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A biópsia líquida (LB) é um conceito que está rapidamente ganhando popularidade no campo biomédico.O conceito baseia-se principalmente na detecção de fragmentos de DNA extracelular circulante (ccfDNA), que são liberados principalmente como pequenos fragmentos após a morte celular em vários tecidos.Uma pequena proporção desses fragmentos se origina de tecidos ou organismos estranhos (estranhos).No trabalho atual, aplicamos esse conceito aos mexilhões, uma espécie sentinela conhecida por sua alta capacidade de filtração da água do mar.Usamos a capacidade dos mexilhões de atuar como filtros naturais para capturar fragmentos de DNA ambiental de várias fontes para fornecer informações sobre a biodiversidade dos ecossistemas costeiros marinhos.Nossos resultados mostram que a hemolinfa de mexilhão contém fragmentos de DNA que variam muito em tamanho, de 1 a 5 kb.O sequenciamento Shotgun mostrou que um grande número de fragmentos de DNA são de origem microbiana estranha.Entre eles, encontramos fragmentos de DNA de bactérias, archaea e vírus, incluindo vírus conhecidos por infectar uma variedade de hospedeiros comumente encontrados em ecossistemas marinhos costeiros.Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito de LB aplicado aos mexilhões representa uma fonte rica, mas ainda inexplorada, de conhecimento sobre a diversidade microbiana nos ecossistemas costeiros marinhos.
O impacto das alterações climáticas (CC) na biodiversidade dos ecossistemas marinhos é uma área de investigação em rápido crescimento.O aquecimento global não só causa estresses fisiológicos importantes, mas também empurra os limites evolutivos da estabilidade térmica dos organismos marinhos, afetando o habitat de várias espécies, levando-os a buscar condições mais favoráveis ​​[1, 2].Além de afetar a biodiversidade dos metazoários, o CC perturba o delicado equilíbrio das interações microbianas do hospedeiro.Essa disbacteriose microbiana representa uma séria ameaça aos ecossistemas marinhos, pois torna os organismos marinhos mais suscetíveis a patógenos infecciosos [3, 4].Acredita-se que a SS desempenhe um papel importante nas mortes em massa, o que é um problema sério para a gestão dos ecossistemas marinhos globais [5, 6].Esta é uma questão importante, dados os impactos econômicos, ecológicos e nutricionais de muitas espécies marinhas.Isto é especialmente verdadeiro para os bivalves que vivem nas regiões polares, onde os efeitos da CK são mais imediatos e severos [6, 7].De fato, bivalves como Mytilus spp.são amplamente utilizados para monitorar os efeitos do CC nos ecossistemas marinhos.Não surpreendentemente, um número relativamente grande de biomarcadores foi desenvolvido para monitorar sua saúde, geralmente usando uma abordagem de dois níveis envolvendo biomarcadores funcionais baseados na atividade enzimática ou funções celulares, como viabilidade celular e atividade fagocitária [8].Esses métodos também incluem a medição da concentração de indicadores de pressão específicos que se acumulam nos tecidos moles após a absorção de grandes quantidades de água do mar.No entanto, a alta capacidade de filtração e o sistema circulatório semiaberto dos bivalves fornecem uma oportunidade para desenvolver novos biomarcadores de hemolinfa usando o conceito de biópsia líquida (LB), uma abordagem simples e minimamente invasiva para o manejo do paciente.amostras de sangue [9, 10].Embora vários tipos de moléculas circulantes possam ser encontrados no LB humano, esse conceito é baseado principalmente na análise de sequenciamento de DNA de fragmentos de DNA extracelular circulante (ccfDNA) no plasma.De fato, a presença de DNA circulante no plasma humano é conhecida desde meados do século 20 [11], mas apenas nos últimos anos o advento de métodos de sequenciamento de alto rendimento levou ao diagnóstico clínico baseado no ccfDNA.A presença desses fragmentos de DNA circulante se deve em parte à liberação passiva de DNA genômico (nuclear e mitocondrial) após a morte celular. Em indivíduos saudáveis, a concentração de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com várias patologias ou submetidos a estresse, resultando em dano tecidual. Em indivíduos saudáveis, a concentração de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com várias patologias ou submetidos a estresse, resultando em dano tecidual. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у бо льных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Em pessoas saudáveis, a concentração de cccDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com várias patologias ou sob estresse que leva a danos teciduais.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低 (<10 ng/mL)），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у па циентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. As concentrações de ccfDNA são geralmente baixas (<10 ng/ml) em indivíduos saudáveis, mas podem aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com várias patologias ou estresse, resultando em dano tecidual.O tamanho dos fragmentos de ccfDNA varia amplamente, mas geralmente varia de 150 a 200 pb.[12].A análise de ccfDNA autoderivado, ou seja, ccfDNA de células hospedeiras normais ou transformadas, pode ser usada para detectar alterações genéticas e epigenéticas presentes no genoma nuclear e/ou mitocondrial, ajudando assim os médicos a selecionar terapias moleculares específicas [13].No entanto, o ccfDNA pode ser obtido de fontes estranhas, como o ccfDNA de células fetais durante a gravidez ou de órgãos transplantados [14,15,16,17].O ccfDNA também é uma importante fonte de informação para detectar a presença de ácidos nucléicos de um agente infeccioso (estranho), o que permite a detecção não invasiva de infecções disseminadas não identificadas por hemoculturas, evitando biópsia invasiva de tecido infectado [18].Estudos recentes mostraram, de fato, que o sangue humano contém uma rica fonte de informações que pode ser usada para identificar patógenos virais e bacterianos, e que cerca de 1% do ccfDNA encontrado no plasma humano é de origem estranha [19].Esses estudos demonstram que a biodiversidade do microbioma circulante de um organismo pode ser avaliada usando a análise de ccfDNA.No entanto, até recentemente, esse conceito era usado exclusivamente em humanos e, em menor escala, em outros vertebrados [20, 21].
