Alguns tópicos de solução de problemas de LC nunca estão desatualizados, pois há problemas na prática de LC, mesmo que a tecnologia do instrumento melhore com o tempo. Existem muitas maneiras pelas quais os problemas podem surgir em um sistema de LC e acabar em uma forma de pico ruim. Quando surgem problemas relacionados à forma de pico, uma pequena lista de possíveis causas para esses resultados ajuda a simplificar nossa experiência de solução de problemas.
Tem sido divertido escrever esta coluna "Solução de problemas de LC" e pensar sobre os tópicos a cada mês, porque alguns tópicos nunca saem de moda. Enquanto no campo da pesquisa de cromatografia, certos tópicos ou ideias se tornam obsoletos à medida que são substituídos por ideias novas e melhores, no campo da solução de problemas, desde que o primeiro artigo sobre solução de problemas apareceu neste periódico (o LC Journal na época), uma vez que alguns tópicos ainda são relevantes) em 1983(1). Nos últimos anos, concentrei-me em vários LC Seções de solução de problemas sobre tendências contemporâneas que afetam a cromatografia líquida (LC) (por exemplo, a comparação relativa de nossa compreensão do efeito da pressão na retenção [2] Novos avanços) Nossa interpretação dos resultados de LC e como solucionar problemas com instrumentos modernos de LC. estão usando. O tópico principal desta série é altamente relevante para o famoso gráfico de parede "Guia de solução de problemas de LC" (4) do LCGC pendurado em muitos laboratórios. usuários antigos de LC encontrarão algumas dicas úteis e lembretes sobre este importante tópico.
Encontro-me cada vez mais respondendo a perguntas de solução de problemas com "tudo é possível". Essa resposta pode parecer fácil ao considerar observações difíceis de interpretar, mas muitas vezes acho apropriada. Com muitas causas possíveis de forma de pico ruim, é importante manter a mente aberta ao considerar qual pode ser o problema e ser capaz de priorizar as causas potenciais para iniciar nossos esforços de solução de problemas, concentrando-se nas possibilidades mais comuns. Esse ponto é muito importante. possível.
Um passo fundamental em qualquer exercício de solução de problemas - mas que eu acho que é subestimado - é reconhecer que há um problema que precisa ser resolvido. Reconhecer que há um problema geralmente significa reconhecer que o que acontece com a ferramenta é diferente de nossas expectativas, que são moldadas pela teoria, conhecimento empírico e experiência (5). simples. A teoria (6) suporta bem a expectativa do livro didático de que, na maioria dos casos, os picos cromatográficos devem ser simétricos e estar de acordo com a forma de uma distribuição gaussiana, conforme mostrado na Figura 1a. O que esperamos das larguras dos picos é uma questão mais complexa e discutiremos esse tópico em um artigo futuro. As outras formas de pico na Figura 1 mostram algumas das outras possibilidades que podem ser observadas - em outras palavras, algumas das maneiras pelas quais as coisas podem dar errado. situações que podem levar a esses tipos de forma.
Às vezes, os picos não são observados no cromatograma onde se espera que sejam eluídos. O gráfico de parede acima indica que a ausência de um pico (assumindo que a amostra realmente contém o analito alvo em uma concentração que deve tornar a resposta do detector suficiente para vê-lo acima do ruído) geralmente está relacionada a algum problema do instrumento ou condições incorretas da fase móvel (se observadas).picos, geralmente muito “fracos”). Uma pequena lista de possíveis problemas e soluções nesta categoria pode ser encontrada na Tabela I.
Como mencionado acima, a questão de quanto alargamento de pico deve ser tolerado antes de prestar atenção e tentar consertá-lo é um tópico complexo que discutirei em um artigo futuro. Minha experiência é que o alargamento de pico significativo é frequentemente acompanhado por uma mudança significativa na forma do pico, e a cauda do pico é mais comum do que o pré-pico ou a divisão. No entanto, os picos nominalmente simétricos também são ampliados, o que pode ser causado por alguns motivos diferentes:
Cada um desses problemas foi discutido em detalhes em edições anteriores do Troubleshooting LC, e os leitores interessados ​​nesses tópicos podem consultar esses artigos anteriores para obter informações sobre as causas principais e possíveis soluções para esses problemas.Mais detalhes.
