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Partículas de sílica porosas foram preparadas pelo método sol-gel com algumas modificações para obter partículas macroporosas. Essas partículas foram derivatizadas por polimerização por transferência de cadeia de fragmentação por adição reversível (RAFT) com N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) e estireno para preparar a fase estacionária de poliestireno (PMP) intercalada com N-fenilmaleimida. Colunas de aço inoxidável de diâmetro estreito (100 × 1,8 mm de diâmetro interno) foram empacotadas por empacotamento em pasta. Avaliou-se a separação em coluna PMP de uma mistura de peptídeos consistindo de cinco peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina), desempenho cromatográfico) e digestão com tripsina de albumina sérica humana (HAS). Sob condições ótimas de eluição, a contagem teórica em placa da mistura de peptídeos é de até 280.000 placas/m².Comparando o desempenho de separação da coluna desenvolvida com a coluna comercial Ascentis Express RP-Amide, observou-se que o desempenho de separação da coluna PMP foi superior à coluna comercial em termos de eficiência de separação e resolução.
Nos últimos anos, a indústria biofarmacêutica tornou-se um mercado global em expansão, com um aumento substancial na participação de mercado. Com o crescimento explosivo da indústria biofarmacêutica1,2,3, a análise de peptídeos e proteínas é altamente desejada. Além do peptídeo alvo, diversas impurezas são geradas durante a síntese de peptídeos, exigindo, portanto, purificação cromatográfica para obter peptídeos com a pureza desejada. A análise e a caracterização de proteínas em fluidos corporais, tecidos e células são tarefas extremamente desafiadoras devido ao grande número de espécies potencialmente detectáveis ​​em uma única amostra. Embora a espectrometria de massas seja uma ferramenta eficaz para o sequenciamento de peptídeos e proteínas, se tais amostras forem injetadas no espectrômetro de massas em uma única passagem, a separação não será ideal. Esse problema pode ser mitigado pela implementação de separações por cromatografia líquida (LC) antes da análise por MS, o que reduzirá o número de analitos que entram no espectrômetro de massas em um determinado momento4,5,6. Além disso, durante a separação em fase líquida, os analitos podem ser focados em regiões estreitas, concentrando-os e melhorando a detecção por MS. sensibilidade. A cromatografia líquida (LC) avançou significativamente na última década e se tornou uma técnica popular em análise proteômica7,8,9,10.
A cromatografia líquida de fase reversa (RP-LC) é amplamente utilizada para a purificação e separação de misturas de peptídeos usando sílica modificada com octadecil (ODS) como fase estacionária11,12,13. No entanto, as fases estacionárias de RP não fornecem separação satisfatória de peptídeos e proteínas devido à sua estrutura complexa e natureza anfifílica14,15. Portanto, fases estacionárias especialmente projetadas são necessárias para analisar peptídeos e proteínas com frações polares e não polares para interagir e reter esses analitos16. A cromatografia de modo misto, que fornece interações multimodais, pode ser uma alternativa à RP-LC para a separação de peptídeos, proteínas e outras misturas complexas. Várias fases estacionárias de modo misto foram preparadas, e colunas preenchidas com essas fases foram usadas para separações de peptídeos e proteínas17,18,19,20,21. Fases estacionárias de modo misto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalação polar/RPLC) são adequados para separações de peptídeos e proteínas devido à presença de grupos polares e apolares22,23,24,25,26,27,28. Da mesma forma, fases estacionárias intercalantes polares com grupos polares covalentemente ligados apresentam bom poder de separação e seletividade única para analitos polares e apolares, visto que a separação depende da interação entre o analito e a fase estacionária. Interações multimodais29, 30, 31, 32. Recentemente, Zhang et al. 30 preparou uma fase estacionária de poliamina terminada em dodecil e separou com sucesso hidrocarbonetos, antidepressivos, flavonoides, nucleosídeos, estrogênios e vários outros analitos. O intercalador polar tem grupos polares e não polares, portanto pode ser usado para separar peptídeos e proteínas que têm grupos hidrofóbicos e hidrofílicos. Colunas com incorporação polar (por exemplo, colunas C18 com incorporação de amida) estão disponíveis comercialmente sob o nome comercial de colunas Ascentis Express RP-Amide, mas essas colunas são usadas apenas para a análise de amina 33.