No presente artigo, usamos o potencial LB para analisar o ccfDNA de Aulacomya atra, uma espécie do sul comumente encontrada nas ilhas Kerguelen subantárticas, um grupo de ilhas no topo de um grande planalto que se formou há 35 milhões de anos.erupção vulcânica.Usando um sistema experimental in vitro, descobrimos que os fragmentos de DNA na água do mar são rapidamente absorvidos pelos mexilhões e entram no compartimento da hemolinfa.O sequenciamento shotgun mostrou que o ccfDNA da hemolinfa de mexilhão contém fragmentos de DNA de origem própria e não própria, incluindo bactérias simbióticas e fragmentos de DNA de biomas típicos de ecossistemas costeiros marinhos vulcânicos frios.O ccfDNA da hemolinfa também contém sequências virais derivadas de vírus com diferentes gamas de hospedeiros.Também encontramos fragmentos de DNA de animais multicelulares, como peixes ósseos, anêmonas do mar, algas e insetos.Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito LB pode ser aplicado com sucesso a invertebrados marinhos para gerar um rico repertório genômico em ecossistemas marinhos.
Adultos (55-70 mm de comprimento) Mytilus platensis (M. platensis) e Aulacomya atra (A. atra) foram coletados das costas rochosas entremarés de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Kerguelen Islands em dezembro de 2018. Outros mexilhões azuis adultos (Mytilus spp.) foram obtidos de um fornecedor comercial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canadá) e colocados em um tanque aerado com temperatura controlada (4°C) contendo 10–20 L de salmoura artificial a 32‰.(sal marinho artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virgínia, EUA).Para cada experimento, o comprimento e o peso de conchas individuais foram medidos.
Um protocolo de acesso aberto gratuito para este programa está disponível online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Resumidamente, a hemolinfa do LB foi coletada dos músculos abdutores conforme descrito [22].A hemolinfa foi clarificada por centrifugação a 1200 × g por 3 minutos, o sobrenadante foi congelado (-20°C) até o uso.Para isolamento e purificação de cfDNA, as amostras (1,5-2,0 ml) foram descongeladas e processadas usando o kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) de acordo com as instruções do fabricante.ccfDNA foi armazenado a -80°C até análise posterior.Em alguns experimentos, o ccfDNA foi isolado e purificado usando o QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontário, Canadá).O DNA purificado foi quantificado usando um ensaio PicoGreen padrão.A distribuição de fragmentos do ccfDNA isolado foi analisada por eletroforese capilar usando um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) usando um kit de DNA de alta sensibilidade.O ensaio foi realizado usando 1 µl da amostra ccfDNA de acordo com as instruções do fabricante.
Para o sequenciamento de fragmentos de ccfDNA da hemolinfa, o Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparou bibliotecas shotgun usando o kit Illumina DNA Mix do kit Illumina MiSeq PE75.Foi utilizado um adaptador padrão (BioO).Os arquivos de dados brutos estão disponíveis no NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 e SRR8924809).A qualidade básica da leitura foi avaliada usando FastQC [23].Trimmomatic [24] tem sido usado para adaptadores de recorte e leituras de baixa qualidade.As leituras shotgun com extremidades emparelhadas foram FLASH mescladas em leituras únicas mais longas com uma sobreposição mínima de 20 pb para evitar incompatibilidades [25]. As leituras mescladas foram anotadas com BLASTN usando um banco de dados bivalve NCBI Taxonomy (valor e < 1e−3 e 90% de homologia) e o mascaramento de sequências de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26]. As leituras mescladas foram anotadas com BLASTN usando um banco de dados bivalve NCBI Taxonomy (valor e < 1e−3 e 90% de homologia) e o mascaramento de sequências de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуствор чатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложностои был выполнено с использованием PÓ [26]. As leituras agrupadas foram anotadas com BLASTN usando o banco de dados de taxonomia bivalve NCBI (valor e < 1e-3 e 90% de homologia) e o mascaramento de sequência de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 dust [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных дв устворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 e 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. As leituras agrupadas foram anotadas com BLASTN usando o banco de dados taxonômico bivalve NCBI (valor e <1e-3 e 90% de homologia) e o mascaramento de sequência de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26].As leituras foram divididas em dois grupos: relacionadas a sequências bivalves (aqui chamadas de autoleituras) e não relacionadas (não autoleituras).Dois grupos foram montados separadamente usando MEGAHIT para gerar contigs [27].Enquanto isso, a distribuição taxonômica das leituras do microbioma alienígena foi classificada usando Kraken2 [28] e representada graficamente por um gráfico de pizza Krona no Galaxy [29, 30].Os kmers ótimos foram determinados como kmers-59 de nossos experimentos preliminares. Autocontigs foram então identificados por alinhamento com BLASTN (banco de dados bivalve NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia) para uma anotação final. Autocontigs foram então identificados por alinhamento com BLASTN (banco de dados bivalve NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia) para uma anotação final. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых мол люсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Auto-contigs foram então identificados por correspondência contra BLASTN (banco de dados bivalve NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia) para anotação final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (ба за данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Auto-contigs foram então identificados para anotação final por comparação com BLASTN (banco de dados de bivalves NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia). Paralelamente, contigs de grupos não próprios foram anotados com BLASTN (banco de dados nt NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia). Paralelamente, contigs de grupos não próprios foram anotados com BLASTN (banco de dados nt NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Paralelamente, contigs de grupos estrangeiros foram anotados com BLASTN (banco de dados NT NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данны х nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Paralelamente, contigs de grupos não próprios foram anotados com BLASTN (base de dados nt NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia). O BLASTX também foi conduzido em contigs não próprios usando os bancos de dados NCBI de proteínas nr e RefSeq (valor e < 1e−10 e 60% de homologia). O BLASTX também foi conduzido em contigs não próprios usando os bancos de dados NCBI de proteínas nr e RefSeq (valor e < 1e−10 e 60% de homologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значе ние e <1e-10 и гомология 60%). O BLASTX também foi realizado em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 e 60% de homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). O BLASTX também foi realizado em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor e <1e-10 e 60% de homologia).Os pools BLASTN e BLASTX de non-self-contigs representam os contigs finais (consulte o arquivo suplementar).
Os primers usados ​​para PCR estão listados na Tabela S1.Taq DNA polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) foi usada para amplificar os genes alvo ccfDNA.As seguintes condições de reação foram usadas: desnaturação a 95°C por 3 minutos, 95°C por 1 minuto, ajuste de temperatura de recozimento por 1 minuto, alongamento a 72°C por 1 minuto, 35 ciclos e finalmente 72°C em 10 minutos..Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em géis de agarose (1,5%) contendo SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Mexilhões (Mytilus spp.) foram aclimatados em 500 ml de água do mar oxigenada (32 PSU) por 24 horas a 4°C.O DNA plasmidial contendo uma inserção que codifica a sequência de cDNA da galectina-7 humana (número de acesso NCBI L07769) foi adicionado ao frasco em uma concentração final de 190 μg/μl.Mexilhões incubados nas mesmas condições sem adição de DNA foram o controle.O terceiro tanque de controle continha DNA sem mexilhões.Para monitorar a qualidade do DNA na água do mar, amostras de água do mar (20 μl; três repetições) foram retiradas de cada tanque no horário indicado.Para rastreabilidade do DNA plasmidial, mexilhões LB foram colhidos nos horários indicados e analisados ​​por qPCR e ddPCR.Devido ao alto teor de sal da água do mar, as alíquotas foram diluídas em água de qualidade para PCR (1:10) antes de todos os ensaios de PCR.
O Digital Droplet PCR (ddPCR) foi realizado usando o protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontário, Canadá).Use o perfil de temperatura para determinar a temperatura ideal (Tabela S1).As gotas foram geradas usando um gerador de gotas QX200 (BioRad).A ddPCR foi realizada da seguinte forma: 95°C por 5 minutos, 50 ciclos de 95°C por 30 segundos e uma determinada temperatura de anelamento por 1 minuto e 72°C por 30 segundos, 4°C por 5 minutos e 90°C em 5 minutos.O número de gotas e reações positivas (número de cópias/µl) foram medidos usando um leitor de gotas QX200 (BioRad).Amostras com menos de 10.000 gotas foram rejeitadas.O controle de padrão não foi realizado toda vez que o ddPCR foi executado.
A qPCR foi realizada usando Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrália) e primers específicos LGALS7.Todas as PCRs quantitativas foram realizadas em 20 µl usando o kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).A qPCR foi iniciada com uma incubação de 15 minutos a 95°C, seguida de 40 ciclos a 95°C por 10 segundos e a 60°C por 60 segundos com uma coleta de dados.As curvas de fusão foram geradas usando medições sucessivas a 95°C por 5 s, 65°C por 60 s e 97°C no final do qPCR.Cada qPCR foi realizada em triplicata, exceto para amostras de controle.
Como os mexilhões são conhecidos por sua alta taxa de filtração, primeiro investigamos se eles poderiam filtrar e reter fragmentos de DNA presentes na água do mar.Também estávamos interessados ​​em saber se esses fragmentos se acumulam em seu sistema linfático semiaberto.Resolvemos esse problema experimentalmente rastreando o destino de fragmentos de DNA solúveis adicionados a tanques de mexilhões azuis.Para facilitar o rastreamento de fragmentos de DNA, usamos DNA de plasmídeo estranho (não próprio) contendo o gene da galectina-7 humana.O ddPCR rastreia fragmentos de DNA de plasmídeo em água do mar e mexilhões.Nossos resultados mostram que se a quantidade de fragmentos de DNA na água do mar permaneceu relativamente constante ao longo do tempo (até 7 dias) na ausência de mexilhões, na presença de mexilhões esse nível desapareceu quase completamente em 8 horas (Fig. 1a,b).Fragmentos de DNA exógeno foram facilmente detectados em 15 minutos no líquido intravalvar e na hemolinfa (Fig. 1c).Esses fragmentos ainda podem ser detectados até 4 horas após a exposição.Esta atividade de filtragem em relação aos fragmentos de DNA é comparável à atividade de filtragem de bactérias e algas [31].Esses resultados sugerem que os mexilhões podem filtrar e acumular DNA estranho em seus compartimentos fluidos.
