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Partículas de sílica porosa foram preparadas por um método sol-gel com algumas modificações para obter partículas macroporosas. Essas partículas foram derivadas por polimerização por transferência de cadeia de fragmentação de adição reversível (RAFT) com N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) e estireno para preparar a intercalação de N-fenilmaleimida de poliestireno (PMP) fase estacionária. Colunas de aço inoxidável de diâmetro estreito (100 × 1,8 mm di) foram empacotadas por pasta .Separação em coluna PMP avaliada de uma mistura de peptídeos consistindo em cinco peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) desempenho cromatográfico) e digestão com tripsina de albumina de soro humano (HAS). Quanto ao desempenho de separação da coluna desenvolvida com a coluna comercial Ascentis Express RP-Amida, observou-se que o desempenho de separação da coluna PMP foi superior ao da coluna comercial em termos de eficiência de separação e resolução.
Nos últimos anos, a indústria biofarmacêutica tornou-se um mercado global em expansão, com um aumento substancial de participação no mercado. Com o crescimento explosivo da indústria biofarmacêutica1,2,3, a análise de peptídeos e proteínas é altamente desejada. a espectrometria de massa é uma ferramenta eficaz para o sequenciamento de peptídeos e proteínas, se tais amostras forem injetadas no espectrômetro de massa em uma única passagem, a separação não será ideal. A cromatografia líquida (LC) avançou significativamente na última década e tornou-se uma técnica popular na análise proteômica7,8,9,10.
A cromatografia líquida de fase reversa (RP-LC) é amplamente utilizada para a purificação e separação de misturas de peptídeos usando sílica modificada por octadecil (ODS) como fase estacionária11,12,13. No entanto, as fases estacionárias RP não fornecem separação satisfatória de peptídeos e proteínas devido à sua estrutura complexa e natureza anfifílica 14,15. Portanto, fases estacionárias especialmente projetadas são necessárias para analisar peptídeos e proteínas com porções polares e não polares para interagir e retêm esses analitos16. A cromatografia de modo misto, que fornece interações multimodais, pode ser uma alternativa ao RP-LC para a separação de peptídeos, proteínas e outras misturas complexas. Várias fases estacionárias de modo misto foram preparadas e colunas empacotadas com essas fases foram usadas para separações de peptídeos e proteínas17,18,19,20,21.Fases estacionárias de modo misto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalação polar/RPLC) são adequados para separações de peptídeos e proteínas devido à presença de grupos polares e não polares22,23,24,25,26,27,28 . Da mesma forma, fases estacionárias intercaladas polares com grupos polares ligados covalentemente mostram bom poder de separação e seletividade única para analitos polares e não polares, pois a separação depende da interação entre o analito e a fase estacionária.Interações multimodais 29, 30, 31, 32.Recentemente, Zhang et al.30 preparou uma fase estacionária de poliamina terminada em dodecil e separou com sucesso hidrocarbonetos, antidepressivos, flavonoides, nucleosídeos, estrogênios e vários outros analitos. colunas RP-Amida, mas essas colunas são usadas apenas para a análise da amina 33.
No estudo atual, uma fase estacionária embebida em polar (poliestireno embebido em N-fenilmaleimida) foi preparada e avaliada para a separação de peptídeos e digeridos por tripsina de HSA. A fase estacionária foi preparada usando a seguinte estratégia. Partículas de sílica porosa foram preparadas de acordo com o procedimento fornecido em nossa publicação anterior com algumas modificações no protocolo de preparação. , um novo ligante, fenilmaleimida-metil vinil isocianato, foi sintetizado e usado para derivatizar partículas de sílica para preparar uma fase estacionária polar incorporada. A fase estacionária resultante foi empacotada em uma coluna de aço inoxidável (100 × 1,8 mm id) usando o esquema de empacotamento otimizado. O empacotamento da coluna é assistido por vibração mecânica para garantir que um leito homogêneo seja formado dentro da coluna.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) e digestão de tripsina de albumina de soro humano (HAS). ser bem resolvido e eficiente na coluna PMP, que foi mais eficiente que a coluna Ascentis Express RP-Amida.
