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Sangramento descontrolado é uma das principais causas de morte. Alcançar hemostasia rápida garante a sobrevivência do sujeito como primeiros socorros durante combates, acidentes de trânsito e operações de redução de mortalidade. O andaime composto reforçado com fibra nanoporosa (NFRCS), derivado de uma composição formadora de filme hemostático simples (HFFC), como uma fase contínua, pode desencadear e aumentar a hemostasia. O desenvolvimento do NFRCS baseia-se no design da asa da libélula. A estrutura da asa da libélula consiste em asas transversais e longitudinais, e as membranas das asas são conectadas entre si para manter a integridade da microestrutura. O HFFC reveste uniformemente a superfície da fibra com uma película de espessura nanométrica e conecta a espessura de algodão distribuída aleatoriamente (Ct) (fase dispersa) para formar uma estrutura nanoporosa. A combinação de fases contínua e dispersa reduz o custo do produto em dez vezes em comparação com os produtos disponíveis comercialmente. O NFRCS modificado (tampões ou pulseiras) pode ser usado em uma variedade de aplicações biomédicas. Estudos in vivo concluíram que o Cp NFRCS desenvolvido desencadeia e potencializa o processo de coagulação no local da aplicação. O NFRCS pode modular o microambiente e atuar no nível celular devido à sua estrutura nanoporosa, resultando em melhor cicatrização de feridas no modelo de excisão de feridas.
Sangramento descontrolado durante combate, situações intraoperatórias e de emergência pode representar uma séria ameaça à vida do ferido1. Essas condições levam ainda a um aumento geral na resistência vascular periférica, levando ao choque hemorrágico. Medidas apropriadas para controlar o sangramento durante e após a cirurgia são consideradas potencialmente fatais2,3. Danos a grandes vasos levam à perda maciça de sangue, resultando em uma taxa de mortalidade de ≤ 50% em combate e 31% durante a cirurgia1. A perda maciça de sangue leva à diminuição do volume corporal, o que reduz o débito cardíaco. Um aumento na resistência vascular periférica total e um comprometimento progressivo da microcirculação levam à hipóxia nos órgãos de suporte à vida. Choque hemorrágico pode ocorrer se a condição continuar sem intervenção eficaz1,4,5. Outras complicações incluem a progressão da hipotermia e acidose metabólica, bem como um distúrbio de coagulação que impede o processo de coagulação. O choque hemorrágico grave está associado a um maior risco de morte6,7,8. No choque grau III (progressivo), a transfusão de sangue é essencial para a sobrevivência do paciente durante a morbidade e mortalidade intra e pós-operatórias. Para superar todas as situações de risco de vida mencionadas acima, desenvolvemos um arcabouço composto reforçado com fibras nanoporosas (NFRCS) que utiliza uma concentração mínima de polímero (0,5%) e uma combinação de polímeros hemostáticos solúveis em água.
Com o uso de reforço de fibras, produtos com boa relação custo-benefício podem ser desenvolvidos. As fibras dispostas aleatoriamente assemelham-se à estrutura da asa de uma libélula, equilibradas pelas listras horizontais e verticais nas asas. As nervuras transversais e longitudinais da asa comunicam-se com a membrana da asa (Fig. 1). O NFRCS consiste em Ct reforçado como um sistema de andaime com melhor resistência física e mecânica (Figura 1). Devido à acessibilidade e à qualidade artesanal, os cirurgiões preferem usar medidores de fios de algodão (Ct) durante as cirurgias e curativos. Portanto, considerando seus múltiplos benefícios, incluindo > 90% de celulose cristalina (que contribui para o aumento da atividade hemostática), o Ct foi usado como um sistema esquelético do NFRCS9,10. Portanto, considerando seus múltiplos benefícios, incluindo > 90% de celulose cristalina (que contribui para o aumento da atividade hemostática), o Ct foi usado como um sistema esquelético do NFRCS9,10. Provavelmente, você terá muitas chances de obter uma cobertura cristalina > 90% (участвует em повышении гемостатической активности), Ct ispolьзовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Portanto, dados seus muitos benefícios, incluindo >90% de celulose cristalina (envolvida no aumento da atividade hemostática), o Ct foi usado como sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Portanto, dados seus muitos benefícios, incluindo mais de 90% de celulose cristalina (ajuda a aumentar a atividade hemostática), o Ct foi usado como um arcabouço para o NFRCS9,10.O Ct foi revestido superficialmente (foi observada a formação de um filme nanoespesso) e interconectado com uma composição formadora de filme hemostático (HFFC). O HFFC atua como um matrigel, mantendo os Ct dispostos aleatoriamente juntos. O design desenvolvido transmite tensão dentro da fase dispersa (fibras de reforço). É difícil obter estruturas nanoporosas com boa resistência mecânica usando concentrações mínimas de polímero. Além disso, não é fácil personalizar diferentes moldes para diferentes aplicações biomédicas.
