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A fertilidade das aves depende de sua capacidade de armazenar espermatozoides viáveis ​​em quantidade suficiente por um longo período nos túbulos de armazenamento de espermatozoides (TSS). O mecanismo exato pelo qual os espermatozoides entram, residem e saem dos TSS permanece controverso. O esperma de galinhas sharkasi apresentou alta tendência à aglutinação, formando feixes filamentosos móveis contendo muitas células. Devido à dificuldade de observar a motilidade e o comportamento dos espermatozoides em uma trompa de Falópio opaca, utilizamos um dispositivo microfluídico com seção transversal de microcanais semelhante à dos espermatozoides para estudar a aglutinação e a motilidade dos espermatozoides. Este estudo discute como os feixes de espermatozoides se formam, como se movem e seu possível papel na extensão da residência dos espermatozoides nos TSS. Investigamos a velocidade e o comportamento reológico dos espermatozoides quando o fluxo de fluido foi gerado dentro de um canal microfluídico por pressão hidrostática (vazão = 33 µm/s). Os espermatozoides tendem a nadar contra a corrente (reologia positiva) e a velocidade do feixe de espermatozoides é significativamente reduzida em comparação com a de espermatozoides isolados. Observou-se que os feixes de espermatozoides se movem em espiral e aumentam em comprimento e espessura à medida que mais espermatozoides isolados são recrutados. Feixes de esperma foram observados se aproximando e aderindo às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem varridos com velocidade de fluxo de fluido > 33 µm/s. Feixes de esperma foram observados se aproximando e aderindo às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem varridos com velocidade de fluxo de fluido > 33 µm/s. Bem, isso é o que os espermatozoides usam para fornecer e usar canais de microfone, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Foi observado que feixes de espermatozoides se aproximam e aderem às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem arrastados em taxas de fluxo de fluido >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Bem, isso é o que os espermatozoides usam para fornecer e usar o canal de microfone, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Foi observado que feixes de espermatozoides se aproximam e aderem às paredes laterais do canal microfluídico para evitar serem arrastados pelo fluxo de fluido a >33 µm/s.A microscopia eletrônica de varredura e transmissão revelou que os feixes de espermatozoides eram sustentados por material denso e abundante. Os dados obtidos demonstram a mobilidade única dos espermatozoides da galinha Sharkazi, bem como a capacidade dos espermatozoides de se aglutinarem e formarem feixes móveis, o que contribui para uma melhor compreensão do armazenamento a longo prazo dos espermatozoides na SMT.
Para atingir a fertilização em humanos e na maioria dos animais, o espermatozoide e os óvulos devem chegar ao local da fertilização no momento certo. Portanto, o acasalamento deve ocorrer antes ou no momento da ovulação. Por outro lado, alguns mamíferos, como cães, bem como espécies não mamíferas, como insetos, peixes, répteis e aves, armazenam espermatozoides em seus órgãos reprodutivos por um longo período de tempo até que seus óvulos estejam prontos para a fertilização (fertilização assíncrona 1 ). As aves são capazes de manter a viabilidade dos espermatozoides capazes de fertilizar os óvulos por 2 a 10 semanas 2 .
Esta é uma característica única que distingue as aves de outros animais, pois proporciona uma alta probabilidade de fertilização após uma única inseminação por várias semanas, sem acasalamento e ovulação simultâneos. O principal órgão de armazenamento de espermatozoides, denominado túbulo de armazenamento de espermatozoides (TSS), está localizado nas pregas da mucosa interna na junção útero-vaginal. Até o momento, os mecanismos pelos quais os espermatozoides entram, permanecem e saem do banco de espermatozoides não são totalmente compreendidos. Com base em estudos anteriores, muitas hipóteses foram levantadas, mas nenhuma delas foi confirmada.
Forman4 levantou a hipótese de que os espermatozoides mantêm sua residência na cavidade do SST por meio de movimento oscilatório contínuo contra a direção do fluxo de fluido através de canais proteicos localizados nas células epiteliais do SST (reologia). O ATP é esgotado devido à constante atividade flagelar necessária para manter os espermatozoides no lúmen do SST e a motilidade eventualmente declina até que os espermatozoides sejam transportados para fora do banco de espermatozoides pelo fluxo de fluido e iniciem uma nova jornada pela trompa de Falópio ascendente para fertilizar o espermatozoide. Óvulo (Forman4). Este modelo de armazenamento de espermatozoides é apoiado pela detecção por imunocitoquímica das aquaporinas 2, 3 e 9 presentes nas células epiteliais do SST. Até o momento, faltam estudos sobre a reologia do sêmen de galinha e seu papel no armazenamento do SST, seleção vaginal de espermatozoides e competição espermática. Em galinhas, o esperma entra na vagina após o acasalamento natural, mas mais de 80% dos espermatozoides são ejetados da vagina logo após o acasalamento. Isso sugere que a vagina é o principal local para a seleção de espermatozoides em aves. Além disso, foi relatado que menos de 1% dos espermatozoides fertilizados na vagina acabam em SSTs2. Na inseminação artificial de pintinhos na vagina, o número de espermatozoides que chegam ao SST tende a aumentar 24 horas após a inseminação. Até o momento, o mecanismo de seleção de espermatozoides durante esse processo não está claro, e a motilidade espermática pode desempenhar um papel importante na captação de espermatozoides pelo SST. Devido às paredes espessas e opacas das trompas de Falópio, é difícil monitorar diretamente a motilidade espermática nas trompas de Falópio das aves. Portanto, não temos conhecimento básico de como os espermatozoides fazem a transição para o SST após a fertilização.