PEG (Polietileno Glicol), Ureia, Ácido Acético, Trimetoxi Ortossilicato (TMOS), Trimetil Clorosilano (TMCS), Tripsina, Albumina de Soro Humano (HSA), Cloreto de Amônio, Ureia, Hexano Metildissilazano (HMDS), Cloreto de Metacriloil (MC), Estireno, 4-Hidroxi-TEMPO, Peróxido de Benzoíla (BPO), Acetonita de Grau HPLC rile (ACN), metanol, 2-propanol e acetona adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Uma mistura de uréia (8 g), polietilenoglicol (8 g) e 8 mL de ácido acético 0,01 N foi agitada por 10 minutos e, em seguida, 24 mL de TMOS foram adicionados a ela sob condições geladas. A mistura de reação foi aquecida a 40°C por 6 horas e depois a 120°C por 8 horas em uma autoclave de aço inoxidável. A água foi despejada e o material residual foi seco a 70°C por 12 horas. O macio seco a massa foi moída em um forno e calcinada a 550°C por 12 horas. Três lotes foram preparados e caracterizados para examinar a reprodutibilidade no tamanho de partícula, tamanho de poro e área de superfície.
Pela modificação da superfície de partículas de sílica com ligante pré-sintetizado fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP), seguido de polimerização radial com estireno, um composto contendo grupo polar foi preparado.Fase estacionária para agregados e cadeias de poliestireno. O processo de preparação é descrito a seguir.
N-fenilmaleimida (200 mg) e metil vinil isocianato (100 mg) foram dissolvidos em tolueno seco e 0,1 mL de 2,2'-azoisobutironitrila (AIBN) foi adicionado ao balão de reação para preparar o copolímero fenilmaleimida-metil vinil isocianato (PMCP). horas.
Partículas de sílica secas (2 g) foram dispersas em tolueno seco (100 mL), agitadas e sonicadas em um frasco de fundo redondo de 500 mL por 10 min. PMCP (10 mg) foi dissolvido em tolueno e adicionado gota a gota ao frasco de reação por meio de um funil de gotejamento. A mistura foi submetida a refluxo a 100°C por 8 horas, filtrada e lavada com acetona e seca a 60°C por 3 horas. Em seguida, partículas de sílica ligadas a PMCP (100 g) foram dissolvidos em tolueno (200 ml) e 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) foi adicionado na presença de 100 µL de dilaurato de dibutilestanho como catalisador. A mistura foi agitada a 50°C durante 8 horas, filtrada e seca a 50°C durante 3 horas.
Estireno (1 mL), peróxido de benzoíla BPO (0,5 mL) e partículas de sílica ligadas a TEMPO-PMCP (1,5 g) foram dispersos em tolueno e purgados com nitrogênio. A polimerização do estireno foi realizada a 100°C por 12 horas. O produto resultante foi lavado com metanol e seco a 60°C durante a noite. O esquema geral da reação é mostrado na Figura 1.
As amostras foram desgaseificadas a 393 K por 1 hora para obter uma pressão residual inferior a 10-3 Torr. A quantidade de N2 adsorvido a uma pressão relativa de P/P0 = 0,99 foi usada para determinar o volume total de poros. Fita adesiva de carbono. O ouro foi banhado nas amostras usando um revestidor de pulverização catódica Q150T e uma camada de Au de 5 nm foi depositada nas amostras. Isso melhora a eficiência do processo usando baixas voltagens e fornece granulação fina, pulverização catódica a frio. Um analisador elementar Thermo Electron (Waltham, MA, EUA) Flash EA1112 foi usado para análise elementar. distribuição de tamanho de partícula. Partículas de sílica nua e partículas de sílica ligadas a ligantes (5 mg cada) foram dispersas em 5 mL de isopropanol, sonicadas por 10 min, submetidas a vórtice por 5 min e colocadas na bancada óptica do Mastersizer. A análise termogravimétrica foi realizada a uma taxa de 5 °C por minuto em uma faixa de temperatura de 30 a 800 °C.
