Novos insights sobre reologia espermática, aglutinação e tufagem em galinhas Sharkasy com base em estudos in vitro

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A fertilidade das aves depende de sua capacidade de armazenar esperma viável suficiente por um longo período de tempo nos túbulos de armazenamento de esperma (SST).O mecanismo exato pelo qual os espermatozóides entram, residem e saem do SST permanece controverso.O esperma de galinhas sharkasi apresentou alta tendência à aglutinação, formando feixes filamentosos móveis contendo muitas células.Devido à dificuldade de observar a motilidade e o comportamento dos espermatozóides em uma trompa de falópio opaca, usamos um dispositivo microfluídico com uma seção transversal de microcanal semelhante à dos espermatozóides para estudar a aglutinação e a motilidade dos espermatozóides.Este estudo discute como os feixes de esperma se formam, como eles se movem e seu possível papel na extensão da residência do esperma no SST.Nós investigamos a velocidade do esperma e o comportamento reológico quando o fluxo de fluido foi gerado dentro de um canal microfluídico por pressão hidrostática (taxa de fluxo = 33 µm/s).Os espermatozóides tendem a nadar contra a corrente (reologia positiva) e a velocidade do feixe de espermatozóides é significativamente reduzida em comparação com espermatozóides individuais.Observou-se que os feixes de espermatozoides se movem em espiral e aumentam em comprimento e espessura à medida que mais espermatozóides individuais são recrutados. Feixes de espermatozoides foram observados se aproximando e aderindo às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem varridos com velocidade de fluxo de fluido > 33 µm/s. Feixes de espermatozoides foram observados se aproximando e aderindo às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem varridos com velocidade de fluxo de fluido > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных к аналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Observou-se que os feixes de esperma se aproximam e aderem às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem varridos a taxas de fluxo de fluido > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上,以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Observou-se que os feixes de esperma se aproximam e aderem às paredes laterais do canal microfluídico para evitar serem arrastados pelo fluxo de fluido a > 33 µm/s.A microscopia eletrônica de varredura e transmissão revelou que os feixes de esperma eram sustentados por abundante material denso.Os dados obtidos demonstram a mobilidade única dos espermatozóides da galinha Sharkazi, bem como a capacidade dos espermatozóides de aglutinar e formar feixes móveis, o que contribui para uma melhor compreensão do armazenamento a longo prazo dos espermatozóides no SMT.
Para conseguir a fertilização em humanos e na maioria dos animais, o esperma e os óvulos devem chegar ao local da fertilização no momento certo.Portanto, o acasalamento deve ocorrer antes ou no momento da ovulação.Por outro lado, alguns mamíferos, como cães, assim como espécies não mamíferos, como insetos, peixes, répteis e aves, armazenam espermatozóides em seus órgãos reprodutivos por um longo período de tempo até que seus óvulos estejam prontos para a fertilização (fertilização assíncrona 1 ).As aves são capazes de manter a viabilidade dos espermatozoides capazes de fertilizar os óvulos por 2 a 10 semanas2.
Esta é uma característica única que distingue as aves de outros animais, pois fornece uma alta probabilidade de fertilização após uma única inseminação por várias semanas sem acasalamento e ovulação simultâneos.O principal órgão de armazenamento de esperma, chamado de túbulo de armazenamento de esperma (TSS), está localizado nas dobras da mucosa interna na junção uterovaginal.Até o momento, os mecanismos pelos quais os espermatozóides entram, residem e saem do banco de esperma não são totalmente compreendidos.Com base em estudos anteriores, muitas hipóteses foram levantadas, mas nenhuma delas foi confirmada.
Forman4 levantou a hipótese de que os espermatozóides mantêm sua residência na cavidade do SST por meio de movimento oscilatório contínuo contra a direção do fluxo de fluido através de canais de proteínas localizados nas células epiteliais do SST (reologia).O ATP é esgotado devido à constante atividade flagelar necessária para manter o esperma no lúmen SST e a motilidade eventualmente diminui até que o esperma seja levado para fora do banco de esperma pelo fluxo de fluido e comece uma nova jornada pela trompa de falópio ascendente para fertilizar o esperma.Ovo (Forman4).Este modelo de armazenamento de esperma é suportado pela detecção por imunocitoquímica das aquaporinas 2, 3 e 9 presentes nas células epiteliais SST.Até o momento, faltam estudos sobre a reologia do sêmen de frango e seu papel no armazenamento de SST, seleção de espermatozoides vaginais e competição espermática.Em galinhas, o esperma entra na vagina após o acasalamento natural, mas mais de 80% dos espermatozóides são ejetados da vagina logo após o acasalamento.Isso sugere que a vagina é o principal local de seleção de esperma em aves.Além disso, foi relatado que menos de 1% dos espermatozóides fertilizados na vagina acabam em SSTs2.Na inseminação artificial de pintos na vagina, o número de espermatozóides que atingem o SST tende a aumentar 24 horas após a inseminação.Até agora, o mecanismo de seleção de esperma durante este processo não é claro, e a motilidade espermática pode desempenhar um papel importante na captação de esperma SST.Devido às paredes espessas e opacas das trompas de falópio, é difícil monitorar diretamente a motilidade espermática nas trompas de falópio das aves.Portanto, não temos conhecimento básico de como os espermatozóides fazem a transição para SST após a fertilização.
