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O sangramento descontrolado é uma das principais causas de morte.A obtenção de hemostasia rápida garante a sobrevivência do sujeito como primeiros socorros durante o combate, acidentes de trânsito e operações de redução de mortes.Andaime composto reforçado com fibra nanoporosa (NFRCS) derivado de uma composição formadora de filme hemostático simples (HFFC) como uma fase contínua pode desencadear e melhorar a hemostasia.O desenvolvimento do NFRCS é baseado no desenho da asa da libélula.A estrutura da asa da libélula consiste em asas transversais e longitudinais, e as membranas das asas são conectadas entre si para manter a integridade da microestrutura.O HFFC reveste uniformemente a superfície da fibra com um filme de espessura nanométrica e conecta a espessura do algodão distribuída aleatoriamente (Ct) (fase dispersa) para formar uma estrutura nanoporosa.A combinação das fases contínua e dispersa reduz em dez vezes o custo do produto em relação aos produtos disponíveis comercialmente.NFRCS modificados (tampões ou pulseiras) podem ser usados ​​em uma variedade de aplicações biomédicas.Estudos in vivo concluíram que o Cp NFRCS desenvolvido desencadeia e melhora o processo de coagulação no local de aplicação.O NFRCS pode modular o microambiente e atuar no nível celular devido à sua estrutura nanoporosa, resultando em melhor cicatrização de feridas no modelo de ferida de excisão.
O sangramento descontrolado em situações de combate, intraoperatórias e de emergência pode representar uma séria ameaça à vida dos feridos1.Essas condições levam ainda a um aumento geral da resistência vascular periférica, levando ao choque hemorrágico.Medidas apropriadas para controlar o sangramento durante e após a cirurgia são consideradas potencialmente fatais2,3.A lesão de grandes vasos leva à perda maciça de sangue, resultando em uma taxa de mortalidade ≤ 50% em combate e 31% durante a cirurgia1.A perda maciça de sangue leva a uma diminuição do volume corporal, o que reduz o débito cardíaco.Um aumento na resistência vascular periférica total e um comprometimento progressivo da microcirculação levam à hipóxia nos órgãos de suporte à vida.Choque hemorrágico pode ocorrer se a condição persistir sem intervenção efetiva1,4,5.Outras complicações incluem a progressão da hipotermia e acidose metabólica, bem como um distúrbio de coagulação que impede o processo de coagulação.Choque hemorrágico grave está associado a maior risco de morte6,7,8.No choque grau III (progressivo), a transfusão de sangue é essencial para a sobrevivência do paciente durante a morbimortalidade intra e pós-operatória.Para superar todas as situações de risco de vida acima, desenvolvemos um andaime composto reforçado com fibra nanoporosa (NFRCS) que utiliza uma concentração mínima de polímero (0,5%) usando uma combinação de polímeros hemostáticos solúveis em água.
Com o uso de reforço de fibra, produtos econômicos podem ser desenvolvidos.As fibras dispostas aleatoriamente lembram a estrutura da asa de uma libélula, equilibrada pelas listras horizontais e verticais nas asas.As veias transversais e longitudinais da asa se comunicam com a membrana da asa (Fig. 1).NFRCS consiste em Ct reforçado como um sistema de andaime com melhor resistência física e mecânica (Figura 1).Devido à acessibilidade e habilidade, os cirurgiões preferem usar medidores de fio de algodão (Ct) durante as operações e curativos. Assim, considerando seus múltiplos benefícios, incluindo > 90% de celulose cristalina (contribui para o aumento da atividade hemostática), a Ct foi utilizada como um sistema esquelético de NFRCS9,10. Assim, considerando seus múltiplos benefícios, incluindo > 90% de celulose cristalina (contribui para o aumento da atividade hemostática), a Ct foi utilizada como um sistema esquelético de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (уч аствует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Portanto, dados seus muitos benefícios, incluindo >90% de celulose cristalina (envolvida no aumento da atividade hemostática), a Ct foi usada como o sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Portanto, dados seus muitos benefícios, incluindo mais de 90% de celulose cristalina (ajuda a aumentar a atividade hemostática), a Ct foi usada como um andaime para NFRCS9,10.A Ct foi revestida superficialmente (observou-se a formação de filme nanoespesso) e interligada com uma composição hemostática formadora de filme (HFFC).O HFFC age como um matrigel, mantendo juntos os Ct colocados aleatoriamente.O projeto desenvolvido transmite tensões dentro da fase dispersa (fibras de reforço).É difícil obter estruturas nanoporosas com boa resistência mecânica usando concentrações mínimas de polímero.Além disso, não é fácil personalizar diferentes moldes para diferentes aplicações biomédicas.