A reologia foi recentemente reconhecida como um fator importante no controle do transporte de espermatozoides na genitália de mamíferos. Com base na capacidade dos espermatozoides móveis de migrarem em contracorrente, Zaferani et al. 8 utilizaram um sistema microfluídico Corra para isolar passivamente espermatozoides móveis de amostras de sêmen confinadas. Esse tipo de triagem de sêmen é essencial para o tratamento médico da infertilidade e para a pesquisa clínica, sendo preferível aos métodos tradicionais, que exigem tempo e trabalho intensivos e podem comprometer a morfologia e a integridade estrutural dos espermatozoides. No entanto, até o momento, não foram realizados estudos sobre o efeito das secreções dos órgãos genitais de galinhas na motilidade espermática.
Independentemente do mecanismo que mantém os espermatozoides armazenados no SST, muitos pesquisadores observaram que os espermatozoides residentes se aglutinam cabeça a cabeça no SST de galinhas 9, 10, codornas 2 e perus 11, formando feixes de espermatozoides aglutinados. Os autores sugerem que existe uma ligação entre essa aglutinação e o armazenamento a longo prazo de espermatozoides no SST.
Tingari e Lake12 relataram uma forte associação entre espermatozoides na glândula receptora de espermatozoides da galinha e questionaram se os espermatozoides aviários aglutinam da mesma forma que os espermatozoides de mamíferos. Eles acreditam que as conexões profundas entre os espermatozoides no ducto deferente podem ser devidas ao estresse causado pela presença de um grande número de espermatozoides em um espaço pequeno.
Ao avaliar o comportamento dos espermatozoides em lâminas de vidro frescas, sinais transitórios de aglutinação podem ser observados, especialmente nas bordas das gotículas de sêmen. No entanto, a aglutinação foi frequentemente perturbada pela ação rotacional associada ao movimento contínuo, o que explica a natureza transitória desse fenômeno. Os pesquisadores também notaram que, quando o diluente foi adicionado ao sêmen, surgiram agregados celulares alongados, semelhantes a fios.
As primeiras tentativas de imitar um espermatozoide foram feitas removendo um fio fino de uma gota pendurada, o que resultou em uma vesícula alongada semelhante a um espermatozoide projetando-se da gota de sêmen. Os espermatozoides imediatamente se alinharam de forma paralela dentro da vesícula, mas a unidade inteira desapareceu rapidamente devido à limitação tridimensional. Portanto, para estudar a aglutinação de espermatozoides, é necessário observar a motilidade e o comportamento dos espermatozoides diretamente em túbulos isolados de armazenamento de espermatozoides, o que é difícil de conseguir. Portanto, é necessário desenvolver um instrumento que imite os espermatozoides para dar suporte aos estudos de motilidade espermática e comportamento de aglutinação. Brillard et al. relataram que o comprimento médio dos túbulos de armazenamento de espermatozoides em pintinhos adultos é de 400–600 µm, mas alguns SSTs podem ter até 2000 µm. Mero e Ogasawara14 dividiram as glândulas seminíferas em túbulos de armazenamento de espermatozoides aumentados e não aumentados, ambos com o mesmo comprimento (~500 µm) e largura do colo (~38 µm), mas o diâmetro médio do lúmen dos túbulos foi de 56,6 e 56,6 µm, respectivamente, 11,2 µm. No estudo atual, usamos um dispositivo microfluídico com um tamanho de canal de 200 µm × 20 µm (L × A), cuja seção transversal é um pouco próxima à do SST amplificado. Além disso, examinamos a motilidade dos espermatozoides e o comportamento de aglutinação no fluido em fluxo, o que é consistente com a hipótese de Foreman de que o fluido produzido pelas células epiteliais do SST mantém os espermatozoides no lúmen em uma direção contracorrente (reológica).
O objetivo deste estudo foi superar os problemas de observação da motilidade dos espermatozoides na trompa de Falópio e evitar as dificuldades de estudar a reologia e o comportamento dos espermatozoides em um ambiente dinâmico. Foi utilizado um dispositivo microfluídico que cria pressão hidrostática para simular a motilidade dos espermatozoides nos genitais de uma galinha.
Quando uma gota de uma amostra diluída de espermatozoides (1:40) foi inserida no dispositivo de microcanais, dois tipos de motilidade espermática puderam ser identificados (espermatozoides isolados e espermatozoides ligados). Além disso, os espermatozoides tenderam a nadar contra a corrente (reologia positiva; vídeo 1, 2). Embora os feixes de espermatozoides tenham apresentado velocidade menor que a dos espermatozoides solitários (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides apresentando reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2). Embora os feixes de espermatozoides tenham apresentado velocidade menor que a dos espermatozoides solitários (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides apresentando reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; tabela 2). Embora os feixes de espermatozoides tenham apresentado velocidade menor que a dos espermatozoides isolados (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides apresentando reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） A pontuação dos espermatozóides é pequena, o que significa que os espermatozoides são ótimos (p < 0,001), o que é positivo процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; tabela 2). Embora a velocidade dos feixes de espermatozoides tenha sido menor que a dos espermatozoides individuais (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides com reologia positiva (p < 0,001; Tabela 2).A reologia positiva para espermatozoides únicos e tufos é estimada em aproximadamente 53% e 85%, respectivamente.