A reologia foi recentemente reconhecida como um fator importante no controle do transporte de esperma na genitália dos mamíferos.Com base na capacidade dos espermatozóides móveis de migrar em contracorrente, Zaferani et al8 usaram um sistema microfluídico de corra para isolar passivamente espermatozóides móveis de amostras de sêmen encurraladas.Este tipo de triagem de sêmen é essencial para o tratamento médico de infertilidade e pesquisa clínica, e é preferível aos métodos tradicionais que são demorados e trabalhosos e podem comprometer a morfologia do esperma e a integridade estrutural.No entanto, até o momento, nenhum estudo foi realizado sobre o efeito das secreções dos órgãos genitais de galinhas na motilidade do esperma.
Independentemente do mecanismo que mantém o esperma armazenado no SST, muitos investigadores observaram que os espermatozóides residentes aglutinam cabeça-a-cabeça no SST das galinhas 9, 10, codornas 2 e perus 11 para formar feixes de espermatozoides aglutinados.Os autores sugerem que existe uma ligação entre esta aglutinação e o armazenamento a longo prazo de espermatozóides no SST.
Tingari e Lake12 relataram uma forte associação entre os espermatozóides na glândula receptora de espermatozóides da galinha e questionaram se os espermatozóides aviários aglutinam da mesma forma que os espermatozóides de mamíferos.Eles acreditam que as conexões profundas entre os espermatozóides no ducto deferente podem ser devidas ao estresse causado pela presença de um grande número de espermatozóides em um pequeno espaço.
Ao avaliar o comportamento dos espermatozoides em lâminas de vidro penduradas frescas, podem ser observados sinais transitórios de aglutinação, especialmente nas bordas das gotículas de sêmen.No entanto, a aglutinação foi muitas vezes perturbada pela ação rotacional associada ao movimento contínuo, o que explica a natureza transitória desse fenômeno.Os pesquisadores também notaram que, quando o diluente era adicionado ao sêmen, apareciam agregados celulares alongados “semelhantes a fios”.
As primeiras tentativas de imitar um espermatozóide foram feitas removendo um fio fino de uma gota pendurada, o que resultou em uma vesícula alongada semelhante a um espermatozoide projetando-se da gota de sêmen.Os espermatozóides alinharam-se imediatamente de forma paralela dentro da vesícula, mas toda a unidade desapareceu rapidamente devido à limitação 3D.Portanto, para estudar a aglutinação de espermatozóides, é necessário observar a motilidade e o comportamento dos espermatozóides diretamente em túbulos de armazenamento de espermatozóides isolados, o que é difícil de conseguir.Portanto, é necessário desenvolver um instrumento que mimetize espermatozoides para subsidiar estudos de motilidade e comportamento de aglutinação espermática.Brillard et al13 relataram que o comprimento médio dos túbulos de armazenamento de esperma em pintos adultos é de 400 a 600 µm, mas alguns SSTs podem chegar a 2.000 µm.Mero e Ogasawara14 dividiram as glândulas seminíferas em túbulos de armazenamento de esperma aumentados e não aumentados, ambos com o mesmo comprimento (~500 µm) e largura do colo (~38 µm), mas o diâmetro médio do lúmen dos túbulos foi de 56,6 e 56,6 µm.., respectivamente 11,2 μm, respectivamente.No estudo atual, usamos um dispositivo microfluídico com um tamanho de canal de 200 µm × 20 µm (L × A), cuja seção transversal é um pouco próxima à do SST amplificado.Além disso, examinamos a motilidade dos espermatozóides e o comportamento de aglutinação no fluido que flui, o que é consistente com a hipótese de Foreman de que o fluido produzido pelas células epiteliais SST mantém os espermatozoides no lúmen em uma direção contracorrente (reológica).
O objetivo deste estudo foi superar os problemas de observação da motilidade dos espermatozóides na trompa de falópio e evitar as dificuldades de estudar a reologia e o comportamento dos espermatozóides em um ambiente dinâmico.Foi utilizado um dispositivo microfluídico que cria pressão hidrostática para simular a motilidade espermática nos órgãos genitais de uma galinha.
Quando uma gota de uma amostra de esperma diluída (1:40) foi carregada no dispositivo de microcanais, dois tipos de motilidade espermática puderam ser identificados (esperma isolado e esperma ligado).Além disso, os espermatozóides tendem a nadar contra a corrente (reologia positiva; vídeo 1, 2). Embora os feixes de espermatozoides tenham velocidade menor do que os espermatozoides solitários (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides com reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2). Embora os feixes de espermatozoides tenham velocidade menor do que os espermatozoides solitários (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides com reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увели чивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Embora os feixes de espermatozóides tenham uma velocidade menor do que os espermatozóides individuais (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozóides com reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度 (p < 0,001),但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比(p < 0,001;表2)。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 (p <0,001) , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 (p <0,001 ; 2。。。。。。)))))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Embora a velocidade dos feixes de espermatozóides tenha sido menor do que a dos espermatozóides individuais (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozóides com reologia positiva (p < 0,001; Tabela 2).A reologia positiva para espermatozóides individuais e tufos é estimada em aproximadamente 53% e 85%, respectivamente.