Colunas de diâmetro estreito de aço inoxidável revestidas com vidro de dimensões (100 × 1,8 mm di) foram empacotadas usando o método de empacotamento em pasta, aplicando o mesmo procedimento usado na Ref.31. Uma coluna de aço inoxidável (revestida com vidro, 100 × 1,8 mm id) com um encaixe de saída contendo uma frita de 1 µm foi conectada a um empacotador de pasta (Alltech Deerfield, IL, EUA). Prepare uma pasta de fase estacionária suspendendo 150 mg de fase estacionária em 1,2 mL de metanol e envie-a para a coluna de armazenamento. O metanol foi usado como solvente de pasta, bem como o solvente de propulsão. Encha a coluna sequencialmente aplicando pressões de 100 MP por 10 minutos, 80 MP por 15 minutos e 60 MP por 30 minutos. Durante o empacotamento, vibração mecânica foi aplicada com dois agitadores de coluna GC (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para garantir o empacotamento uniforme da coluna. Feche o empacotador de polpa e libere a pressão lentamente para evitar qualquer dano dentro da coluna. Desconecte a coluna da unidade de empacotamento de polpa e conecte outro encaixe à entrada e ao sistema LC para verificar seu desempenho.
Uma bomba LC (10AD Shimadzu, Japão), injetor (Valco (EUA) C14 W.05) com loop de injeção de 50 nL, desgaseificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), janela capilar UV-VIS foi construída Detector de dispositivo µLC especial (UV-2075) e microcolunas revestidas de vidro. 365 e capilares de união redutora (50 μm) foram instalados na saída de 1/16" da união redutora. A coleta de dados e o processamento cromatográfico foram feitos usando o software Multichro 2000. Monitoramento a 254 nm Os analitos foram testados quanto à absorção de UV. Os dados cromatográficos foram analisados pelo OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina de soro humano, pó liofilizado, ≥ 96% (eletroforese em gel de agarose) 3 mg misturado com tripsina (1,5 mg), ureia 4,0 M (1 mL) e bicarbonato de amônio 0,2 M (1 mL). abaixo de 4ºC.
A separação de misturas de peptídeos e digestões de tripsina HSA foram avaliadas separadamente em colunas PMP. Verifique a separação da mistura de peptídeos e digestão de tripsina de HSA pela coluna PMP e compare os resultados com a coluna Ascentis Express RP-Amida. O número teórico da placa é calculado da seguinte forma:
Imagens SEM de partículas de sílica nuas e partículas de sílica ligadas a ligantes são mostradas na FIG.2.Sem imagens de partículas de sílica nua (A, B) mostram que, em contraste com nossos estudos anteriores, essas partículas são esféricas nas quais as partículas são alongadas ou têm simetria irregular.
Imagens de microscopia eletrônica de varredura de partículas de sílica nuas (A, B) e partículas de sílica ligadas a ligantes (C, D).
As distribuições de tamanho de partícula de partículas de sílica nua e partículas de sílica ligadas a ligantes são mostradas na Figura 3(A). As curvas de distribuição de tamanho de partícula baseadas em volume mostraram que o tamanho das partículas de sílica aumentou após modificação química (Fig. 3A). Os dados de distribuição de tamanho de partícula das partículas de sílica do estudo atual e do estudo anterior são comparados na Tabela 1(A). 3,05 μm (partículas de sílica ligadas a poliestireno)34. Este lote tinha uma distribuição de tamanho de partícula mais estreita em comparação com nosso estudo anterior devido às proporções variáveis de PEG, ureia, TMOS e ácido acético na mistura de reação. O tamanho de partícula da fase PMP é ligeiramente maior do que o da fase de partícula de sílica ligada a poliestireno que estudamos anteriormente. superfície de sílica, enquanto na fase PMP a espessura da camada foi de 1,38 µm.
Distribuição de tamanho de partícula (A) e distribuição de tamanho de poro (B) de partículas de sílica nuas e partículas de sílica ligadas a ligantes.