Observou-se que os espermatozoides de galinhas Sharkasi formam feixes lineares, compostos por dezenas de indivíduos, imediatamente após a ejaculação. Esses tufos aumentam de comprimento e espessura ao longo do tempo e podem permanecer in vitro por várias horas antes de se dissiparem (vídeo 3). Esses feixes filamentosos têm o formato de espermatozoides de equidna que se formam na extremidade do epidídimo. Foi descoberto que o sêmen de galinhas Sharkasi tem alta tendência a se aglutinar e formar um feixe reticulado em menos de um minuto após a coleta. Esses feixes são dinâmicos e capazes de aderir a quaisquer paredes próximas ou objetos estáticos. Embora os feixes de espermatozoides reduzam a velocidade das células espermáticas, é evidente que, macroscopicamente, eles aumentam sua linearidade. O comprimento dos feixes varia dependendo do número de espermatozoides coletados nos feixes. Duas partes do feixe foram isoladas: a parte inicial, incluindo a cabeça livre do espermatozoide aglutinado, e a parte terminal, incluindo a cauda e toda a extremidade distal do espermatozoide. Utilizando uma câmera de alta velocidade (950 fps), cabeças livres de espermatozoides aglutinados foram observadas na parte inicial do feixe, responsáveis ​​pelo movimento do feixe devido ao seu movimento oscilatório, arrastando os restantes para dentro do feixe com um movimento helicoidal (Vídeo 4). No entanto, em tufos longos, observou-se que algumas cabeças livres de espermatozoides aderiam ao corpo e a porção terminal do tufo atuava como palhetas para ajudar a impulsionar o tufo.
Enquanto em um fluxo lento de fluido, os feixes de espermatozoides se movem paralelamente uns aos outros, no entanto, eles começam a se sobrepor e grudar em tudo o que está parado, para não serem arrastados pela correnteza à medida que a velocidade aumenta. Os feixes se formam quando um punhado de espermatozoides se aproxima, começam a se mover em sincronia e se enrolam, aderindo a uma substância pegajosa. As Figuras 1 e 2 mostram como os espermatozoides se aproximam, formando uma junção à medida que as caudas se enrolam.
Os pesquisadores aplicaram pressão hidrostática para criar um fluxo de fluido em um microcanal para estudar a reologia dos espermatozoides. Foi utilizado um microcanal com dimensões de 200 µm × 20 µm (L × A) e comprimento de 3,6 µm. Utilizaram-se microcanais entre recipientes com seringas encaixadas nas extremidades. Corante alimentício foi utilizado para tornar os canais mais visíveis.
Prenda os cabos de interconexão e acessórios à parede. O vídeo foi gravado com um microscópio de contraste de fase. Com cada imagem, são apresentadas imagens de microscopia de contraste de fase e mapeamento. (A) A conexão entre dois fluxos resiste ao fluxo devido ao movimento helicoidal (seta vermelha). (B) A conexão entre o feixe tubular e a parede do canal (setas vermelhas), ao mesmo tempo em que estão conectados a dois outros feixes (setas amarelas). (C) Os feixes de espermatozoides no canal microfluídico começam a se conectar (setas vermelhas), formando uma malha de feixes de espermatozoides. (D) Formação de uma rede de feixes de espermatozoides.
Quando uma gota de espermatozoide diluído foi carregada no dispositivo microfluídico e um fluxo foi criado, observou-se que o feixe de espermatozoides se movia na direção contrária ao fluxo. Os feixes se encaixam perfeitamente nas paredes dos microcanais, e as cabeças livres na parte inicial dos feixes se encaixam perfeitamente nelas (vídeo 5). Eles também aderem a quaisquer partículas estacionárias em seu caminho, como detritos, para resistir à correnteza. Com o tempo, esses tufos se transformam em longos filamentos, aprisionando outros espermatozoides isolados e tufos mais curtos (Vídeo 6). À medida que o fluxo começa a diminuir, longas fileiras de espermatozoides começam a formar uma rede de fileiras de espermatozoides (Vídeo 7; Figura 2).
Em altas velocidades de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos espirais dos fios são aumentados como uma tentativa de capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes que resistem melhor à força de deriva do fluxo. Em altas velocidades de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos espirais dos fios são aumentados como uma tentativa de capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes que resistem melhor à força de deriva do fluxo. Para uma maior velocidade (V > 33 мкм/s) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Em altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos helicoidais dos filamentos aumentam à medida que eles tentam capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes que são mais capazes de resistir à força de deriva do fluxo.Velocidade máxima(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子, 从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 , 从而 更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 Quando a quantidade de água for maior (V > 33 мкм/s) множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Em altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), o movimento helicoidal dos filamentos aumenta na tentativa de capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes para resistir melhor às forças de deriva do fluxo.Eles também tentaram anexar microcanais nas paredes laterais.
Feixes de espermatozoides foram identificados como aglomerados de cabeças de espermatozoides e caudas enroladas usando microscopia óptica (ML). Feixes de espermatozoides com vários agregados também foram identificados como cabeças torcidas e agregados flagelares, múltiplas caudas de espermatozoides fundidas, cabeças de espermatozoides presas a uma cauda e cabeças de espermatozoides com núcleos curvados como múltiplos núcleos fundidos. microscopia eletrônica de transmissão (MET). A microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou que os feixes de espermatozoides eram agregados revestidos de cabeças de espermatozoides e os agregados de espermatozoides apresentavam uma rede anexa de caudas enroladas.
A morfologia e a ultraestrutura dos espermatozoides, a formação de feixes de espermatozoides foram estudadas usando microscopia de luz (meia seção), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET), esfregaços de esperma foram corados com laranja de acridina e examinados usando microscopia de epifluorescência.