Foi observado que os espermatozoides de galinhas sharkasi imediatamente após a ejaculação formam feixes lineares, constituídos por dezenas de indivíduos.Esses tufos aumentam de comprimento e espessura com o tempo e podem permanecer in vitro por várias horas antes de se dissiparem (vídeo 3).Esses feixes filamentosos têm a forma de espermatozóides de equidna que se formam no final do epidídimo.Verificou-se que o sêmen da galinha Sharkashi tem uma alta tendência para aglutinar e formar um feixe reticulado em menos de um minuto após a coleta.Esses feixes são dinâmicos e podem aderir a qualquer parede próxima ou objetos estáticos.Embora os feixes de espermatozoides reduzam a velocidade das células espermáticas, é claro que macroscopicamente eles aumentam sua linearidade.O comprimento dos feixes varia dependendo do número de espermatozoides coletados em feixes.Duas partes do feixe foram isoladas: a parte inicial, incluindo a cabeça livre do espermatozóide aglutinado, e a parte terminal, incluindo a cauda e toda a extremidade distal do espermatozoide.Com uma câmera de alta velocidade (950 fps), foram observadas cabeças livres de espermatozoides aglutinados na parte inicial do feixe, responsáveis ​​pelo movimento do feixe devido ao seu movimento oscilatório, arrastando os demais para dentro do feixe com um movimento helicoidal (Vídeo 4).No entanto, em tufos longos, observou-se que algumas cabeças de esperma livres aderidas ao corpo e a porção terminal do tufo atuam como palhetas para ajudar a impulsionar o tufo.
Enquanto em um fluxo lento de fluido, os feixes de esperma se movem paralelamente uns aos outros, porém, eles começam a se sobrepor e a aderir a tudo o que está parado, para não serem arrastados pelo fluxo de corrente à medida que a velocidade do fluxo aumenta.Os feixes se formam quando um punhado de espermatozóides se aproximam, eles começam a se mover em sincronia e se enrolam, e então se prendem a uma substância pegajosa.As Figuras 1 e 2 mostram como os espermatozoides se aproximam, formando uma junção à medida que as caudas se envolvem.
Os pesquisadores aplicaram pressão hidrostática para criar fluxo de fluido em um microcanal para estudar a reologia do esperma.Foi utilizado um microcanal com tamanho de 200 µm × 20 µm (L × A) e comprimento de 3,6 µm.Use microcanais entre recipientes com seringas encaixadas nas extremidades.Corante alimentar foi usado para tornar os canais mais visíveis.
Amarre cabos de interconexão e acessórios na parede.O vídeo foi feito com um microscópio de contraste de fase.Com cada imagem, microscopia de contraste de fase e imagens de mapeamento são apresentadas.(A) A conexão entre duas correntes resiste ao fluxo devido ao movimento helicoidal (seta vermelha).(B) A conexão entre o feixe tubular e a parede do canal (setas vermelhas), ao mesmo tempo em que estão conectados a outros dois feixes (setas amarelas).(C) Feixes de esperma no canal microfluídico começam a se conectar uns com os outros (setas vermelhas), formando uma malha de feixes de esperma.(D) Formação de uma rede de feixes de esperma.
Quando uma gota de esperma diluído foi carregada no dispositivo microfluídico e um fluxo foi criado, observou-se que o feixe de esperma se movia contra a direção do fluxo.Os feixes se encaixam perfeitamente nas paredes dos microcanais e as cabeças livres na parte inicial dos feixes se encaixam perfeitamente contra eles (vídeo 5).Eles também aderem a quaisquer partículas estacionárias em seu caminho, como detritos, para resistir a serem arrastados pela corrente.Com o tempo, esses tufos tornam-se longos filamentos prendendo outros espermatozoides únicos e tufos mais curtos (Vídeo 6).À medida que o fluxo começa a diminuir, longas filas de esperma começam a formar uma rede de linhas de esperma (Vídeo 7; Figura 2).
Em alta velocidade de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos espirais dos fios são aumentados na tentativa de capturar muitos feixes formadores de espermatozóides individuais que resistem melhor à força de deriva do fluxo. Em alta velocidade de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos espirais dos fios são aumentados na tentativa de capturar muitos feixes formadores de espermatozóides individuais que resistem melhor à força de deriva do fluxo. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаютс я поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфую щей силе потока. Em altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos helicoidais dos fios aumentam à medida que tentam capturar muitos espermatozoides individuais formando feixes que são mais capazes de resistir à força de deriva do fluxo.在高流速(V > 33 µm/s)地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 , 从而 更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить м ножество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа поток a. Em altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), o movimento helicoidal dos filamentos aumenta na tentativa de capturar muitos espermatozoides individuais formando feixes para melhor resistir às forças de deriva do fluxo.Eles também tentaram anexar microcanais às paredes laterais.
Feixes de esperma foram identificados como aglomerados de cabeças de esperma e caudas onduladas usando microscopia de luz (LM).Feixes de espermatozoides com vários agregados também foram identificados como cabeças retorcidas e agregados flagelares, múltiplas caudas espermáticas fundidas, cabeças espermáticas presas a uma cauda e cabeças espermáticas com núcleos dobrados como múltiplos núcleos fundidos.microscopia eletrônica de transmissão (TEM).A microscopia eletrônica de varredura (SEM) mostrou que os feixes de esperma eram agregados revestidos de cabeças de esperma e os agregados de esperma mostravam uma rede anexada de caudas enroladas.
A morfologia e ultraestrutura dos espermatozóides, a formação de feixes de espermatozóides foram estudadas usando microscopia de luz (meia seção), microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), esfregaços de esperma foram corados com laranja de acridina e examinados por microscopia de epifluorescência.
