-Wunsch.alinhamento permitindo até 2 inconsistências por alinhamento31.Portanto, leituras sem tags de início e parada e leituras contendo inserções de fundo, ou seja, alinhamentos que excedem o número permitido de incompatibilidades, foram removidas da biblioteca.Quanto às leituras restantes, a sequência de DNA N-mer que se estende desde a marca inicial e termina antes da marca final foi extirpada da sequência de leitura original e processada posteriormente (doravante denominada "inserção").Após a tradução do inserto, a porção após o primeiro códon de parada na extremidade 5' do primer é removida do inserto.Além disso, os nucleotídeos que levam a códons incompletos na extremidade 3' do primer também foram removidos.Para excluir inserções contendo apenas sequências de fundo, as inserções traduzidas começando com o padrão de aminoácidos “PAG” também foram removidas.Os péptidos com um comprimento pós-traducional inferior a 3 aminoácidos foram removidos da biblioteca.Por fim, remova a redundância no pool de inserções e determine a frequência de cada inserção exclusiva.Os resultados desta análise incluíram uma lista de sequências de nucleotídeos (inserções) e suas frequências (lidas) (Figuras complementares 1c e 2).
Agrupar inserções de DNA N-mer por similaridade de sequência: Para eliminar erros de sequenciamento específicos de 454/Roche (como problemas com extensões de homopolímeros de sequenciamento) e remover redundâncias menos importantes, as inserções de sequência de DNA N-mer previamente filtradas (inserções) são classificadas por similaridade.inserções (até 2 bases não correspondentes permitidas) usando um algoritmo iterativo definido da seguinte forma: as inserções são classificadas primeiro por sua frequência (da maior para a menor) e, se forem iguais, pela classificação secundária por comprimento (da maior para a menor).Assim, as inserções mais frequentes e mais longas definem o primeiro “grupo”.A frequência do grupo é definida para a frequência principal.Então, cada inserção remanescente na lista classificada foi tentada para ser adicionada ao grupo por alinhamento de Needleman-Wunsch pairwise.Se o número de incompatibilidades, inserções ou exclusões em um alinhamento não exceder um limite de 2, uma inserção será adicionada ao grupo e a frequência geral do grupo será aumentada de acordo com a frequência com que a inserção foi adicionada.As inserções adicionadas a um grupo são marcadas como usadas e excluídas do processamento posterior.Se a sequência de inserção não puder ser adicionada a um grupo já existente, a sequência de inserção será usada para criar um novo grupo com a frequência de inserção apropriada e marcada como usada.A iteração termina quando cada sequência de inserção tiver sido usada para formar um novo grupo ou puder ser incluída em um grupo já existente.Afinal, inserções agrupadas consistindo de nucleotídeos são eventualmente traduzidas em sequências peptídicas (bibliotecas peptídicas).O resultado desta análise é um conjunto de inserções e suas frequências correspondentes que compõem o número de leituras consecutivas (Suplemento Fig. 2).
Geração de motivos: Com base em uma lista de peptídeos exclusivos, foi criada uma biblioteca contendo todos os padrões de aminoácidos possíveis (aa), conforme mostrado abaixo.Cada padrão possível de comprimento 3 foi extraído do peptídeo e seu padrão inverso foi adicionado juntamente com uma biblioteca de motivos comum contendo todos os padrões (tripeptídeos).Bibliotecas de motivos altamente repetitivos foram sequenciadas e a redundância removida.Então, para cada tripeptídeo na biblioteca de motivos, verificamos sua presença na biblioteca usando ferramentas computacionais.Neste caso, a frequência do peptídeo contendo o tripeptídio motivo encontrado é adicionada e atribuída ao motivo na biblioteca de motivos (“número de motivos”).O resultado da geração do motif é um array bidimensional contendo todas as ocorrências de tripeptídeos (motifs) e seus respectivos valores, que são o número de leituras de sequenciamento que resultam no motivo correspondente quando as leituras são filtradas, agrupadas e traduzidas.Métricas conforme descrito em detalhes acima.
Normalização do número de motivos e gráficos de dispersão correspondentes: O número de motivos para cada amostra foi normalizado usando
onde ni é o número de reads contendo o tópico i.Assim, vi representa a frequência percentual de leituras (ou peptídeos) contendo motivo i na amostra.Os valores de p para o número não normalizado de motivos foram calculados usando o teste exato de Fisher.Em relação aos correlogramas do número de motivos, as correlações de Spearman foram calculadas usando o número normalizado de motivos com R.