A cauda de pico, a frente de pico e a divisão podem ser causados ​​por fenômenos químicos ou físicos, e a lista de possíveis soluções para esses problemas varia muito, dependendo se estamos lidando com um problema químico ou físico. Muitas vezes, comparando os diferentes picos em um cromatograma, você pode encontrar pistas importantes sobre qual é o culpado. Se todos os picos em um cromatograma exibirem formas semelhantes, a causa provavelmente não é física.
As causas químicas da cauda de pico são muito complexas para serem discutidas brevemente aqui. O leitor interessado é encaminhado para a edição recente de "LC Troubleshooting" para uma discussão mais aprofundada (10). No entanto, uma coisa fácil de tentar é reduzir a massa do analito injetado e ver se a forma do pico melhora. Se assim for, então esta é uma boa pista de que o problema é "sobrecarga de massa". boas formas de pico podem ser obtidas mesmo com massas maiores injetadas.
Há também muitas razões físicas potenciais para cauda de pico. Os leitores interessados ​​em uma discussão detalhada das possibilidades devem consultar outra edição recente de "LC Troubleshooting" (11). Uma das causas físicas mais comuns de cauda de pico é uma conexão ruim em um ponto entre o injetor e o detector (12). Um exemplo extremo é mostrado na Figura 1d, obtida em meu laboratório há algumas semanas. foi moldado em um capilar de aço inoxidável. Após alguns experimentos iniciais de solução de problemas, percebemos que a profundidade da porta no estator da válvula de injeção era muito mais profunda do que estávamos acostumados, resultando em um grande volume morto na parte inferior da porta. Esse problema é facilmente resolvido substituindo o loop de injeção por outro tubo, podemos ajustar a ponteira para a posição adequada para eliminar o volume morto na parte inferior da porta.
Frentes de pico como as mostradas na Figura 1e também podem ser causadas por problemas físicos ou químicos.Uma causa física comum da borda de ataque é que o leito de partículas da coluna não está bem compactado ou que as partículas se reorganizaram com o tempo.Assim como ocorre com a cauda de pico causada por esse fenômeno físico, a melhor maneira de corrigir isso é substituir a coluna e continuar.Fundamentalmente, as formas de pico de borda de ataque com origem química geralmente surgem do que chamamos de condições de retenção "não lineares".Sob condições ideais (lineares), a quantidade de analito retido pela fase estacionária (portanto, o fator de retenção) está linearmente relacionado à concentração do analito na coluna. Cromatograficamente, isso significa que, à medida que a massa do analito injetado na coluna aumenta, o pico se torna mais alto, mas não mais largo. Essa relação é quebrada quando o comportamento de retenção é não linear e os picos não apenas se tornam mais altos, mas também mais largos à medida que mais massa é injetada. Além disso, formas não lineares determinam a forma dos picos cromatográficos, resultando em bordas iniciais ou finais .Assim como ocorre com a sobrecarga de massa que causa a cauda do pico (10), o avanço do pico causado pela retenção não linear também pode ser diagnosticado reduzindo a massa do analito injetado. Se o formato do pico melhorar, o método deve ser modificado para não exceder a qualidade da injeção que causa a borda de ataque ou as condições cromatográficas devem ser alteradas para minimizar esse comportamento.