O tamanho de poro, volume de poro e área de superfície das partículas de sílica do estudo atual são fornecidos na Tabela 1(B). Os perfis PSD de partículas de sílica nuas e partículas de sílica ligadas a ligantes são mostrados na Figura 3(B). Os resultados são comparáveis ao nosso estudo anterior. é mostrado na Fig. 3(B). Da mesma forma, o volume de poros das partículas de sílica diminuiu de 0,67 para 0,58 cm3/g após modificação química. A área de superfície específica das partículas de sílica atualmente estudadas é de 116 m2/g, o que é comparável ao nosso estudo anterior (124 m2/g). /g após modificação química.
Os resultados da análise elementar da fase estacionária são mostrados na Tabela 2. A carga de carbono da fase estacionária atual é de 6,35%, que é menor do que a carga de carbono de nosso estudo anterior (partículas de sílica ligadas a poliestireno, 7,93%35 e 10,21%, respectivamente) -metilvinilisocianato (PCMP) e 4-hidroxi-TEMPO foram usados. A porcentagem em peso de nitrogênio da fase estacionária atual é de 2,21%, em comparação com 0,1735 e 0,85% em peso de nitrogênio em estudos anteriores, respectivamente. Isso significa que a % em peso de nitrogênio é maior na fase estacionária atual devido à fenilmaleimida. Da mesma forma, as cargas de carbono dos produtos (4) e (5) foram de 2,7% e 2,9%, respectivamente, enquanto a carga de carbono do produto final (6) foi de 6,35%, conforme mostrado na Tabela 2. A perda de peso foi verificada com fase estacionária PMP, e a curva TGA é mostrada na Figura 4. A curva TGA mostra uma perda de peso de 8,6%, o que está de acordo com a carga de carbono (6,35%) porque os ligantes contêm não apenas C, mas também N, O e H.
O ligante fenilmaleimida-metilvinilisocianato foi escolhido para a modificação da superfície das partículas de sílica porque possui grupos polares de fenilmaleimida e grupos de vinilisocianato.Os grupos de isocianato de vinil podem reagir ainda mais com o estireno por polimerização radical viva. da fase estacionária pode ser controlada pela quantidade ideal de estireno e o tempo de reação da polimerização por radicais livres. A última etapa da reação (polimerização por radicais livres) é crítica e pode alterar a polaridade da fase estacionária. Foi realizada uma análise elementar para verificar a carga de carbono dessas fases estacionárias. carregar essas fases estacionárias em colunas de aço inoxidável e verificar seu desempenho cromatográfico (seletividade, resolução, valor N, etc.). Com base nesses experimentos, uma formulação otimizada foi selecionada para preparar a fase estacionária PMP para garantir polaridade controlada e boa retenção do analito.
Cinco misturas de peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) também foram avaliadas usando uma coluna PMP usando uma fase móvel;60/40 (v/v) acetonitrila/água (0,1% TFA) a uma taxa de fluxo de 80 μL/min. Sob condições de eluição ideais, o número teórico de placas (N) por coluna (100 × 1,8 mm id) é 20.000 ± 100 (200.000 placas/m²). A Tabela 3 fornece os valores N para as três colunas PMP e os cromatogramas são mostrados na Figura 5 A. Análise rápida em uma coluna PMP em alta taxa de fluxo (700 μL/min), cinco peptídeos foram eluídos em um minuto, os valores de N foram muito bons, 13.500 ± 330 por coluna (100 × 1,8 mm id), Corresponde a 135.000 placas/m (Figura 5B). Três colunas de tamanho idêntico (100 × 1,8 mm id) foram embaladas com três lotes diferentes de fase estacionária PMP para verifique a reprodutibilidade. A concentração do analito para cada coluna foi registrada usando as condições de eluição ideais e o número de placas teóricas N e tempo de retenção para separar a mesma mistura de teste em cada coluna.
Separação da mistura de peptídeos em coluna PMP (B) e coluna Ascentis Express RP-Amida (A);fase móvel 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensões da coluna PMP (100 × 1,8 mm id);analítico A ordem de eluição dos compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) ácido encefalina)).