A coloração do esfregaço de esperma com laranja de acridina (Fig. 3B) mostrou que as cabeças dos espermatozóides estavam grudadas e cobertas com material secretor, o que levou à formação de grandes tufos (Fig. 3D).Os feixes de esperma consistiam em agregados de esperma com uma rede de caudas anexadas (Fig. 4A-C).Os feixes de espermatozoides são compostos pelas caudas de muitos espermatozóides grudados (Fig. 4D).Segredos (Fig. 4E,F) cobriam as cabeças dos feixes de espermatozóides.
Formação do feixe de espermatozóides Usando microscopia de contraste de fase e esfregaços de esperma corados com laranja de acridina, mostrou que as cabeças dos espermatozóides se unem.(A) A formação inicial do tufo de esperma começa com um espermatozóide (círculo branco) e três espermatozóides (círculo amarelo), com a espiral começando na cauda e terminando na cabeça.(B) Fotomicrografia de esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando cabeças espermáticas aderentes (setas).A descarga cobre a(s) cabeça(s).Ampliação × 1000. (C) Desenvolvimento de um grande feixe transportado por fluxo em um canal microfluídico (usando uma câmera de alta velocidade a 950 fps).(D) Micrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando grandes tufos (setas).Ampliação: ×200.
Micrografia eletrônica de varredura de um feixe de esperma e um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina.(A, B, D, E) são micrografias eletrônicas de varredura digital coloridas de espermatozóides, e C e F são micrografias de esfregaços de esperma corados com laranja de acridina mostrando a fixação de múltiplos espermatozóides envolvendo a teia caudal.(AC) Agregados de esperma são mostrados como uma rede de caudas anexadas (setas).(D) Adesão de vários espermatozóides (com substância adesiva, contorno rosa, seta) envolvendo a cauda.(E e F) Agregados de cabeça de esperma (ponteiros) cobertos com material adesivo (ponteiros).Os espermatozóides formaram feixes com várias estruturas em forma de vórtice (F).(C) ampliações de 400 × e (F) de 200 ×.
Usando microscopia eletrônica de transmissão, descobrimos que os feixes de esperma tinham caudas anexadas (Fig. 6A, C), cabeças ligadas às caudas (Fig. 6B) ou cabeças ligadas às caudas (Fig. 6D).As cabeças dos espermatozoides no feixe são curvas, apresentando em corte duas regiões nucleares (Fig. 6D).No feixe de incisão, os espermatozóides apresentavam uma cabeça torcida com duas regiões nucleares e múltiplas regiões flagelares (Fig. 5A).
Micrografia eletrônica colorida digital mostrando as caudas de conexão no feixe de esperma e o material aglutinante conectando as cabeças de esperma.(A) Cauda anexada de um grande número de espermatozóides.Observe como a cauda fica nas projeções retrato (seta) e paisagem (seta).(B) A cabeça (seta) do esperma está conectada à cauda (seta).(C) Várias caudas de esperma (setas) estão ligadas.(D) Material de aglutinação (AS, azul) conecta quatro cabeças de esperma (roxo).
A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para detectar cabeças espermáticas em feixes espermáticos cobertos por secreções ou membranas (Figura 6B), indicando que os feixes espermáticos estavam ancorados por material extracelular.O material aglutinado foi concentrado na cabeça do espermatozoide (conjunto em forma de cabeça de água-viva; Fig. 5B) e expandido distalmente, dando uma aparência amarelo brilhante sob microscopia de fluorescência quando corado com laranja de acridina (Fig. 6C).Esta substância é claramente visível ao microscópio de varredura e é considerada um aglutinante.Seções semifinas (Fig. 5C) e esfregaços de esperma corados com laranja de acridina mostraram feixes de esperma contendo cabeças densamente compactadas e caudas enroladas (Fig. 5D).
Várias fotomicrografias mostrando agregação de cabeças de esperma e caudas dobradas usando vários métodos.(A) Micrografia eletrônica de transmissão colorida digital transversal de um feixe de espermatozóides mostrando uma cabeça de espermatozoide enrolada com um núcleo de duas partes (azul) e várias partes flagelares (verde).(B) Micrografia eletrônica de varredura digital colorida mostrando um aglomerado de cabeças de espermatozoides semelhantes a águas-vivas (setas) que parecem estar cobertas.(C) Corte semifino mostrando cabeças de esperma agregadas (setas) e caudas enroladas (setas).(D) Micrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando agregados de cabeças de esperma (setas) e caudas aderentes enroladas (setas).Observe que uma substância pegajosa (S) cobre a cabeça do espermatozóide.(D) Ampliação de 1000 ×.
Usando microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 7A), também foi notado que as cabeças dos espermatozoides eram torcidas e os núcleos tinham uma forma espiral, como confirmado por esfregaços de espermatozoides corados com laranja de acridina e examinados por microscopia de fluorescência (Fig. 7B).
(A) Micrografia eletrônica de transmissão colorida digital e (B) Esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando cabeças enroladas e fixação de cabeças e caudas de espermatozoides (setas).(B) Ampliação de 1000 ×.
Uma descoberta interessante é que o esperma de Sharkazi se agrega para formar feixes filamentosos móveis.As propriedades desses feixes permitem entender seu possível papel na absorção e armazenamento de espermatozóides no SST.
Após o acasalamento, os espermatozóides entram na vagina e passam por um intenso processo de seleção, resultando em apenas um número limitado de espermatozoides entrando no SST15,16.Até o momento, os mecanismos pelos quais os espermatozóides entram e saem do SST não são claros.Nas aves, os espermatozóides são armazenados no SST por um período prolongado de 2 a 10 semanas, dependendo da espécie6.A controvérsia permanece sobre a condição do sêmen durante o armazenamento no SST.Eles estão em movimento ou em repouso?Em outras palavras, como os espermatozóides mantêm sua posição no SST por tanto tempo?