Concentrações relativas de DNA plasmidial na água do mar na presença (A) ou ausência (B) de mexilhões, medidas por ddPCR.Em A, os resultados são expressos em porcentagens, com as bordas das caixas representando os percentis 75 e 25.A curva logarítmica ajustada é mostrada em vermelho e a área sombreada em cinza representa o intervalo de confiança de 95%.Em B, a linha vermelha representa a média e a linha azul representa o intervalo de confiança de 95% para a concentração.C Acúmulo de DNA plasmidial na hemolinfa e fluido valvular de mexilhões em momentos diferentes após a adição de DNA plasmidial.Os resultados são apresentados como cópias absolutas detectadas/mL (±SE).
Em seguida, investigamos a origem do ccfDNA em mexilhões coletados de bancos de mexilhões nas Ilhas Kerguelen, um grupo remoto de ilhas com influência antropogênica limitada.Para este propósito, cccDNA de hemolinfas de mexilhão foi isolado e purificado por métodos comumente usados ​​para purificar cccDNA humano [32, 33].Descobrimos que as concentrações médias de ccfDNA de hemolinfa em mexilhões estão na faixa de baixos microgramas por ml de hemolinfa (ver Tabela S2, Informações Suplementares).Essa faixa de concentrações é muito maior do que em pessoas saudáveis ​​(baixos nanogramas por mililitro), mas em casos raros, em pacientes com câncer, o nível de ccfDNA pode atingir vários microgramas por mililitro [34, 35].Uma análise da distribuição de tamanho do ccfDNA da hemolinfa mostrou que esses fragmentos variam muito em tamanho, variando de 1000 pb a 1000 pb.até 5000 pb (Fig. 2).Resultados semelhantes foram obtidos usando o QIAamp Investigator Kit baseado em sílica, um método comumente usado em ciência forense para isolar e purificar rapidamente DNA genômico de amostras de DNA de baixa concentração, incluindo ccfDNA [36].
Eletroforegrama ccfDNA representativo de hemolinfa de mexilhão.Extraído com o kit NucleoSnap Plasma (topo) e o kit QIAamp DNA Investigator.B Gráfico de violino mostrando a distribuição das concentrações de ccfDNA da hemolinfa (±SE) em mexilhões.As linhas pretas e vermelhas representam a mediana e o primeiro e terceiro quartis, respectivamente.
Aproximadamente 1% do ccfDNA em humanos e primatas tem uma fonte estranha [21, 37].Dado o sistema circulatório semi-aberto dos bivalves, a água do mar rica em microbial e a distribuição de tamanho do ccfDNA do mexilhão, levantamos a hipótese de que o ccfDNA da hemolinfa do mexilhão pode conter um conjunto rico e diversificado de DNA microbiano.Para testar essa hipótese, sequenciamos o ccfDNA da hemolinfa de amostras de Aulacomya atra coletadas nas Ilhas Kerguelen, resultando em mais de 10 milhões de leituras, 97,6% das quais passaram no controle de qualidade.As leituras foram então classificadas de acordo com fontes próprias e não próprias usando os bancos de dados de bivalves BLASTN e NCBI (Fig. S1, Informações Suplementares).
Em humanos, tanto o DNA nuclear quanto o mitocondrial podem ser liberados na corrente sanguínea [38].No entanto, no presente estudo, não foi possível descrever detalhadamente o DNA genômico nuclear dos mexilhões, uma vez que o genoma de A. atra não foi sequenciado ou descrito.No entanto, fomos capazes de identificar vários fragmentos de ccfDNA de nossa própria origem usando a biblioteca bivalve (Fig. S2, Informações Suplementares).Também confirmamos a presença de fragmentos de DNA de nossa própria origem por amplificação por PCR direcionada dos genes de A. atra que foram sequenciados (Fig. 3).Da mesma forma, dado que o genoma mitocondrial de A. atra está disponível em bancos de dados públicos, pode-se encontrar evidências da presença de fragmentos mitocondriais de ccfDNA na hemolinfa de A. atra.A presença de fragmentos de DNA mitocondrial foi confirmada por amplificação por PCR (Fig. 3).
Vários genes mitocondriais estavam presentes na hemolinfa de A. atra (pontos vermelhos – número de estoque: SRX5705969) e M. platensis (pontos azuis – número de estoque: SRX5705968) amplificados por PCR.Figura adaptada de Breton et al., 2011 B Amplificação do sobrenadante de hemolinfa de A. atra Armazenado em papel FTA.Use um soco de 3 mm para adicionar diretamente ao tubo de PCR que contém a mistura de PCR.