Às vezes, observamos o que parece ser um pico "dividido", conforme mostrado na Figura 1f. A primeira etapa para resolver esse problema é determinar se o formato do pico é devido à coeluição parcial (ou seja, a presença de dois compostos distintos, mas com eluição próxima). coluna em si. Frequentemente, a pista mais importante para essa decisão é se todos os picos no cromatograma exibem formas divididas ou apenas um ou dois. Se for apenas um ou dois, provavelmente é um problema de coeluição;se todos os picos estiverem divididos, provavelmente é um problema físico, provavelmente relacionado à própria coluna.
Os picos divididos relacionados às propriedades físicas da própria coluna são geralmente devidos a fritas de entrada ou saída parcialmente bloqueadas ou à reorganização de partículas na coluna, permitindo que a fase móvel flua mais rapidamente do que a fase móvel em certas áreas da formação do canal da coluna.no entanto, na minha experiência, esta é geralmente uma solução de curto prazo em vez de uma solução de longo prazo. Isso geralmente é fatal com colunas modernas se as partículas se recombinarem dentro da coluna. Neste ponto, é melhor substituir a coluna e continuar.
O pico na Figura 1g, também de uma instância recente em meu próprio laboratório, geralmente indica que o sinal é tão alto que atingiu o limite superior da faixa de resposta. Para detectores de absorção óptica (UV-vis neste caso), quando a concentração do analito é muito alta, o analito absorve a maior parte da luz que passa pela célula de fluxo do detector, deixando muito pouca luz a ser detectada. Nessas condições, o sinal elétrico do fotodetector é fortemente influenciado por várias fontes de ruído, como luz difusa e "corrente escura ”, tornando o sinal muito “confuso” na aparência e independente da concentração do analito.Quando isso acontece, o problema pode ser facilmente resolvido reduzindo o volume de injeção do analito – reduzindo o volume de injeção, diluindo a amostra ou ambos.
Na escola de cromatografia, usamos o sinal do detector (ou seja, o eixo y no cromatograma) como um indicador da concentração do analito na amostra. Portanto, parece estranho ver um cromatograma com um sinal abaixo de zero, pois a interpretação simples é que isso indica uma concentração negativa do analito - o que obviamente não é fisicamente possível.
Nesse caso, um pico negativo significa simplesmente que as moléculas que eluem da coluna absorvem menos luz do que a própria fase móvel imediatamente antes e depois do pico. Isso pode ocorrer, por exemplo, ao usar comprimentos de onda de detecção relativamente baixos (<230 nm) e aditivos de fase móvel que absorvem a maior parte da luz nesses comprimentos de onda. Esses aditivos podem ser componentes solventes da fase móvel, como metanol, ou componentes tampão, como acetato ou formato. per se (esse método às vezes é chamado de "detecção UV indireta") (13). No entanto, se realmente quisermos evitar picos negativos, no caso da detecção de absorbância, a melhor solução é usar um comprimento de onda de detecção diferente para que o analito absorva mais do que a fase móvel ou altere a composição da fase móvel para que absorvam menos luz do que os analitos.
Picos negativos também podem aparecer ao usar a detecção de índice de refração (RI) quando o índice de refração de outros componentes além do analito na amostra, como a matriz de solvente, é diferente do índice de refração da fase móvel. Isso também acontece com a detecção UV-vis, mas esse efeito tende a ser atenuado em relação à detecção de RI. Em ambos os casos, os picos negativos podem ser minimizados combinando mais de perto a composição da matriz da amostra com a da fase móvel.
Na parte três, sobre o tópico básico de solução de problemas de LC, discuti situações nas quais a forma de pico observada difere da forma de pico esperada ou normal. A solução de problemas eficaz de tais problemas começa com o conhecimento das formas de pico esperadas (com base na teoria ou na experiência anterior com métodos existentes), portanto, os desvios dessas expectativas são óbvios. ing, mas não captura todas as possibilidades. Os leitores interessados ​​em uma lista mais detalhada de causas e soluções podem consultar o gráfico de parede do LCGC “Guia de solução de problemas do LC”.
(4) Gráfico de parede do “Guia de solução de problemas de LC” do LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, Nova York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.