A coloração do esfregaço de esperma com laranja de acridina (Fig. 3B) mostrou que as cabeças dos espermatozoides estavam coladas e cobertas por material secretor, o que levou à formação de grandes tufos (Fig. 3D). Os feixes de espermatozoides consistiam em agregados de espermatozoides com uma rede de caudas aderidas (Fig. 4A-C). Os feixes de espermatozoides são compostos pelas caudas de muitos espermatozoides coladas (Fig. 4D). Secreções (Fig. 4E, F) cobriam as cabeças dos feixes de espermatozoides.
Formação do feixe de espermatozoides Usando microscopia de contraste de fase e esfregaços de esperma corados com laranja de acridina, mostrou que as cabeças dos espermatozoides se unem. (A) A formação inicial do tufo de espermatozoides começa com um espermatozoide (círculo branco) e três espermatozoides (círculo amarelo), com a espiral começando na cauda e terminando na cabeça. (B) Fotomicrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando cabeças de espermatozoides aderentes (setas). A secreção cobre a(s) cabeça(s). Ampliação × 1000. (C) Desenvolvimento de um grande feixe transportado por fluxo em um canal microfluídico (usando uma câmera de alta velocidade a 950 fps). (D) Micrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando grandes tufos (setas). Ampliação: × 200.
Micrografia eletrônica de varredura de um feixe de espermatozoides e um esfregaço de esperma corados com laranja de acridina. (A, B, D, E) são micrografias eletrônicas de varredura coloridas digitais de espermatozoides, e C e F são micrografias de esfregaços de esperma corados com laranja de acridina mostrando a fixação de múltiplos espermatozoides envolvendo a membrana caudal. (AC) Agregados de espermatozoides são mostrados como uma rede de caudas aderidas (setas). (D) Adesão de vários espermatozoides (com substância adesiva, contorno rosa, seta) envolvendo a cauda. (E e F) Agregados da cabeça do espermatozoide (ponteiros) cobertos com material adesivo (ponteiros). Os espermatozoides formaram feixes com várias estruturas semelhantes a vórtices (F). (C) Ampliações de ×400 e (F) de ×200.
Utilizando microscopia eletrônica de transmissão, constatamos que os feixes de espermatozoides apresentavam caudas aderidas (Fig. 6A, C), cabeças aderidas às caudas (Fig. 6B) ou cabeças aderidas às caudas (Fig. 6D). As cabeças dos espermatozoides no feixe são curvas, apresentando em corte duas regiões nucleares (Fig. 6D). Na incisão do feixe, os espermatozoides apresentavam uma cabeça torcida com duas regiões nucleares e múltiplas regiões flagelares (Fig. 5A).
Micrografia eletrônica digital colorida mostrando as caudas de conexão no feixe espermático e o material aglutinante conectando as cabeças espermáticas. (A) Cauda aderida de um grande número de espermatozoides. Observe a aparência da cauda tanto na projeção retrato (seta) quanto na horizontal (seta). (B) A cabeça (seta) do espermatozoide está conectada à cauda (seta). (C) Várias caudas espermáticas (setas) estão aderidas. (D) Material de aglutinação (AS, azul) conecta quatro cabeças espermáticas (roxa).
A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para detectar cabeças espermáticas em feixes espermáticos cobertos por secreções ou membranas (Figura 6B), indicando que os feixes espermáticos estavam ancorados por material extracelular. O material aglutinado concentrou-se na cabeça espermática (conjunto semelhante a uma cabeça de água-viva; Figura 5B) e expandiu-se distalmente, apresentando uma aparência amarelo-brilhante à microscopia de fluorescência quando corado com laranja de acridina (Figura 6C). Essa substância é claramente visível ao microscópio de varredura e é considerada um ligante. Cortes semifinos (Figura 5C) e esfregaços espermáticos corados com laranja de acridina mostraram feixes espermáticos contendo cabeças densamente compactadas e caudas enroladas (Figura 5D).
Várias fotomicrografias mostrando agregação de cabeças de espermatozoides e caudas dobradas usando vários métodos. (A) Micrografia eletrônica de transmissão digital colorida em corte transversal de um feixe de espermatozoides mostrando uma cabeça de espermatozoide enrolada com um núcleo de duas partes (azul) e várias partes flagelares (verde). (B) Micrografia eletrônica de varredura colorida digital mostrando um aglomerado de cabeças de espermatozoides semelhantes a águas-vivas (setas) que parecem estar cobertas. (C) Seção semifina mostrando cabeças de espermatozoides agregadas (setas) e caudas enroladas (setas). (D) Micrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando agregados de cabeças de espermatozoides (setas) e caudas aderentes enroladas (setas). Observe que uma substância pegajosa (S) cobre a cabeça do espermatozoide. (D) Ampliação de × 1000.
Usando microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 7A), também foi observado que as cabeças dos espermatozoides eram torcidas e os núcleos tinham formato espiral, conforme confirmado por esfregaços de esperma corados com laranja de acridina e examinados usando microscopia de fluorescência (Fig. 7B).
(A) Micrografia eletrônica de transmissão colorida digital e (B) Esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando cabeças enroladas e fixação de cabeças e caudas de espermatozoides (setas). (B) Ampliação de × 1000.
Uma descoberta interessante é que os espermatozoides de Sharkazi se agregam para formar feixes filamentosos móveis. As propriedades desses feixes nos permitem compreender seu possível papel na absorção e armazenamento de espermatozoides no SST.