Dado o abundante conteúdo microbiano na água do mar, inicialmente nos concentramos na caracterização de sequências de DNA microbiano na hemolinfa.Para fazer isso, usamos duas estratégias diferentes.A primeira estratégia usou o Kraken2, um programa de classificação de sequência baseado em algoritmo que pode identificar sequências microbianas com precisão comparável ao BLAST e outras ferramentas [28].Mais de 6.719 reads foram determinados como sendo de origem bacteriana, enquanto 124 e 64 eram de archaea e vírus, respectivamente (Fig. 4).Os fragmentos de DNA bacteriano mais abundantes foram Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) e Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Essa distribuição é consistente com estudos anteriores do microbioma do mexilhão azul marinho [39, 40].Gammaproteobacteria foi a principal classe de Proteobacteria (44%), incluindo muitos Vibrionales (Fig. 4b).O método ddPCR confirmou a presença de fragmentos de DNA do Vibrio no ccfDNA da hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41].Para obter mais informações sobre a origem bacteriana do ccfDNA, uma abordagem adicional foi adotada (Fig. S2, Informações Suplementares). Nesse caso, as reads que se sobrepõem foram montadas como reads paired-end e foram classificadas como de origem própria (bivalves) ou não própria usando BLASTN e um valor e de 1e−3 e um corte com > 90% de homologia. Nesse caso, as reads que se sobrepõem foram montadas como reads paired-end e foram classificadas como de origem própria (bivalves) ou não própria usando BLASTN e um valor e de 1e−3 e um corte com > 90% de homologia. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифициро ваны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Neste caso, as leituras sobrepostas foram coletadas como leituras pareadas e foram classificadas como nativas (bivalves) ou não originais usando BLASTN e valor e de 1e-3 e corte com > 90% de homologia.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы к ак собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 e порога гомологии> 90%. Nesse caso, as leituras sobrepostas foram coletadas como leituras pareadas e classificadas como próprias (bivalves) ou não originais usando valores e BLASTN e 1e-3 e um limite de homologia > 90%.Como o genoma de A. atra ainda não foi sequenciado, usamos a estratégia de montagem de novo do montador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Um total de 147.188 contigs foram identificados como dependentes (bivalves) de origem.Esses contigs foram então explodidos com valores e de 1e-10 usando BLASTN e BLASTX.Essa estratégia permitiu identificar 482 fragmentos não bivalves presentes no ccfDNA de A. atra.Mais da metade (57%) desses fragmentos de DNA foram obtidos de bactérias, principalmente de simbiontes branquiais, incluindo simbiontes sulfotróficos, e de simbiontes branquiais Solemya velum (Fig. 5).
Abundância relativa no nível do tipo.B Diversidade microbiana de dois filos principais (Firmicutes e Proteobacteria).Amplificação representativa de ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmentos do gene 16S rRNA (azul) em três hemolinfas atra.
Um total de 482 contigs coletados foram analisados.Perfil geral da distribuição taxonômica de anotações contig metagenômicas (procariontes e eucariontes).B Distribuição detalhada dos fragmentos de DNA bacteriano identificados por BLASTN e BLASTX.
A análise de Kraken2 também mostrou que o ccfDNA de mexilhão continha fragmentos de DNA archaeal, incluindo fragmentos de DNA de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) e Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).A presença de fragmentos de DNA derivados de Euryarchaeota e Crenarchaeota, previamente encontrados na comunidade microbiana de mexilhões californianos, não deveria ser uma surpresa [42].Embora Euryarchaeota seja frequentemente associado a condições extremas, agora é reconhecido que tanto Euryarchaeota quanto Crenarcheota estão entre os procariotos mais comuns no ambiente criogênico marinho [43, 44].A presença de microorganismos metanogênicos em mexilhões não é surpreendente, dados os relatos recentes de extensos vazamentos de metano de vazamentos de fundo no Planalto Kerguelen [45] e possível produção microbiana de metano observada na costa das Ilhas Kerguelen [46].
Nossa atenção então se voltou para leituras de vírus de DNA.Até onde sabemos, este é o primeiro estudo fora do alvo do conteúdo viral de mexilhões.Como esperado, encontramos fragmentos de DNA de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b).No entanto, o DNA viral mais comum vem de um filo de nucleocitovírus, também conhecido como vírus de DNA citoplasmático nuclear grande (NCLDV), que possui o maior genoma de qualquer vírus.Dentro desse filo, a maioria das sequências de DNA pertence às famílias Mimimidoviridae (58%) e Poxviridae (21%), cujos hospedeiros naturais incluem vertebrados e artrópodes, enquanto uma pequena proporção dessas sequências de DNA pertence a algas virológicas conhecidas.Infecta algas eucarióticas marinhas.As sequências também foram obtidas do vírus Pandora, o vírus gigante com o maior tamanho de genoma de todos os gêneros virais conhecidos.Curiosamente, a gama de hospedeiros sabidamente infectados com o vírus, conforme determinado pelo sequenciamento de ccfDNA da hemolinfa, era relativamente grande (Figura S3, Informações Suplementares).Inclui vírus que infectam insetos como Baculoviridae e Iridoviridae, bem como vírus que infectam amebas, algas e vertebrados.Também encontramos sequências correspondentes ao genoma do Pithovirus sibericum.Pitovírus (também conhecidos como “vírus zumbis”) foram isolados pela primeira vez em permafrost de 30.000 anos na Sibéria [47].Assim, nossos resultados são consistentes com relatórios anteriores que mostram que nem todas as espécies modernas desses vírus estão extintas [48] e que esses vírus podem estar presentes em ecossistemas marinhos subárticos remotos.
