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Organelas neurais automontáveis ​​representam uma plataforma in vitro promissora para a modelagem do desenvolvimento e de doenças humanas. No entanto, organoides não possuem a conectividade existente in vivo, o que limita a maturação e impede a integração com outros circuitos que controlam o comportamento. Aqui, mostramos que organoides corticais derivados de células-tronco humanas transplantados para o córtex somatossensorial de ratos nus neonatais desenvolvem tipos celulares maduros que se integram a circuitos sensoriais e relacionados à motivação. A ressonância magnética revelou crescimento de organoides pós-transplante em diversas linhagens de células-tronco e animais, enquanto a análise de núcleo único revelou progressão da corticogênese e o surgimento de um programa de transcrição dependente da atividade. De fato, neurônios corticais transplantados exibem propriedades morfológicas, sinápticas e de membrana interna mais complexas do que suas contrapartes in vitro, permitindo a detecção de defeitos neuronais em pacientes com síndrome de Timothy. O traçado anatômico e funcional demonstrou que organelas transplantadas recebem estímulos tálamo-corticais e cortico-corticais, e registros in vivo da atividade neural sugerem que esses estímulos podem gerar respostas sensoriais em células humanas. Por fim, organoides corticais estendem axônios por todo o cérebro do rato, e sua ativação optogenética leva ao comportamento de busca por recompensa. Assim, neurônios do córtex humano transplantados amadurecem e participam dos circuitos do hospedeiro que controlam o comportamento. Esperamos que essa abordagem facilite a detecção de fenótipos em nível de cadeia em células derivadas de pacientes que não podem ser detectados por outros meios.
O cérebro humano em desenvolvimento é um notável processo de auto-organização no qual as células proliferam, diferenciam-se, migram e conectam-se para formar circuitos neuronais funcionais que são posteriormente refinados através da experiência sensorial. Um problema fundamental na compreensão do desenvolvimento do cérebro humano, especialmente no contexto de doenças, é a falta de acesso ao tecido cerebral. Organelas auto-organizadas, incluindo organoides do córtex humano (hCO; também conhecidas como esfera do córtex humano), podem gerar 2,3,4,5,6. No entanto, várias limitações limitam sua aplicação mais ampla à compreensão do desenvolvimento e funcionamento dos circuitos neurais. Em particular, não está claro se a maturação do hCO é limitada pela ausência de certos estímulos microambientais e sensoriais presentes in vivo. Além disso, como os hCOs não são integrados em circuitos que podem gerar resultados comportamentais, sua utilidade na modelagem de transtornos neuropsiquiátricos comportamentais e geneticamente complexos é atualmente limitada.
O transplante de hCO em um cérebro vivo intacto pode superar essas limitações. Estudos anteriores demonstraram que neurônios humanos transplantados para o córtex de roedores são capazes de sobreviver, projetar-se e comunicar-se com células de roedores7,8,9,10,11,12. No entanto, esses experimentos são geralmente realizados em animais adultos, o que pode limitar a integração sináptica e axonal. Aqui, descrevemos um paradigma de transplante no qual transplantamos hCO 3D derivado de células hiPS para o córtex somatossensorial primário (S1) de ratos imunodeficientes em um estágio inicial de desenvolvimento plástico. Neurônios hCO (t-hCO) transplantados passam por maturação substancial, recebem estímulos tálamo-corticais e córtico-corticais que eliciam respostas sensoriais e estendem projeções axonais para o cérebro do rato para impulsionar o comportamento de busca por recompensa. A maturação prolongada do t-hCO revelou defeitos neuronais em pacientes com síndrome de Timothy (ST), um distúrbio genético grave causado por mutações no canal de cálcio CaV1.2 do tipo L sensível à voltagem (codificado por CACNA1C).
Para estudar neurônios corticais humanos em circuitos in vivo, transplantamos estereotaxicamente hCO3 intacto para S1 de ratos atímicos pós-natais precoces (dias 3-7 pós-natal) (Fig. 1a e dados expandidos das Figs. 1a-c). Nesse ponto, as projeções axonais tálamo-corticais e córtico-corticais ainda não completaram sua inervação em S1 (ref. 13). Portanto, essa abordagem visa maximizar a integração do t-hCO3, minimizando o impacto nos circuitos endógenos. Para visualizar a localização do t-hCO3 em animais vivos, realizamos reconstruções cerebrais ponderadas em T2 de ratos 2 a 3 meses após o transplante (Fig. 1b e dados expandidos, Fig. 1d). t-hCO foram facilmente observados e as medições de volume de t-hCO foram semelhantes às calculadas a partir de fatias fixas (Dados Estendidos Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO foram facilmente observados e as medições de volume de t-hCO foram semelhantes às calculadas a partir de fatias fixas (Dados Estendidos Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO é confiável, e a configuração correta do t-hCO é uma transferência analógica para fins físicos (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO foram facilmente observados, e as medições volumétricas de t-hCO foram semelhantes às calculadas para seções fixas (dados expandidos, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO,并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e;P > 0,05）。很容易观察到t-hCO,并且t-hCO t-hCO é legal, e a configuração correta do t-hCO é uma transferência analítica para a física (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO foi facilmente observado, e as medições volumétricas de t-hCO foram semelhantes às calculadas para seções fixas (dados expandidos, Fig. 1d, e; P > 0,05).Determinamos o t-hCO em 81% dos animais transplantados aproximadamente 2 meses após o transplante (n = 72 animais; hCO de 10 linhagens celulares hiPS; linhagens celulares hiPS na Tabela Suplementar 1). Destes, 87% estavam localizados no córtex cerebral (Fig. 1c). Ao realizar exames de ressonância magnética seriados em múltiplos pontos no mesmo rato transplantado, encontramos um aumento de nove vezes no volume de t-hCO em 3 meses (Fig. 1d e dados expandidos, Fig. 1f). Os animais transplantados apresentaram alta taxa de sobrevivência (74%) 12 meses após o transplante (dados expandidos, Fig. 1g e Tabela Suplementar 2), e não foram encontrados comprometimentos motores ou de memória evidentes, gliose ou eletroencefalograma (EEG). Dados (Fig. 1g e tabela suplementar 2). 1h–m e 3e).
a, Esquema do delineamento experimental. hCO derivado de células hiPS foi transplantado para S1 de ratos nus recém-nascidos nos dias 30-60 de diferenciação. b, Imagens de ressonância magnética coronais e horizontais ponderadas em T2 mostrando t-hCO em S1 2 meses após o transplante. Barra de escala, 2 mm. c, Quantificação das taxas de sucesso de enxerto mostradas para cada linhagem de células hiPS (n = 108, números dentro das barras indicam a quantidade de t-hCO por linhagem de células hIPS) e localização cortical ou subcortical (n = 88). d, Imagem de ressonância magnética de uma artéria coronária (esquerda; barra de escala, 3 mm) e reconstrução volumétrica 3D correspondente (barra de escala, 3 mm) mostrando um aumento em t-hCO ao longo de 3 meses. e, Revisão dos padrões de t-hCO no córtex cerebral de ratos. Barra de escala, 1 mm. f, Imagens imuno-histoquímicas representativas de t-hCO mostradas do canto superior esquerdo para a direita (durante a diferenciação): PPP1R17 (4 meses de idade), NeuN (8 meses de idade), SOX9 e GFAP (8 meses de idade), PDGFRα; (8 meses), MAP2 (8 meses) e IBA1 (8 meses). Barra de escala, 20 µm. A coexpressão de HNA indica células de origem humana. g, snRNA-seq: Imagem de redução de dimensionalidade de variedade e projeção unificadas (UMAP) de todos os núcleos de t-hCO de alta qualidade após integração de Seurat (n = 3 amostras de t-hCO, n = 2 linhagens de células hiPS). Astrócitos, células da linhagem de astrócitos; cyc prog, progenitores circulantes; GluN DL, neurônios glutamatérgicos profundos; GluN DL/SP, neurônios glutamatérgicos profundos e sublamelares; GluN UL, neurônios glutamatérgicos da camada superior; oligodendrócitos, oligodendrócitos; OPC, células progenitoras de oligodendrócitos; RELN, neurônios reelin. h, análise de enriquecimento de termos da Ontologia Genética (GO) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, expressos em pelo menos 10% dos núcleos) em neurônios glutamatérgicos t-hCO em comparação com neurônios glutamatérgicos hCO. h, análise de enriquecimento de termos da Ontologia Genética (GO) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, expressos em pelo menos 10% dos núcleos) em neurônios glutamatérgicos t-hCO em comparação com neurônios glutamatérgicos hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) para генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, expressão por mais de 10% de diâmetro) em glutamato não-hCO por meio de glutamato não-hCO. h, análise de enriquecimento de termos da Ontologia Genética (GO) para genes com ativação significativa (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, expressão em pelo menos 10% dos núcleos) em neurônios glutamatérgicos t-hCO em comparação com neurônios glutamatérgicos hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0.05，倍数变化> 2,在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 , 变化变化> 2 , 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的⚄ 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по mais de 10% de desconto) em глутаматергических нейронах t-hCO em comparação com глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) análise término da operação. h, os genes foram significativamente regulados positivamente (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, expressos em pelo menos 10% dos núcleos) em neurônios glutamatérgicos t-hCO em comparação aos neurônios glutamatérgicos hCO Análise ontológica (GO) do termo de enriquecimento.A linha pontilhada indica um valor de aq de 0,05. i, Imagem UMAP de tipos de células GluN em t-hCO usando transferência de marcadores de um conjunto de dados de referência de 22 snRNA-seq do córtex motor adulto. TC — células corticotalâmicas, ET — células extracerebrais, IT — células telencefálicas internas, NP — projeção próxima.