A figura mostra um diagrama do projeto do NFRCS baseado na estrutura da asa de uma libélula (A). Esta imagem mostra uma analogia comparativa da estrutura da asa de uma libélula (as veias interseccionais e longitudinais da asa estão interconectadas) e uma fotomicrografia em corte transversal do NFRCS Cp (B). Representação esquemática do NFRCS.
NFRCs foram desenvolvidos usando HFFC como uma fase contínua para abordar as limitações acima. HFFC é composto de vários polímeros hemostáticos formadores de filme, incluindo quitosana (como o principal polímero hemostático) com metilcelulose (MC), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC 50 cp) e álcool polivinílico (PVA)) (125 kDa) como um polímero de suporte que promove a formação de trombos. A adição de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) melhorou a capacidade de absorção de umidade do NFRCS. Polietilenoglicol 400 (PEG 400) foi adicionado para melhorar a reticulação do polímero em misturas de polímeros ligados. Três diferentes composições hemostáticas de HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), ou seja, quitosana com MC (Cm), quitosana com HPMC (Ch) e quitosana com PVA (Cp), foram aplicadas ao Ct. Diversos estudos de caracterização in vitro e in vivo confirmaram a atividade hemostática e de cicatrização de feridas do NFRCS. Os materiais compósitos oferecidos pelo NFRCS podem ser usados ​​para personalizar diversas formas de andaimes para atender a necessidades específicas.
Além disso, o NFRCS pode ser modificado como uma bandagem ou rolo para cobrir toda a área lesionada das extremidades inferiores e outras partes do corpo. Especificamente para lesões em membros de combate, o design do NFRCS pode ser alterado para meio braço ou perna inteira (Figura Suplementar S11). O NFRCS pode ser transformado em uma pulseira com cola de tecido, que pode ser usada para estancar sangramentos de ferimentos graves no pulso em casos de suicídio. Nosso principal objetivo é desenvolver um NFRCS com o mínimo de polímero possível, que possa ser entregue a uma grande população (abaixo da linha da pobreza) e que possa ser colocado em um kit de primeiros socorros. Simples, eficiente e econômico em design, o NFRCS beneficia comunidades locais e pode ter um impacto global.
Quitosana (peso molecular 80 kDa) e amaranto foram adquiridos da Merck, Índia. Hidroxipropilmetilcelulose 50 Cp, polietilenoglicol 400 e metilcelulose foram adquiridos da Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Álcool polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90% hidrolisado) foi adquirido da National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirrolidina K30 foi adquirida da Molychem, Mumbai, e swabs estéreis foram adquiridos da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, com água Milli Q (sistema de purificação de água Direct-Q3, Merck, Índia) como veículo.
O NFRCS foi desenvolvido usando um método de liofilização11,12. Todas as composições de HFFC (Tabela 1) foram preparadas usando um agitador mecânico. Prepare uma solução de quitosana a 0,5% usando ácido acético a 1% em água por agitação contínua a 800 rpm em um agitador mecânico. O peso exato do polímero carregado indicado na Tabela 1 foi adicionado à solução de quitosana e agitado até que uma solução polimérica límpida fosse obtida. PVP K30 e PEG 400 foram adicionados à mistura resultante nas quantidades indicadas na Tabela 1, e a agitação foi continuada até que uma solução polimérica viscosa e límpida fosse obtida. O banho resultante de solução polimérica foi sonicado por 60 minutos para remover bolhas de ar presas na mistura polimérica. Conforme mostrado na Figura Suplementar S1(b), o Ct foi distribuído uniformemente em cada poço de uma placa de 6 poços (molde) suplementada com 5 ml de HFFC.
A placa de seis poços foi sonicada por 60 minutos para obter umedecimento e distribuição uniformes de HFFC na rede de Ct. Em seguida, a placa de seis poços foi congelada a -20 °C por 8 a 12 horas. As placas congeladas foram liofilizadas por 48 horas para obter diferentes formulações de NFRCS. O mesmo procedimento é usado para produzir diferentes formatos e estruturas, como tampões ou tampões cilíndricos, ou qualquer outro formato para diferentes aplicações.
Quitosana (80 kDa) (3%) pesada com precisão é dissolvida em ácido acético a 1% usando um agitador magnético. À solução de quitosana resultante, adiciona-se 1% de PEG 400 e agita-se por 30 minutos. A solução resultante é vertida em um recipiente quadrado ou retangular e congelada a -80 °C por 12 horas. As amostras congeladas são liofilizadas por 48 horas para obtenção de Cs13 poroso.
O NFRCS desenvolvido foi submetido a experimentos utilizando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tóquio, Japão) para confirmar a compatibilidade química da quitosana com outros polímeros14,15. Os espectros de FTIR (amplitude da faixa espectral de 400 a 4000 cm-1) de todas as amostras testadas foram obtidos por meio da realização de 32 varreduras.