Por fim, testamos para ver se conseguíamos encontrar fragmentos de DNA de outros animais multicelulares.Um total de 482 contigs estranhos foram identificados por BLASTN e BLASTX com bibliotecas nt, nr e RefSeq (genômica e proteica).Nossos resultados mostram que entre os fragmentos estranhos de ccfDNA de animais multicelulares predomina o DNA de ossos ósseos (Fig. 5).Fragmentos de DNA de insetos e outras espécies também foram encontrados.Uma parte relativamente grande dos fragmentos de DNA não foi identificada, possivelmente devido à sub-representação de um grande número de espécies marinhas em bancos de dados genômicos em comparação com espécies terrestres [49].
No presente artigo, aplicamos o conceito LB a mexilhões, argumentando que o sequenciamento de disparos de ccfDNA da hemolinfa pode fornecer informações sobre a composição dos ecossistemas costeiros marinhos.Em particular, descobrimos que 1) a hemolinfa de mexilhão contém concentrações relativamente altas (níveis de microgramas) de fragmentos de DNA circulantes relativamente grandes (~1-5 kb);2) esses fragmentos de DNA são independentes e não independentes 3) Entre as fontes estranhas desses fragmentos de DNA, encontramos DNA bacteriano, arqueológico e viral, bem como DNA de outros animais multicelulares;4) O acúmulo desses fragmentos estranhos de ccfDNA na hemolinfa ocorre rapidamente e contribui para a atividade de filtragem interna dos mexilhões.Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito de LB, que até agora tem sido aplicado principalmente no campo da biomedicina, codifica uma fonte de conhecimento rica, mas inexplorada, que pode ser usada para entender melhor a interação entre as espécies sentinelas e seu ambiente.
Além de primatas, o isolamento de ccfDNA foi relatado em mamíferos, incluindo camundongos, cães, gatos e cavalos [50, 51, 52].No entanto, até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a relatar a detecção e sequenciamento de ccfDNA em espécies marinhas com sistema de circulação aberta.Esta característica anatômica e capacidade de filtragem dos mexilhões podem, pelo menos em parte, explicar as diferentes características de tamanho dos fragmentos de DNA circulantes em comparação com outras espécies.Em humanos, a maioria dos fragmentos de DNA que circulam no sangue são pequenos fragmentos que variam em tamanho de 150 a 200 pb.com um pico máximo de 167 pb [34, 53].Uma porção pequena, mas significativa, de fragmentos de DNA tem tamanho entre 300 e 500 pb e cerca de 5% tem mais de 900 pb.[54].A razão para essa distribuição de tamanho é que a principal fonte de ccfDNA no plasma ocorre como resultado da morte celular, seja por morte celular ou por necrose de células hematopoiéticas circulantes em indivíduos saudáveis ​​ou por apoptose de células tumorais em pacientes com câncer (conhecido como DNA tumoral circulante)., ctDNA).A distribuição do tamanho do ccfDNA da hemolinfa que encontramos nos mexilhões variou de 1000 a 5000 pb, sugerindo que o ccfDNA do mexilhão tem uma origem diferente.Esta é uma hipótese lógica, uma vez que os mexilhões possuem um sistema vascular semi-aberto e vivem em ambientes aquáticos marinhos contendo altas concentrações de DNA genômico microbiano.De fato, nossos experimentos de laboratório usando DNA exógeno mostraram que os mexilhões acumulam fragmentos de DNA na água do mar, pelo menos após algumas horas, eles são degradados após a absorção celular e/ou liberados e/ou armazenados em várias organizações.Dada a raridade das células (tanto procarióticas quanto eucarióticas), o uso de compartimentos intravalvares reduzirá a quantidade de ccfDNA de fontes próprias, bem como de fontes externas.Considerando a importância da imunidade inata dos bivalves e o grande número de fagócitos circulantes, levantamos a hipótese de que mesmo ccfDNA estranho é enriquecido em fagócitos circulantes que acumulam DNA estranho após a ingestão de microorganismos e/ou detritos celulares.Em conjunto, nossos resultados mostram que o ccfDNA da hemolinfa bivalve é um repositório único de informações moleculares e reforça seu status de espécie sentinela.
Nossos dados indicam que o sequenciamento e a análise de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa derivados de bactérias podem fornecer informações importantes sobre a flora bacteriana hospedeira e as bactérias presentes no ecossistema marinho circundante.As técnicas de sequenciamento de tiro revelaram sequências da bactéria comensal A. atra gill que teriam sido perdidas se métodos convencionais de identificação de 16S rRNA tivessem sido usados, em parte devido a um viés da biblioteca de referência.De fato, nosso uso de dados de LB coletados de M. platensis na mesma camada de mexilhões em Kerguelen mostrou que a composição de simbiontes bacterianos associados às guelras era a mesma para ambas as espécies de mexilhões (Fig. S4, Informações Suplementares).Essa semelhança de dois mexilhões geneticamente diferentes pode refletir a composição das comunidades bacterianas nos depósitos frios, sulfurosos e vulcânicos de Kerguelen [55, 56, 57, 58].Níveis mais elevados de microrganismos redutores de enxofre foram bem descritos na colheita de mexilhões de áreas costeiras bioturbadas [59], como a costa de Port-au-France.Outra possibilidade é que a flora comensal de mexilhões possa ser afetada pela transmissão horizontal [60, 61].Mais pesquisas são necessárias para determinar a correlação entre o ambiente marinho, a superfície do fundo do mar e a composição de bactérias simbióticas nos mexilhões.Esses estudos estão em andamento.
O comprimento e a concentração do ccfDNA da hemolinfa, sua facilidade de purificação e alta qualidade para permitir o sequenciamento shotgun rápido são algumas das muitas vantagens do uso do ccfDNA de mexilhão para avaliar a biodiversidade em ecossistemas costeiros marinhos.Essa abordagem é especialmente eficaz para caracterizar comunidades virais (viromas) em um determinado ecossistema [62, 63].Ao contrário de bactérias, archaea e eucariotos, os genomas virais não contêm genes conservados filogeneticamente, como sequências 16S.Nossos resultados indicam que biópsias líquidas de espécies indicadoras, como mexilhões, podem ser usadas para identificar números relativamente grandes de fragmentos de vírus ccfDNA conhecidos por infectar hospedeiros que normalmente habitam ecossistemas marinhos costeiros.Isso inclui vírus conhecidos por infectar protozoários, artrópodes, insetos, plantas e vírus bacterianos (por exemplo, bacteriófagos).Uma distribuição semelhante foi encontrada quando examinamos o viroma de hemolinfa ccfDNA de mexilhões azuis (M. platensis) coletados na mesma camada de mexilhão em Kerguelen (Tabela S2, Informações Suplementares).O sequenciamento shotgun do ccfDNA é de fato uma nova abordagem ganhando força no estudo do viroma de humanos ou outras espécies [21, 37, 64].Essa abordagem é particularmente útil para estudar vírus de DNA de fita dupla, uma vez que nenhum gene único é conservado entre todos os vírus de DNA de fita dupla, representando a classe mais diversa e ampla de vírus em Baltimore [65].Embora a maioria desses vírus permaneça não classificada e possa incluir vírus de uma parte completamente desconhecida do mundo viral [66], descobrimos que os viromas e as variedades de hospedeiros dos mexilhões A. atra e M. platensis estão entre as duas espécies.da mesma forma (ver figura S3, informações adicionais).Essa semelhança não é surpreendente, pois pode refletir uma falta de seletividade na captação do DNA presente no ambiente.Estudos futuros usando RNA purificado são atualmente necessários para caracterizar o viroma de RNA.
Em nosso estudo, usamos um pipeline muito rigoroso adaptado do trabalho de Kowarski e colegas [37], que usaram uma exclusão em duas etapas de leituras agrupadas e contigs antes e depois da montagem do ccfDNA nativo, resultando em uma alta proporção de leituras não mapeadas.Portanto, não podemos descartar que alguns desses reads não mapeados ainda possam ter sua própria origem, principalmente porque não temos um genoma de referência para essa espécie de mexilhão.Também usamos esse pipeline porque estávamos preocupados com as quimeras entre leituras próprias e não próprias e os comprimentos de leitura gerados pelo Illumina MiSeq PE75.Outra razão para a maioria das leituras não mapeadas é que muitos dos micróbios marinhos, especialmente em áreas remotas como Kerguelen, não foram anotados.Usamos Illumina MiSeq PE75, assumindo comprimentos de fragmentos de ccfDNA semelhantes ao ccfDNA humano.Para estudos futuros, dados nossos resultados mostrando que o ccfDNA da hemolinfa tem leituras mais longas do que humanos e/ou mamíferos, recomendamos o uso de uma plataforma de sequenciamento mais adequada para fragmentos mais longos do ccfDNA.Essa prática facilitará muito a identificação de mais indícios para uma análise mais profunda.A obtenção da sequência completa do genoma nuclear de A. atra atualmente indisponível também facilitaria muito a discriminação do ccfDNA de fontes próprias e não próprias.Dado que a nossa investigação se centrou na possibilidade de aplicar o conceito de biopsia líquida aos mexilhões, esperamos que, à medida que este conceito for utilizado em pesquisas futuras, sejam desenvolvidas novas ferramentas e condutas para aumentar o potencial deste método para estudar a diversidade microbiana dos mexilhões.ecossistema marinho.
Como um biomarcador clínico não invasivo, os níveis plasmáticos elevados de ccfDNA estão associados a várias doenças, danos nos tecidos e condições de estresse [67,68,69].Esse aumento está associado à liberação de fragmentos de DNA de sua própria origem após dano tecidual.Abordamos esse problema usando o estresse térmico agudo, no qual os mexilhões foram brevemente expostos a uma temperatura de 30 °C.Realizamos esta análise em três tipos diferentes de mexilhões em três experimentos independentes.No entanto, não encontramos nenhuma alteração nos níveis de ccfDNA após estresse térmico agudo (consulte a Figura S5, informações adicionais).Esta descoberta pode explicar, pelo menos em parte, o fato de que os mexilhões têm um sistema circulatório semi-aberto e acumulam grandes quantidades de DNA estranho devido à sua alta atividade de filtragem.Por outro lado, os mexilhões, como muitos invertebrados, podem ser mais resistentes ao dano tecidual induzido pelo estresse, limitando assim a liberação de ccfDNA em sua hemolinfa [70, 71].
Até o momento, a análise de DNA da biodiversidade em ecossistemas aquáticos tem se concentrado principalmente no metabarcoding de DNA ambiental (eDNA).No entanto, esse método geralmente é limitado na análise da biodiversidade quando são usados ​​primers.O uso de sequenciamento shotgun contorna as limitações de PCR e a seleção tendenciosa de conjuntos de primers.Assim, em certo sentido, nosso método está mais próximo do método de sequenciamento eDNA Shotgun de alto rendimento usado recentemente, que é capaz de sequenciar diretamente o DNA fragmentado e analisar quase todos os organismos [72, 73].No entanto, há uma série de questões fundamentais que distinguem LB dos métodos padrão de eDNA.Claro, a principal diferença entre eDNA e LB é o uso de filtros hospedeiros naturais.O uso de espécies marinhas como esponjas e bivalves (Dresseina spp.) como um filtro natural para o estudo de eDNA foi relatado [74, 75].No entanto, o estudo de Dreissena usou biópsias de tecido das quais o DNA foi extraído.A análise de ccfDNA de LB não requer biópsia de tecido, equipamento especializado e às vezes caro e logística associada ao eDNA ou biópsia de tecido.De fato, relatamos recentemente que o ccfDNA do LB pode ser armazenado e analisado com suporte de FTA sem manter uma cadeia de frio, o que é um grande desafio para pesquisas em áreas remotas [76].A extração de ccfDNA de biópsias líquidas também é simples e fornece DNA de alta qualidade para sequenciamento shotgun e análise de PCR.Esta é uma grande vantagem, dadas algumas das limitações técnicas associadas à análise de eDNA [77].A simplicidade e o baixo custo do método de amostragem também são particularmente adequados para programas de monitoramento de longo prazo.Além de sua alta capacidade de filtragem, outra característica bem conhecida dos bivalves é a composição química mucopolissacarídica de seu muco, que promove a absorção de vírus [78, 79].Isso torna os bivalves um filtro natural ideal para caracterizar a biodiversidade e o impacto das mudanças climáticas em um determinado ecossistema aquático.Embora a presença de fragmentos de DNA derivados do hospedeiro possa ser vista como uma limitação do método em comparação com o eDNA, o custo associado a ter um ccfDNA nativo em comparação com o eDNA é simultaneamente compreensível pela vasta quantidade de informações disponíveis para estudos de saúde.host de deslocamento.Isso inclui a presença de sequências virais integradas no genoma do hospedeiro hospedeiro.Isso é especialmente importante para mexilhões, dada a presença de retrovírus leucêmicos transmitidos horizontalmente em bivalves [80, 81].Outra vantagem do LB sobre o eDNA é que ele explora a atividade fagocítica das células sanguíneas circulantes na hemolinfa, que engloba os microorganismos (e seus genomas).A fagocitose é a principal função das células sanguíneas em bivalves [82].Finalmente, o método aproveita a alta capacidade de filtragem dos mexilhões (média de 1,5 l/h de água do mar) e a circulação de dois dias, que aumentam a mistura de diferentes camadas de água do mar, permitindo a captura de eDNA heterólogo.[83, 84].Assim, a análise de ccfDNA de mexilhão é um caminho interessante, dados os impactos nutricionais, econômicos e ambientais dos mexilhões.Semelhante à análise de LB coletados de humanos, esse método também abre a possibilidade de medir alterações genéticas e epigenéticas no DNA do hospedeiro em resposta a substâncias exógenas.Por exemplo, tecnologias de sequenciamento de terceira geração podem ser consideradas para realizar análises de metilação em todo o genoma em ccfDNA nativo usando sequenciamento de nanoporos.Esse processo deve ser facilitado pelo fato de que o comprimento dos fragmentos de ccfDNA do mexilhão é idealmente compatível com plataformas de sequenciamento de leitura longa que permitem a análise de metilação do DNA em todo o genoma a partir de uma única execução de sequenciamento sem a necessidade de transformações químicas.85,86] Essa é uma possibilidade interessante, pois foi demonstrado que os padrões de metilação do DNA refletem uma resposta ao estresse ambiental e persistem por muitas gerações.Portanto, pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes que regem a resposta após a exposição a mudanças climáticas ou poluentes [87].No entanto, o uso de LB não é sem limitações.Desnecessário dizer que isso requer a presença de espécies indicadoras no ecossistema.Como mencionado acima, usar LB para avaliar a biodiversidade de um determinado ecossistema também requer um pipeline de bioinformática rigoroso que leva em conta a presença de fragmentos de DNA da fonte.Outro grande problema é a disponibilidade de genomas de referência para espécies marinhas.Espera-se que iniciativas como o Marine Mammal Genomes Project e o recentemente estabelecido projeto Fish10k [88] facilitem essa análise no futuro.A aplicação do conceito LB a organismos marinhos que se alimentam de filtros também é compatível com os últimos avanços na tecnologia de sequenciamento, tornando-o adequado para o desenvolvimento de biomarcadores multi-ohm para fornecer informações importantes sobre a saúde dos habitats marinhos em resposta ao estresse ambiental.
Os dados de sequenciamento do genoma foram depositados no NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 em Bioprojects SRR8924808.
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