Em seguida, avaliamos a citoarquitetura e a composição celular geral do t-hCO. A coloração de anticorpos em células endoteliais de ratos revelou vascularização com t-hCO, enquanto a coloração com IBA1 revelou a presença de microglia de ratos em todo o enxerto (Fig. 1f e dados expandidos, Fig. 3c,d). A imunocoloração revelou células positivas para antígeno nuclear humano (HNA) coexpressando PPP1R17 (progenitores corticais), NeuN (neurônios), SOX9 e GFAP (células derivadas da glia) ou PDGFRα (progenitores de oligodendrócitos) (Figura 1f). Para estudar a composição celular do t-hCO em resolução de célula única, realizamos sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) após aproximadamente 8 meses de diferenciação. A filtração em massa e a remoção de núcleos de ratos produziram 21.500 mapas mononucleares humanos de alta qualidade (Fig. 1g e dados expandidos, Fig. 4a,b). Os padrões de expressão de marcadores típicos de tipo celular identificaram grupos das principais classes de células corticais, incluindo neurônios glutamatérgicos profundos e superficiais, progenitores circulantes, oligodendrócitos e linhagem de astrócitos (Fig. 1g, dados expandidos, Fig. 4c e Tabela Suplementar 3). A imunocoloração para SATB2 e CTIP2 mostrou que, apesar da presença de subtipos corticais, o t-hCO não apresentou estratificação anatômica clara (dados expandidos, Fig. 3a). O snRNA-seq hCO com estágio correspondente produziu classes celulares amplamente semelhantes, com algumas exceções, incluindo a ausência de oligodendrócitos e a presença de neurônios GABAérgicos, o que pode refletir as condições in vitro favoráveis ​​relatadas anteriormente para células progenitoras laterais15 (dados expandidos, Fig. 4f-i e Tabela Suplementar 4). A análise da expressão gênica diferencial revelou diferenças significativas nos neurônios glutamatérgicos entre t-hCO e hCO (Tabela Suplementar 5), incluindo a ativação de conjuntos de genes associados à maturação neuronal, como sinalização sináptica, localização dendrítica e atividade do canal dependente de voltagem (Figura 1h e Tabela Suplementar 5). Tabela 6). Consequentemente, os neurônios glutamatérgicos corticais t-hCO exibiram maturação transcricional acelerada.
Para elucidar se essas alterações transcricionais em t-hCO estavam relacionadas a diferenças morfológicas entre hCO in vitro e t-hCO in vivo, reconstruímos hCO preenchido com biocitina e hCO em secções agudas após 7 a 8 meses de diferenciação. neurônios hCO (Fig. 2a). Os neurônios t-hCO eram significativamente maiores, tinham 1,5 vez o diâmetro do soma, o dobro de dendritos e um aumento geral de seis vezes no comprimento total dendrítico em comparação com hCO in vitro (Fig. 2b). Além disso, observamos uma densidade significativamente maior de espinhos dendríticos em neurônios t-hCO do que em neurônios hCO (Fig. 2c). Isso sugere que os neurônios t-hCO sofrem extenso alongamento e ramificação dendrítica, o que, em combinação com a proliferação celular contínua, pode contribuir para o crescimento intensivo de t-hCO após o transplante (Fig. 1d e Dados Estendidos Fig. 1f). Isso nos levou a investigar as propriedades eletrofisiológicas. A capacitância da membrana foi oito vezes maior (dados expandidos, Fig. 8d), o potencial de membrana em estado de repouso foi mais hiperpolarizado (aproximadamente 20 mV) e a injeção de corrente induziu uma taxa máxima de excitação mais alta em neurônios t-hCO do que em neurônios hCO. in vitro (Fig. 2d), e), o que é consistente com as características morfológicas maiores e mais complexas do t-hCO. Além disso, a frequência de eventos de corrente pós-sinápticos excitatórios espontâneos (EPSC) foi significativamente maior em neurônios t-hCO (Fig. 2f), sugerindo que o aumento da densidade de espinhas dendríticas observado em neurônios t-hCO estava associado à excitabilidade funcional. sinapse sexual. Confirmamos o caráter imaturo dos neurônios hCO in vitro registrando neurônios glutamatérgicos marcados (dados expandidos, Fig. 6a-c).
a, reconstrução 3D de neurônios hCO e t-hCO cheios de biocitina após 8 meses de diferenciação. b, Quantificação de características morfológicas (n = 8 neurônios hCO, n = 6 neurônios t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 e ***P < 0,0001). b, Quantificação de características morfológicas (n = 8 neurônios hCO, n = 6 neurônios t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 e ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 e *** P <0,0001). b, quantificação de características morfológicas (n=8 neurônios hCO, n=6 neurônios t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 e ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 e *** P <0,0001). b, quantificação de características morfológicas (n=8 neurônios hCO, n=6 neurônios t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 e ***P<0,0001).c, Reconstrução 3D dos ramos dendríticos de hCO e t-hCO após 8 meses de diferenciação. Asteriscos vermelhos indicam possíveis espinhas dendríticas. Quantificação da densidade das espinhas dendríticas (n = 8 neurônios hCO, n = 6 neurônios t-hCO; **P = 0,0092). d, Quantificação do potencial de membrana em repouso (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). d, Quantificação do potencial de membrana em repouso (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, quantificação do potencial de membrana em repouso (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, quantificação do potencial de membrana em repouso (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). e, Disparo de potencial de ação repetitivo em hCO e t-hCO induzido pelo aumento de injeções de corrente e quantificação da taxa máxima de disparo (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). e, Disparo de potencial de ação repetitivo em hCO e t-hCO induzido pelo aumento de injeções de corrente e quantificação da taxa máxima de disparo (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). e, é possível obter um destino potencial em hCO e t-hCO, você pode usar o som e a temperatura escorço máximo возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, reativação do potencial de ação em hCO e t-hCO induzida pelo aumento da corrente e quantificação da taxa máxima de ativação (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25 个hCO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 （(n = 25 个 hco神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO e t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 novos hCO, n = 16 novos t-hCO; *** P <0,0001). e, disparo repetitivo de potenciais de ação de hCO e t-hCO induzidos pelo aumento do fornecimento de corrente e quantificação da taxa máxima de disparo (n = 25 neurônios hCO, n = 16 neurônios t-hCO; *** P < 0,0001). f, EPSCs espontâneos (sEPSCs) em neurônios hCO e t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação da frequência de eventos sinápticos (n = 25 neurônios hCO, n = 17 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSCs espontâneos (sEPSCs) em neurônios hCO e t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação da frequência de eventos sinápticos (n = 25 neurônios hCO, n = 17 neurônios t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) em нейронах hCO e t-hCO durante 8 meses de diferenças e colagens синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P<0,0001) . f, EPSCs espontâneos (sEPSCs) em neurônios hCO e t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação das taxas de eventos sinápticos (n=25 neurônios hCO, n=17 neurônios t-hCO; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) em нейронах hCO e t-hCO durante 8 meses de diferenças e colagens синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P<0,0001). f, EPSCs espontâneos (sEPSCs) em neurônios hCO e t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação das taxas de eventos sinápticos (n = 25 neurônios hCO, n = 17 neurônios t-hCO; *** P<0,0001).Para bf, hCO e t-hCO na linha 1208-2 foram retirados do mesmo lote de diferenciação mantido em paralelo. g, Análise de enriquecimento do conjunto de genes (teste exato de Fisher unilateral) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, expressos em pelo menos 10% dos núcleos) em neurônios glutamatérgicos t-hCO em comparação com neurônios glutamatérgicos hCO com conjuntos de genes de genes dependentes da atividade de resposta precoce (ERG) e resposta tardia (LRG) identificados a partir de um estudo in vivo com camundongos16 e LRGs específicos para humanos de neurônios in vitro17. g, Análise de enriquecimento do conjunto de genes (teste exato de Fisher unilateral) de genes significativamente regulados positivamente (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, expressos em pelo menos 10% dos núcleos) em neurônios glutamatérgicos t-hCO em comparação com neurônios glutamatérgicos hCO com conjuntos de genes de genes dependentes da atividade de resposta precoce (ERG) e resposta tardia (LRG) identificados a partir de um estudo in vivo com camundongos16 e LRGs específicos para humanos de neurônios in vitro17. g, análise de dados de genovs (critérios de criptografia de dados) genovs com ativação ativa (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими neйронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, e especificações para o LRG de bebês in vitro17. g, análise do enriquecimento do conjunto de genes (teste exato de Fisher unilateral) de genes com ativação significativa (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, expressão em pelo menos 10% dos núcleos) em neurônios glutamatérgicos t-hCO em comparação aos conjuntos de neurônios glutamatérgicos hCO de genes dependentes de atividade precoce (ERG) e tardia (LRG) identificados em camundongos in vivo16 e LRGs específicos de humanos de neurônios in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 , 倍数> 2 , 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）） 体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO é usado para ativar a atividade do glutamato нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, não менее 10% раннего ответа (ERG) e позднего Genéticos, identificados por atividade ativa (LRG), identificados em testes in vivo16 e neonatais in vitro17. LRG, especificação para carro. g, os neurônios glutamatérgicos t-hCO foram significativamente regulados positivamente em comparação aos neurônios glutamatérgicos hCO (P ajustado < 0,05, alteração de dobra > 2, pelo menos 10% Análise de enriquecimento de genes de resposta precoce (ERG) e tardia (teste exato de Fisher unilateral) genes dependentes da atividade de resposta (LRGs) identificados em camundongos in vivo16 e neurônios in vitro.17 LRGs específicos para humanos.A linha pontilhada indica um valor de P corrigido por Bonferroni de 0,05. h, a expressão do gene GluN (pseudopacote e escalonamento de cada gene) foi significativamente aumentada em réplicas de snRNA-seq de genes LRG em neurônios glutamatérgicos t-hCO. i, imunocoloração mostrando a expressão de SCG2 em neurônios t-hCO (superior) e hCO (inferior). As setas brancas apontam para células SCG2+. Barra de escala, 25 µm. Os dados são expressos como média ± desvio padrão.
Com base na atividade aumentada de t-hCO observada em fatias ex vivo, o snRNA-seq revelou uma regulação positiva dependente da atividade de transcritos gênicos em t-hCO em comparação com hCO in vitro. Neurônios glutamatérgicos de t-hCO expressaram níveis mais elevados de genes que regulam a atividade de resposta tardia (Fig. 2g,h), que foram encontrados em estudos anteriores em neurônios de camundongos e humanos16,17. Por exemplo, BDNF18, SCG2 e OSTN, um gene regulador de atividade específico de primatas, apresentaram expressão aumentada em neurônios de t-hCO em comparação com neurônios de hCO (Fig. 2g-i). Assim, os neurônios de t-hCO exibiram características de maturação aprimoradas em comparação com neurônios de hCO por meio de análises transcricionais, morfológicas e funcionais.