Para visualizar o conteúdo de aminoácidos em cada posição na biblioteca de peptídeos, foram criados os web logogramas 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Primeiro, o conteúdo de aminoácidos em cada posição do peptídeo 12-mer é armazenado em uma matriz 20×12.Em seguida, um conjunto de 1.000 peptídeos contendo o mesmo conteúdo relativo de aminoácidos em cada posição é gerado no formato de sequência rápida e fornecido como entrada para o web-logo 3, que gera uma representação gráfica do conteúdo relativo de aminoácidos em cada posição.para uma determinada biblioteca de peptídeos.Para visualizar conjuntos de dados multidimensionais, mapas de calor foram criados usando uma ferramenta desenvolvida internamente em R (biosHeatmap, um pacote R ainda a ser lançado).Os dendrogramas apresentados nos mapas de calor foram calculados usando o método de agrupamento hierárquico de Ward com a métrica de distância euclidiana.Para análise estatística dos dados de pontuação do motivo, os valores P para pontuação não normalizada foram calculados usando o teste exato de Fisher.Os valores de P para outros conjuntos de dados foram calculados em R usando o teste t de Student ou ANOVA.
Clones de fagos selecionados e fagos sem inserções foram injetados por via intravenosa através da veia da cauda (2 × 1010 fagos/animal em 300 μl de PBS).Dez minutos antes da perfusão e subsequente fixação, os mesmos animais foram injetados por via intravenosa com 100 μl de lectina marcada com DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutos após a injeção de fagos, os ratos foram perfundidos através do coração com 50 ml de PBS seguido por 50 ml de 4% PFA/PBS.As amostras de cérebro foram adicionalmente fixadas durante a noite em 4% PFA/PBS e embebidas em 30% de sacarose durante a noite a 4°C.As amostras são congeladas rapidamente na mistura OCT.A análise imuno-histoquímica de amostras congeladas foi realizada à temperatura ambiente em criosseções de 30 µm bloqueadas com BSA a 1% e incubadas com anticorpos policlonais marcados com FITC contra o fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C.Incubar durante a noite.Por fim, os cortes foram lavados 3 vezes com PBS e examinados em microscópio confocal a laser (Leica TCS SP5).
Todos os peptídeos com pureza mínima de 98% foram sintetizados pela GenScript USA, biotinilados e liofilizados.A biotina é ligada por meio de um espaçador triplo de glicina adicional no N-terminal.Verifique todos os peptídeos usando espectrometria de massa.
A estreptavidina (Sigma S0677) foi misturada com um excesso equimolar de 5 vezes de peptídeo biotinilado, peptídeo inibidor BACE1 biotinilado ou uma combinação (proporção 3:1) de peptídeo inibidor BACE1 biotinilado e peptídeo inibidor BACE1 em 5-10% DMSO/incubado em PBS.1 hora à temperatura ambiente antes da injeção.Peptídeos conjugados com estreptavidina foram injetados por via intravenosa na dose de 10 mg/kg em uma das veias da cauda de ratos com cavidade cerebral.
A concentração de complexos estreptavidina-peptídeo foi avaliada por ELISA.As placas de microtitulação Nunc Maxisorp (Sigma) foram revestidas durante a noite a 4°C com 1,5 μg/ml de anticorpo antiestreptavidina de camundongo (Thermo, MA1-20011).Após o bloqueio (tampão de bloqueio: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) à temperatura ambiente por 2 horas, lave a placa com 0,05% Tween-20/PBS (tampão de lavagem) por 3 segundos, amostras de CSF e plasma foram adicionadas aos poços diluídos com tampão de bloqueio (plasma 1:10.000, CSF 1:115 ).A placa foi então incubada durante a noite a 4°C com anticorpo de detecção (1 μg/ml, antiestreptavidina-HRP, Novus NB120-7239).Após três etapas de lavagem, a estreptavidina foi detectada por incubação em solução de substrato TMB (Roche) por até 20 min.Depois de interromper o desenvolvimento da cor com H2SO4 1M, meça a absorbância a 450 nm.
A função do complexo inibidor de estreptavidina-peptídeo-BACE1 foi avaliada por Aβ(1-40) ELISA de acordo com o protocolo do fabricante (Wako, 294-64701).Resumidamente, as amostras de CSF foram diluídas em diluente padrão (1:23) e incubadas durante a noite a 4°C em placas de 96 poços revestidas com anticorpo de captura BNT77.Após cinco etapas de lavagem, o anticorpo BA27 conjugado com HRP foi adicionado e incubado por 2 horas a 4°C, seguido de cinco etapas de lavagem.Aβ(1–40) foi detectado por incubação em solução de TMB por 30 minutos em temperatura ambiente.Depois que o desenvolvimento da cor for interrompido com a solução de parada, meça a absorbância a 450 nm.As amostras de plasma foram submetidas à extração em fase sólida antes do ELISA Aβ(1–40).O plasma foi adicionado a DEA 0,2% (Sigma) em placas de 96 poços e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos.Após sucessivas lavagens das placas SPE (Oasis, 186000679) com água e metanol 100%, amostras de plasma foram adicionadas às placas SPE e todo o líquido foi removido.As amostras foram lavadas (primeiro com 5% de metanol e depois 30% de metanol) e eluídas com 2% de NH4OH/90% de metanol.Depois de secar o eluato a 55°C por 99 min em corrente constante de N2, as amostras foram reduzidas em diluentes padrão e Aβ(1–40) foi medido conforme descrito acima.
Como citar este artigo: Urich, E. et al.Entrega de carga ao cérebro usando peptídeos de trânsito identificados in vivo.a ciência.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
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