Uma coluna PMP (100 × 1,8 mm id) foi avaliada para separação de digestões trípticas de albumina de soro humano em cromatografia líquida de alta eficiência. O cromatograma na Figura 6 mostra que a amostra está bem separada e a resolução é muito boa. As digestões de HSA foram analisadas usando uma taxa de fluxo de 100 µL/min, fase móvel 70/30 acetonitrila/água e 0,1% de TFA. Conforme mostrado no cromatograma (Figura 6), a digestão de HSA tem foi dividido em 17 picos correspondentes a 17 peptídeos. A eficiência de separação de cada pico na digestão de HSA foi calculada e os valores são dados na Tabela 5.
Uma digestão tríptica de HSA (100 × 1,8 mm id) foi separada em uma coluna PMP;taxa de fluxo (100 µL/min), fase móvel 60/40 acetonitrila/água com 0,1% de TFA.
onde L é o comprimento da coluna, η é a viscosidade da fase móvel, ΔP é a contrapressão da coluna e u é a velocidade linear da fase móvel. A permeabilidade da coluna PMP foi de 2,5 × 10-14 m2, a taxa de fluxo foi de 25 μL/min e 60/40 v/v ACN/água foi usado. A permeabilidade da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) foi semelhante à do nosso estudo anterior Ref .34. A permeabilidade da coluna preenchida com partículas superficialmente porosas é: 1,7 × 10-15 para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 e 2,5 × 10-14 m2 para partículas de 2,6 μm Para partículas de 5 μm 43. Portanto, a permeabilidade da fase PMP é semelhante à de Partículas núcleo-casca de 5 μm.
onde Wx é o peso da coluna preenchida com clorofórmio, Wy é o peso da coluna preenchida com metanol e ρ é a densidade do solvente. Densidades de metanol (ρ = 0,7866) e clorofórmio (ρ = 1,484). 0,55, respectivamente. Isso significa que a presença de ligantes de ureia reduz a permeabilidade da fase estacionária. Por outro lado, a porosidade total da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) é 0,60. A permeabilidade das colunas PMP é menor do que a das colunas preenchidas com partículas de sílica ligadas a C18 porque nas fases estacionárias do tipo C18 os ligantes C18 estão ligados às partículas de sílica como cadeias lineares, enquanto na estação do tipo poliestireno árias, a camada de polímero relativamente espessa é formada em torno dela. Em um experimento típico, a porosidade da coluna é calculada como:
A Figura 7A,B mostra a coluna PMP (100 × 1,8 mm id) e a coluna Ascentis Express RP-Amida (100 × 1,8 mm id) usando as mesmas condições de eluição (isto é, 60/40 ACN/H2O e 0,1% TFA).) da trama de van Deemter.Misturas de peptídeos selecionadas (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) foram preparadas em 20 µL/ A vazão mínima para ambas as colunas é de 800 µL/min. 2,6 µm e 3,9 µm, respectivamente. Os valores HETP indicam que a eficiência de separação da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) é muito melhor do que a coluna Ascentis Express RP-Amide disponível comercialmente (100 × 1,8 mm id). 1,8 mm id) em comparação com a coluna Ascentis Express RP-Amida é baseada em melhorias na forma de partícula, tamanho e procedimentos complexos de embalagem de coluna usados no trabalho atual34.
(A) Plotagem de van consideração (velocidade linear de fase hetp versus móvel) obtida usando uma coluna PMP (ID 100 × 1,8 mm) em 60/40 ACN/H2O com 0,1% TFA. TFA.
Uma fase estacionária de poliestireno embebido em polar foi preparada e avaliada para separação de misturas de peptídeos sintéticos e digestos de tripsina de albumina de soro humano (HAS) em cromatografia líquida de alta performance. em altas taxas de fluxo é outra vantagem desta fase estacionária.As colunas PMP apresentam boa reprodutibilidade e podem ser usadas para a análise de misturas de peptídeos e digestão de tripsina de várias proteínas.Pretendemos usar esta coluna para a separação de produtos naturais, compostos bioativos de plantas medicinais e extratos de fungos em cromatografia líquida.No futuro, as colunas PMP também serão avaliadas para a separação de proteínas e anticorpos monoclonais.
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Horário de postagem: 05 de junho de 2022