Para avaliar ainda mais a associação da maturação do t-hCO com o desenvolvimento do cérebro humano, realizamos comparações transcriptômicas de tipos de células corticais fetais e adultas19,20 e adultas21,22, bem como dados extensivos sobre a expressão gênica cortical23 durante o desenvolvimento (dados expandidos, Fig. 5). ). Com base em trabalhos anteriores24, o status global de maturação do transcriptoma do hCO e do t-hCO aos 7–8 meses de diferenciação é amplamente consistente com o tempo de desenvolvimento in vivo e é mais equivalente à vida fetal tardia (Dados Estendidos Fig. 5a). Notavelmente, observamos aumento da maturidade do transcriptoma no t-hCO em comparação ao hCO da mesma idade, bem como ativação do transcriptoma associada à sinaptogênese, astrogênese e mielinização (dados expandidos, Fig. 5b-d). No nível celular, encontramos evidências de um subtipo de córtex mais fino em t-hCO, com aglomerados de neurônios glutamatérgicos sobrepostos aos subtipos de neurônios L2/3, L5 e L6 adultos (Figura 1i). Em contraste, a sobreposição de aglomerados entre neurônios glutamatérgicos de t-hCO e neurônios corticais fetais foi mais limitada na metade da gestação (dados expandidos, Figura 5e-j). Para determinar se os neurônios de t-hCO são funcionalmente semelhantes aos neurônios neocorticais pós-natais humanos, realizamos registros eletrofisiológicos e reconstruções anatômicas de neurônios piramidais L2/3 humanos em secções nítidas do córtex pós-natal humano (dados expandidos, Figura 7a). As propriedades eletrofisiológicas dos neurônios piramidais L2/3 foram semelhantes às dos neurônios piramidais de t-hCO (dados expandidos, Figura 7e). Morfologicamente, os neurônios L2/3 de amostras humanas pós-natais eram mais semelhantes ao t-hCO do que ao hCO, embora as células L2/3 fossem mais longas, contivessem mais ramificações no geral e tivessem maior densidade de espinhos (Fig. 3g e dados expandidos, Fig. 7b-). G).
a, transplante de hCO produzido por linhas celulares de controle e TS hiPS em ratos neonatais. b, reconstrução 3D de neurônios t-hCO preenchidos com biocitina após 8 meses de diferenciação. c, quantificação do comprimento dendrítico médio (n = 19 neurônios de controle, n = 21 neurônios TS; **P = 0,0041). d, ramos dendríticos reconstruídos em 3D do controle e TS t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação da densidade de espinhos dendríticos (n = 16 neurônios de controle, n = 21 neurônios TS, ***P < 0,0001). d, ramos dendríticos reconstruídos em 3D do controle e TS t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação da densidade de espinhos dendríticos (n = 16 neurônios de controle, n = 21 neurônios TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrução 3D de ramos dendríticos de controle e TS t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação da densidade de espinhos dendríticos (n=16 neurônios de controle, n=21 neurônios TS, ***P<0,0001). d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支,以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d, 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个 神经元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля e TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrução 3D de ramos dendríticos de controle e TS t-hCO em 8 meses de diferenciação e quantificação da densidade de espinhos dendríticos (n=16 neurônios de controle, n=21 neurônios TS, ***P<0,0001).Asteriscos vermelhos indicam possíveis espinhas dendríticas. e, EPSCs espontâneas em neurônios t-hCO de controle e TS após 8 meses de diferenciação. f, gráfico de frequência cumulativa e quantificação da frequência e amplitude de eventos sinápticos (n = 32 neurônios de controle, n = 26 neurônios TS; **P = 0,0076 e P = 0,8102). g, análise de Scholl de neurônios TS e controle em hCO e t-hCO. As linhas tracejadas mostram neurônios piramidais pós-natais L2/3 humanos para comparação (n = 24 neurônios t-hCO de controle, n = 21 neurônios t-hCO de TS, n = 8 neurônios hCO de controle e n = 7 neurônios hCO de TS). Os dados são expressos como média ± desvio padrão.
A capacidade do t-hCO de replicar em alto nível as características morfológicas e funcionais dos neurônios do córtex humano nos levou a explorar se o t-hCO poderia ser usado para detectar fenótipos de doenças. Nosso foco foi a ST, um distúrbio grave do neurodesenvolvimento causado por mutações de ganho de função no gene que codifica o CaV1.2, que inicia a transcrição gênica dependente de atividade em neurônios. Obtivemos hCO de três pacientes com ST portadores da substituição mais comum (p.G406R) e três controles (Fig. 3a). Após o transplante, constatamos que a morfologia dendrítica foi alterada nos neurônios da ST em comparação aos controles (Fig. 3b e dados expandidos, Fig. 8a, b), com um aumento de duas vezes no número de dendritos primários e um aumento geral na média e uma diminuição geral no comprimento dendrítico (Fig. 3c e dados expandidos, Fig. 8c). Isso foi associado a um aumento na densidade de espinhos e a uma maior frequência de EPSCs espontâneas em neurônios do grupo TS em comparação com neurônios do grupo controle (Fig. 3d-f e dados expandidos, Fig. 8g). Análises posteriores revelaram padrões de ramificação dendrítica anormal em neurônios do grupo t-hCO3 em comparação com os neurônios do grupo controle, mas não em neurônios do grupo TS in vitro com hCO3 em um estágio semelhante de diferenciação (Fig. 3g). Isso é consistente com nossos relatos anteriores de redução dendrítica dependente da atividade em neurônios do grupo TS e destaca a capacidade desta plataforma de transplante de detectar fenótipos de doenças in vivo.
Em seguida, questionamos em que medida as células t-hCO estão funcionalmente integradas ao S1 do rato. O S1 em roedores recebe fortes estímulos sinápticos dos núcleos talâmicos posteriores e basais ventrais ipsilaterais, bem como dos córtices motor e somatossensorial secundário ipsilateral e do S1 contralateral (Fig. 4a). Para restaurar o padrão de inervação, infectamos o hCO com o vírus da raiva-dG-GFP/AAV-G e transplantamos o hCO no rato S1 3 dias depois. Observamos uma densa expressão de GFP em neurônios do S1 ipsilateral e dos gânglios basais ventrais 7 a 14 dias após o transplante (Fig. 4b, c). Além disso, a coloração por anticorpos do marcador talâmico netrina G1 revelou a presença de terminações talâmicas no t-hCO (Fig. 4d, e). Para avaliar se essas projeções aferentes poderiam eliciar respostas sinápticas em células t-hCO, realizamos gravações de células inteiras de células humanas em secções nítidas da camada tálamo-cortical. A estimulação elétrica de S1, cápsula interna, substância branca e fibras de rato próximas a t-hCO ou a ativação optogenética de terminações talâmicas que expressam opsina em t-hCO induziram EPSCs de curta latência em neurônios de t-hCO expostos ao antagonista do receptor AMPA, NBQX (Fig. 4f, g e dados expandidos, Fig. 9a-g). Esses dados demonstram que o t-hCO está anatomicamente integrado ao cérebro do rato e pode ser ativado pelo tecido hospedeiro do rato.
a, Diagrama esquemático de um experimento de rastreamento da raiva. b, expressão de GFP e STEM121 específica para humanos entre t-hCO e córtex cerebral de rato (painel superior). Também é mostrada a expressão de GFP no núcleo basal ventral ipsilateral (VB) do rato (inferior esquerdo) e S1 ipsilateral (inferior direito). Barra de escala, 50 µm. Os quadrados vermelhos representam as áreas do cérebro onde as imagens foram obtidas. c, quantificação de células expressando GFP (n = 4 ratos). d, e — Terminais talâmicos de Netrina G1+ em t-hCO. d mostra uma seção coronal contendo núcleos de t-hCO e VB. Barra de escala, 2 mm. e mostra a expressão de Netrina G1 e STEM121 em neurônios de t-hCO (esquerda) e VB (direita). Barra de escala, 50 µm. A linha pontilhada laranja indica a borda de t-hCO. f, g, Traços atuais de neurônios t-hCO após estimulação elétrica em S1 de rato (f) ou cápsula interna (g), com (roxo) ou sem (preto) NBQX (esquerda). Amplitudes de EPSC com e sem NBQX (n = 6 neurônios S1, *P = 0,0119; e n = 6 neurônios da cápsula interna, **P = 0,0022) (centro). Porcentagem de neurônios t-hCO mostrando EPSC em resposta à estimulação elétrica de S1 de rato (f) ou cápsula interna (g) (direita). aCSF, fluido cerebrospinal artificial. h, diagrama esquemático do experimento de imagem 2P (esquerda). Expressão de GCaMP6s em t-hCO (meio). Barra de escala, 100 µm. Lapso de tempo de fluorescência de GCaMP6s (direita). i, escore Z da fluorescência da atividade espontânea. j, ilustração esquemática da estimulação do bigode. k, trajetórias de fluorescência 2P com pontuação z em um teste, alinhadas com o desvio do bigode no tempo zero (linha tracejada) em células de exemplo. l, respostas de pontuação z médias da população de todas as células alinhadas com o desvio do bigode no tempo zero (linha tracejada) (vermelho) ou carimbos de data/hora gerados aleatoriamente (cinza). m. Diagrama esquemático do experimento sobre marcação óptica. n, curvas de voltagem brutas de uma célula t-hCO3 de exemplo durante estimulação com laser azul ou deflexão do bigode. As setas vermelhas indicam os primeiros picos causados ​​pela luz (superior) ou causados ​​pela deflexão do bigode (inferior). O sombreamento cinza indica períodos de deflexão do bigode. o, formas de onda de luz de pico e respostas de deflexão do bigode. p, picos de uma única tentativa, alinhados com o desvio dos bigodes nas células do exemplo. 0 indica desvio do bigode (linha tracejada). q, taxa de disparo do escore z média populacional para todas as células fotossensíveis, alinhada com o desvio do bigode no tempo zero (linha tracejada) (vermelho) ou com carimbos de tempo gerados aleatoriamente (cinza). r, proporção de unidades fotossensíveis moduladas significativamente pelo desvio do bigode (n = 3 ratos) (esquerda). Latência máxima do escore z (n = 3 ratos; n = 5 (verde claro), n = 4 (verde escuro) e n = 4 (ciano) unidades de modulação da deflexão do bigode por rato) (direita). Os dados são expressos como média ± desvio padrão.