Após o acasalamento, os espermatozoides entram na vagina e passam por um intenso processo de seleção, resultando na entrada de apenas um número limitado de espermatozoides no SST15,16. Até o momento, os mecanismos pelos quais os espermatozoides entram e saem do SST não são claros. Em aves, os espermatozoides são armazenados no SST por um período prolongado de 2 a 10 semanas, dependendo da espécie6. Ainda há controvérsia sobre a condição do sêmen durante o armazenamento no SST. Eles estão em movimento ou em repouso? Em outras palavras, como os espermatozoides mantêm sua posição no SST por tanto tempo?
Forman4 sugeriu que a residência e a ejeção do SST poderiam ser explicadas em termos de motilidade espermática. Os autores levantam a hipótese de que os espermatozoides mantêm sua posição nadando contra o fluxo de fluido criado pelo epitélio do SST e que os espermatozoides são ejetados do SST quando sua velocidade cai abaixo do ponto em que começam a se mover para trás devido à falta de energia. Zaniboni5 confirmou a presença de aquaporinas 2, 3 e 9 na porção apical das células epiteliais do SST, o que pode indiretamente apoiar o modelo de armazenamento de espermatozoides de Foreman. No estudo atual, descobrimos que quase metade dos espermatozoides de Sharkashi apresentam reologia positiva no fluido em fluxo, e que feixes de espermatozoides aglutinados aumentam o número de espermatozoides com reologia positiva, embora a aglutinação os retarde. Como os espermatozoides viajam pela trompa de Falópio da ave até o local da fertilização não é totalmente compreendido. Em mamíferos, o fluido folicular quimioatrai os espermatozoides. No entanto, acredita-se que os quimioatraentes direcionam os espermatozoides a se aproximarem de longas distâncias7. Portanto, outros mecanismos são responsáveis ​​pelo transporte de espermatozoides. A capacidade do esperma de se orientar e fluir contra o fluido da trompa de Falópio liberado após o acasalamento foi relatada como um fator importante no direcionamento do esperma em camundongos. Parker 17 sugeriu que os espermatozoides cruzam os ovidutos nadando contra a corrente ciliar em pássaros e répteis. Embora não tenha sido demonstrado experimentalmente em pássaros, Adolphi 18 foi o primeiro a descobrir que o esperma aviário dá resultados positivos quando uma fina camada de líquido entre uma lamínula e uma lâmina é criada com uma tira de papel de filtro. Reologia. Hino e Yanagimachi [19] colocaram um complexo ovário-tuba-uterino de camundongo em um anel de perfusão e injetaram 1 µl de tinta no istmo para visualizar o fluxo de fluido nas trompas de Falópio. Eles notaram um movimento muito ativo de contração e relaxamento na trompa de Falópio, no qual todas as bolas de tinta se moviam constantemente em direção à ampola da trompa de Falópio. Os autores enfatizam a importância do fluxo de fluido tubário das trompas de Falópio inferiores para as superiores para a elevação do esperma e a fertilização. Brillard20 relatou que, em galinhas e perus, os espermatozoides migram por movimento ativo da entrada vaginal, onde são armazenados, para a junção útero-vaginal, onde são armazenados. No entanto, esse movimento não é necessário entre a junção útero-vaginal e o infundíbulo, pois os espermatozoides são transportados por deslocamento passivo. Conhecendo essas recomendações anteriores e os resultados obtidos no estudo atual, pode-se presumir que a capacidade dos espermatozoides de se moverem a montante (reologia) é uma das propriedades nas quais se baseia o processo de seleção. Isso determina a passagem dos espermatozoides pela vagina e sua entrada no CCT para armazenamento. Como Forman4 sugeriu, isso também pode facilitar o processo de entrada dos espermatozoides no SST e seu habitat por um período de tempo e depois sua saída quando sua velocidade começa a diminuir.
Por outro lado, Matsuzaki e Sasanami 21 sugeriram que os espermatozoides aviários sofrem alterações de motilidade, da dormência à motilidade, nos tratos reprodutivos masculino e feminino. A inibição da motilidade dos espermatozoides residentes no SST foi proposta para explicar o longo tempo de armazenamento dos espermatozoides e seu posterior rejuvenescimento após a saída do SST. Em condições hipóxicas, Matsuzaki et al. 1 relataram alta produção e liberação de lactato no SST, o que pode levar à inibição da motilidade dos espermatozoides residentes. Nesse caso, a importância da reologia espermática se reflete na seleção e absorção dos espermatozoides, e não em seu armazenamento.
O padrão de aglutinação espermática é considerado uma explicação plausível para o longo período de armazenamento de espermatozoides no SST, pois este é um padrão comum de retenção de espermatozoides em aves2,22,23. Bakst et al. 2 observaram que a maioria dos espermatozoides aderiu uns aos outros, formando agregados fasciculares, e espermatozoides únicos raramente foram encontrados no CCM de codornas. Por outro lado, Wen et al. 24 observaram espermatozoides mais dispersos e menos tufos de espermatozoides no lúmen do SST em galinhas. Com base nessas observações, pode-se presumir que a propensão à aglutinação espermática difere entre as aves e entre os espermatozoides no mesmo ejaculado. Além disso, Van Krey et al. 9 sugeriram que a dissociação aleatória de espermatozoides aglutinados é responsável pela penetração gradual de espermatozoides no lúmen da trompa de Falópio. De acordo com essa hipótese, os espermatozoides com menor capacidade de aglutinação devem ser expelidos do SST primeiro. Nesse contexto, a capacidade dos espermatozoides de se aglutinarem pode ser um fator que influencia o resultado da competição espermática em aves sujas. Além disso, quanto mais tempo o espermatozoide aglutinado se dissocia, mais tempo a fertilidade é mantida.