Forman4 sugeriu que a residência e ejeção do SST poderiam ser explicadas em termos de motilidade espermática.Os autores levantam a hipótese de que os espermatozoides mantêm sua posição nadando contra o fluxo de fluido criado pelo epitélio SST e que os espermatozóides são ejetados do SST quando sua velocidade cai abaixo do ponto em que eles começam a se mover para trás devido à falta de energia.Zaniboni5 confirmou a presença das aquaporinas 2, 3 e 9 na porção apical das células epiteliais SST, que podem indiretamente apoiar o modelo de armazenamento de esperma de Foreman.No estudo atual, descobrimos que quase metade dos espermatozóides de Sharkashi apresentam reologia positiva no fluido que flui, e que feixes de espermatozóides aglutinados aumentam o número de espermatozóides apresentando reologia positiva, embora a aglutinação os retarde.Como os espermatozóides viajam pela trompa de falópio da ave até o local da fertilização não é totalmente compreendido.Nos mamíferos, o fluido folicular quimioatrai os espermatozóides.No entanto, acredita-se que os quimioatrativos direcionam os espermatozóides a se aproximarem de longas distâncias7.Portanto, outros mecanismos são responsáveis ​​pelo transporte espermático.A capacidade do esperma de se orientar e fluir contra o fluido da trompa de Falópio liberado após o acasalamento foi relatada como um fator importante no direcionamento do esperma em camundongos.Parker 17 sugeriu que os espermatozoides atravessam os ovidutos nadando contra a corrente ciliar em aves e répteis.Embora não tenha sido demonstrado experimentalmente em aves, Adolphi18 foi o primeiro a descobrir que o esperma aviário dá resultados positivos quando uma fina camada de líquido entre a lamínula e a lâmina é criada com uma tira de papel de filtro.Reologia.Hino e Yanagimachi [19] colocaram um complexo ovário-tubário-uterino de camundongo em um anel de perfusão e injetaram 1 µl de tinta no istmo para visualizar o fluxo de fluido nas trompas de falópio.Eles notaram um movimento muito ativo de contração e relaxamento na trompa de falópio, no qual todas as bolas de tinta se moviam continuamente em direção à ampola da trompa de falópio.Os autores enfatizam a importância do fluxo do fluido tubário das trompas de falópio inferiores para as superiores para a elevação do esperma e a fertilização.Brillard20 relatou que em galinhas e perus, os espermatozóides migram por movimento ativo desde a entrada vaginal, onde são armazenados, até a junção útero-vaginal, onde são armazenados.No entanto, esse movimento não é necessário entre a junção uterovaginal e o infundíbulo porque os espermatozóides são transportados por deslocamento passivo.Conhecendo estas recomendações anteriores e os resultados obtidos no presente estudo, pode-se supor que a capacidade dos espermatozóides de se moverem a montante (reologia) é uma das propriedades em que se baseia o processo de seleção.Isso determina a passagem dos espermatozóides pela vagina e sua entrada no CCT para armazenamento.Como sugeriu Forman4, isso também pode facilitar o processo de entrada do esperma no SST e seu habitat por um período de tempo e a saída quando sua velocidade começa a diminuir.
Por outro lado, Matsuzaki e Sasanami 21 sugeriram que os espermatozóides aviários sofrem mudanças de motilidade de dormência para motilidade nos tratos reprodutivos masculino e feminino.A inibição da motilidade do esperma residente no SST foi proposta para explicar o longo tempo de armazenamento do esperma e, em seguida, o rejuvenescimento após deixar o SST.Em condições hipóxicas, Matsuzaki et al.1 relataram alta produção e liberação de lactato no SST, o que pode levar à inibição da motilidade espermática residente.Neste caso, a importância da reologia espermática se reflete na seleção e absorção dos espermatozóides, e não no seu armazenamento.
O padrão de aglutinação espermática é considerado uma explicação plausível para o longo período de armazenamento dos espermatozóides no SST, pois este é um padrão comum de retenção espermática em aves domésticas2,22,23.Bakst et ai.2 observaram que a maioria dos espermatozóides aderiu uns aos outros, formando agregados fasciculares, e espermatozoides únicos raramente foram encontrados em codornas CCM.Por outro lado, Wen et al.24 observaram espermatozóides mais dispersos e menos tufos de espermatozóides no lúmen SST em galinhas.Com base nessas observações, pode-se supor que a propensão à aglutinação espermática difere entre as aves e entre os espermatozóides no mesmo ejaculado.Além disso, Van Krey et al.9 sugeriram que a dissociação aleatória de espermatozóides aglutinados é responsável pela penetração gradual dos espermatozóides no lúmen da tuba uterina.De acordo com esta hipótese, os espermatozóides com menor capacidade de aglutinação deveriam ser expelidos primeiro do SST.Nesse contexto, a capacidade de aglutinação dos espermatozóides pode ser um fator que influencia o resultado da competição espermática em aves sujas.Além disso, quanto mais tempo o esperma aglutinado se dissocia, mais tempo a fertilidade é mantida.