A taxa de absorção sanguínea (BAR) para todas as formulações foi avaliada usando o método descrito por Chen et al. 16 com pequenas modificações. Os NFRKs desenvolvidos de todas as composições foram secos em uma estufa a vácuo a 105 °C durante a noite para remover o solvente residual. 30 mg de NFRCS (peso inicial da amostra - W0) e 30 mg de Ct (controle positivo) foram colocados em placas separadas contendo uma pré-mistura de 3,8% de citrato de sódio. Em intervalos de tempo predeterminados, ou seja, 5, 10, 20, 30, 40 e 60 segundos, os NFRCS foram removidos e suas superfícies limpas de sangue não absorvido, colocando as amostras em Ct por 30 segundos. O peso final de sangue absorvido por NFRCS 16 foi considerado (W1) em cada ponto de tempo. Calcule a porcentagem de BAR usando a seguinte fórmula:
O tempo de coagulação sanguínea (BCT) foi determinado conforme relatado por Wang et al. 17 . O tempo necessário para o sangue total (sangue de rato pré-misturado com 3,8% de citrato de sódio) coagular na presença de NFRCS foi calculado como o BCT da amostra de teste. Os vários componentes do NFRCS (30 mg) foram colocados em frascos com tampa de rosca de 10 ml e incubados a 37 °C. Sangue (0,5 ml) foi adicionado ao frasco e 0,3 ml de 0,2 M CaCl2 foi adicionado para ativar a coagulação sanguínea. Finalmente, inverta o frasco a cada 15 segundos (até 180 °) até que um coágulo firme se forme. O BCT da amostra é estimado pelo número de vails flips17,18. Com base no BCT, duas composições ótimas de NFRCS Cm, Ch e Cp foram selecionadas para estudos de caracterização adicionais.
O BCT das composições de Ch NFRCS e Cp NFRCS foi determinado implementando o método descrito por Li et al. 19 . Coloque 15 x 15 mm2 de Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (controle positivo) em placas de Petri separadas (37 °C). Sangue contendo 3,8% de citrato de sódio foi misturado com 0,2 M de CaCl2 em uma proporção de volume de 10:1 para iniciar o processo de coagulação sanguínea. 20 µl de mistura de sangue de rato com 0,2 M de CaCl2 foram aplicados à superfície da amostra e colocados em uma placa de Petri vazia. O controle foi sangue vertido em placas de Petri vazias sem Ct. Em intervalos fixos de 0, 3 e 5 minutos, pare a coagulação adicionando 10 ml de água deionizada (DI) à amostra contendo a placa sem perturbar o coágulo. Eritrócitos não coagulados (eritrócitos) sofrem hemólise na presença de água deionizada e liberam hemoglobina. A hemoglobina em diferentes pontos no tempo (HA(t)) foi medida a 540 nm (λmax hemoglobina) usando um espectrofotômetro UV-Vis. A absorção absoluta de hemoglobina (AH(0)) em 0 min de 20 µl de sangue em 10 ml de água deionizada foi tomada como padrão de referência. A captação relativa de hemoglobina (RHA) do sangue coagulado foi calculada a partir da razão HA(t)/HA(0) usando o mesmo lote de sangue.
Utilizando um analisador de textura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EUA), foram determinadas as propriedades adesivas da NFRK ao tecido danificado. Pressionou-se uma placa cilíndrica de fundo aberto contra a parte interna da pele suína (sem a camada de gordura). As amostras (NFRCS Ch e NFRCS Cp) foram aplicadas por meio de cânula em moldes cilíndricos para criar adesão à pele do suíno. Após 3 minutos de incubação à temperatura ambiente (TA) (25 °C), a força adesiva da NFRCS foi registrada a uma taxa constante de 0,5 mm/s.
A principal característica dos selantes cirúrgicos é aumentar a coagulação sanguínea enquanto reduz a perda de sangue. A coagulação sem perdas em NFRCS foi avaliada usando um método publicado anteriormente com pequenas modificações 19 . Faça um tubo de microcentrífuga (2 ml) (diâmetro interno de 10 mm) com um orifício de 8 × 5 mm2 em um lado do tubo de centrífuga (representando uma ferida aberta). O NFRCS é usado para fechar a abertura e fita é usada para selar as bordas externas. Adicione 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M ao tubo de microcentrífuga contendo a pré-mistura de citrato de sódio a 3,8%. Após 10 minutos, os tubos de microcentrífuga foram removidos das placas e o aumento na massa das placas foi determinado devido ao fluxo de sangue do NFRK (n = 3). A perda de sangue Ch NFRCS e Cp NFRCS foram comparadas com Cs.
A integridade úmida do NFRCS foi determinada com base no método descrito por Mishra e Chaudhary21, com pequenas modificações. Coloque o NFRCS em um erlenmeyer de 100 ml com 50 ml de água e agite por 60 s sem formar uma camada superior. Inspecione visualmente e priorize as amostras quanto à integridade física com base na coleta.
A força de ligação do HFFC ao Ct foi estudada usando métodos publicados anteriormente com pequenas modificações. A integridade do revestimento da superfície foi avaliada expondo o NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) na presença de água milliQ (Ct). Os NFRCS Ch NFRCS e Cp NFRCS desenvolvidos foram colocados em um béquer cheio de água e sonicados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 min, respectivamente. Após a secagem, a diferença percentual entre o peso inicial e final do NFRCS foi usada para calcular a porcentagem de perda de material (HFFC). O BCT in vitro confirmou ainda mais a força de ligação ou perda de materiais de superfície. A eficiência da ligação do HFFC ao Ct proporciona coagulação sanguínea e um revestimento elástico na superfície do Ct22.
A homogeneidade do NFRCS desenvolvido foi determinada pelo BCT de amostras (30 mg) retiradas de locais gerais do NFRCS selecionados aleatoriamente. Siga o procedimento de BCT mencionado anteriormente para determinar a conformidade do NFRCS. A proximidade entre as cinco amostras garante uma cobertura de superfície uniforme e a deposição de HFFC na malha de Ct.
A área nominal de contato com o sangue (NBCA) foi determinada conforme relatado anteriormente, com algumas modificações. Coagulou-se o sangue pinçando 20 µl de sangue entre as duas superfícies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. Após 1 hora, as duas partes do stent foram separadas e a área do coágulo foi medida manualmente. O valor médio de três repetições foi considerado NBCA NFRCS19.
A análise de Sorção Dinâmica de Vapor (SVD) foi utilizada para avaliar a eficácia do NFRCS na absorção de água do ambiente externo ou do local da lesão responsável pelo início da coagulação. A SVD avalia ou registra a captação e a perda de vapor em uma amostra gravimetricamente, utilizando uma balança ultrassensível com resolução de massa de ±0,1 µg. Uma pressão parcial de vapor (umidade relativa) é gerada por um controlador eletrônico de fluxo de massa ao redor da amostra, misturando gases de arraste saturados e secos. De acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia, com base na porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram categorizadas em 4 categorias (0–0,012% p/p − não higroscópicas, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópicas, 2–15% moderadamente higroscópicas e > 15% muito higroscópicas)23. De acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia, com base na porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram categorizadas em 4 categorias (0–0,012% p/p - não higroscópicas, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópicas, 2–15% moderadamente higroscópicas e > 15% muito higroscópicas)23.De acordo com as recomendações da Farmacopeia Europeia, dependendo da porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram divididas em 4 categorias (0–0,012% p/p – não higroscópicas, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópicas, 2– quinze%).% умеренно гигроскопичен e > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópico e > 15% muito higroscópico)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15%非常吸湿）23。De acordo com as recomendações da Farmacopeia Europeia, as amostras são divididas em 4 classes dependendo da porcentagem de umidade absorvida pela amostra (0-0,012% em peso - não higroscópica, 0,2-2% em peso ligeiramente higroscópica, 2-15% em peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadamente higroscópico, > 15% muito higroscópico) 23.A eficiência higroscópica de NFCS X NFCS e TsN NFCS foi determinada em um analisador DVS TA TGA Q5000 SA. Durante esse processo, foram obtidos o tempo de corrida, a umidade relativa (UR) e o peso da amostra em tempo real a 25 °C24. O teor de umidade é calculado por meio da análise precisa da massa de NFCS usando a seguinte equação:
MC é a umidade do NFRCS. m1 – peso seco dos AINEs. m2 é a massa do NFRCS em tempo real a uma determinada UR.
A área total da superfície foi estimada usando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após esvaziar as amostras a 25 °C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr). A área total da superfície foi estimada usando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após esvaziar as amostras a 25 °C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Use o plano de teste para obter uma boa experiência com a ajuda de uma boa opção опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A área total da superfície foi estimada usando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após as amostras serem esvaziadas a 25°C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Mais de 25°C Obtenha um plano de teste de desempenho com testes de isolamento para adsoluções азотом после опорожнения образцов na temperatura 10 horas a 25°C (< 7 × 10-3 temperatura). A área total da superfície foi estimada usando experimentos de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após amostras serem esvaziadas por 10 horas a 25°C (< 7 x 10-3 torr).A área total da superfície, o volume dos poros e o tamanho dos poros do NFRCS foram determinados com um Quantachrome da NOVA 1000e, Áustria, usando o software RS 232.
Preparar 5% de hemácias (solução salina como diluente) a partir de sangue total. Em seguida, transferir uma alíquota de HFFC (0,25 ml) para uma placa de 96 poços e 5% da massa de hemácias (0,1 ml). Incubar a mistura a 37 °C por 40 minutos. Uma mistura de hemácias e soro foi considerada como controle positivo, e uma mistura de solução salina e hemácias como controle negativo. A hemaglutinação foi determinada de acordo com a escala de Stajitzky. As escalas propostas são as seguintes: + + + + agregados granulares densos; + + + almofadas de fundo liso com bordas curvas; + + almofadas de fundo liso com bordas rasgadas; + anéis vermelhos estreitos ao redor das bordas das almofadas lisas; – (negativo) botão vermelho discreto 12 no centro do poço inferior.
A hemocompatibilidade do NFRCS foi estudada de acordo com o método da Organização Internacional para Padronização (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. O método gravimétrico descrito por Singh et al. Pequenas modificações foram feitas para avaliar a formação de trombos na presença ou na superfície do NFRCS. 500 mg de NFRCS Cs, Ch e Cp foram incubados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 24 horas a 37 °C. Após 24 horas, o PBS foi removido e o NFRCS foi tratado com 2 ml de sangue contendo 3,8% de citrato de sódio. Na superfície do NFRCS, adicione 0,04 ml de CaCl2 0,1 M às amostras incubadas. Após 45 minutos, 5 ml de água destilada foram adicionados para interromper a coagulação. O sangue coagulado na superfície do NFRK foi tratado com solução de formaldeído a 36-38%. Os coágulos fixados com formaldeído foram secos e pesados. A porcentagem de trombose foi estimada calculando-se o peso do copo sem sangue e da amostra (controle negativo) e do copo com sangue (controle positivo).
Como confirmação inicial, as amostras foram visualizadas em microscópio óptico para avaliar a capacidade do revestimento superficial de HFFC, da interconexão de Ct e da rede de Ct de formar poros. Secções finas de Ch e Cp do NFRCS foram aparadas com lâmina de bisturi. A secção resultante foi colocada sobre uma lâmina de vidro, coberta com uma lamínula, e as bordas foram fixadas com cola. As lâminas preparadas foram visualizadas em microscópio óptico e fotografias foram tiradas em diferentes ampliações.
A deposição de polímeros em redes Ct foi visualizada usando microscopia de fluorescência baseada no método descrito por Rice et al.29. A composição HFFC usada para a formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto), e os NFRCS (Ch e Cp) foram preparados conforme o método mencionado anteriormente. A composição HFFC usada para a formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto), e os NFRCS (Ch e Cp) foram preparados conforme o método mencionado anteriormente.A composição de HFFC usada para formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto) e o NFRCS (Ch e Cp) foi obtido de acordo com o método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。A composição HFFC usada na formulação foi misturada com um corante fluorescente (Amaranto) e recebeu NFRCS (Ch e Cp), conforme mencionado anteriormente.Secções finas de NFRK foram cortadas das amostras obtidas, colocadas em lâminas de vidro e cobertas com lamínulas. Observe as lâminas preparadas sob um microscópio de fluorescência utilizando um filtro verde (310-380 nm). As imagens foram obtidas com ampliação de 4x para compreender as relações Ct e a deposição excessiva de polímero na rede Ct.
A topografia da superfície de NFRCS Ch e Cp foi determinada usando um microscópio de força atômica (AFM) com um cantilever TESP ultra-afiado em modo de batida: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. A rugosidade da superfície foi determinada pela raiz quadrada média (RMS) usando um software (Scanning Probe Image Processor). Várias localizações de NFRCS foram renderizadas em imagens 3D para verificar a uniformidade da superfície. O desvio padrão da pontuação para uma determinada área é definido como a rugosidade da superfície. A equação RMS foi usada para quantificar a rugosidade da superfície de NFRCS31.
Estudos baseados em FESEM foram realizados usando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tóquio, para entender a morfologia da superfície de Ch NFRCS e Cp NFRCS, que apresentaram melhor BCT do que Cm NFRCS. O estudo FESEM foi realizado de acordo com o método descrito por Zhao et al. 32 com pequenas modificações. NFRCS 20 a 30 mg de Ch NFRCS e Cp NFRCS foram pré-misturados com 20 µl de citrato de sódio a 3,8% pré-misturado com sangue de rato. 20 µl de 0,2 M CaCl2 foram adicionados às amostras tratadas com sangue para iniciar a coagulação e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos. Além disso, o excesso de eritrócitos foi removido da superfície do NFRCS por lavagem com solução salina.
Amostras subsequentes foram tratadas com glutaraldeído a 0,1% e então secas em uma estufa de ar quente a 37°C para remover a umidade. As amostras secas foram revestidas e analisadas 32 . Outras imagens obtidas durante a análise foram a formação de coágulos na superfície de fibras individuais de algodão, deposição de polímero entre Ct, morfologia do eritrócito (formato), integridade do coágulo e morfologia do eritrócito na presença de NFRCS. Áreas de NFRCS não tratadas e áreas de NFRCS tratadas com Ch e Cp incubadas com sangue foram escaneadas para íons elementares (sódio, potássio, nitrogênio, cálcio, magnésio, zinco, cobre e selênio) 33 . Compare as porcentagens de íons elementares entre amostras tratadas e não tratadas para entender o acúmulo de íons elementares durante a formação do coágulo e a homogeneidade do coágulo.
A espessura do revestimento superficial de HFFC Cp na superfície de Ct foi determinada por MEFES. As seções transversais de NFRCS Cp foram cortadas da estrutura e revestidas por pulverização catódica. As amostras de revestimento por pulverização catódica resultantes foram observadas por MEFES e a espessura do revestimento superficial foi medida 34, 35, 36.
A microtomografia computadorizada de raios X fornece imagens 3D não destrutivas de alta resolução e permite o estudo do arranjo estrutural interno do NFRK. A microtomografia computadorizada utiliza um feixe de raios X que atravessa a amostra para registrar o coeficiente de atenuação linear local dos raios X na amostra, o que auxilia na obtenção de informações morfológicas. A localização interna do Ct em Cp NFRCS e Cp NFRCS tratado com sangue foi examinada por microtomografia computadorizada para compreender a eficiência de absorção e a coagulação sanguínea na presença de NFRCS37,38,39. As estruturas 3D das amostras de Cp NFRCS tratadas e não tratadas com sangue foram reconstruídas usando microtomografia computadorizada (V|tome|x S240, Phoenix, Alemanha). Utilizando o software VG STUDIO-MAX versão 2.2, diversas imagens de raios X foram obtidas de diferentes ângulos (idealmente com cobertura de 360°) para desenvolver imagens 3D para NFRCS. Os dados de projeção coletados foram reconstruídos em imagens volumétricas 3D usando o software 3D ScanIP Academic simples correspondente.
Além disso, para compreender a distribuição do coágulo, 20 µl de sangue citratado pré-misturado e 20 µl de CaCl₂ 0,2 M foram adicionados ao NFRCS para iniciar a coagulação sanguínea. As amostras preparadas foram deixadas para endurecer. A superfície do NFRK foi tratada com glutaraldeído a 0,5% e seca em estufa de ar quente a 30–40 °C por 30 minutos. O coágulo sanguíneo formado no NFRCS foi escaneado, reconstruído e uma imagem 3D do coágulo sanguíneo foi visualizada.
Ensaios antibacterianos foram realizados em Cp NFRCS (melhor comparado a Ch NFRCS) usando o método descrito anteriormente com pequenas modificações. A atividade antibacteriana de Cp NFRCS e Cp HFFC foi determinada usando três microrganismos de teste diferentes [S. aureus (bactérias gram-positivas), E. coli (bactérias gram-negativas) e Candida branca (C. albicans)] crescendo em ágar em placas de Petri em uma incubadora. Inocule uniformemente 50 ml da suspensão de cultura bacteriana diluída a uma concentração de 105-106 UFC ml-1 no meio de ágar. Despeje o meio em uma placa de Petri e deixe solidificar. Poços foram feitos na superfície da placa de ágar para preencher com HFFC (3 poços para HFFC e 1 para controle negativo). Adicione 200 µl de HFFC a 3 poços e 200 µl de PBS pH 7,4 ao 4º poço. No outro lado da placa de Petri, coloque um disco de 12 mm de Cp NFRCS sobre o ágar solidificado e umedeça com PBS (pH 7,4). Os comprimidos de ciprofloxacino, ampicilina e fluconazol são considerados padrões de referência para Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Meça a zona de inibição manualmente e obtenha uma imagem digital da zona de inibição.
Após aprovação ética institucional, o estudo foi conduzido no Kasturba Medical College of Education and Research em Manipal, Karnataka, no sul da Índia. O protocolo experimental de TEG in vitro foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Os indivíduos foram recrutados entre doadores de sangue voluntários (com idades entre 18 e 55 anos) do banco de sangue do hospital. Além disso, um termo de consentimento informado foi obtido dos voluntários para a coleta de amostras de sangue. O TEG nativo (N-TEG) ​​foi usado para estudar o efeito da formulação Cp HFFC em sangue total pré-misturado com citrato de sódio. O N-TEG é amplamente reconhecido por seu papel na ressuscitação no local de atendimento, o que cria problemas para os médicos devido ao potencial de atraso clinicamente significativo nos resultados (testes de coagulação de rotina). A análise do N-TEG foi realizada usando sangue total. O consentimento informado e o histórico médico detalhado foram obtidos de todos os participantes. O estudo não incluiu participantes com complicações hemostáticas ou trombóticas, como gravidez/pós-parto ou doença hepática. Indivíduos tomando medicamentos que afetam a cascata de coagulação também foram excluídos do estudo. Testes laboratoriais básicos (hemoglobina, tempo de protrombina, tromboplastina ativada e contagem de plaquetas) foram realizados em todos os participantes de acordo com procedimentos padrão. O N-TEG determina a viscoelasticidade do coágulo sanguíneo, a estrutura inicial do coágulo, a interação de partículas, o fortalecimento do coágulo e a lise do coágulo. A análise do N-TEG fornece dados gráficos e numéricos sobre os efeitos coletivos de vários elementos celulares e plasma. A análise do N-TEG foi realizada em dois volumes diferentes de Cp HFFC (10 µl e 50 µl). Como resultado, 1 ml de sangue total com ácido cítrico foi adicionado a 10 µl de Cp HFFC. Adicione 1 ml (Cp HFFC + sangue citratado), 340 µl de sangue misto a 20 µl de placa de TEG contendo 0,2 M CaCl2. Em seguida, as placas TEG foram carregadas no TEG® 5000, US para medir R, K, ângulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% das amostras de sangue na presença de Cp HFFC41.
O protocolo do estudo in vivo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC), Faculdade de Medicina de Kasturba, Instituto de Ensino Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações do Comitê de Controle e Supervisão de Experimentação Animal (CPCSEA). Todos os estudos NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) foram realizados em ratos Wistar fêmeas (pesando 200 a 250 g). Todos os animais foram aclimatados a uma temperatura de 24-26 °C, os animais tiveram livre acesso a comida padrão e água ad libitum. Todos os animais foram divididos aleatoriamente em grupos diferentes, cada grupo consistia de três animais. Todos os estudos foram realizados de acordo com Estudos em Animais: Relatório de Experimentos In Vivo 43 . Antes do estudo, os animais foram anestesiados por administração intraperitoneal (ip) de uma mistura de 20-50 mg de cetamina (por 1 kg de peso corporal) e 2-10 mg de xilazina (por 1 kg de peso corporal). Após o estudo, o volume de sangramento foi calculado avaliando-se a diferença entre o peso inicial e final das amostras. A média obtida nos três testes foi considerada o volume de sangramento da amostra.
O modelo de amputação de cauda de rato foi implementado para compreender o potencial do NFRCS para modular o sangramento em traumas, combates ou acidentes de trânsito (modelo de lesão). Cortou-se 50% da cauda com uma lâmina de bisturi e colocou-se no ar por 15 segundos para garantir o sangramento normal. Além disso, amostras de teste foram colocadas na cauda de um rato aplicando-se pressão (Ct, Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS). Sangramento e PCT foram relatados para os espécimes de teste (n = 3)17,45.
A eficácia do controle de pressão do NFRCS em combate foi investigada em um modelo da artéria femoral superficial. A artéria femoral é exposta, puncionada com um trocarte 24G e sangrada em 15 segundos. Após a observação de sangramento descontrolado, a amostra de teste é colocada no local da punção com pressão aplicada. Imediatamente após a aplicação da amostra de teste, o tempo de coagulação é registrado e a eficiência hemostática é observada pelos 5 minutos seguintes. O mesmo procedimento foi repetido com Cs e Ct46.
Dowling et al. 47 propuseram um modelo de lesão hepática para avaliar o potencial hemostático de materiais hemostáticos no contexto de sangramento intraoperatório. O BCT foi registrado para amostras de Ct (controle negativo), estrutura de Cs (controle positivo), amostras de Ch NFRCS e amostras de Cp NFRCS. A veia cava supra-hepática do rato foi exposta realizando uma laparotomia mediana. Depois disso, a parte distal do lobo esquerdo foi cortada com tesoura. Faça uma incisão no fígado com uma lâmina de bisturi e deixe sangrar por alguns segundos. Amostras de teste de Ch NFRCS e Cp NFRCS pesadas com precisão foram colocadas na superfície danificada sem qualquer pressão positiva e o BCT foi registrado. O grupo controle (Ct) então aplicou pressão seguida de Cs 30 s47 sem romper a lesão.
Ensaios de cicatrização de feridas in vivo foram realizados usando um modelo de ferida excisional para avaliar as propriedades de cicatrização de feridas dos NFRCSs baseados em polímeros desenvolvidos. Os modelos de feridas excisionais foram selecionados e realizados de acordo com métodos publicados anteriormente, com pequenas modificações19,32,48. Todos os animais foram anestesiados conforme descrito anteriormente. Utilizando um punch de biópsia (12 mm) para fazer uma incisão circular profunda na pele do dorso. Os locais de feridas preparados foram tratados com Cs (controle positivo), Ct (reconhecendo que almofadas de algodão interferem na cicatrização), Ch NFRCS e Cp NFRCS (grupo experimental) e um controle negativo sem qualquer tratamento. Em cada dia do estudo, a área da ferida foi medida em todos os ratos. Utilizando uma câmera digital para tirar uma foto da área da ferida e colocar um novo curativo. A porcentagem de fechamento da ferida foi medida pela seguinte fórmula:
Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele do rato do melhor grupo foi excisada ((Cp NFRCS) e do grupo controle) e estudada por coloração H&E e coloração tricrômica de Masson. Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele do rato do melhor grupo foi excisada ((Cp NFRCS) e do grupo controle) e estudada por coloração H&E e coloração tricrômica de Masson.Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele dos ratos do melhor grupo ((Cp NFRCS) e do grupo controle) foi excisada e examinada por coloração com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Os ratos do melhor grupo ((Cp NFRCS) e grupos de controle) foram excisados ​​para coloração de hematoxilina-eosina e coloração tricrômica de Masson com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo.O procedimento de coloração implementado foi realizado de acordo com métodos previamente descritos49,50. Resumidamente, após a fixação em formalina a 10%, as amostras foram desidratadas utilizando uma série de álcoois graduados. Utilizou-se um micrótomo para obter cortes finos (5 µm de espessura) do tecido excisado. Cortes seriados finos de controles e Cp NFRCS foram tratados com hematoxilina e eosina para estudar as alterações histopatológicas. A coloração tricrômica de Masson foi utilizada para detectar a formação de fibrilas de colágeno. Os resultados obtidos foram estudados às cegas por patologistas.
A estabilidade das amostras de Cp NFRCS foi estudada em temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/60% UR ± 5%) por 12 meses51. O Cp NFRCS (descoloração da superfície e crescimento microbiano) foi inspecionado visualmente e testado quanto à resistência ao desgaste por dobra e BCT de acordo com os métodos acima descritos na seção Materiais e Métodos.
A escalabilidade e a reprodutibilidade do Cp NFRCS foram examinadas pela preparação de Cp NFRCS com dimensões de 15 x 15 cm². Além disso, amostras de 30 mg (n = 5) foram excisadas de várias frações de Cp NFRCS e o BCT das amostras estudadas foi avaliado conforme descrito anteriormente na seção Métodos.
Tentamos desenvolver diversos formatos e estruturas utilizando composições de Cp NFRCS para diversas aplicações biomédicas. Tais formatos ou configurações incluem cotonetes cônicos para sangramentos nasais, procedimentos odontológicos e cotonetes cilíndricos para sangramento vaginal.
Todos os conjuntos de dados foram expressos como média ± desvio padrão e foram analisados ​​por ANOVA usando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EUA), seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni (*p<0,05).
Todos os procedimentos realizados em estudos com humanos estavam de acordo com as normas do Instituto e do Conselho Nacional de Pesquisa, bem como com a Declaração de Helsinque de 1964 e suas emendas subsequentes, ou padrões éticos semelhantes. Todos os participantes foram informados sobre as características do estudo e sua natureza voluntária. Os dados dos participantes permanecem confidenciais após a coleta. O protocolo experimental de TEG in vitro foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Os voluntários assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido para a coleta de amostras de sangue.
Todos os procedimentos realizados em estudos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Faculdade de Medicina de Kastuba, Instituto de Ensino Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Controle e Supervisão de Experimentação Animal (CPCSEA). Todos os autores seguem as diretrizes da ARRIVE.
Os espectros de FTIR de todos os NFRCS foram analisados ​​e comparados com o espectro de quitosana mostrado na Figura 2A. Picos espectrais característicos de quitosana (registrados) em 3437 cm-1 (alongamento de OH e NH, sobreposição), 2945 e 2897 cm-1 (alongamento de CH), 1660 cm-1 (deformação NH2), 1589 cm-1 (flexão N–H), 1157 cm-1 (alongamento de ponte O-), 1067 cm-1 (alongamento C–O, hidroxila secundária), 993 cm-1 (alongamento CO, Bo-OH) 52,53,54. A Tabela Suplementar S1 mostra os valores do espectro de absorção de FTIR NFRCS para quitosana (repórter), quitosana pura, Cm, Ch e Cp. Os espectros de FTIR de todos os NFRCS (Cm, Ch e Cp) apresentaram as mesmas bandas de absorção características da quitosana pura, sem alterações significativas (Fig. 2A). Os resultados de FTIR confirmaram a ausência de interações químicas ou físicas entre os polímeros utilizados para desenvolver os NFRCS, indicando que os polímeros utilizados são inertes.
Caracterização in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. (A) representa os espectros FTIR combinados das composições de quitosana e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS sob compressão. (B) a) Taxa de captação de sangue total de NFRCS Cm, Ch, Cp e Cg (n = 3); As amostras de Ct apresentaram BAR mais alta porque o cotonete tem maior eficiência de absorção; b) Sangue após absorção de sangue Ilustração da amostra absorvida. Representação gráfica do BCT da amostra de teste C (Cp NFRCS teve o melhor BCT (15 s, n = 3)). Os dados em C, D, E e G foram apresentados como média ± DP, e as barras de erro representam DP, ***p < 0,0001. Os dados em C, D, E e G foram apresentados como média ± DP, e as barras de erro representam DP, ***p < 0,0001. Os ajustes em C, D, E e G são adequados para o padrão ± abertura padrão e uma placa de configuração classificação padrão, ***p <0,0001. Os dados em C, D, E e G são apresentados como média ± desvio padrão, e as barras de erro representam desvio padrão, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Os ajustes em C, D, E e G são adequados para o ajuste correto ± abertura padrão, pranchas de ajuste padrão abertura padrão, ***p <0,0001. Os dados em C, D, E e G são mostrados como média ± desvio padrão, as barras de erro representam desvio padrão, ***p<0,0001.