A figura mostra um diagrama do projeto do NFRCS baseado na estrutura da asa da libélula (A).Esta imagem mostra uma analogia comparativa da estrutura da asa de uma libélula (as veias longitudinais e cruzadas da asa estão interconectadas) e uma fotomicrografia de seção transversal de Cp NFRCS (B).Representação esquemática do NFRCS.
Os NFRCs foram desenvolvidos usando HFFC como uma fase contínua para abordar as limitações acima.O HFFC é composto de vários polímeros hemostáticos formadores de filme, incluindo quitosana (como o principal polímero hemostático) com metilcelulose (MC), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC 50 cp) e álcool polivinílico (PVA) (125 kDa) como um polímero de suporte que promove a formação de trombos.formação.A adição de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) melhorou a capacidade de absorção de umidade do NFRCS.O polietileno glicol 400 (PEG 400) foi adicionado para melhorar a reticulação do polímero em misturas de polímeros ligados.Três diferentes composições hemostáticas HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), ou seja, quitosana com MC (Cm), quitosana com HPMC (Ch) e quitosana com PVA (Cp), foram aplicadas ao Ct.Vários estudos de caracterização in vitro e in vivo confirmaram a atividade hemostática e cicatrizante do NFRCS.Os materiais compostos oferecidos pelo NFRCS podem ser usados ​​para personalizar várias formas de andaimes para atender a necessidades específicas.
Além disso, o NFRCS pode ser modificado como uma bandagem ou rolo para cobrir toda a área de lesão das extremidades inferiores e outras partes do corpo.Especificamente para lesões de membros em combate, o design do NFRCS projetado pode ser alterado para meio braço ou perna inteira (Figura complementar S11).O NFRCS pode ser transformado em uma pulseira com cola de tecido, que pode ser usada para estancar o sangramento de graves lesões suicidas no pulso.Nosso principal objetivo é desenvolver um NFRCS com o mínimo de polímero possível que possa ser entregue a uma grande população (abaixo da linha da pobreza) e que possa ser colocado em um kit de primeiros socorros.Simples, eficiente e econômico em design, o NFRCS beneficia as comunidades locais e pode ter um impacto global.
A quitosana (peso molecular 80 kDa) e o amaranto foram adquiridos da Merck, Índia.Hidroxipropilmetilcelulose 50 Cp, polietileno glicol 400 e metilcelulose foram adquiridos da Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.O álcool polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90% hidrolisado) foi adquirido à National Chemicals, Gujarat.A polivinilpirrolidina K30 foi adquirida da Molychem, Mumbai, e os swabs estéreis foram adquiridos da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, com água Milli Q (sistema de purificação de água Direct-Q3, Merck, Índia) como veículo.
NFRCS foi desenvolvido usando um método de liofilização11,12.Todas as composições de HFFC (Tabela 1) foram preparadas usando um agitador mecânico.Prepare uma solução de 0,5% de quitosana usando 1% de ácido acético em água por agitação contínua a 800 rpm em um agitador mecânico.O peso exato do polímero carregado indicado na Tabela 1 foi adicionado à solução de quitosana e agitado até que uma solução de polímero límpida fosse obtida.PVP K30 e PEG 400 foram adicionados à mistura resultante nas quantidades indicadas na Tabela 1, e a agitação foi continuada até que uma solução viscosa transparente de polímero fosse obtida.O banho resultante da solução de polímero foi sonicado por 60 minutos para remover as bolhas de ar aprisionadas da mistura de polímero.Conforme mostrado na Figura Suplementar S1(b), a Ct foi distribuída uniformemente em cada poço de uma placa de 6 poços (molde) suplementada com 5 ml de HFFC.
A placa de seis poços foi sonicada por 60 min para obter umedecimento uniforme e distribuição de HFFC na rede Ct.Em seguida, congele a placa de seis poços a -20°C por 8 a 12 horas.As placas congeladas foram liofilizadas por 48 horas para obter várias formulações de NFRCS.O mesmo procedimento é usado para produzir diferentes formas e estruturas, como tampões ou tampões cilíndricos, ou qualquer outra forma para diferentes aplicações.
Quitosana pesada com precisão (80 kDa) (3%) é dissolvida em ácido acético a 1% usando um agitador magnético.À solução resultante de quitosano adicionou-se PEG 400 a 1% e agitou-se durante 30 minutos.Despeje a solução resultante em um recipiente quadrado ou retangular e congele a -80°C por 12 horas.Amostras congeladas foram liofilizadas por 48 horas para obtenção de Cs13 poroso.
O NFRCS desenvolvido foi submetido a experimentos usando espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tóquio, Japão) para confirmar a compatibilidade química da quitosana com outros polímeros14,15.Os espectros FTIR (largura da faixa espectral de 400 a 4000 cm-1) de todas as amostras testadas foram obtidos através da realização de 32 varreduras.