Embora a agregação e agregação de espermatozóides em feixes tenha sido observada em vários estudos2,22,24, eles não foram descritos em detalhes devido à complexidade de sua observação cinemática dentro do SST.Várias tentativas foram feitas para estudar a aglutinação de espermatozoides in vitro.Agregação extensa, mas transitória, foi observada quando o fio fino foi removido da gota de semente pendente.Isso leva ao fato de que uma bolha alongada se projeta da gota, imitando a glândula seminal.Devido a limitações 3D e curtos tempos de secagem por gotejamento, todo o bloco caiu rapidamente em desuso9.No estudo atual, usando galinhas Sharkashi e chips microfluídicos, conseguimos descrever como esses tufos se formam e como eles se movem.Os feixes de espermatozoides se formaram imediatamente após a coleta do sêmen e se moveram em espiral, mostrando reologia positiva quando presentes no fluxo.Além disso, quando vistos macroscopicamente, observou-se que os feixes de esperma aumentam a linearidade da motilidade em comparação com espermatozóides isolados.Isso sugere que a aglutinação de espermatozóides pode ocorrer antes da penetração do SST e que a produção de espermatozoides não se limita a uma pequena área devido ao estresse, conforme sugerido anteriormente (Tingari e Lake12).Durante a formação do tufo, os espermatozóides nadam em sincronia até formarem uma junção, então suas caudas se enrolam e a cabeça do espermatozóide permanece livre, mas a cauda e a parte distal do espermatozóide se unem com uma substância pegajosa.Portanto, a cabeça livre do ligamento é responsável pelo movimento, arrastando o resto do ligamento.A microscopia eletrônica de varredura dos feixes de espermatozóides mostrou cabeças de espermatozoides aderidas cobertas por muito material pegajoso, sugerindo que as cabeças de espermatozoides estavam presas em feixes de repouso, o que pode ter ocorrido após atingir o local de armazenamento (SST).
Quando um esfregaço de esperma é corado com laranja de acridina, o material adesivo extracelular ao redor das células espermáticas pode ser visto sob um microscópio fluorescente.Essa substância permite que os feixes de esperma adiram e se prendam a quaisquer superfícies ou partículas circundantes, de modo que não se desviem com o fluxo circundante.Assim, nossas observações mostram o papel da adesão dos espermatozóides na forma de feixes móveis.Sua capacidade de nadar contra a corrente e aderir a superfícies próximas permite que o esperma permaneça mais tempo no SST.
Rothschild25 utilizou uma câmera de hemocitometria para estudar a distribuição flutuante do sêmen bovino em uma gota de suspensão, fazendo fotomicrografias através de uma câmera com eixo óptico vertical e horizontal do microscópio.Os resultados mostraram que os espermatozóides foram atraídos para a superfície da câmara.Os autores sugerem que pode haver interações hidrodinâmicas entre o esperma e a superfície.Levando isso em consideração, juntamente com a capacidade do sêmen do pinto Sharkashi de formar tufos pegajosos, pode aumentar a probabilidade de o sêmen aderir à parede SST e ser armazenado por longos períodos de tempo.
Bccetti e Afzeliu26 relataram que o glicocálice espermático é necessário para o reconhecimento e aglutinação dos gametas.Forman10 observou que a hidrólise de ligações α-glicosídicas em revestimentos de glicoproteína-glicolipídio, tratando o sêmen aviário com neuraminidase, resultou em redução da fertilidade sem afetar a motilidade espermática.Os autores sugerem que o efeito da neuraminidase no glicocálice prejudica o sequestro de esperma na junção útero-vaginal, reduzindo assim a fertilidade.Suas observações não podem ignorar a possibilidade de que o tratamento com neuraminidase possa reduzir o reconhecimento de espermatozoides e ovócitos.Forman e Engel10 descobriram que a fertilidade foi reduzida quando as galinhas foram inseminadas por via intravaginal com sêmen tratado com neuraminidase.No entanto, a fertilização in vitro com esperma tratado com neuraminidase não afetou a fertilidade em comparação com as galinhas de controle.Os autores concluíram que as alterações no revestimento glicoproteína-glicolipídica ao redor da membrana espermática reduziram a capacidade do esperma de fertilizar, prejudicando o sequestro de esperma na junção útero-vaginal, o que, por sua vez, aumentou a perda de esperma devido à velocidade da junção útero-vaginal, mas não afeta o reconhecimento do esperma e do óvulo.
Em perus, Bakst e Bauchan 11 encontraram pequenas vesículas e fragmentos de membrana no lúmen do SST e observaram que alguns desses grânulos haviam se fundido com a membrana espermática.Os autores sugerem que essas relações podem contribuir para o armazenamento a longo prazo de espermatozóides em SST.No entanto, os pesquisadores não especificaram a origem dessas partículas, se são secretadas por células epiteliais CCT, produzidas e secretadas pelo sistema reprodutor masculino ou produzidas pelo próprio esperma.Além disso, essas partículas são responsáveis ​​pela aglutinação.Grützner et al27 relataram que as células epiteliais epididimárias produzem e secretam uma proteína específica necessária para a formação de tratos seminais de poro único.Os autores também relatam que a dispersão desses feixes depende da interação de proteínas do epidídimo.Nixon et al28 descobriram que os anexos secretam uma proteína, a osteonectina rica em cisteína ácida;SPARC está envolvido na formação de tufos de esperma em equidnas de bico curto e ornitorrincos.A dispersão desses feixes está associada à perda dessa proteína.