Em seguida, questionamos se o t-hCO poderia ser ativado por estímulos sensoriais in vivo. Transplantamos hCO expressando os indicadores de cálcio geneticamente codificados GCaMP6 em ratos S1. Após 150 dias, realizamos fotometria de fibras ou imagens de cálcio de dois fótons (Fig. 4h e dados expandidos, Fig. 10a). Constatamos que as células t-hCO exibiram atividade rítmica sincronizada (Figura 4i, Dados Expandidos, Figura 10b e Vídeo Suplementar 1). Para caracterizar o pico de atividade do t-hCO, realizamos registros eletrofisiológicos extracelulares em ratos transplantados anestesiados (dados expandidos, Fig. 10c-f). Geramos coordenadas estereotáxicas a partir de imagens de ressonância magnética; portanto, essas unidades registradas representam supostos neurônios humanos, embora a eletrofisiologia por si só não permita determinar uma espécie de origem. Observamos surtos sincronizados de atividade (dados expandidos, Fig. 10d). As explosões duraram cerca de 460 ms e foram separadas por períodos de silêncio de cerca de 2 s (dados expandidos, Fig. 10d, e). Unidades individuais dispararam uma média de cerca de três disparos por rajada, o que representa aproximadamente 73% das unidades registradas por rajada. As atividades das unidades individuais foram altamente correlacionadas, e essas correlações foram maiores do que as das unidades identificadas em animais não vacinados registrados nas mesmas condições (dados expandidos, Fig. 10f). Para caracterizar melhor as respostas de pico dos neurônios derivados de humanos identificados, realizamos experimentos de marcação luminosa em ratos anestesiados transplantados com hCO2 expressando o canal catiônico fotossensível rodopsina 2 (hChR2), através do qual os neurônios t-hCO2 realizam o reconhecimento de curta latência (menos de 10 ms) em resposta a estímulos de luz azul (Fig. 4m-o). Os neurônios t-hCO exibiram surtos de atividade espontânea em frequências semelhantes às observadas em imagens de cálcio, bem como em registros eletrofisiológicos realizados em t-hCO na ausência de marcação luminosa (dados expandidos, Fig. 10c-g). Nenhuma atividade espontânea foi observada nos estágios correspondentes de hCO registrados in vitro. Para avaliar se o t-hCO poderia ser ativado por estímulos sensoriais, desviamos brevemente os bigodes do rato para longe do t-hCO (Fig. 4j,m e dados expandidos, Fig. 10h,k). De acordo com estudos anteriores8,10, um subconjunto de células t-hCO apresentou atividade aumentada em resposta à deflexão dos bigodes, o que não foi observado quando os dados foram comparados com registros de tempo aleatórios (Fig. 4k-q e dados expandidos, Fig. 10h-q). De fato, cerca de 54% das unidades individuais optomarcadas apresentaram uma taxa de excitação significativamente aumentada após a estimulação dos bigodes, com pico em cerca de 650 ms (Fig. 4r). Tomados em conjunto, esses dados sugerem que o t-hCO recebe entradas funcionais apropriadas e pode ser ativado por estímulos ambientais.
Em seguida, investigamos se o t-hCO poderia ativar circuitos em ratos para controlar o comportamento. Primeiramente, investigamos se os axônios dos neurônios do t-hCO se projetam para os tecidos circundantes do rato. Infectamos o hCO com um lentivírus que codifica hChR2 fundido ao EYFP (hChR2-EYFP). Após 110 dias, observamos a expressão do EYFP em regiões corticais ipsilaterais, incluindo os córtices auditivo, motor e somatossensorial, bem como em regiões subcorticais, incluindo o estriado, o hipocampo e o tálamo (Fig. 5a). Para avaliar se essas projeções eferentes poderiam eliciar respostas sinápticas em células de rato, ativamos opticamente células t-hCO que expressam hChR2-EYFP, registrando células do córtex cerebral do rato em secções cerebrais nítidas. A ativação dos axônios t-hCO com luz azul induziu EPSCs de curta latência em neurônios do córtex piramidal de ratos, que foram bloqueados por NBQX (Figs. 5b-g). Além disso, essas respostas puderam ser bloqueadas por tetrodotoxina (TTX) e restauradas por 4-aminopiridina (4-AP), sugerindo que foram causadas por conexões monossinápticas (Fig. 5e).
a, Diagrama esquemático do rastreamento de axônios (esquerda). Expressão de EYFP por t-hCO (direita). Barra de escala, 100 µm. A1, córtex auditivo, ACC, córtex cingulado anterior, d. estriado, estriado dorsal, HPC, hipocampo; diafragma, septo lateral, mPFC, córtex pré-frontal medial, piri, córtex piriforme, v. estriado, estriado ventral, VPM, núcleo ventropostomedial do tálamo, VTA, região tegmentar ventral. Os quadrados vermelhos representam as áreas do cérebro onde as imagens foram obtidas. b, Diagrama esquemático do experimento de estimulação. c, d, Exemplos da resposta da fotocorrente (superior) e da voltagem (inferior) induzidas por luz azul em células EYFP+ t-hCO humanas (c) ou EYFP- de rato (d). e, f, Traços atuais de neurônios de ratos após estimulação com luz azul de axônios t-hCO com TTX e 4-AR (verde), TTX (cinza) ou aCSF (preto) (e), com (violeta) ou sem (preto) ) ) NBQX (e). g, latência de respostas induzidas por luz azul em células de ratos (n = 16 células); barras horizontais indicam latência média (7,13 ms) (esquerda). Amplitude de EPSCs evocados por luz registrados com ou sem NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (meio). Amplitude de EPSCs evocados por luz registrados com ou sem NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (meio). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных сили без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (no centro). Amplitude de EPSCs induzidos por luz registrados com ou sem NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (centro).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）(中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）(中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных сили без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (no centro). Amplitude de EPSCs induzidos por luz registrados com ou sem NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (centro).Porcentagem de células de rato apresentando EPSCs que respondem à luz azul (direita). h, Diagrama esquemático de uma tarefa comportamental. d0, dia 0. i. Desempenho de animais exemplares no dia 1 (esquerda) ou dia 15 (direita) de treinamento. Número médio de lambidas realizadas no dia 1 (esquerda) ou no dia 15 (centro direita) (n = 150 testes de luz azul, n = 150 testes de luz vermelha; ***P < 0,0001). Número médio de lambidas realizadas no dia 1 (esquerda) ou no dia 15 (centro direita) (n = 150 testes de luz azul, n = 150 testes de luz vermelha; ***P < 0,0001). A última coleção foi lançada, no dia 1 de janeiro (no dia) ou no dia 15 de dezembro (no centro da cidade) (n = 150 episódios). синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P<0,0001). Número médio de lambidas realizadas no dia 1 (esquerda) ou no dia 15 (centro direita) (n = 150 testes de luz azul, n = 150 testes de luz vermelha; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,001 A última coleção foi lançada, no dia 1 de janeiro (no dia) ou no dia 15 de dezembro (no centro da cidade) (n = 150 episódios). синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P<0,0001). Número médio de lambidas realizadas no dia 1 (esquerda) ou no dia 15 (centro direita) (n = 150 testes de luz azul, n = 150 testes de luz vermelha; ***P < 0,0001).Lambidas cumulativas para testes de luz vermelha e azul no dia 1 (centro à esquerda) ou dia 15 (direita). NS, não significativo. j,k, Características comportamentais de todos os animais transplantados com t-hCO expressando hChR2-EYFP (j) ou fluoróforo de controle (k) no dia 1 ou 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ratos, ** P = 0,0049; controle: n = 9, P = 0,1497). l, Evolução da pontuação de preferência (n = 9 hChR2, n = 9 controle; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolução da pontuação de preferência (n = 9 hChR2, n = 9 controle; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolução da pontuação de preferência (n = 9 hChR2, n = 9 controles; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolução das pontuações de preferência (n = 9 hChR2, n = 9 controles; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, expressão de FOS em resposta à ativação optogenética de t-hCO em S1. Imagens da expressão de FOS (esquerda) e quantificação (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001) (direita) são mostradas. Imagens da expressão de FOS (esquerda) e quantificação (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001) (direita) são mostradas. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) e количественного определения (n = 3 no grupo; * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001) (справа). Imagens da expressão de FOS (esquerda) e quantificação (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001) são mostradas (direita).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) e количественного определения (n = 3 no grupo; * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001) (справа). Imagens da expressão de FOS (esquerda) e quantificação (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001) são mostradas (direita).Barra de escala, 100 µm. Os dados são expressos como média ± erro padrão de BLA, tonsila basolateral, MDT, núcleo talâmico dorsomedial, PAG, substância cinzenta periaquedutal.
Finalmente, perguntamos se o t-hCO poderia modular o comportamento do rato. Para testar isso, transplantamos hCO expressando hChR2-EYFP em S1 e, 90 dias depois, implantamos fibras ópticas em t-hCO para fornecimento de luz. Em seguida, treinamos os ratos com um paradigma de condicionamento operante modificado (Fig. 5h). Colocamos os animais em uma câmara de teste comportamental e aplicamos aleatoriamente estímulos de laser azul (473 nm) e vermelho (635 nm) de 5 segundos. Os animais receberam uma recompensa de água se lambessem durante a estimulação de luz azul, mas não lamberam durante a estimulação de luz vermelha. No primeiro dia de treinamento, os animais não mostraram diferença na lambida quando estimulados com luz azul ou vermelha. No entanto, no dia 15, os animais transplantados com hCO expressando hChR2-EYFP mostraram lambida mais ativa quando estimulados com luz azul em comparação à estimulação de luz vermelha. Essas mudanças no comportamento de lamber não foram observadas em animais controle transplantados com hCO expressando o fluoróforo controle (taxa de sucesso de aprendizagem: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 e Vídeo Suplementar 2). Esses dados sugerem que as células t-hCO podem ativar neurônios de ratos para estimular o comportamento de busca por recompensa. Para descobrir quais circuitos neurais de t-hCO de ratos podem estar envolvidos nessas mudanças comportamentais, ativamos optogeneticamente o t-hCO em animais treinados e coletamos tecidos 90 minutos depois. A imuno-histoquímica revelou a expressão da proteína FOS dependente de atividade em várias regiões cerebrais envolvidas no comportamento motivado, incluindo o córtex pré-frontal medial, o tálamo medial e a substância cinzenta periaquedutal, que foi expressa em animais controle não estimulados ou em animais. arroz. 5m). Tomados em conjunto, esses dados sugerem que o t-hCO pode modular a atividade neuronal do rato para direcionar o comportamento.