A taxa de absorção sanguínea (BAR) para todas as formulações foi avaliada usando o método descrito por Chen et al.16 com pequenas modificações.Os NFRKs desenvolvidos de todas as composições foram secos em estufa a vácuo a 105°C durante a noite para remover o solvente residual.30 mg de NFRCS (peso inicial da amostra – W0) e 30 mg de Ct (controle positivo) foram colocados em placas separadas contendo uma pré-mistura de 3,8% de citrato de sódio.Em intervalos de tempo predeterminados, ou seja, 5, 10, 20, 30, 40 e 60 segundos, os NFRCS foram removidos e suas superfícies limpas de sangue não absorvido, colocando as amostras em Ct por 30 segundos.O peso final de sangue absorvido pelo NFRCS 16 foi considerado (W1) em cada ponto de tempo.Calcule a porcentagem de BAR usando a seguinte fórmula:
O tempo de coagulação do sangue (BCT) foi determinado conforme relatado por Wang et al.17 .O tempo necessário para o sangue total (sangue de rato pré-misturado com 3,8% de citrato de sódio) coagular na presença de NFRCS foi calculado como o BCT da amostra de teste.Os vários componentes NFRCS (30 mg) foram colocados em frascos de 10 ml com tampa de rosca e incubados a 37°C.Sangue (0,5 ml) foi adicionado ao frasco e 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M foi adicionado para ativar a coagulação do sangue.Finalmente, inverter o frasco a cada 15 segundos (até 180°) até formar um coágulo firme.O BCT da amostra é estimado pelo número de flips vails17,18.Com base no BCT, duas composições ótimas de NFRCS Cm, Ch e Cp foram selecionadas para estudos de caracterização adicionais.
O BCT das composições Ch NFRCS e Cp NFRCS foi determinado implementando o método descrito por Li et al.19 .Coloque 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (controle positivo) em placas de Petri separadas (37 °C).Sangue contendo 3,8% de citrato de sódio foi misturado com 0,2 M de CaCl2 em uma proporção de 10:1 em volume para iniciar o processo de coagulação do sangue.20 µl de mistura de sangue de rato CaCl2 0,2 ​​M foram aplicados à superfície da amostra e colocados em uma placa de Petri vazia.O controle foi sangue derramado em placas de Petri vazias sem Ct.Em intervalos fixos de 0, 3 e 5 minutos, interrompa a coagulação adicionando 10 ml de água deionizada (DI) à amostra que contém a placa sem perturbar o coágulo.Eritrócitos não coagulados (eritrócitos) sofrem hemólise na presença de água deionizada e liberam hemoglobina.A hemoglobina em diferentes pontos de tempo (HA(t)) foi medida a 540 nm (λmax hemoglobina) usando um espectrofotômetro UV-Vis.A absorção absoluta de hemoglobina (AH(0)) em 0 min de 20 µl de sangue em 10 ml de água deionizada foi tomada como padrão de referência.A absorção relativa de hemoglobina (RHA) do sangue coagulado foi calculada a partir da razão HA(t)/HA(0) usando o mesmo lote de sangue.
Usando um analisador de textura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EUA), as propriedades adesivas do NFRK ao tecido danificado foram determinadas.Pressione um prato cilíndrico de fundo aberto contra o interior da pele de porco (sem a camada de gordura).Amostras (Ch NFRCS e Cp NFRCS) foram aplicadas via cânula em moldes cilíndricos para criar adesão à pele do porco.Após uma incubação de 3 minutos à temperatura ambiente (RT) (25° C.), a força adesiva NFRCS foi registrada a uma taxa constante de 0,5 mm/seg.
A principal característica dos selantes cirúrgicos é aumentar a coagulação do sangue enquanto reduz a perda de sangue.A coagulação sem perdas em NFRCS foi avaliada usando um método previamente publicado com pequenas modificações 19 .Faça um tubo de microcentrífuga (2 ml) (diâmetro interno de 10 mm) com um orifício de 8 × 5 mm2 em um lado do tubo de centrífuga (representando uma ferida aberta).O NFRCS é usado para fechar a abertura e a fita é usada para selar as bordas externas.Adicione 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M ao tubo da microcentrífuga contendo a pré-mistura de citrato de sódio a 3,8%.Após 10 minutos, os tubos da microcentrífuga foram retirados das placas e foi determinado o aumento da massa das placas devido à saída de sangue do NFRK (n = 3).Perda de sangue Ch NFRCS e Cp NFRCS foram comparados com Cs.
A integridade úmida do NFRCS foi determinada com base no método descrito por Mishra e Chaudhary21 com pequenas modificações.Coloque o NFRCS em um Erlenmeyer de 100 ml com 50 ml de água e agite por 60 s sem formar uma tampa.Inspeção visual e priorização de amostras quanto à integridade física com base na coleta.
A força de ligação do HFFC ao Ct foi estudada usando métodos publicados anteriormente com pequenas modificações.A integridade do revestimento da superfície foi avaliada expondo o NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) na presença de água miliQ (Ct).Os NFRCS Ch NFRCS e Cp NFRCS desenvolvidos foram colocados em um béquer cheio de água e sonicados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 min, respectivamente.Após a secagem, a diferença percentual entre o peso inicial e final do NFRCS foi utilizada para calcular o percentual de perda de material (HFFC).In vitro BCT apoiou ainda mais a força de ligação ou perda de materiais de superfície.A eficiência da ligação do HFFC ao Ct proporciona a coagulação do sangue e um revestimento elástico na superfície do Ct22.
A homogeneidade do NFRCS desenvolvido foi determinada pelo BCT de amostras (30 mg) retiradas de locais gerais selecionados aleatoriamente do NFRCS.Siga o procedimento BCT mencionado anteriormente para determinar a conformidade com NFRCS.A proximidade entre todas as cinco amostras garante cobertura de superfície uniforme e deposição de HFFC na malha Ct.
A área nominal de contato com o sangue (NBCA) foi determinada conforme relatado anteriormente com algumas modificações.Coagule o sangue prendendo 20 µl de sangue entre as duas superfícies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs.Após 1 hora, as duas partes do stent foram separadas e mediu-se manualmente a área do coágulo.O valor médio de três repetições foi considerado NBCA NFRCS19.
A análise de Dynamic Vapor Sorption (DVS) foi usada para avaliar a eficácia do NFRCS para absorver água do ambiente externo ou do local da lesão responsável por iniciar a coagulação.O DVS avalia ou registra a absorção e perda de vapor em uma amostra gravimetricamente usando uma balança ultrassensível com uma resolução de massa de ±0,1 µg.Uma pressão de vapor parcial (umidade relativa) é gerada por um controlador eletrônico de fluxo de massa ao redor da amostra, misturando gases de arraste saturados e secos. De acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia, com base na porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram categorizadas em 4 categorias (0–0,012% p/p− não higroscópico, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópico, 2–15% moderadamente higroscópico e > 15% muito higroscópico)23. De acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia, com base na porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram categorizadas em 4 categorias (0–0,012% p/p− não higroscópico, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópico, 2–15% moderadamente higroscópico e > 15% muito higroscópico)23.De acordo com as recomendações da Farmacopeia Europeia, dependendo da porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram divididas em 4 categorias (0–0,012% p/p – não higroscópico, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópico, 2– quinze%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópico e > 15% muito higroscópico)23.根据欧洲药典指南,根据样品吸收水分的百分比,样品分为4 类（0-0,012% w/w- 非吸湿性、0,2-2% w /w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23De acordo com as recomendações da Farmacopeia Europeia, as amostras são divididas em 4 classes dependendo da porcentagem de umidade absorvida pela amostra (0-0,012% em peso – não higroscópico, 0,2-2% em peso ligeiramente higroscópico, 2-15% em peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadamente higroscópico, > 15% muito higroscópico) 23.A eficiência higroscópica de NFCS X NFCS e TsN NFCS foi determinada em um analisador DVS TA TGA Q5000 SA.Durante esse processo, foram obtidos o tempo de execução, a umidade relativa (UR) e o peso da amostra em tempo real a 25°C24.O teor de umidade é calculado por análise de massa NFRCS precisa usando a seguinte equação:
MC é a umidade NFRCS.m1 – peso seco de AINEs.m2 é a massa NFRCS em tempo real em uma determinada UR.
A área superficial total foi estimada usando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após o esvaziamento das amostras a 25 °C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr). A área superficial total foi estimada usando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após o esvaziamento das amostras a 25 °C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом пос ле опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A área de superfície total foi estimada usando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido depois que as amostras foram esvaziadas a 25°C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азот ом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). A área de superfície total foi estimada usando experimentos de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido depois que as amostras foram esvaziadas por 10 horas a 25°C (< 7 x 10-3 torr).A área de superfície total, volume de poro e tamanho de poro NFRCS foram determinados com um Quantachrome da NOVA 1000e, Áustria usando o software RS 232.
Prepare hemácias a 5% (solução salina como diluente) de sangue total.Em seguida, transfira uma alíquota de HFFC (0,25 ml) para uma placa de 96 poços e 5% de massa de RBC (0,1 ml).Incubar a mistura a 37°C por 40 minutos.Uma mistura de hemácias e soro foi considerada como controle positivo, e uma mistura de soro fisiológico e hemácias como controle negativo.A hemaglutinação foi determinada de acordo com a escala de Stajitzky.As escalas propostas são as seguintes: + + + + agregados granulares densos;+ + + almofadas de fundo liso com bordas curvas;+ + almofadas de fundo liso com bordas rasgadas;+ anéis vermelhos estreitos nas bordas das almofadas lisas;– (negativo) discreto botão vermelho 12 no centro da cavidade inferior.