No presente estudo, a análise ultraestrutural por microscopia eletrônica mostrou que os espermatozóides aderiram a uma grande quantidade de material denso.Acredita-se que essas substâncias sejam responsáveis ​​pela aglutinação que se condensa entre e ao redor das cabeças aderentes, mas em concentrações menores na região da cauda.Supomos que essa substância aglutinante seja excretada do aparelho reprodutor masculino (epidídimo ou ducto deferente) junto com o sêmen, pois frequentemente observamos o sêmen se separando da linfa e do plasma seminal durante a ejaculação.Foi relatado que, à medida que os espermatozóides aviários passam pelo epidídimo e pelos canais deferentes, eles sofrem alterações relacionadas à maturação que sustentam sua capacidade de se ligar a proteínas e adquirir glicoproteínas associadas ao lema plasmático.A persistência dessas proteínas nas membranas espermáticas residentes no SST sugere que essas proteínas podem influenciar a aquisição da estabilidade da membrana espermática 30 e determinar sua fertilidade 31 .Ahammad et al32 relataram que os espermatozoides obtidos de várias partes do sistema reprodutor masculino (dos testículos aos vasos deferentes distais) mostraram um aumento progressivo da viabilidade em condições de armazenamento líquido, independentemente da temperatura de armazenamento, e a viabilidade em galinhas também aumenta nas trompas de falópio após a inseminação artificial.
Os tufos de esperma de galinha Sharkashi têm características e funções diferentes de outras espécies, como equidnas, ornitorrincos, ratos de madeira, ratos de veado e porquinhos-da-índia.Em galinhas sharkasi, a formação de feixes de espermatozóides reduziu sua velocidade de natação em comparação com espermatozóides individuais.No entanto, esses feixes aumentaram a porcentagem de espermatozóides reologicamente positivos e aumentaram a capacidade dos espermatozóides de se estabilizarem em um ambiente dinâmico.Assim, nossos resultados confirmam a sugestão anterior de que a aglutinação de espermatozóides em SST está associada ao armazenamento de espermatozóides a longo prazo.Também levantamos a hipótese de que a propensão dos espermatozoides para formar tufos pode controlar a taxa de perda de espermatozoides no SST, o que pode alterar o resultado da competição espermática.De acordo com essa suposição, espermatozóides com baixa capacidade de aglutinação liberam SST primeiro, enquanto espermatozóides com alta capacidade de aglutinação produzem a maior parte da prole.A formação de feixes de espermatozóides de poro único é benéfica e afeta a relação pais-filhos, mas usa um mecanismo diferente.Em equidnas e ornitorrincos, os espermatozóides são dispostos paralelamente uns aos outros para aumentar a velocidade de avanço do feixe.Grupos de equidnas movem-se cerca de três vezes mais rápido do que espermatozóides individuais.Acredita-se que a formação de tais tufos de esperma em equidnas seja uma adaptação evolutiva para manter a dominância, já que as fêmeas são promíscuas e costumam acasalar com vários machos.Portanto, os espermatozoides de diferentes ejaculados competem ferozmente pela fertilização do óvulo.
Espermatozóides aglutinados de galinhas sharkasi são fáceis de visualizar usando microscopia de contraste de fase, o que é considerado vantajoso porque permite fácil estudo do comportamento dos espermatozóides in vitro.O mecanismo pelo qual a formação do tufo de esperma promove a reprodução em galinhas sharkasi também é diferente daquele observado em alguns mamíferos placentários que representam o comportamento cooperativo do esperma, como camundongos da madeira, onde alguns espermatozóides alcançam os óvulos, ajudando outros indivíduos relacionados a alcançar e danificar seus óvulos.para provar a si mesmo.comportamento altruísta.Autofecundação 34. Outro exemplo de comportamento cooperativo em espermatozóides foi encontrado em camundongos veados, onde os espermatozóides foram capazes de identificar e combinar com os espermatozóides mais geneticamente relacionados e formar grupos cooperativos para aumentar sua velocidade em comparação com espermatozóides não aparentados35.
Os resultados obtidos neste estudo não contradizem a teoria de Foman de armazenamento a longo prazo de espermatozóides em SWS.Os pesquisadores relatam que as células espermáticas continuam a se mover no fluxo de células epiteliais que revestem o SST por um longo período de tempo e, após um certo período de tempo, os estoques de energia das células espermáticas se esgotam, resultando em uma diminuição da velocidade, o que permite a expulsão de substâncias de baixo peso molecular.energia dos espermatozóides com o fluxo de fluido do lúmen do SST A cavidade da trompa de falópio.No estudo atual, observamos que metade dos espermatozóides individuais mostrou a capacidade de nadar contra o fluxo de fluidos, e sua adesão ao feixe aumentou sua capacidade de mostrar reologia positiva.Além disso, nossos dados são consistentes com os de Matsuzaki et al.1 que relatou que o aumento da secreção de lactato no SST pode inibir a motilidade do esperma residente.No entanto, nossos resultados descrevem a formação de ligamentos móveis espermáticos e seu comportamento reológico na presença de um ambiente dinâmico dentro de um microcanal na tentativa de elucidar seu comportamento em SST.Pesquisas futuras podem se concentrar em determinar a composição química e a origem do agente aglutinante, o que, sem dúvida, ajudará os pesquisadores a desenvolver novas maneiras de armazenar o sêmen líquido e aumentar a duração da fertilidade.