Embora a agregação de espermatozoides e a agregação em feixes tenham sido observadas em vários estudos2,22,24, elas não foram descritas em detalhes devido à complexidade de sua observação cinemática dentro do SST. Várias tentativas foram feitas para estudar a aglutinação de espermatozoides in vitro. Agregação extensa, porém transitória, foi observada quando o fio fino foi removido da gota de semente pendurada. Isso leva ao fato de que uma bolha alongada se projeta da gota, imitando a glândula seminal. Devido às limitações 3D e aos curtos tempos de secagem por gotejamento, todo o bloco rapidamente caiu em desuso9. No estudo atual, usando galinhas Sharkashi e chips microfluídicos, fomos capazes de descrever como esses tufos se formam e como eles se movem. Os feixes de espermatozoides se formaram imediatamente após a coleta do sêmen e foram encontrados se movendo em espiral, mostrando reologia positiva quando presentes no fluxo. Além disso, quando visualizados macroscopicamente, observou-se que os feixes de espermatozoides aumentam a linearidade da motilidade em comparação com espermatozoides isolados. Isso sugere que a aglutinação espermática pode ocorrer antes da penetração do SST e que a produção de espermatozoides não se limita a uma pequena área devido ao estresse, como sugerido anteriormente (Tingari e Lake12). Durante a formação do tufo, os espermatozoides nadam em sincronia até formarem uma junção, então suas caudas se enrolam e a cabeça do espermatozoide permanece livre, mas a cauda e a parte distal do espermatozoide se unem com uma substância pegajosa. Portanto, a cabeça livre do ligamento é responsável pelo movimento, arrastando o restante do ligamento. A microscopia eletrônica de varredura dos feixes de espermatozoides mostrou cabeças de espermatozoides aderidas cobertas com muito material pegajoso, sugerindo que as cabeças de espermatozoides estavam presas em feixes de repouso, o que pode ter ocorrido após atingir o local de armazenamento (SST).
Quando um esfregaço de esperma é corado com laranja de acridina, o material adesivo extracelular ao redor dos espermatozoides pode ser visto em um microscópio de fluorescência. Essa substância permite que os feixes de espermatozoides adiram e se fixem em quaisquer superfícies ou partículas circundantes, impedindo que se desloquem com o fluxo circundante. Assim, nossas observações demonstram o papel da adesão dos espermatozoides na forma de feixes móveis. Sua capacidade de nadar contra a corrente e aderir às superfícies próximas permite que os espermatozoides permaneçam por mais tempo no SST.
Rothschild25 utilizou uma câmera de hemocitometria para estudar a distribuição flutuante do sêmen bovino em uma gota de suspensão, obtendo fotomicrografias através de uma câmera com eixo óptico vertical e horizontal do microscópio. Os resultados mostraram que os espermatozoides foram atraídos para a superfície da câmara. Os autores sugerem que pode haver interações hidrodinâmicas entre o espermatozoide e a superfície. Levando isso em consideração, juntamente com a capacidade do sêmen do pintinho Sharkashi de formar tufos pegajosos, pode-se aumentar a probabilidade de o sêmen aderir à parede do SST e ser armazenado por longos períodos.
Bccetti e Afzeliu26 relataram que o glicocálice do espermatozoide é necessário para o reconhecimento e aglutinação dos gametas. Forman10 observou que a hidrólise de ligações α-glicosídicas em revestimentos de glicoproteína-glicolipídios pelo tratamento do sêmen aviário com neuraminidase resultou em fertilidade reduzida sem afetar a motilidade dos espermatozoides. Os autores sugerem que o efeito da neuraminidase no glicocálice prejudica o sequestro de espermatozoides na junção útero-vaginal, reduzindo assim a fertilidade. Suas observações não podem ignorar a possibilidade de que o tratamento com neuraminidase possa reduzir o reconhecimento de espermatozoides e ovócitos. Forman e Engel10 descobriram que a fertilidade foi reduzida quando as galinhas foram inseminadas intravaginalmente com sêmen tratado com neuraminidase. No entanto, a fertilização in vitro com espermatozoides tratados com neuraminidase não afetou a fertilidade em comparação com as galinhas controle. Os autores concluíram que alterações no revestimento glicoproteico-glicolipídico ao redor da membrana do espermatozoide reduziram a capacidade do esperma de fertilizar ao prejudicar o sequestro de espermatozoides na junção útero-vaginal, o que por sua vez aumentou a perda de espermatozoides devido à velocidade da junção útero-vaginal, mas não afetou o reconhecimento do espermatozoide e do óvulo.
Em perus, Bakst e Bauchan 11 encontraram pequenas vesículas e fragmentos de membrana no lúmen do SST e observaram que alguns desses grânulos haviam se fundido com a membrana do espermatozoide. Os autores sugerem que essas relações podem contribuir para o armazenamento de longo prazo de espermatozoides no SST. No entanto, os pesquisadores não especificaram a fonte dessas partículas, se são secretadas por células epiteliais do CCT, produzidas e secretadas pelo sistema reprodutor masculino ou produzidas pelo próprio espermatozoide. Além disso, essas partículas são responsáveis ​​pela aglutinação. Grützner et al 27 relataram que as células epiteliais do epidídimo produzem e secretam uma proteína específica necessária para a formação de tratos seminais de poro único. Os autores também relatam que a dispersão desses feixes depende da interação de proteínas epididimais. Nixon et al 28 descobriram que os anexos secretam uma proteína, a osteonectina ácida rica em cisteína; O SPARC está envolvido na formação de tufos de esperma em equidnas de bico curto e ornitorrincos. A dispersão desses feixes está associada à perda dessa proteína.