A hemocompatibilidade do NFRCS foi estudada de acordo com o método da Organização Internacional de Padronização (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.O método gravimétrico descrito por Singh et al.Pequenas modificações foram feitas para avaliar a formação de trombos na presença ou na superfície de NFRCS.500 mg de Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS foram incubados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 24 horas a 37°C.Após 24 horas, o PBS foi removido e o NFRCS foi tratado com 2 ml de sangue contendo 3,8% de citrato de sódio.Na superfície do NFRCS, adicione 0,04 ml de 0,1 M CaCl2 às amostras incubadas.Após 45 minutos, foram adicionados 5 ml de água destilada para interromper a coagulação.O sangue coagulado na superfície do NFRK foi tratado com solução de formaldeído a 36-38%.Os coágulos fixados com formaldeído foram secos e pesados.A porcentagem de trombose foi estimada calculando-se o peso do copo sem sangue e amostra (controle negativo) e do copo com sangue (controle positivo).
Como confirmação inicial, as amostras foram visualizadas em microscópio óptico para entender a capacidade do revestimento superficial de HFFC, Ct interligado e rede de Ct de formar poros.Seções finas de Ch e Cp de NFRCS foram cortadas com uma lâmina de bisturi.A seção resultante foi colocada em uma lâmina de vidro, coberta com uma lamínula e as bordas fixadas com cola.As lâminas preparadas foram visualizadas em microscópio óptico e as fotografias foram tiradas em diferentes aumentos.
A deposição de polímeros em redes de Ct foi visualizada usando microscopia de fluorescência com base no método descrito por Rice et al.29. A composição de HFFC utilizada para a formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto) e os NFRCS (Ch & Cp) foram preparados de acordo com o método mencionado anteriormente. A composição de HFFC utilizada para a formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto) e os NFRCS (Ch & Cp) foram preparados de acordo com o método mencionado anteriormente.A composição de HFFC utilizada para formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto) e o NFRCS (Ch e Cp) foi obtido de acordo com o método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。A composição de HFFC utilizada na formulação foi misturada com um corante fluorescente (Amaranto) e recebeu NFRCS (Ch e Cp), conforme mencionado anteriormente.Seções finas de NFRK foram cortadas das amostras obtidas, colocadas em lâminas de vidro e cobertas com lamínulas.Observe as lâminas preparadas sob um microscópio fluorescente usando um filtro verde (310-380 nm).As imagens foram tiradas com ampliação de 4x para entender as relações Ct e excesso de deposição de polímero na rede Ct.
A topografia da superfície de NFRCS Ch e Cp foi determinada usando um microscópio de força atômica (AFM) com um cantilever TESP ultra-afiado no modo de toque: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.A rugosidade da superfície foi determinada por raiz quadrada média (RMS) usando o software (Scanning Probe Image Processor).Vários locais NFRCS foram renderizados em imagens 3D para verificar a uniformidade da superfície.O desvio padrão da pontuação para uma determinada área é definido como a rugosidade da superfície.A equação RMS foi utilizada para quantificar a rugosidade superficial do NFRCS31.
Estudos baseados em FESEM foram realizados usando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tóquio, para entender a morfologia da superfície de Ch NFRCS e Cp NFRCS, que mostraram melhor BCT do que Cm NFRCS.O estudo FESEM foi realizado de acordo com o método descrito por Zhao et al.32 com pequenas modificações.NFRCS 20 a 30 mg de Ch NFRCS e Cp NFRCS foram pré-misturados com 20 µl de citrato de sódio a 3,8% pré-misturado com sangue de rato.20 μl de CaCl2 0,2 ​​M foram adicionados às amostras tratadas com sangue para iniciar a coagulação e as amostras foram incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos.Além disso, o excesso de eritrócitos foi removido da superfície do NFRCS por lavagem com solução salina.
As amostras subsequentes foram tratadas com glutaraldeído a 0,1% e depois secas em estufa de ar quente a 37°C para remover a umidade.As amostras secas foram revestidas e analisadas 32 .Outras imagens obtidas durante a análise foram a formação de coágulos na superfície de fibras de algodão individuais, deposição de polímero entre Ct, morfologia eritrocitária (forma), integridade do coágulo e morfologia eritrocitária na presença de NFRCS.Áreas de NFRCS não tratadas e áreas de NFRCS tratadas com Ch e Cp incubadas com sangue foram escaneadas para íons elementares (sódio, potássio, nitrogênio, cálcio, magnésio, zinco, cobre e selênio)33.Compare as porcentagens de íons elementares entre amostras tratadas e não tratadas para entender o acúmulo de íons elementares durante a formação do coágulo e a homogeneidade do coágulo.