Quinze sharkasi machos de pescoço descoberto com 30 semanas de idade (homozigoto dominante; Na Na) foram selecionados como doadores de esperma no estudo.As aves foram criadas na Research Poultry Farm da Faculdade de Agricultura, Ashit University, Ashit Governorate, Egito.As aves foram alojadas em gaiolas individuais (30 x 40 x 40 cm), submetidas a um programa de luz (16 horas de luz e 8 horas de escuridão) e alimentadas com uma dieta contendo 160 g de proteína bruta, 2800 kcal de energia metabolizável, 35 g de cálcio cada.5 gramas de fósforo disponível por quilo de dieta.
De acordo com os dados 36, ​​37, o sêmen foi coletado de machos por massagem abdominal.Um total de 45 amostras de sêmen foram coletadas de 15 homens durante 3 dias.O sêmen (n = 15/dia) foi imediatamente diluído 1:1 (v:v) com Belsville Poultry Semen Diluent, que contém difosfato de potássio (1,27 g), glutamato monossódico monohidratado (0,867 g), frutose (0,5 d) sódio anidro.acetato (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potássio monohidratado (0,064 g), monofosfato de potássio (0,065 g), cloreto de magnésio (0,034 g) e H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolaridade 333 mOsm/kg38.Amostras de sêmen diluídas foram primeiro examinadas em um microscópio de luz para garantir boa qualidade do sêmen (umidade) e então armazenadas em banho-maria a 37°C até o uso dentro de meia hora após a coleta.
A cinemática e a reologia dos espermatozóides são descritas usando um sistema de dispositivos microfluídicos.As amostras de sêmen foram ainda diluídas a 1:40 em Beltsville Avian Semen Diluent, carregadas em um dispositivo microfluídico (veja abaixo), e os parâmetros cinéticos foram determinados usando um sistema de Análise Computadorizada de Sêmen (CASA) previamente desenvolvido para caracterização microfluídica.sobre a mobilidade de espermatozoides em meio líquido (Departamento de Engenharia Mecânica, Faculdade de Engenharia, Universidade de Assiut, Egito).O plugin pode ser baixado em: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Velocidade da curva (VCL, μm/s), velocidade linear (VSL, μm/s) e velocidade média da trajetória (VAP, μm/s) foram medidas.Vídeos de espermatozóides foram feitos usando um microscópio de contraste de fase Optika XDS-3 invertido (com objetiva de 40x) conectado a uma câmera Tucson ISH1000 a 30 fps por 3 s.Use o software CASA para estudar pelo menos três áreas e 500 trajetórias de esperma por amostra.O vídeo gravado foi processado usando um CASA caseiro.A definição de motilidade no plug-in CASA é baseada na velocidade de natação do espermatozóide em comparação com a taxa de fluxo e não inclui outros parâmetros, como movimento lateral, pois isso é considerado mais confiável no fluxo de fluidos.O movimento reológico é descrito como o movimento das células espermáticas contra a direção do fluxo de fluido.Os espermatozóides com propriedades reológicas foram divididos pelo número de espermatozóides móveis;espermatozóides que estavam em repouso e espermatozóides em movimento convectivo foram excluídos da contagem.
Todos os produtos químicos utilizados foram obtidos da Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egito), salvo indicação em contrário.O dispositivo foi fabricado conforme descrito por El-sherry et al.40 com algumas modificações.Os materiais usados ​​para fabricar os microcanais incluíram placas de vidro (Howard Glass, Worcester, MA), resistência negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), álcool diacetônico (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha) e poliacetona.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Os microcanais são fabricados usando litografia macia.Primeiro, uma máscara protetora transparente com o design de microcanal desejado foi impressa em uma impressora de alta resolução (Prismatic, Cairo, Egito e Pacific Arts and Design, Markham, ON).Os mestres foram feitos usando placas de vidro como substratos.As placas foram limpas em acetona, isopropanol e água deionizada e então revestidas com uma camada de 20 µm de SU8-25 por spin coating (3000 rpm, 1 min).As camadas de SU-8 foram então suavemente secas (65°C, 2 min e 95°C, 10 min) e expostas à radiação UV por 50 s.Pós-exposição assar a 65°C e 95°C por 1 min e 4 min para reticular camadas SU-8 expostas, seguido de desenvolvimento em álcool diacetônico por 6,5 min.Asse os waffles (200°C por 15 min) para solidificar ainda mais a camada SU-8.
O PDMS foi preparado misturando o monômero e o endurecedor em uma proporção de peso de 10:1, depois desgaseificado em um dessecador a vácuo e derramado na estrutura principal do SU-8.O PDMS foi curado em estufa (120°C, 30 min), depois os canais foram cortados, separados do mestre e perfurados para permitir a fixação dos tubos na entrada e saída do microcanal.Finalmente, microcanais PDMS foram permanentemente ligados a lâminas de microscópio usando um processador corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL) conforme descrito em outro lugar.O microcanal usado neste estudo mede 200 µm × 20 µm (L × A) e tem 3,6 cm de comprimento.
O escoamento do fluido induzido pela pressão hidrostática no interior do microcanal é obtido mantendo-se o nível do fluido no reservatório de entrada acima da diferença de altura Δh39 no reservatório de saída (Fig. 1).
onde f é o coeficiente de atrito, definido como f = C/Re para fluxo laminar em um canal retangular, onde C é uma constante dependendo da proporção do canal, L é o comprimento do microcanal, Vav é a velocidade média dentro do microcanal, Dh é o diâmetro hidráulico do canal, g – aceleração da gravidade.Usando esta equação, a velocidade média do canal pode ser calculada usando a seguinte equação:


Horário da postagem: 17 de agosto de 2022