No estudo atual, uma fase estacionária polar incorporada (poliestireno incorporado com N-fenilmaleimida) foi preparada e avaliada para separação de peptídeos e digestões de tripsina de HSA. A fase estacionária foi preparada usando a seguinte estratégia. Partículas de sílica porosas foram preparadas de acordo com o procedimento fornecido em nossa publicação anterior, com algumas modificações no protocolo de preparação. A proporção de ureia, polietilenoglicol (PEG), TMOS, água e ácido acético foi ajustada para preparar partículas de sílica com grande tamanho de poro. Em segundo lugar, um novo ligante, fenilmaleimida-metil vinil isocianato, foi sintetizado e usado para derivatizar partículas de sílica para preparar uma fase estacionária polar incorporada. A fase estacionária resultante foi empacotada em uma coluna de aço inoxidável (100 × 1,8 mm id) usando o esquema de empacotamento otimizado. O empacotamento da coluna é auxiliado por vibração mecânica para garantir que um leito homogêneo seja formado dentro da coluna. Avalie a separação em coluna empacotada de misturas de peptídeos consistindo de cinco peptídeos; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) e digestão de tripsina de albumina sérica humana (HAS). Observou-se que a mistura de peptídeos e a digestão de tripsina de HSA se separaram com boa resolução e eficiência. O desempenho de separação da coluna PMP foi comparado com o da coluna Ascentis Express RP-Amide. Observou-se que tanto os peptídeos quanto as proteínas estavam bem resolvidos e eficientes na coluna PMP, que foi mais eficiente do que a coluna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenoglicol), ureia, ácido acético, trimetoxi ortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina sérica humana (HSA), cloreto de amônio, ureia, hexano metildisilazano (HMDS), cloreto de metacriloíla (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoíla (BPO), acetonitrila de grau HPLC (ACN), metanol, 2-propanol e acetona adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Uma mistura de ureia (8 g), polietilenoglicol (8 g) e 8 mL de ácido acético 0,01 N foi agitada por 10 minutos e, em seguida, 24 mL de TMOS foram adicionados sob condições de gelo. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C por 6 horas e, em seguida, a 120 °C por 8 horas em uma autoclave de aço inoxidável. A água foi vertida e o material residual foi seco a 70 °C por 12 horas. A massa macia seca foi moída suavemente em um forno e calcinada a 550 °C por 12 horas. Três lotes foram preparados e caracterizados para examinar a reprodutibilidade no tamanho de partícula, tamanho de poro e área de superfície.
Por meio da modificação da superfície de partículas de sílica com o ligante pré-sintetizado fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP), seguido de polimerização radial com estireno, foi preparado um composto contendo grupos polares. Fase estacionária para agregados e cadeias de poliestireno. O processo de preparação é descrito a seguir.
N-fenilmaleimida (200 mg) e metil vinil isocianato (100 mg) foram dissolvidos em tolueno seco, e 0,1 mL de 2,2'-azoisobutironitrila (AIBN) foi adicionado ao balão de reação para preparar o copolímero de fenilmaleimida-metil vinil isocianato (PMCP). A mistura foi aquecida a 60°C por 3 horas, filtrada e seca em estufa a 40°C por 3 horas.
Partículas de sílica secas (2 g) foram dispersas em tolueno seco (100 mL), agitadas e sonicadas em um balão de fundo redondo de 500 mL por 10 min. PMCP (10 mg) foi dissolvido em tolueno e adicionado gota a gota ao balão de reação por meio de um funil de gotejamento. A mistura foi submetida a refluxo a 100 °C por 8 horas, filtrada e lavada com acetona e seca a 60 °C por 3 horas. Em seguida, partículas de sílica ligadas a PMCP (100 g) foram dissolvidas em tolueno (200 mL) e 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) foi adicionado na presença de 100 µL de dilaurato de dibutilestanho como catalisador. A mistura foi agitada a 50 °C por 8 horas, filtrada e seca a 50 °C por 3 horas.
Estireno (1 mL), peróxido de benzoíla BPO (0,5 mL) e partículas de sílica ligadas a TEMPO-PMCP (1,5 g) foram dispersas em tolueno e purgadas com nitrogênio. A polimerização do estireno foi realizada a 100 °C por 12 horas. O produto resultante foi lavado com metanol e seco a 60 °C durante a noite. O esquema geral da reação é mostrado na Figura 1.
As amostras foram desgaseificadas a 393 K por 1 hora para obter uma pressão residual de menos de 10-3 Torr. A quantidade de N2 adsorvida a uma pressão relativa de P/P0 = 0,99 foi usada para determinar o volume total de poros. A morfologia das partículas de sílica nuas e ligadas por ligantes foi examinada com microscopia eletrônica de varredura (Hitachi High Technologies, Tóquio, Japão). Amostras secas (sílica nua e partículas de sílica ligadas por ligantes) foram colocadas em uma coluna de alumínio usando fita adesiva de carbono. O ouro foi revestido nas amostras usando um revestidor de pulverização catódica Q150T, e uma camada de Au de 5 nm foi depositada nas amostras. Isso melhora a eficiência do processo usando baixas tensões e fornece pulverização catódica fria de grãos finos. Um analisador elementar Thermo Electron (Waltham, MA, EUA) Flash EA1112 foi usado para análise elementar. Um analisador de tamanho de partícula Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 foi usado para obter o tamanho de partícula distribuição. Partículas de sílica nuas e partículas de sílica ligadas por ligante (5 mg cada) foram dispersas em 5 mL de isopropanol, sonicadas por 10 min, agitadas por vortex por 5 min e colocadas na bancada óptica do Mastersizer. A análise termogravimétrica foi realizada a uma taxa de 5 °C por minuto em uma faixa de temperatura de 30 a 800 °C.
Colunas estreitas de aço inoxidável revestidas de vidro com dimensões (100 × 1,8 mm de diâmetro interno) foram embaladas usando o método de embalagem de polpa, aplicando o mesmo procedimento usado na Ref. 31. Uma coluna de aço inoxidável (revestida com vidro, 100 × 1,8 mm de diâmetro interno) com um encaixe de saída contendo um frita de 1 µm foi conectada a um empacotador de polpa (Alltech Deerfield, IL, EUA). Prepare uma suspensão de fase estacionária suspendendo 150 mg de fase estacionária em 1,2 mL de metanol e envie-a para a coluna de armazenamento. O metanol foi usado como solvente da polpa, bem como o solvente propulsor. Encha a coluna sequencialmente aplicando pressões de 100 MP por 10 minutos, 80 MP por 15 minutos e 60 MP por 30 minutos. Durante o empacotamento, vibração mecânica foi aplicada com dois agitadores de coluna GC (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para garantir o empacotamento uniforme da coluna. Feche o empacotador de polpa e libere a pressão lentamente para evitar qualquer dano dentro da coluna. Desconecte a coluna da unidade de empacotamento de polpa e conecte outro encaixe à entrada e ao sistema LC para verificar seu desempenho.
Uma bomba LC (10AD Shimadzu, Japão), injetor (Valco (EUA) C14 W.05) com loop de injeção de 50 nL, desgaseificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), janela capilar UV-VIS foi construída Detector de dispositivo µLC especial (UV-2075) e microcolunas revestidas de vidro. Use tubulação de conexão muito estreita e curta para minimizar o efeito do alargamento de banda extra da coluna. Após o empacotamento, capilares (50 μm id 365 e capilares de união redutora (50 μm) foram instalados na saída de 1/16″ da união redutora. A coleta de dados e o processamento cromatográfico foram feitos usando o software Multichro 2000. Monitoramento a 254 nm Os analitos foram testados para absorbância UV. Os dados cromatográficos foram analisados ​​pelo OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina de soro humano, pó liofilizado, ≥ 96% (eletroforese em gel de agarose) 3 mg misturada com tripsina (1,5 mg), ureia 4,0 M (1 mL) e bicarbonato de amônio 0,2 M (1 mL). A solução foi agitada por 10 minutos e mantida em banho-maria a 37 °C por 6 horas, depois temperada com 1 mL de TFA 0,1%. Filtrar a solução e armazenar abaixo de 4 °C.
A separação das misturas de peptídeos e das digestões de tripsina HSA foram avaliadas separadamente em colunas PMP. Verifique a separação da mistura de peptídeos e da digestão de tripsina de HSA pela coluna PMP e compare os resultados com a coluna Ascentis Express RP-Amide. O número teórico da placa é calculado da seguinte forma:
Imagens SEM de partículas de sílica nuas e partículas de sílica ligadas por ligantes são mostradas na FIG. 2. Imagens SEM de partículas de sílica nuas (A, B) mostram que, em contraste com nossos estudos anteriores, essas partículas são esféricas, nas quais as partículas são alongadas ou têm simetria irregular. A superfície das partículas de sílica ligadas por ligantes (C, D) é mais lisa do que a das partículas de sílica nuas, o que pode ser devido ao revestimento de cadeias de poliestireno na superfície das partículas de sílica.
Imagens de microscópio eletrônico de varredura de partículas de sílica nuas (A, B) e partículas de sílica ligadas por ligantes (C, D).
As distribuições de tamanho de partícula de partículas de sílica nua e partículas de sílica ligadas por ligante são mostradas na Figura 3(A). As curvas de distribuição de tamanho de partícula baseadas no volume mostraram que o tamanho das partículas de sílica aumentou após a modificação química (Fig. 3A). Os dados de distribuição de tamanho de partícula das partículas de sílica do estudo atual e do estudo anterior são comparados na Tabela 1(A). O tamanho de partícula baseado no volume, d(0,5), de PMP é 3,36 μm, em comparação com nosso estudo anterior com valor ad(0,5) de 3,05 μm (partículas de sílica ligadas a poliestireno)34. Este lote teve uma distribuição de tamanho de partícula mais estreita em comparação com nosso estudo anterior devido às proporções variáveis ​​de PEG, ureia, TMOS e ácido acético na mistura de reação. O tamanho de partícula da fase PMP é ligeiramente maior do que o da fase de partículas de sílica ligadas a poliestireno que estudamos anteriormente. Isso significa que a funcionalização da superfície de partículas de sílica com estireno depositou apenas uma camada de poliestireno (0,97 µm) na superfície da sílica, enquanto na fase PMP a espessura da camada era de 1,38 µm.
Distribuição do tamanho de partículas (A) e distribuição do tamanho de poros (B) de partículas de sílica nua e partículas de sílica ligadas a ligantes.
O tamanho dos poros, o volume dos poros e a área de superfície das partículas de sílica do estudo atual são apresentados na Tabela 1(B). Os perfis de PSD das partículas de sílica nuas e das partículas de sílica ligadas por ligantes são mostrados na Figura 3(B). Os resultados são comparáveis ​​aos do nosso estudo anterior. Os tamanhos dos poros das partículas de sílica nua e ligada por ligantes são 310 e 241, respectivamente, o que indica que o tamanho dos poros diminui em 69 após a modificação química, conforme mostrado na Tabela 1(B), e a mudança da curva é mostrada na Figura 3(B). Da mesma forma, o volume dos poros das partículas de sílica diminuiu de 0,67 para 0,58 cm3/g após a modificação química. A área de superfície específica das partículas de sílica atualmente estudadas é de 116 m2/g, o que é comparável ao nosso estudo anterior (124 m2/g). Conforme mostrado na Tabela 1(B), a área de superfície (m2/g) das partículas de sílica também diminuiu de 116 m2/g para 105 m2/g após modificação química.
Os resultados da análise elementar da fase estacionária são mostrados na Tabela 2. A carga de carbono da fase estacionária atual é de 6,35%, que é menor do que a carga de carbono do nosso estudo anterior (partículas de sílica ligadas a poliestireno, 7,93%35 e 10,21%, respectivamente) 42. A carga de carbono da fase estacionária atual é baixa, porque na preparação do SP atual, além do estireno, alguns ligantes polares, como fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) e 4-hidroxi-TEMPO foram usados. A porcentagem em peso de nitrogênio da fase estacionária atual é de 2,21%, em comparação com 0,1735 e 0,85% em peso de nitrogênio em estudos anteriores, respectivamente. Isso significa que a % em peso de nitrogênio é maior na fase estacionária atual devido à fenilmaleimida. Da mesma forma, as cargas de carbono dos produtos (4) e (5) foram de 2,7% e 2,9%, respectivamente, enquanto a carga de carbono do produto final (6) foi de 6,35%, conforme mostrado na Tabela 2. A perda de peso foi verificada com fase estacionária PMP, e a curva TGA é mostrada na Figura 4. A curva TGA mostra uma perda de peso de 8,6%, o que está em boa concordância com a carga de carbono (6,35%) porque os ligantes contêm não apenas C, mas também N, O e H.
O ligante fenilmaleimida-metilvinilisocianato foi escolhido para modificação da superfície de partículas de sílica porque possui grupos fenilmaleimida polares e grupos vinilisocianato. Os grupos isocianato de vinila podem reagir ainda mais com o estireno por polimerização radicalar viva. A segunda razão é inserir um grupo que tenha uma interação moderada com o analito e nenhuma interação eletrostática forte entre o analito e a fase estacionária, uma vez que a fração fenilmaleimida não tem carga virtual em pH normal. A polaridade da fase estacionária pode ser controlada pela quantidade ideal de estireno e pelo tempo de reação da polimerização radicalar livre. A última etapa da reação (polimerização radicalar livre) é crítica e pode alterar a polaridade da fase estacionária. A análise elementar foi realizada para verificar a carga de carbono dessas fases estacionárias. Foi observado que o aumento da quantidade de estireno e do tempo de reação aumentou a carga de carbono da fase estacionária e vice-versa. Os SPs preparados com diferentes concentrações de estireno têm diferentes cargas de carbono. Novamente, a carga essas fases estacionárias em colunas de aço inoxidável e verificar seu desempenho cromatográfico (seletividade, resolução, valor N, etc.). Com base nesses experimentos, uma formulação otimizada foi selecionada para preparar a fase estacionária PMP para garantir polaridade controlada e boa retenção do analito.
Cinco misturas de peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) também foram avaliadas usando uma coluna PMP usando uma fase móvel; 60/40 (v/v) acetonitrila/água (0,1% TFA) a uma vazão de 80 μL/min. Sob condições ótimas de eluição, o número teórico de placas (N) por coluna (100 × 1,8 mm id) é de 20.000 ± 100 (200.000 placas/m²). A Tabela 3 fornece os valores de N para as três colunas PMP e os cromatogramas são mostrados na Figura 5A. Análise rápida em uma coluna PMP em alta vazão (700 μL/min), cinco peptídeos foram eluídos em um minuto, os valores de N foram muito bons, 13.500 ± 330 por coluna (100 × 1,8 mm id), Corresponde a 135.000 placas/m (Figura 5B). Três colunas de tamanho idêntico (100 × 1,8 mm id) foram embalados com três lotes diferentes de fase estacionária PMP para verificar a reprodutibilidade. A concentração do analito para cada coluna foi registrada usando as condições ótimas de eluição e o número de pratos teóricos N e tempo de retenção para separar a mesma mistura de teste em cada coluna. Os dados de reprodutibilidade para as colunas PMP são mostrados na Tabela 4. A reprodutibilidade da coluna PMP se correlaciona bem com valores %RSD muito baixos, conforme mostrado na Tabela 3.
Separação da mistura de peptídeos na coluna PMP (B) e na coluna Ascentis Express RP-Amide (A); fase móvel 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensões da coluna PMP (100 × 1,8 mm id); ordem de eluição analítica dos compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) (encefalina ácida).
Uma coluna PMP (100 × 1,8 mm id) foi avaliada para separação de digestões trípticas de albumina sérica humana em cromatografia líquida de alta eficiência. O cromatograma na Figura 6 mostra que a amostra está bem separada e a resolução é muito boa. As digestões HSA foram analisadas usando uma vazão de 100 µL/min, fase móvel 70/30 acetonitrila/água e 0,1% TFA. Conforme mostrado no cromatograma (Figura 6), a digestão HSA foi dividida em 17 picos correspondentes a 17 peptídeos. A eficiência de separação de cada pico na digestão HSA foi calculada e os valores são fornecidos na Tabela 5.
Uma digestão tríptica de HSA (100 × 1,8 mm id) foi separada em uma coluna PMP; vazão (100 µL/min), fase móvel 60/40 acetonitrila/água com 0,1% TFA.
onde L é o comprimento da coluna, η é a viscosidade da fase móvel, ΔP é a contrapressão da coluna e u é a velocidade linear da fase móvel. A permeabilidade da coluna PMP foi de 2,5 × 10-14 m2, a vazão foi de 25 μL/min e foi utilizado 60/40 v/v ACN/água. A permeabilidade da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) foi semelhante à do nosso estudo anterior Ref.34. A permeabilidade da coluna preenchida com partículas superficialmente porosas é: 1,7 × 10-15 para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 e 2,5 × 10-14 m2 para partículas de 2,6 μm Para 5 Partículas de μm 43. Portanto, a permeabilidade da fase PMP é semelhante à das partículas núcleo-casca de 5 μm.
onde Wx é o peso da coluna preenchida com clorofórmio, Wy é o peso da coluna preenchida com metanol e ρ é a densidade do solvente. Densidades de metanol (ρ = 0,7866) e clorofórmio (ρ = 1,484). A porosidade total das colunas SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 e colunas C18-Ureia 31 que estudamos anteriormente foram 0,63 e 0,55, respectivamente. Isso significa que a presença de ligantes de ureia reduz a permeabilidade da fase estacionária. Por outro lado, a porosidade total da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) é 0,60. A permeabilidade das colunas PMP é menor do que a das colunas preenchidas com partículas de sílica ligadas a C18 porque nas fases estacionárias do tipo C18 os ligantes C18 estão ligados à sílica partículas como cadeias lineares, enquanto em fases estacionárias do tipo poliestireno, uma camada de polímero relativamente espessa é formada ao seu redor. Em um experimento típico, a porosidade da coluna é calculada como:
A Figura 7A,B mostra a coluna PMP (100 × 1,8 mm id) e a coluna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) usando as mesmas condições de eluição (ou seja, 60/40 ACN/H2O e 0,1% TFA). ) do gráfico de van Deemter. Misturas de peptídeos selecionadas (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) foram preparadas em 20 µL/ A vazão mínima para ambas as colunas é de 800 µL/min. Os valores mínimos de HETP na vazão ótima (80 µL/min) para a coluna PMP e a coluna Ascentis Express RP-Amide foram 2,6 µm e 3,9 µm, respectivamente. Os valores de HETP indicam que a eficiência de separação da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) é muito melhor do que a coluna Ascentis Express RP-Amide disponível comercialmente (100 × 1,8 mm id). O gráfico de van Deemter na Fig. 7(A) mostra que a diminuição no valor de N com o aumento do fluxo não é significativa em comparação com nosso estudo anterior. A maior eficiência de separação da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) em comparação com a coluna Ascentis Express RP-Amide é baseada em melhorias no formato das partículas, tamanho e procedimentos complexos de empacotamento da coluna usados ​​no trabalho atual34.
(A) diagrama de van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido usando uma coluna PMP (100 × 1,8 mm id) em 60/40 ACN/H2O com 0,1% TFA. (B) diagrama de van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido usando uma coluna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) em 60/40 ACN/H2O com 0,1% TFA.
Uma fase estacionária de poliestireno com incorporação polar foi preparada e avaliada para separação de misturas de peptídeos sintéticos e digestões de tripsina de albumina sérica humana (HAS) em cromatografia líquida de alta eficiência. O desempenho cromatográfico das colunas PMP para misturas de peptídeos é excelente em eficiência de separação e resolução. O desempenho aprimorado de separação das colunas PMP se deve a uma variedade de razões, como o tamanho de partícula e o tamanho de poro das partículas de sílica, síntese controlada da fase estacionária e empacotamento complexo da coluna. Além da alta eficiência de separação, a baixa contrapressão da coluna em altas vazões é outra vantagem desta fase estacionária. As colunas PMP exibem boa reprodutibilidade e podem ser usadas para análise de misturas de peptídeos e digestão de tripsina de várias proteínas. Pretendemos usar esta coluna para a separação de produtos naturais, compostos bioativos de plantas medicinais e extratos fúngicos em cromatografia líquida. No futuro, as colunas PMP também serão avaliadas para separação de proteínas e anticorpos monoclonais.
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