No estudo atual, a análise ultraestrutural usando microscopia eletrônica mostrou que os espermatozoides aderiram a uma grande quantidade de material denso. Acredita-se que essas substâncias sejam responsáveis ​​pela aglutinação que se condensa entre e ao redor das cabeças aderentes, mas em concentrações mais baixas na região da cauda. Presumimos que essa substância aglutinante seja excretada do sistema reprodutor masculino (epidídimo ou ducto deferente) junto com o sêmen, uma vez que frequentemente observamos o sêmen se separando da linfa e do plasma seminal durante a ejaculação. Foi relatado que, à medida que os espermatozoides aviários passam pelo epidídimo e pelo ducto deferente, eles passam por mudanças relacionadas à maturação que sustentam sua capacidade de se ligar a proteínas e adquirir glicoproteínas associadas ao lema plasmático. A persistência dessas proteínas nas membranas espermáticas residentes no SST sugere que essas proteínas podem influenciar a aquisição da estabilidade da membrana espermática 30 e determinar sua fertilidade 31 . Ahammad et al32 relataram que os espermatozoides obtidos de várias partes do sistema reprodutor masculino (dos testículos ao ducto deferente distal) apresentaram aumento progressivo na viabilidade em condições de armazenamento líquido, independentemente da temperatura de armazenamento, e a viabilidade em galinhas também aumenta nas trompas de Falópio após a inseminação artificial.
Os tufos de espermatozoides da galinha Sharkashi têm características e funções diferentes das de outras espécies, como equidnas, ornitorrincos, camundongos selvagens, ratos-cervos e porquinhos-da-índia. Em galinhas Sharkasi, a formação de feixes de espermatozoides reduziu sua velocidade de natação em comparação com espermatozoides únicos. No entanto, esses feixes aumentaram a porcentagem de espermatozoides reologicamente positivos e aumentaram a capacidade dos espermatozoides de se estabilizarem em um ambiente dinâmico. Assim, nossos resultados confirmam a sugestão anterior de que a aglutinação espermática em SST está associada ao armazenamento de espermatozoides a longo prazo. Também levantamos a hipótese de que a propensão dos espermatozoides a formar tufos pode controlar a taxa de perda de espermatozoides em SST, o que pode alterar o resultado da competição espermática. De acordo com essa suposição, espermatozoides com baixa capacidade de aglutinação liberam SST primeiro, enquanto espermatozoides com alta capacidade de aglutinação produzem a maior parte da prole. A formação de feixes de espermatozoides de poro único é benéfica e afeta a proporção pai-filho, mas usa um mecanismo diferente. Em equidnas e ornitorrincos, os espermatozoides estão dispostos paralelamente uns aos outros para aumentar a velocidade de avanço do feixe. Grupos de equidnas se movem cerca de três vezes mais rápido do que espermatozoides isolados. Acredita-se que a formação desses tufos de espermatozoides em equidnas seja uma adaptação evolutiva para manter a dominância, visto que as fêmeas são promíscuas e geralmente acasalam com vários machos. Portanto, espermatozoides de diferentes ejaculados competem ferozmente pela fertilização do óvulo.
Espermatozoides aglutinados de galinhas sharkasi são fáceis de visualizar usando microscopia de contraste de fase, o que é considerado vantajoso porque permite o estudo fácil do comportamento dos espermatozoides in vitro. O mecanismo pelo qual a formação de tufos de esperma promove a reprodução em galinhas sharkasi também é diferente daquele observado em alguns mamíferos placentários que representam comportamento cooperativo de espermatozoides, como camundongos selvagens, onde alguns espermatozoides alcançam os óvulos, ajudando outros indivíduos relacionados a alcançar e danificar seus óvulos. para provar a si mesmo. comportamento altruísta. Autofecundação 34. Outro exemplo de comportamento cooperativo em espermatozoides foi encontrado em camundongos-cervos, onde os espermatozoides foram capazes de identificar e combinar-se com os espermatozoides mais geneticamente relacionados e formar grupos cooperativos para aumentar sua velocidade em comparação com espermatozoides não relacionados 35.
Os resultados obtidos neste estudo não contradizem a teoria de Foman sobre o armazenamento a longo prazo de espermatozoides em SWS. Os pesquisadores relatam que os espermatozoides continuam a se mover no fluxo de células epiteliais que revestem o SST por um longo período de tempo e, após um certo período, os estoques de energia dos espermatozoides se esgotam, resultando em uma diminuição na velocidade, o que permite a expulsão de substâncias de baixo peso molecular. energia dos espermatozoides com o fluxo de fluido do lúmen do SST da cavidade da trompa de Falópio. No estudo atual, observamos que metade dos espermatozoides individuais demonstrou a capacidade de nadar contra fluidos em fluxo, e sua adesão ao feixe aumentou sua capacidade de apresentar reologia positiva. Além disso, nossos dados são consistentes com os de Matsuzaki et al. 1, que relataram que o aumento da secreção de lactato no SST pode inibir a motilidade dos espermatozoides residentes. No entanto, nossos resultados descrevem a formação de ligamentos móveis dos espermatozoides e seu comportamento reológico na presença de um ambiente dinâmico dentro de um microcanal, na tentativa de elucidar seu comportamento no SST. Pesquisas futuras podem se concentrar na determinação da composição química e da origem do agente aglutinante, o que sem dúvida ajudará os pesquisadores a desenvolver novas maneiras de armazenar sêmen líquido e aumentar a duração da fertilidade.