Organoides neurais representam um sistema promissor para o estudo do desenvolvimento humano e de doenças in vitro, mas são limitados pela falta de conexões entre os circuitos existentes in vivo. Desenvolvemos uma nova plataforma na qual transplantamos hCO para S1 de ratos imunocomprometidos no período pós-natal inicial para estudar o desenvolvimento e a função de células humanas in vivo. Demonstramos que o t-hCO desenvolve tipos de células maduras não observados in vitro28 e que o t-hCO está anatomicamente e funcionalmente integrado ao cérebro de roedores. A integração do t-hCO em circuitos neurais de roedores nos permitiu estabelecer uma ligação entre a atividade celular humana e o comportamento animal estudado, demonstrando que os neurônios t-hCO podem modular a atividade neuronal de ratos para impulsionar respostas comportamentais.
A plataforma que descrevemos apresenta diversas vantagens em relação a pesquisas anteriores sobre transplante de células humanas em cérebros de roedores. Primeiramente, transplantamos hCO2 para o córtex em desenvolvimento de ratos pós-natais precoces, o que pode facilitar a integração anatômica e funcional. Em segundo lugar, o monitoramento por ressonância magnética com t-hCO2 nos permitiu estudar a posição e o crescimento do enxerto em animais vivos, possibilitando a realização de estudos multianimais de longo prazo e o estabelecimento da confiabilidade de diversas linhagens celulares hiPS. Por fim, transplantamos organoides intactos, em vez de suspensões isoladas de células únicas, que são menos destrutivas para células humanas e podem promover a integração e a geração de neurônios do córtex humano em cérebros de ratos.
Reconhecemos que, apesar dos avanços nessa plataforma, restrições temporais, espaciais e entre espécies impedem a formação de circuitos neurais humanos com alta fidelidade, mesmo após o transplante em um estágio inicial de desenvolvimento. Por exemplo, não está claro se a atividade espontânea observada em t-hCO representa um fenótipo de desenvolvimento semelhante à atividade rítmica observada durante o desenvolvimento cortical, ou se é devido à ausência de tipos de células supressoras presentes em t-hCO. Da mesma forma, não está claro em que medida a ausência de laminação em t-hCO afeta a conectividade da cadeia30. Trabalhos futuros se concentrarão na integração de outros tipos de células, como microglia humana, células endoteliais humanas e proporções variáveis ​​de interneurônios GABAérgicos, como mostrado usando a montagem 6 in vitro, bem como na compreensão de como a integração e o processamento neural podem ocorrer em níveis transcricionais, sinápticos e comportamentais alterados em células obtidas de pacientes.
No geral, esta plataforma in vivo representa um recurso poderoso que pode complementar o desenvolvimento do cérebro humano in vitro e a pesquisa de doenças. Prevemos que esta plataforma nos permitirá descobrir novos fenótipos em nível de cadeia em células derivadas de pacientes, que de outra forma seriam difíceis de serem identificadas, e testar novas estratégias terapêuticas.
Geramos hCO₂ a partir de células HiPS conforme descrito anteriormente. Para iniciar a produção de hCO₂ a partir de células hiPS cultivadas em camadas alimentadoras, colônias intactas de células hiPS foram removidas das placas de cultura utilizando dispase (0,35 mg/mL) e transferidas para culturas plásticas de ultrabaixa adesão contendo placas com meio de cultura de células hiPS (Corning) suplementado com dois inibidores de SMAD: dorsomorfina (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) e SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) e o inibidor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Durante os primeiros 5 dias, o meio de cultura para células hiPS foi trocado diariamente, com adição de dorsomorfina e SB-431542. No sexto dia de suspensão, os esferoides neurais foram transferidos para meio neural contendo neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sem vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina e estreptomicina (1:100, Life Technologies) e suplementado com fator de crescimento epidérmico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) até o dia 24. Do dia 25 ao dia 42, o meio foi suplementado com fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) e neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) com trocas de meio em dias alternados. No sexto dia de suspensão, os esferoides neurais foram transferidos para meio neural contendo neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sem vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina e estreptomicina (1:100, Life Technologies) e suplementado com fator de crescimento epidérmico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) até o dia 24. Do dia 25 ao dia 42, o meio foi suplementado com fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) e neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) com trocas de meio em dias alternados.No sexto dia de suspensão, os esferoides neurais foram transferidos para um meio neural contendo Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sem vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina.e стрептомицин (1:100, Life Technologies) e дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) e фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) até 24 dias. e estreptomicina (1:100, Life Technologies) e suplementados com fator de crescimento epidérmico (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) até o dia 24.Dos dias 25 a 42, o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) e a neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) foram adicionados ao meio, trocando o meio em dias alternados.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27 补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Tecnologias）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；Sistemas de P&D）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；P&D Sistemas）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 , Life Technologies） 不 含 维生素 a 的 b-27补充剂 (12587, Life Technologies) Glutamax (1: 100, Life TechNOGIS). 生长 因子 （(（20 ng ml-1 ； Sistemas de P&D） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；P&D Sistemas）直至第24天。 No dia 6 de janeiro, a suspensão dos negócios será realizada em casa, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 sem vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) com добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Sistemas de P&D) e fator de produção фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; No dia 6, as suspensões de neuroesferas foram trocadas por um suplemento contendo neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sem vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), estreptomicina neutralizada com penicilina (1:100, Life Technologies) suplementada com fator de crescimento epidérmico (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistemas de P&D) até 24 horas por dia. Sistemas de P&D) até o dia 24.Do 25º ao 42º dia, o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) e o fator neurotrófico 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) foram adicionados ao meio de cultura em dias alternados. Troca de meio uma vez.A partir do 43º dia, o hCO foi mantido em meio neurobasal-A não suplementado (NM; 1088022, Thermo Fisher), com troca de meio a cada 4 a 6 dias. Para obter hCO a partir de células hiPS cultivadas em condições sem alimentador, as células hiPS foram incubadas com Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) a 37 °C por 7 minutos, dissociadas em células individuais e semeadas em placas AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) a uma densidade de 3 × 106 células individuais por poço em meio Essential 8 suplementado com o inibidor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Após 24 horas, os meios nos poços foram pipetados para cima e para baixo em meio contendo meio Essential 6 (A1516401, Life Technologies) suplementado com dorsomorfina (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) e SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Do 2º ao 6º dia, o meio Essential 6 foi substituído diariamente por dorsomorfina e o suplemento SB-431542. A partir do sexto dia, as suspensões de neuroesferas foram transferidas para o meio neurobasal e mantidas conforme descrito acima.
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com animais aprovadas pelo Comitê Administrativo de Cuidados com Animais de Laboratório da Universidade de Stanford (APLAC). Ratas prenhes eutímicas RNU (rnu/+) foram adquiridas (Charles River Laboratories) ou alojadas. Os animais foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum. Filhotes de ratos nus (FOXN1–/–) com idades entre três e sete dias foram identificados pelo crescimento de bigodes imaturos antes do abate. Os filhotes (machos e fêmeas) foram anestesiados com 2-3% de isoflurano e colocados em uma estrutura estereotáxica. Uma trepanação do crânio com um diâmetro de aproximadamente 2-3 mm acima de S1 foi realizada, mantendo a integridade da dura-máter. Em seguida, use uma agulha 30-G (aproximadamente 0,3 mm) logo fora da craniotomia para perfurar a dura-máter. Em seguida, aplique HCO em um parafilme fino de 3 × 3 cm e remova o excesso de meio. Usando uma seringa Hamilton acoplada a uma agulha 23 G, 45°, aspire delicadamente hCO2 para a extremidade mais distal da agulha. Em seguida, instale a seringa na bomba de seringa conectada ao dispositivo estereotáxico. Em seguida, coloque a ponta da agulha sobre um orifício de punção de 0,3 mm de largura previamente feito na dura-máter (z = 0 mm) e estreite a seringa 1–2 mm (z = aproximadamente –1,5 mm) até que a agulha esteja entre a dura-máter A. um selo denso é formado. Em seguida, eleve a seringa até o centro da superfície cortical em z = -0,5 mm e injete hCO2 a uma taxa de 1-2 µl por minuto. Após a conclusão da injeção de hCO2, a agulha é retraída a uma taxa de 0,2-0,5 mm por minuto, a pele é suturada e o filhote é imediatamente colocado em uma almofada térmica aquecida até a recuperação completa. Alguns animais foram transplantados bilateralmente.
Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com animais aprovadas pela APLAC da Universidade Stanford. Ratos (mais de 60 dias após o transplante) foram induzidos com anestesia de isoflurano a 5% e anestesiados com isoflurano a 1-3% durante a obtenção de imagens. Para visualização, foi utilizado um scanner de poço horizontal Bruker (Bruker Corp.) com blindagem ativa de 7 Tesla, com acionamento por gradiente da International Electric Company (IECO), um inserto de gradiente blindado com diâmetro interno de 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) usando o AVANCE. III, capacidades de RF multibobina de oito canais e multinúcleo, e a plataforma Paravision 6.0.1 que o acompanha. A gravação foi realizada usando uma bobina de RF volumétrica ativamente desacoplada com diâmetro interno de 86 mm e uma bobina de RF crio-resfriada de quatro canais apenas para recepção. Axial 2D Turbo-RARE (tempo de repetição = 2500 ms, tempo de eco = 33 ms, 2 médias) com 16 capturas de cortes, espessura de corte de 0,6–0,8 mm, contendo 256 × 256 amostras. Os sinais foram recebidos usando uma bobina de RF volumétrica transceptora de quadratura com diâmetro interno de 2 cm (Rapid MR International, LLC). Por fim, use as funções de estimativa de superfície Imaris (BitPlane) integradas para renderização 3D e análise de volume. Um transplante bem-sucedido foi definido como aquele em que áreas de sinal de RM ponderado em T2 contínuo foram formadas no hemisfério transplantado. A rejeição do enxerto foi definida como um enxerto que não produziu áreas de sinal de RM ponderado em T2 contínuo no hemisfério transplantado. O t-hCO3 subcortical foi excluído da análise subsequente.
Para expressar GCaMP6s de forma estável em hCO para imagens de cálcio de dois fótons, células hiPS foram infectadas com pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, seguidas da seleção de antibióticos. Resumidamente, as células foram dissociadas com EDTA e suspensas em 1 ml de meio Essential 8 a uma densidade de aproximadamente 300.000 células na presença de polibreno (5 μg/ml) e 15 μl de vírus. As células foram então incubadas em suspensão por 60 minutos e semeadas a uma densidade de 50.000 células por poço. Após a confluência, as células foram tratadas com 5-10 μg ml-1 de puromicina por 5-10 dias ou até o surgimento de colônias estáveis. A infecção aguda por hCO foi realizada conforme descrito anteriormente, com algumas modificações. Resumidamente, transfira o hCO2 do dia 30-45 para tubos de microcentrífuga Eppendorf de 1,5 ml contendo 100 µl de meio para nervos. Em seguida, aproximadamente 90 µl do meio são removidos, 3-6 µl de lentivírus de alto título (de 0,5 x 108 a 1,2 x 109) são adicionados ao tubo e o hCO2 é transferido para a incubadora por 30 minutos. Em seguida, adicione 90-100 µl de meio a cada tubo e retorne os tubos à incubadora durante a noite. No dia seguinte, transfira o hCO2 para meio para nervos fresco em placas de baixa adesão. Após 7 dias, o hCO2 foi transferido para placas com fundo de vidro de 24 poços para visualização e avaliação da qualidade da infecção. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE e pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE foram gerados pelo VectorBuilder. O lentivírus é utilizado na maioria dos experimentos porque está integrado ao genoma do hospedeiro, permitindo a expressão do gene repórter em linhagens celulares infectadas. Para o acompanhamento da raiva, o hCO2 foi coinfectado entre os dias 30 e 45 com raiva-ΔG-eGFP e AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmídeo nº 67528, Addgene), lavado cuidadosamente por 3 dias e transplantado em ratos em S1 e mantido in vivo por 7 a 14 dias.
Para imuno-histoquímica, os animais foram anestesiados e perfundidos transcardialmente com PBS seguido de paraformaldeído a 4% (PFA em PBS; Electron Microscopy Sciences). Os cérebros foram fixados em PFA a 4% por 2 horas ou durante a noite a 4 °C, criopreservados em sacarose a 30% em PBS por 48-72 horas e incluídos em 1:1, 30% de sacarose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) e secções coronais foram feitas a 30 µm usando um criostato (Leica). Para imuno-histoquímica de secções espessas, os animais foram perfundidos com PBS, e o cérebro foi dissecado e seccionado coronalmente a 300-400 µm usando um vibratome (Leica) e as secções foram fixadas com PFA a 4% por 30 minutos. Em seguida, as criosecções ou secções espessas foram lavadas com PBS, bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente (10% de soro normal de burro (NDS) e 0,3% de Triton X-100 diluído em PBS) e bloqueadas com solução de bloqueio a 4°C. – Incubação As criosecções foram incubadas durante a noite e as secções espessas foram incubadas durante 5 dias. Os anticorpos primários utilizados foram: anti-NeuN (camundongo, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coelho, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (frango, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (camundongo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coelho, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coelho, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coelho, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (camundongo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coelho, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (camundongo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (camundongo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coelho, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Os anticorpos primários utilizados foram: anti-NeuN (camundongo, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coelho, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (frango, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (camundongo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coelho, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coelho, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coelho, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (camundongo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coelho, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (camundongo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (camundongo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coelho, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), anti- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), anti-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) e анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Os anticorpos primários utilizados foram: anti-NeuN (camundongo, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coelho, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (frango, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (camundongo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coelho, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coelho, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coelho, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (camundongo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coelho, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (camundongo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (camundongo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coelho, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (camundongo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coelho, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam).Os anticorpos primários utilizados foram: anti-NeuN (camundongo, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rato, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coelho, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (frango, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (camundongo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coelho, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coelho, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coelho, 1:200; HPA047819, anticorpo Atlas), anti-RECA-1 (camundongo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coelho), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (camundongo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (camundongo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coelho, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).As secções foram então lavadas com PBS e incubadas com anticorpo secundário durante 1 hora à temperatura ambiente (secções congeladas) ou durante a noite a 4 °C (secções espessas). Foi utilizado anticorpo secundário Alexa Fluor (Life Technologies) diluído 1:1000 em solução de bloqueio. Após a lavagem com PBS, os núcleos foram visualizados com um Hoechst 33258 (Life Technologies). Finalmente, as lâminas foram colocadas num microscópio com lamínulas (Fisher Scientific) usando um Aquamount (Polysciences) e analisadas num microscópio de fluorescência Keyence (analisador BZ-X) ou num microscópio confocal Leica TCS SP8 (Las-X) na imagem. As imagens foram processadas usando o programa ImageJ (Fiji). Para quantificar a proporção de neurónios humanos no t-hCO e no córtex do rato, foram tiradas imagens retangulares com 387,5 μm de largura no centro do t-hCO, na ou perto da borda do córtex do rato. As margens do enxerto foram determinadas avaliando-se as alterações na transparência do tecido, núcleos HNA+ e/ou a presença de autofluorescência tecidual. Em cada imagem, o número total de células NeuN+ e HNA+ foi dividido pelo número total de células NeuN+ na mesma área. Para garantir que apenas células com núcleos no plano da imagem sejam contadas, apenas células que também são Hoechst+ são incluídas no cálculo. Duas imagens separadas por pelo menos 1 mm foram calculadas para reduzir o erro estatístico.
Uma semana antes da coleta da amostra, coloque os animais transplantados com hCO3 (aproximadamente 8 meses de diferenciação) em uma sala escura com os pelos aparados para minimizar a estimulação sensorial. O isolamento dos núcleos foi realizado conforme descrito anteriormente, com algumas modificações. Resumidamente, t-hCO3 e hCO3 foram destruídos por lise celular detergente-mecânica e um triturador de tecidos de vidro de 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Os núcleos brutos foram então filtrados com um filtro de 40 µm e centrifugados a 320 g por 10 minutos a 4 °C antes da realização de um gradiente de densidade de sacarose. Após a etapa de centrifugação (320 g por 20 min a 4 °C), as amostras foram ressuspensas em 0,04% de BSA/PBS com a adição de 0,2 unidades de inibidor de RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) e passadas por um filtro de fluxo de 40 µm. Os núcleos dissociados foram então ressuspensos em PBS contendo 0,02% de BSA e carregados em um chip Chromium Single Cell 3' (recuperação estimada de 8.000 células por pista). Bibliotecas snRNA-seq foram preparadas com o Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Bibliotecas snRNA-seq foram preparadas com o Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). A biblioteca snRNA-seq foi desenvolvida com cromo de célula única 3′ GEM, biblioteca e kit de contas de gel v3 (10x Genomics). As bibliotecas snRNA-seq foram preparadas usando Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 A biblioteca snRNA-seq foi desenvolvida com o Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). A biblioteca snRNA-seq foi preparada usando Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Bibliotecas de diferentes amostras foram reunidas e sequenciadas pela Admera Health no NovaSeq S4 (Illumina).
Os níveis de expressão gênica para cada código de barras nuclear putativo foram quantificados usando o pacote de software de análise 10x Genomics CellRanger (versão 6.1.2). Especificamente, as leituras foram comparadas com uma combinação de genomas de referência humanos (GRCh38, Ensemble, versão 98) e de rato (Rnor_6.0, Ensemble, versão 100) criados com o comando mkref e usando count com o comando –include-introns=TRUE para quantificar leituras de inclusão mapeadas para regiões de íntron. Para amostras de t-hCO3, núcleos humanos foram identificados com base no requisito conservador de que pelo menos 95% de todas as leituras mapeadas correspondam ao genoma humano. Todas as análises subsequentes foram realizadas em uma matriz de código de barras filtrada, gerada pelo CellRanger, usando o pacote R (versão 4.1.2) Seurat (versão 4.1.1)32.
Para garantir que apenas núcleos de alta qualidade sejam incluídos na análise subsequente, um processo de filtragem iterativa foi implementado para cada amostra. Primeiramente, núcleos de baixa qualidade, com menos de 1.000 genes únicos encontrados e mais de 20% do total de mitocôndrias, são identificados e removidos. Subsequentemente, a matriz de números de genes brutos foi normalizada por regressão binomial negativa regularizada usando a função sctransform(vst.flavor=”v2″), que também identificou os 3000 genes mais variáveis ​​usando parâmetros padrão. A redução de dimensão foi realizada nos genes variáveis ​​superiores usando Análise de Componentes Principais (ACP) com parâmetros padrão usando uma dimensão de conjunto de dados de 30 (dims = 30 foi escolhido com base na inspeção visual dos locais do joelho e usado para todas as amostras e análises de conjunto). Em seguida, realizamos várias rodadas de agrupamento iterativo (resolução = 1) para classificar genes com base na contagem de genes anormalmente baixa (mediana abaixo do 10º percentil), contagem de genes mitocondriais anormalmente alta (mediana acima do 95º percentil) para identificar e remover células putativas de baixa qualidade. agrupamentos e/ou uma alta proporção de gêmeos suspeitos identificados usando o pacote DoubletFinder33 (pontuação média do DoubletFinder acima do 95º percentil). amostras de t-hCO3 (n=3) e amostras de hCO3 (n=3) foram integrados separadamente usando a função IntegrateData com os parâmetros acima. Em seguida, outra rodada de filtragem qualitativa do conjunto de dados integrados foi realizada conforme descrito acima.
Após a remoção dos kernels de baixa qualidade, o conjunto de dados integrado foi agrupado (resolução = 0,5) e incorporado para fins de visualização UMAP34. Os genes marcadores para cada cluster foram determinados usando a função FindMarkers com parâmetros padrão calculados a partir de dados de expressão gênica normalizados. Identificamos e classificamos as principais classes de células combinando conjuntos de dados de referência corticais fetais e adultos com expressão gênica marcadora 19,20,21,35 e anotação. Em particular, os precursores circulantes foram identificados pela expressão de MKI67 e TOP2A. Os clusters de progenitores foram definidos pela ausência de transcritos mitóticos, alta sobreposição com clusters de progenitores gliais multipotentes descritos no córtex fetal em metáfase tardia e expressão de EGFR e OLIG1. Usamos o termo astrócito para abranger vários estados de diferenciação de astrócito, da glia radial tardia à maturação de astrócitos. Aglomerados de astrócitos expressam altos níveis de SLC1A3 e AQP4 e demonstraram ser compatíveis com subtipos de glia radial fetal e/ou astrócitos adultos. As OPCs expressam PDGFRA e SOX10, enquanto os oligodendrócitos expressam marcadores de mielinização (MOG e MYRF). Neurônios glutamatérgicos foram identificados pela presença de transcritos neuronais (SYT1 e SNAP25), ausência de marcadores GABAérgicos (GAD2) e expressão de NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ou SATB2. Os neurônios GluN foram subdivididos em subclasses superiores (expressão de SATB2 e perda de BCL11B) e profundas (expressão de BCL11B). Neurônios putativos de subplaca (SP) expressam marcadores SP18 conhecidos, como ST18 e SORCS1, além de marcadores GluN profundos. Células semelhantes ao plexo coroide foram identificadas pela expressão de TTR, e células semelhantes às meníngeas expressaram genes associados a fibroblastos e mapearam células piais/vasculares do conjunto de dados de referência.
A análise diferencial da expressão gênica entre as subclasses t-hCO e hCO foi realizada usando um método pseudo-lote recentemente desenvolvido, reproduzido em amostras implementadas usando o pacote Libra R (versão 1.0.0). Especificamente, os testes de log-verossimilhança edgeR (versão 3.36.0, pacote R) foram realizados para grupos somando o número de genes em células para uma determinada classe de células para cada replicação da amostra. Para a visualização do mapa de calor, os valores normalizados por milhão (CPM) são computados usando edgeR (função cpm()) e escalonados (para atingir média = 0, desvio padrão = 1). A análise de enriquecimento de Ontologia Genética (GO) de genes GluN t-hCO significativamente regulados positivamente foi realizada (valor de P corrigido por Benjamini-Hochberg de menos de 0,05 expresso em pelo menos 10% das células GluN t-hCO e um aumento de dobra na mudança de pelo menos 2 vezes). realizada usando ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Usamos o aplicativo ToppFun com parâmetros padrão e relatamos valores de P corrigidos por Benjamini-Hochberg calculados a partir de testes hipergeométricos anotados por GO.
Para combinar nossos clusters de snRNA-seq com clusters de células anotados de estudos de referência de RNA-seq primário de célula única ou snRNA-seq adulto19,20,21,22, aplicamos uma abordagem de integração de conjuntos de dados pareados. Usamos o fluxo de trabalho de normalização SCTransform (v2) no Seurat para integrar e comparar sobreposições de clusters entre conjuntos de dados (usando os mesmos parâmetros acima). Conjuntos de dados individuais foram subdivididos aleatoriamente em até 500 células ou núcleos por cluster original para eficiência computacional. Usando uma abordagem semelhante à descrita anteriormente, a sobreposição de clusters foi definida como a proporção de células ou núcleos em cada cluster agrupado que se sobrepuseram ao rótulo do cluster de referência. Para classificar melhor as GluNs, usamos o fluxo de trabalho TransferData do Seurat para dados de subconjuntos de GluN para atribuir rótulos de conjuntos de dados de referência às nossas células GluN.
Para avaliar o estado de maturação do transcriptoma global de amostras de t-hCO e hCO, comparamos nossas amostras pseudo-bulk com BrainSpan/psychENCODE23, que consiste em uma grande sequência de RNA abrangendo o desenvolvimento do cérebro humano. Realizamos PCA em uma matriz combinada de expressão gênica normalizada por padrão de amostras corticais 10 semanas após a concepção e, posteriormente, em 5.567 genes (juntamente com nossos dados) que foram previamente identificados como ativos em amostras corticais BrainSpan (definidas como maiores que 50% na variância do desenvolvimento explicada pela idade usando um modelo cúbico)38. Além disso, derivamos genes associados às principais assinaturas transcriptômicas do neurodesenvolvimento usando fatoração de matriz não negativa, conforme descrito anteriormente. Os pesos amostrais calculados usando o procedimento de fatoração de matriz não negativa são plotados nas Figuras 5b com dados expandidos para cada uma das cinco assinaturas descritas por Zhu et al.38. Novamente, marcadores transcricionais dependentes de atividade foram derivados de estudos publicados anteriormente. Em particular, ERG e LRG foram significativamente suprarregulados em neurônios glutamatérgicos identificados pela coleta de snRNA-seq do córtex visual de camundongos após estimulação visual, conforme Tabela Suplementar 3 (Hrvatin et al.16). LRGs enriquecidos em humanos foram obtidos de culturas de cérebro fetal humano ativadas com KCl e coletados 6 horas após a estimulação, e os genes filtrados foram significativamente suprarregulados em humanos, mas não em roedores (Tabela Suplementar 4). A análise do enriquecimento do conjunto de genes usando esses conjuntos de genes foi realizada por meio do teste exato de Fisher unidirecional.
Anestesiar ratos com isoflurano, remover os cérebros e colocá-los em solução de sacarose oxigenada (95% O2 e 5% CO2) fria (aproximadamente 4°C) para cortes contendo: 234 mM de sacarose, 11 mM de glicose, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 10 mM de MgSO4 e 0,5 mM de CaCl2 (cerca de 310 mOsm). Cortes coronais de cérebro de rato (300–400 µm) contendo t-hCO foram feitos usando um vibratome Leica VT1200, conforme descrito anteriormente39. As secções foram então transferidas para uma câmara de seccionamento com oxigenação contínua à temperatura ambiente contendo aCSF preparado a partir de: 10 mM de glicose, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaHPO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e 126 mM de NaCl (298 mOsm), pelo menos 45 minutos antes do registo. As secções foram registadas numa câmara imersa, onde foram continuamente perfundidas com aCSF (frasco com 95% de O2 e 5% de CO2). Todos os dados foram registados à temperatura ambiente. Os neurônios t-hCO foram terminados com uma pipeta de vidro borossilicato preenchida com uma solução contendo 127 mM de gluconato de potássio, 8 mM de NaCl, 4 mM de ATP de magnésio, 0,3 mM de GTP de sódio, 10 mM de HEPES e 0,6 mM de EGTA, pH 7,2, com solução interna ajustada com KOH (290 mOsm). Para recuperação, biocitina (0,2%) foi adicionada à solução de registro.
Os dados foram adquiridos utilizando um amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) e um digitalizador Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrados em passa-baixa a 2 kHz, digitalizados a 20 kHz e analisados ​​utilizando Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). e funções personalizadas do MATLAB (Mathworks). O potencial de junção foi calculado utilizando JPCalc e as entradas foram ajustadas para o valor calculado de -14 mV. A Operação IV consiste em uma série de etapas de corrente em passos de 10 a 25 pA, de -250 a 750 pA.
O tálamo, a substância branca e os aferentes S1 foram estimulados eletricamente em fatias tálamo-corticais durante o registro patch-clamp dos neurônios hCO, conforme descrito anteriormente. Resumidamente, o cérebro foi colocado sobre uma mesa de impressão 3D inclinada em um ângulo de 10°, e a parte frontal do cérebro foi cortada em um ângulo de 35°. O cérebro foi então colado à superfície cortada e seccionado, preservando os axônios protrusos tálamo-corticais. Eletrodos bipolares de tungstênio (0,5 MΩ) foram montados em um segundo micromanipulador e estrategicamente posicionados para estimular quatro regiões por célula (cápsula interna, substância branca, S1 e hCO). Registre as respostas sinápticas após estimulação fásica de 300 µA a 0,03–0,1 Hz.
Neurônios hCO expressando hChR2 foram ativados a 480 nm e pulsos de luz gerados por um LED (Prizmatix) foram aplicados através de uma objetiva ×40 (0,9 NA; Olympus) para registrar a expressão de hChR2 próximo às células. O diâmetro do campo iluminado é de aproximadamente 0,5 mm e a potência total é de 10-20 mW. A largura do pulso foi definida para 10 ms, o que corresponde ao pulso dado durante o experimento de aprendizagem comportamental. Várias frequências de estimulação foram usadas, de 1 a 20 Hz, mas apenas o primeiro pulso da série foi usado para quantificação. Os intervalos entre os trens são geralmente maiores que 30 s para minimizar o efeito nas vias inibitórias ou facilitadoras sinápticas. Para testar se a resposta de hChR2 era monossináptica, aplicamos TTX (1 μM) ao banho até que a reação EPSC desaparecesse e, em seguida, aplicamos 4-aminopiridina (4-AP; 100 μM). Normalmente, uma resposta é retornada em poucos minutos, com um atraso um pouco maior entre o disparo do LED e a geração do EPSC. O NBQX (10 μM) foi usado para testar se a resposta é conduzida pelos receptores AMPA.
Secções nítidas de hCO foram criadas conforme descrito anteriormente. Resumidamente, secções de hCO foram embebidas em agarose a 4% e transferidas para células contendo 126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 e 10 mM de d-(+)-glicose em secções que foram cortadas a 200–300 µm à temperatura ambiente utilizando um vibrador Leica VT1200 e armazenadas em ASF à temperatura ambiente. Em seguida, foi realizado o registo patch-camp de células inteiras em secções de hCO sob um microscópio SliceScope direto (Scientifica). As secções foram perfundidas com aCSF (95% de O2 e 5% de CO2) e os sinais celulares foram registados à temperatura ambiente. Neurônios hCO foram aplicados utilizando uma pipeta de vidro borossilicato preenchida com uma solução contendo 127 mM de gluconato de potássio, 8 mM de NaCl, 4 mM de ATP de magnésio, 0,3 mM de GTP de sódio, 10 mM de HEPES e 0,6 mM de EGTA, com pH interno de 7,2, ajustado com KOH (osmolaridade de 290). Para fins de recuperação, adicionar 0,2% de biocitina à solução interna.
Os dados foram adquiridos pelo Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) usando um amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) e um digitalizador Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrados em passa-baixa a 2 kHz, digitalizados a 20 kHz e analisados ​​usando o Clampfit (versão 10.6) para análise, dispositivos moleculares) e funções personalizadas do MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). O potencial de junção foi calculado usando JPCalc e as entradas foram ajustadas ao potencial de junção calculado de -14 mV. A Operação IV consiste em uma série de etapas de corrente em passos de 5 a 10 pA, de -50 a 250 pA.
Para a reconstrução morfológica dos neurônios comprimidos, 0,2% de biocitina (Sigma-Aldrich) foi adicionado à solução interna. As células são preparadas por pelo menos 15 minutos após a fragmentação. A pipeta é então lentamente aspirada por 1 a 2 minutos até que a membrana registrada esteja completamente selada. Seguindo o procedimento de fisiologia dos cortes, os cortes foram fixados durante a noite a 4°C em PFA a 4%, lavados com PBS 3 vezes e diluídos 1:1000 com DyLight 549 ou DyLight 405 conjugado com estreptavidina (Vector Labs). As células preenchidas com biocitina (2%; Sigma-Aldrich) foram marcadas durante o registro por patch clamp à temperatura ambiente por 2 horas. As secções foram então montadas em lâminas de microscopia usando um Aquamount (Thermo Scientific) e visualizadas no dia seguinte num microscópio confocal Leica TCS SP8 usando uma objetiva de imersão em óleo com uma abertura numérica ×40 1,3, ampliação ×0,9–1,0, xy. A taxa de amostragem é de aproximadamente 7 pixels por mícron. Pilhas Z em intervalos de 1 µm foram obtidas em série, e mosaicos de pilha z e auto-costura baseados em Leica foram realizados para cobrir toda a árvore dendrítica de cada neurônio. Os neurônios foram então rastreados semi-manualmente usando a interface neuTube 40 e os arquivos SWC foram gerados. Os arquivos foram então carregados para o plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versão 2.1.0; NIH).
Tecido cortical humano foi obtido com consentimento informado, de acordo com um protocolo aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade Stanford. Duas amostras de tecido humano pós-parto (3 e 18 anos de idade) foram obtidas por ressecção do córtex frontal (giro frontal médio) como parte de uma cirurgia para epilepsia refratária. Após a ressecção, o tecido foi colhido em NMDG-aCSF gelado contendo: 92 mM de NMDG, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 30 mM de NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 mM de glicose, 2 mM de tioureia, 5 mM de ascorbato de sódio, 3 mM de piruvato de sódio, 0,5 mM de CaCl2.4H2O e 10 mM de MgSO4.7H2O. Titule para pH 7,3-7,4 com ácido clorídrico concentrado. Os tecidos foram entregues ao laboratório em 30 minutos e as secções coronais foram retiradas de acordo com o procedimento descrito acima.
Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com animais aprovadas pela APLAC da Universidade Stanford. Ratos (com mais de 140 dias de pós-transplante) foram induzidos com anestesia de isoflurano a 5% e anestesiados com isoflurano a 1-3% no intraoperatório. Os animais foram colocados em uma estrutura estereotáxica (Kopf) e buprenorfina de liberação sustentada (SR) foi injetada subcutaneamente. O crânio é exposto, limpo e 3-5 parafusos ósseos são inseridos. Para atingir o t-hCO3, geramos coordenadas estereotáxicas a partir de imagens de ressonância magnética. Um orifício de trepanação foi perfurado no local de interesse e fibras (400 µm de diâmetro, NA 0,48, Doric) foram abaixadas 100 µm abaixo da superfície do hCO3 e fixadas ao crânio com cimento odontológico curável por UV (Relyx).
Os registros fotométricos de fibra foram realizados conforme descrito anteriormente42. Para registrar a atividade espontânea, os ratos foram colocados em uma gaiola limpa e um cabo de fibra óptica de 400 µm de diâmetro (Doric) conectado a um sistema de aquisição de dados fotométricos de fibra óptica foi conectado ao cabo de fibra óptica implantado. Durante os 10 minutos de registro da atividade motora, os animais estavam livres para explorar a gaiola. Para registrar a atividade evocada, os ratos (mais de 140 dias após o transplante) foram anestesiados com 5% de isoflurano para indução e 1-3% de isoflurano para manutenção. Coloque o animal em uma estrutura estereotáxica (Kopf) e os bigodes no lado oposto do t-hCO são aparados para cerca de 2 cm e passados ​​através de uma malha conectada a um atuador piezoelétrico (PI). Um cabo de fibra óptica de 400 µm (Doric) foi conectado à fibra implantada e conectado ao sistema de aquisição de dados. Os fios no lado oposto do t-hCO foram então defletidos 50 vezes (2 mm a 20 Hz, 2 s por apresentação) em momentos aleatórios por um acionamento piezoelétrico durante um período de gravação de 20 minutos. Use o pacote de suporte MATLAB do Arduino para controlar o tempo de deflexão com código MATLAB personalizado. Os eventos são sincronizados com o software de aquisição de dados usando pulsos de lógica transistor-transistor (TTL).
Ratos (com mais de 140 dias de pós-transplante) foram induzidos com anestesia com isoflurano a 5% e anestesiados com isoflurano a 1-3% durante a cirurgia. Os animais foram colocados em uma estrutura estereotáxica (Kopf) e buprenorfina SR e dexametasona foram injetadas por via subcutânea. O crânio é exposto, limpo e 3-5 parafusos ósseos são inseridos. Para atingir o t-hCO3, geramos coordenadas estereotáxicas a partir de imagens de ressonância magnética. Uma craniotomia circular (aproximadamente 1 cm de diâmetro) foi realizada com uma broca de alta velocidade diretamente sobre o hCO3 transplantado. Uma vez que o osso esteja o mais fino possível, mas antes de perfurar todo o osso, use uma pinça para remover o disco pélvico intacto restante para revelar o t-hCO3 subjacente. A craniotomia foi preenchida com solução salina estéril, e uma lamínula e um pino de cabeça especial foram fixados ao crânio com cimento odontológico curado por UV (Relyx).
A imagem de dois fótons foi realizada usando um microscópio multifóton Bruker com uma objetiva Nikon LWD (×16, 0,8 NA). A imagem GCaMP6 foi realizada a 920 nm com ampliação de 1,4x no plano z único e média de 8x de 7,5 fps. Os ratos foram induzidos com anestesia de isoflurano a 5% e mantidos com isoflurano a 1-3%. Os ratos foram colocados em um suporte de cabeça feito sob medida e posicionados sob a lente. Uma gravação de fundo de 3 minutos da atividade motora foi obtida. Ao longo de 20 minutos de gravação, 50 puffs (cada apresentação com 100 ms de duração) foram entregues aleatoriamente à almofada do bigode oposta ao t-hCO usando um picospricer. Use o pacote de suporte MATLAB do Arduino para controlar o tempo de rajada com código MATLAB personalizado. Sincronize os eventos com o software de aquisição de dados (PrairieView 5.5) usando pulsos TTL. Para análise, as imagens foram corrigidas para movimento xy usando correção afim no programa MoCo, lançado em Fiji. Os traços fluorescentes foram extraídos de células individuais usando CNMF-E43. A fluorescência foi extraída para cada região de interesse, convertida em curvas dF/F e, em seguida, convertida em escores z.
Ratos (com mais de 140 dias de pós-transplante) foram induzidos com 5% de isoflurano e anestesiados com 1-3% de isoflurano intraoperatoriamente. Os animais foram colocados em uma estrutura estereotáxica (Kopf) e buprenorfina SR e dexametasona foram injetadas subcutaneamente. Os bigodes no lado oposto do t-hCO foram cortados para cerca de 2 cm e enfiados através de uma malha conectada a um atuador piezoelétrico. O crânio é exposto e limpo. Um parafuso de aterramento de aço inoxidável é fixado ao crânio. Para atingir o t-hCO, geramos coordenadas estereotáxicas a partir de imagens de ressonância magnética. Realize uma craniotomia circular (aproximadamente 1 cm de diâmetro) com uma broca de alta velocidade logo acima do t-hCO. Uma vez que o osso esteja o mais fino possível, mas antes de perfurar todo o osso, use uma pinça para remover o disco pélvico intacto restante para revelar o t-hCO subjacente. Células individuais foram registradas usando sondas de silício de alta densidade de 32 ou 64 canais (Cambridge Neurotech) aterradas em parafusos de aterramento e pré-amplificadas com amplificadores RHD (Intan). Use o manipulador para abaixar os eletrodos até o local alvo através da craniotomia, que é preenchida com solução salina estéril. A coleta de dados foi realizada a uma frequência de 30 kHz usando o sistema de aquisição de dados Open Ephys. A gravação continuou apenas quando detectamos atividade espontânea rítmica altamente correlacionada em mais de 10 canais, sugerindo que os eletrodos estavam localizados no enxerto (com base em dados de imagem de cálcio de dois fótons). Uma gravação de fundo de 10 minutos da atividade motora foi obtida. Os bigodes no lado oposto do t-hCO foram então desviados 50 vezes (2 mm a 20 Hz, 2 s por apresentação) em momentos aleatórios por um acionamento piezoelétrico ao longo de um período de gravação de 20 minutos. Usando o Pacote de Suporte MATLAB para Arduino (MATLAB 2019b), controle o tempo de deflexão com código MATLAB personalizado. Use pulsos TTL para sincronizar eventos com o software de aquisição de dados.
Para experimentos de marcação óptica, um cabo de conexão óptica de 200 µm (Doric) conectado a um laser de 473 nm (Omicron) foi conectado a uma fibra óptica de 200 µm colocada sobre a craniotomia. Imediatamente antes disso, ajuste a potência do jumper para 20 mW. Use o manipulador para abaixar os eletrodos até o local alvo através da craniotomia, que é preenchida com solução salina estéril. No início da gravação, dez pulsos de luz de 473 nm (frequência de 2 Hz, duração do pulso de 10 ms) foram emitidos. Células fotossensíveis foram definidas como células que exibiram uma resposta de pico dentro de 10 ms de luz em 70% ou mais dos ensaios.