A espessura do revestimento de superfície Cp HFFC na superfície Ct foi determinada usando FESEM.As seções transversais de Cp NFRCS foram cortadas da estrutura e revestidas por pulverização catódica.As amostras resultantes do revestimento por pulverização foram observadas pela FESEM e a espessura do revestimento superficial foi medida 34 , 35 , 36 .
A micro-CT de raios X fornece imagens 3D não destrutivas de alta resolução e permite estudar o arranjo estrutural interno do NFRK.O Micro-CT usa um feixe de raios X que passa pela amostra para registrar o coeficiente de atenuação linear local dos raios X na amostra, o que ajuda a obter informações morfológicas.A localização interna de Ct em Cp NFRCS e Cp NFRCS tratado com sangue foi examinada por micro-CT para entender a eficiência de absorção e a coagulação do sangue na presença de NFRCS37,38,39.As estruturas 3D de amostras de Cp NFRCS tratadas e não tratadas com sangue foram reconstruídas usando micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Alemanha).Usando o software VG STUDIO-MAX versão 2.2, várias imagens de raios X foram tiradas de diferentes ângulos (cobertura ideal de 360°) para desenvolver imagens 3D para NFRCS.Os dados de projeção coletados foram reconstruídos em imagens volumétricas 3D usando o software 3D ScanIP Academic simples correspondente.
Além disso, para entender a distribuição do coágulo, 20 µl de sangue citratado pré-misturado e 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M foram adicionados ao NFRCS para iniciar a coagulação do sangue.As amostras preparadas são deixadas para endurecer.A superfície do NFRK foi tratada com glutaraldeído a 0,5% e seca em estufa de ar quente a 30-40°C por 30 minutos.O coágulo de sangue formado no NFRCS foi escaneado, reconstruído e uma imagem 3D do coágulo de sangue foi visualizada.
Os ensaios antibacterianos foram realizados em Cp NFRCS (melhor em comparação com Ch NFRCS) usando o método descrito anteriormente com pequenas modificações.A atividade antibacteriana de Cp NFRCS e Cp HFFC foi determinada usando três microrganismos de teste diferentes [S.aureus (bactérias gram-positivas), E.coli (bactérias gram-negativas) e Candida branca (C.albicans)] crescendo em ágar em placas de Petri em uma incubadora.Inocular uniformemente 50 ml da suspensão de cultura bacteriana diluída na concentração de 105-106 UFC ml-1 no meio ágar.Despeje o meio em uma placa de Petri e deixe solidificar.Poços foram feitos na superfície da placa de ágar para encher com HFFC (3 poços para HFFC e 1 para controle negativo).Adicione 200 µl de HFFC a 3 poços e 200 µl de pH 7,4 PBS ao quarto poço.Do outro lado da placa de Petri, coloque um disco Cp NFRCS de 12 mm no ágar solidificado e umedeça com PBS (pH 7,4).Os comprimidos de ciprofloxacina, ampicilina e fluconazol são considerados padrões de referência para Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans.Meça a zona de inibição manualmente e tire uma imagem digital da zona de inibição.
Após a aprovação ética institucional, o estudo foi conduzido no Kasturba Medical College of Education and Research em Manipal, Karnataka, no sul da Índia.O protocolo experimental TEG in vitro foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Os indivíduos foram recrutados de doadores de sangue voluntários (de 18 a 55 anos) do banco de sangue do hospital.Além disso, um termo de consentimento informado foi obtido dos voluntários para a coleta de amostras de sangue.O TEG nativo (N-TEG) ​​​​foi usado para estudar o efeito da formulação Cp HFFC no sangue total pré-misturado com citrato de sódio.O N-TEG é amplamente reconhecido por seu papel na ressuscitação no local de atendimento, o que cria problemas para os médicos devido ao potencial de atraso clinicamente significativo nos resultados (testes de coagulação de rotina).A análise de N-TEG foi realizada usando sangue total.O consentimento informado e o histórico médico detalhado foram obtidos de todos os participantes.O estudo não incluiu participantes com complicações hemostáticas ou trombóticas, como gravidez/pós-parto ou doença hepática.Indivíduos que tomam drogas que afetam a cascata de coagulação também foram excluídos do estudo.Testes laboratoriais básicos (hemoglobina, tempo de protrombina, tromboplastina ativada e contagem de plaquetas) foram realizados em todos os participantes de acordo com os procedimentos padrão.O N-TEG determina a viscoelasticidade do coágulo sanguíneo, a estrutura inicial do coágulo, a interação das partículas, o fortalecimento do coágulo e a lise do coágulo.A análise N-TEG fornece dados gráficos e numéricos sobre os efeitos coletivos de vários elementos celulares e plasma.A análise de N-TEG foi realizada em dois volumes diferentes de Cp HFFC (10 µl e 50 µl).Como resultado, 1 ml de sangue total com ácido cítrico foi adicionado a 10 μl de Cp HFFC.Adicione 1 ml (Cp HFFC + sangue citratado), 340 µl de sangue misturado a 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M contendo placa TEG.Posteriormente, as placas TEG foram carregadas no TEG® 5000, US para medir R, K, ângulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% das amostras de sangue na presença de Cp HFFC41.
O protocolo do estudo in vivo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações do Comitê de Controle e Supervisão de Experimentação Animal (CPCSEA).Todos os estudos in vivo de NFRCS (2 × 2 cm2) foram realizados em ratas Wistar (pesando de 200 a 250 g).Todos os animais foram aclimatados a uma temperatura de 24-26°C, os animais tiveram livre acesso a comida padrão e água ad libitum.Todos os animais foram divididos aleatoriamente em diferentes grupos, cada grupo composto por três animais.Todos os estudos foram realizados de acordo com Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Antes do estudo, os animais foram anestesiados por administração intraperitoneal (ip) de uma mistura de 20-50 mg de cetamina (por 1 kg de peso corporal) e 2-10 mg de xilazina (por 1 kg de peso corporal).Após o estudo, o volume de sangramento foi calculado avaliando a diferença entre o peso inicial e final das amostras, o valor médio obtido nos três testes foi considerado o volume de sangramento da amostra.
O modelo de amputação da cauda do rato foi implementado para entender o potencial do NFRCS para modular o sangramento em trauma, combate ou acidente de trânsito (modelo de lesão).Corte 50% da cauda com uma lâmina de bisturi e coloque no ar por 15 s para garantir o sangramento normal.Além disso, as amostras de teste foram colocadas na cauda de um rato aplicando pressão (Ct, Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS).Sangramento e PCT foram relatados para corpos de prova (n = 3)17,45.
A eficácia do controle de pressão NFRCS em combate foi investigada em um modelo da artéria femoral superficial.A artéria femoral é exposta, puncionada com um trocarte 24G e sangrada em 15 segundos.Após a observação de sangramento descontrolado, a amostra de teste é colocada no local da punção com pressão aplicada.Imediatamente após a aplicação da amostra de teste, o tempo de coagulação foi registrado e a eficiência hemostática foi observada pelos próximos 5 minutos.O mesmo procedimento foi repetido com Cs e Ct46.
Dowling e outros.47 propuseram um modelo de lesão hepática para avaliar o potencial hemostático de materiais hemostáticos no contexto de sangramento intraoperatório.BCT foi registrado para amostras Ct (controle negativo), estrutura Cs (controle positivo), amostras Ch NFRCS e amostras Cp NFRCS.A veia cava supra-hepática do rato foi exposta através da realização de uma laparotomia mediana.A seguir, a parte distal do lobo esquerdo foi cortada com tesoura.Faça uma incisão no fígado com uma lâmina de bisturi e deixe sangrar por alguns segundos.Amostras de teste Ch NFRCS e Cp NFRCS pesadas com precisão foram colocadas na superfície danificada sem qualquer pressão positiva e o BCT foi registrado.O grupo controle (Ct) então aplicou pressão seguida de Cs 30s47 sem interromper a lesão.
Ensaios de cicatrização de feridas in vivo foram realizados usando um modelo de ferida excisional para avaliar as propriedades de cicatrização de feridas dos NFRCSs baseados em polímeros desenvolvidos.Modelos de feridas excisionais foram selecionados e executados de acordo com métodos previamente publicados com pequenas modificações19,32,48.Todos os animais foram anestesiados conforme descrito anteriormente.Use um punção de biópsia (12 mm) para fazer uma incisão circular profunda na pele das costas.Os locais das feridas preparadas foram tratados com Cs (controle positivo), Ct (reconhecendo que as almofadas de algodão interferem na cicatrização), Ch NFRCS e Cp NFRCS (grupo experimental) e um controle negativo sem qualquer tratamento.Em cada dia do estudo, a área da ferida foi medida em todos os ratos.Use uma câmera digital para tirar uma foto da área da ferida e coloque um novo curativo.A porcentagem de fechamento da ferida foi medida pela seguinte fórmula:
Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele de rato do melhor grupo foi excisada ((Cp NFRCS) e o grupo controle) e estudada por coloração H&E e coloração com tricrômico de Masson. Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele de rato do melhor grupo foi excisada ((Cp NFRCS) e o grupo controle) e estudada por coloração H&E e coloração com tricrômico de Masson.Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele dos ratos do melhor grupo ((Cp NFRCS) e o grupo controle) foi excisada e examinada por coloração com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色 e Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Os ratos no melhor grupo ((Cp NFRCS) e grupos de controle) foram excisados ​​para coloração com hematoxilina-eosina e coloração com tricrômico de Masson com base na porcentagem de fechamento da ferida no dia 12 do estudo.O procedimento de coloração implementado foi realizado de acordo com métodos previamente descritos49,50.Resumidamente, após fixação em formol a 10%, as amostras foram desidratadas com uma série de álcoois graduados.Use um micrótomo para obter seções finas (5 µm de espessura) do tecido extirpado.Cortes seriados finos de controles e Cp NFRCS foram tratados com hematoxilina e eosina para estudar alterações histopatológicas.A coloração tricrômica de Masson foi usada para detectar a formação de fibrilas de colágeno.Os resultados obtidos foram estudados cegamente por patologistas.
A estabilidade das amostras de Cp NFRCS foi estudada em temperatura ambiente (25°C ± 2°C/60% UR ± 5%) por 12 meses51.Cp NFRCS (descoloração da superfície e crescimento microbiano) foi inspecionado visualmente e testado quanto à resistência ao desgaste por dobras e BCT de acordo com os métodos descritos acima na seção de Materiais e Métodos.
A escalabilidade e reprodutibilidade de Cp NFRCS foi examinada preparando Cp NFRCS com um tamanho de 15 × 15 cm2.Além disso, amostras de 30 mg (n = 5) foram excisadas de várias frações Cp NFRCS e o BCT das amostras estudadas foi avaliado conforme descrito anteriormente na seção Métodos.
Tentamos desenvolver várias formas e estruturas usando composições Cp NFRCS para várias aplicações biomédicas.Tais formas ou configurações incluem zaragatoas cónicas para hemorragias nasais, procedimentos dentários e zaragatoas cilíndricas para hemorragia vaginal.
Todos os conjuntos de dados são expressos como média ± desvio padrão e foram analisados ​​por ANOVA usando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni (*p<0,05).
Todos os procedimentos realizados em estudos humanos estavam de acordo com os padrões do Instituto e do Conselho Nacional de Pesquisa, bem como com a Declaração de Helsinque de 1964 e suas emendas subsequentes, ou padrões éticos semelhantes.Todos os participantes foram informados sobre as características do estudo e seu caráter voluntário.Os dados dos participantes permanecem confidenciais depois de coletados.O protocolo experimental TEG in vitro foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Os voluntários assinaram consentimento informado para coletar amostras de sangue.
Todos os procedimentos realizados em estudos com animais foram realizados de acordo com a Faculdade de Medicina de Kastuba, Instituto Manipal de Ensino Superior, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Todos os experimentos com animais planejados foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Controle e Supervisão de Experimentação Animal (CPCSEA).Todos os autores seguem as diretrizes ARRIVE.
Os espectros de FTIR de todos os NFRCS foram analisados ​​e comparados com o espectro de quitosana mostrado na Figura 2A.Picos espectrais característicos de quitosana (registrados) em 3437 cm-1 (estiramento de OH e NH, sobreposição), 2945 e 2897 cm-1 (estiramento de CH), 1660 cm-1 (estiramento NH2), 1589 cm-1 (flexão N-H), 1157 cm-1 (estiramento da ponte O-), 1067 cm-1 (estiramento C-O, hidroxila secundária), 993 cm-1 ( trecho CO, Bo-OH) 52.53.54.A Tabela Complementar S1 mostra os valores do espectro de absorção FTIR NFRCS para quitosana (repórter), quitosana pura, Cm, Ch e Cp.Os espectros de FTIR de todos os NFRCS (Cm, Ch e Cp) mostraram as mesmas bandas de absorção características da quitosana pura sem quaisquer alterações significativas (Fig. 2A).Os resultados de FTIR confirmaram a ausência de interações químicas ou físicas entre os polímeros usados ​​para desenvolver o NFRCS, indicando que os polímeros usados ​​são inertes.
Caracterização in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs.(A) representa os espectros FTIR combinados das composições de quitosana e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS sob compressão.(B) a) taxa de captação de sangue total de NFRCS Cm, Ch, Cp e Cg (n = 3);As amostras de Ct apresentaram maior BAR porque o cotonete tem maior eficiência de absorção;b) Sangue após absorção sanguínea Ilustração da amostra absorvida.Representação gráfica do BCT da amostra de teste C (Cp NFRCS teve o melhor BCT (15 s, n = 3)). Os dados em C, D, E e G foram apresentados como média ± DP, e as barras de erro representam DP, ***p < 0,0001. Os dados em C, D, E e G foram apresentados como média ± DP, e as barras de erro representam DP, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандар тное отклонение, ***p <0,0001. Os dados em C, D, E e G são apresentados como média ± desvio padrão, e as barras de erro representam o desvio padrão, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют с тандартное отклонение, ***p <0,0001. Os dados em C, D, E e G são apresentados como média ± desvio padrão, as barras de erro representam o desvio padrão, ***p<0,0001.