Quinze sharkasi machos de pescoço nu, com 30 semanas de idade (homozigotos dominantes; NaNa), foram selecionados como doadores de esperma no estudo. As aves foram criadas na Granja de Pesquisa Avícola da Faculdade de Agricultura da Universidade de Ashit, na província de Ashit, Egito. As aves foram alojadas em gaiolas individuais (30 x 40 x 40 cm), submetidas a um programa de iluminação (16 horas de luz e 8 horas de escuridão) e alimentadas com uma dieta contendo 160 g de proteína bruta, 2.800 kcal de energia metabolizável e 35 g de cálcio cada. 5 gramas de fósforo disponível por quilograma de dieta.
De acordo com os dados 36, 37, o sêmen foi coletado de machos por massagem abdominal. Um total de 45 amostras de sêmen foram coletadas de 15 homens ao longo de 3 dias. O sêmen (n = 15/dia) foi imediatamente diluído 1:1 (v:v) com Belsville Poultry Semen Diluent, que contém difosfato de potássio (1,27 g), glutamato monossódico monoidratado (0,867 g), frutose (0,5 d) acetato de sódio anidro (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potássio monoidratado (0,064 g), monofosfato de potássio (0,065 g), cloreto de magnésio (0,034 g) e H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaridade 333 mOsm/kg38. Amostras de sêmen diluído foram primeiramente examinadas em um microscópio óptico para garantir boa qualidade do sêmen (umidade) e então armazenadas em banho-maria a 37°C até o uso dentro de meia hora após a coleta.
A cinemática e a reologia dos espermatozoides são descritas utilizando um sistema de dispositivos microfluídicos. Amostras de sêmen foram posteriormente diluídas a 1:40 em Beltsville Avian Semen Diluent, carregadas em um dispositivo microfluídico (veja abaixo), e os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando um sistema de Análise Computadorizada de Sêmen (CASA) previamente desenvolvido para caracterização microfluídica. sobre a mobilidade dos espermatozoides em meios líquidos (Departamento de Engenharia Mecânica, Faculdade de Engenharia, Universidade de Assiut, Egito). O plugin pode ser baixado em: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Foram medidas a velocidade da curva (VCL, μm/s), a velocidade linear (VSL, μm/s) e a velocidade média da trajetória (VAP, μm/s). Vídeos de espermatozoides foram obtidos usando um microscópio de contraste de fase invertido Optika XDS-3 (com objetiva de 40x) conectado a uma câmera Tucson ISH1000 a 30 fps por 3 s. Use o software CASA para estudar pelo menos três áreas e 500 trajetórias de espermatozoides por amostra. O vídeo gravado foi processado usando um CASA caseiro. A definição de motilidade no plug-in CASA é baseada na velocidade de nado do espermatozoide em comparação com a taxa de fluxo e não inclui outros parâmetros, como movimento lateral, pois este se mostrou mais confiável no fluxo de fluidos. O movimento reológico é descrito como o movimento das células espermáticas contra a direção do fluxo de fluidos. Os espermatozoides com propriedades reológicas foram divididos pelo número de espermatozoides móveis; espermatozoides que estavam em repouso e espermatozoides em movimento convectivo foram excluídos da contagem.
Todos os produtos químicos utilizados foram obtidos da Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egito), salvo indicação em contrário. O dispositivo foi fabricado conforme descrito por El-sherry et al. 40 com algumas modificações. Os materiais utilizados para fabricar os microcanais incluíram placas de vidro (Howard Glass, Worcester, MA), resina negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), álcool diacetona (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha) e poliacetona. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Os microcanais são fabricados usando litografia suave. Primeiro, uma máscara facial protetora transparente com o design de microcanal desejado foi impressa em uma impressora de alta resolução (Prismatic, Cairo, Egito e Pacific Arts and Design, Markham, ON). Os masters foram feitos usando placas de vidro como substratos. As placas foram limpas em acetona, isopropanol e água deionizada e então revestidas com uma camada de 20 µm de SU8-25 por centrifugação (3000 rpm, 1 min). As camadas de SU-8 foram então secas suavemente (65 °C, 2 min e 95 °C, 10 min) e expostas à radiação UV por 50 s. Após a exposição, as camadas de SU-8 expostas foram assadas a 65 °C e 95 °C por 1 min e 4 min para reticular, seguidas de desenvolvimento em álcool diacetona por 6,5 min. As waffles foram assadas em forno forte (200 °C por 15 min) para solidificar ainda mais a camada de SU-8.
O PDMS foi preparado misturando-se o monômero e o endurecedor na proporção de 10:1 em peso, sendo então desgaseificado em um dessecador a vácuo e vertido sobre a estrutura principal do SU-8. O PDMS foi curado em um forno (120 °C, 30 min), e então os canais foram cortados, separados do master e perfurados para permitir a fixação dos tubos na entrada e na saída do microcanal. Finalmente, os microcanais de PDMS foram fixados permanentemente às lâminas de microscópio usando um processador corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL), conforme descrito anteriormente. O microcanal utilizado neste estudo mede 200 µm × 20 µm (L × A) e tem 3,6 cm de comprimento.
O fluxo de fluido induzido pela pressão hidrostática dentro do microcanal é obtido mantendo o nível do fluido no reservatório de entrada acima da diferença de altura Δh39 no reservatório de saída (Fig. 1).
Onde f é o coeficiente de atrito, definido como f = C/Re para escoamento laminar em um canal retangular, onde C é uma constante que depende da razão de aspecto do canal, L é o comprimento do microcanal, Vav é a velocidade média dentro do microcanal, Dh é o diâmetro hidráulico do canal, g é a aceleração da gravidade. Utilizando esta equação, a velocidade média do canal pode ser calculada usando a seguinte equação: