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Partículas de sílica porosas foram preparadas pelo método sol-gel com algumas modificações para obter partículas de poros largos. Essas partículas foram derivatizadas com N-fenilmaleimida-metilvinil isocianato (PMI) e estireno via polimerização por fragmentação por transferência de cadeia reversa (RAFT) para produzir poliamidas intercaladas com N-fenilmaleimida. Fase estacionária de estireno (PMP). Colunas de aço inoxidável de diâmetro estreito (100 × 1,8 mm de diâmetro interno) foram preenchidas com um empacotamento de suspensão. O desempenho cromatográfico da coluna PMP foi avaliado para separar uma mistura de peptídeos sintéticos consistindo de cinco peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoácido encefalina) e hidrolisado tríptico de albumina sérica humana (HAS). Em condições ótimas de eluição, o número teórico de placas com a mistura de peptídeos atingiu 280.000 placas/m². Comparando o desempenho de separação da coluna desenvolvida com a coluna comercial Ascentis Express RP-Amide, observou-se que a eficiência de separação da coluna PMP foi superior à da coluna comercial em termos de eficiência de separação e resolução.
A indústria biofarmacêutica tornou-se um mercado global em expansão, com um aumento significativo de participação de mercado nos últimos anos. Com o crescimento explosivo da indústria biofarmacêutica1,2,3, há uma grande necessidade de análises de peptídeos e proteínas. Além do peptídeo alvo, diversas impurezas são formadas durante a síntese de peptídeos, sendo necessária a purificação cromatográfica para obter a pureza desejada do peptídeo. A análise e a caracterização de proteínas em fluidos corporais, tecidos e células são tarefas extremamente desafiadoras devido ao grande número de espécies potencialmente detectáveis ​​presentes em uma única amostra. Embora a espectrometria de massas seja uma ferramenta eficaz para o sequenciamento de peptídeos e proteínas, se tais amostras forem introduzidas diretamente no espectrômetro de massas, a separação será insatisfatória. Esse problema pode ser resolvido realizando-se cromatografia líquida (LC) antes da análise por MS, o que reduzirá a quantidade de analitos que entram no espectrômetro de massas em um determinado momento4,5,6. Além disso, os analitos podem se concentrar em uma região estreita durante a separação em fase líquida, concentrando-os e aumentando a sensibilidade da detecção por MS. A cromatografia líquida (LC) avançou significativamente na última década e se tornou um método amplamente utilizado para análise proteômica7,8,9,10.
A cromatografia líquida de fase reversa (RP-LC) é amplamente utilizada para purificar e separar misturas de peptídeos usando sílica modificada com octadecil (ODS) como fase estacionária11,12,13. No entanto, devido à sua estrutura complexa e natureza anfotérica,14,15 as fases estacionárias da RP não podem fornecer uma separação satisfatória de peptídeos e proteínas. Portanto, a análise de peptídeos e proteínas com fragmentos polares e apolares requer fases estacionárias especialmente projetadas para interagir e reter esses analitos16. A cromatografia mista, que oferece interações multimodais, pode ser uma alternativa à RP-LC para separar peptídeos, proteínas e outras misturas complexas. Várias fases estacionárias do tipo misto foram preparadas e colunas preenchidas com essas fases estacionárias foram usadas para separar peptídeos e proteínas17,18,19,20,21. Devido à presença de grupos polares e não polares, fases estacionárias de modo misto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalação polar/RPLC) são adequadas para a separação de peptídeos e proteínas22,23,24,25,26,27,28. , fases estacionárias intercaladas polares com grupos polares covalentemente ligados mostram boas capacidades de separação e seletividade única para analitos polares e não polares porque a separação depende da interação entre o analito e a fase estacionária Interações multimodais29,30,31,32. Recentemente, Zhang et al. 30 obtiveram fases estacionárias terminadas em beenil de poliaminas e separaram com sucesso hidrocarbonetos, antidepressivos, flavonoides, nucleosídeos, estrogênios e alguns outros analitos. O material estacionário polar incorporado tem grupos polares e não polares, então ele pode ser usado para separar peptídeos e proteínas em partes hidrofóbicas e hidrofílicas. Colunas polares em linha (por exemplo, colunas C18 com amida em linha) estão disponíveis sob o nome comercial de colunas Ascentis Express RP-Amide, mas essas colunas foram usadas apenas para a análise da amina 33.
No presente estudo, uma fase estacionária de incorporação polar (N-fenilmaleimida, poliestireno de incorporação) foi preparada e avaliada para separação de peptídeos e clivagem de HSA tríptica. A seguinte estratégia foi usada para preparar a fase estacionária. Partículas de sílica porosas foram preparadas de acordo com os procedimentos descritos em nossas publicações anteriores, com algumas mudanças nos esquemas de preparação 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. As proporções de ureia, polietilenoglicol (PEG), TMOS e ácido acético aquoso foram ajustadas para obter partículas de sílica com grandes tamanhos de poros. Em segundo lugar, um novo ligante fenilmaleimida-metilvinil isocianato foi sintetizado e suas partículas de sílica derivatizadas foram usadas para preparar fases estacionárias de incorporação polar. A fase estacionária obtida foi empacotada em uma coluna de aço inoxidável (diâmetro interno 100 × 1,8 mm) de acordo com um esquema de empacotamento otimizado. O empacotamento da coluna é auxiliado por vibração mecânica para garantir uma camada uniforme dentro da coluna. A coluna empacotada foi avaliada para separação de uma mistura de peptídeos consistindo de cinco peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptídeo leucina-encefalina) e hidrolisados ​​trípticos de albumina sérica humana (HSA). Foi observado que a mistura de peptídeos e o digesto tríptico de HSA separaram-se com boa resolução e eficiência. A eficiência de separação da coluna PMP foi comparada à da coluna Ascentis Express RP-Amide. Foi observado que peptídeos e proteínas têm boa resolução e alta eficiência de separação na coluna PMP, e a eficiência de separação da coluna PMP é maior que a da coluna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenoglicol), ureia, ácido acético, trimetoxiortossilicato (TMOS), trimetilclorossilano (TMCS), tripsina, albumina sérica humana (HSA), cloreto de amônio, ureia, hexametilmetacriloildissilazano (HMDS), cloreto de metacriloíla (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoíla (BPO), acetonitrila (ACN) para HPLC, metanol, 2-propanol e acetona. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, EUA).
Uma mistura de ureia (8 g), polietilenoglicol (8 g) e 8 ml de ácido acético 0,01 N foi agitada por 10 minutos, e 24 ml de TMOS foram adicionados sob resfriamento com gelo. A mistura reacional foi aquecida a 40 °C por 6 horas e, em seguida, a 120 °C por 8 horas em uma autoclave de aço inoxidável. A água foi decantada e o resíduo foi seco a 70 °C por 12 horas. Os blocos macios secos foram moídos suavemente e calcinados em uma estufa a 550 °C por 12 horas. Três lotes foram preparados e caracterizados para testar a reprodutibilidade dos tamanhos de partícula, tamanho de poro e área superficial.
Grupo polar e fase estacionária para cadeias de poliestireno. O procedimento de preparação é descrito a seguir.
N-fenilmaleimida (200 mg) e metil vinil isocianato (100 mg) foram dissolvidos em tolueno anidro e, em seguida, 0,1 ml de 2,2'-azoisobutironitrila (AIBN) foi adicionado ao balão de reação para obter um copolímero de fenilmaleimida e metil vinil isocianato (PMCP). ) A mistura foi aquecida a 60°C por 3 horas, filtrada e seca em estufa a 40°C por 3 horas.
Partículas de sílica secas (2 g) foram dispersas em tolueno seco (100 ml), agitadas e sonicadas por 10 min em um balão de fundo redondo de 500 ml. PMCP (10 mg) foi dissolvido em tolueno e adicionado gota a gota ao balão de reação por meio de um funil de adição. A mistura foi refluxada a 100 °C por 8 horas, filtrada, lavada com acetona e seca a 60 °C por 3 horas. Em seguida, as partículas de sílica associadas ao PMCP (100 g) foram dissolvidas em tolueno (200 ml) e 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) foi adicionado na presença de 100 μl de dilaurato de dibutilestanho como catalisador. A mistura foi agitada a 50 °C por 8 horas, filtrada e seca a 50 °C por 3 horas.
Estireno (1 ml), peróxido de benzoíla BPO (0,5 ml) e partículas de sílica ligadas a TEMPO-PMCP (1,5 g) foram dispersos em tolueno e purgados com nitrogênio. A polimerização do estireno foi realizada a 100 °C por 12 horas. O produto resultante foi lavado com metanol e seco durante a noite a 60 °C. O esquema geral da reação é mostrado na Figura 1.
As amostras foram desgaseificadas a 393 K por 1 h até que uma pressão residual de menos de 10–3 Torr fosse obtida. A quantidade de N2 adsorvida à pressão relativa P/P0 = 0,99 foi usada para determinar o volume total de poros. A morfologia das partículas de sílica pura e ligadas ao ligante foi examinada usando um microscópio eletrônico de varredura (Hitachi High Technologies, Tóquio, Japão). Amostras secas (sílica pura e partículas de sílica ligadas ao ligante) foram colocadas em hastes de alumínio usando fita de carbono. Ouro foi depositado na amostra usando um dispositivo de pulverização catódica Q150T, e uma camada de Au de 5 nm de espessura foi depositada na amostra. Isso melhora a eficiência do processo de baixa tensão e fornece pulverização a frio fina. A análise elementar foi realizada usando um analisador de composição elementar Thermo Electron (Waltham, MA, EUA) Flash EA1112. Um analisador de tamanho de partículas Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 foi usado para obter a distribuição do tamanho de partículas. Partículas de sílica não revestidas e partículas de sílica ligadas ao ligante (5 mg cada) foram dispersas em 5 ml de isopropanol, sonicadas por 10 minutos, agitadas por 5 minutos e colocadas em uma bancada óptica Mastersizer. A análise termogravimétrica foi realizada a uma taxa de 5 °C por minuto na faixa de temperatura de 30 a 800 °C.
Colunas de aço inoxidável de furo estreito revestidas com fibra de vidro com dimensões (DI 100 × 1,8 mm) foram embaladas pelo método de enchimento de suspensão seguindo o mesmo procedimento da referência 31. A coluna de aço inoxidável (revestida com fibra de vidro, DI 100 × 1,8 mm) e uma saída contendo uma frita de 1 µm foram conectadas a uma máquina de embalagem de suspensão (Alltech Deerfield, IL, EUA). Prepare uma suspensão da fase estacionária suspendendo 150 mg da fase estacionária em 1,2 ml de metanol e alimentando-a em uma coluna reservatório. O metanol foi usado como solvente da suspensão e solvente de controle. Empacote a coluna aplicando uma sequência de pressão de 100 MP por 10 min, 80 MP por 15 min e 60 MP por 30 min. O processo de empacotamento usou dois vibradores de coluna de cromatografia gasosa (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para vibração mecânica a fim de garantir o empacotamento uniforme da coluna. Feche o compactador de polpa e libere a pressão lentamente para evitar danos à coluna. A coluna foi desconectada do bocal de polpa e outro encaixe foi conectado à entrada e ao sistema de LC para testar seu funcionamento.
Uma MLC personalizada foi construída usando uma bomba LC (10AD Shimadzu, Japão), um amostrador com um circuito de injeção de 50 nL (Valco (EUA) C14 W.05), um desgaseificador de membrana (Shimadzu DGU-14A) e uma janela capilar UV-VIS. Dispositivo detector (UV-2075) e microcoluna esmaltada. Use tubos de conexão muito estreitos e curtos para minimizar o efeito da expansão adicional da coluna. Após o enchimento da coluna, instale um capilar (50 µm id 365) na saída da junção redutora de 1/16" e instale um capilar (50 µm) da junção redutora. A coleta de dados e o processamento do cromatograma são realizados usando o software Multichro 2000. A 254 nm, a absorbância UV dos analitos em questão foi monitorada a 0. Os dados cromatográficos foram analisados ​​usando OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina sérica humana, pó liofilizado, ≥ 96% (eletroforese em gel de agarose), 3 mg misturados com tripsina (1,5 mg), ureia 4,0 M (1 ml) e bicarbonato de amônio 0,2 M (1 ml). A solução foi agitada por 10 min e mantida em banho-maria a 37 °C por 6 h, sendo então dissolvida com 1 ml de TFA a 0,1%. Filtrar a solução e armazenar abaixo de 4 °C.
A separação de uma mistura de peptídeos e HSA de digestão tríptica em uma coluna PMP foi avaliada separadamente. Verifique a hidrólise tríptica de uma mistura de peptídeos e HSA separados por uma coluna PMP e compare os resultados com uma coluna Ascentis Express RP-Amide. O número teórico de pratos é calculado usando a seguinte equação:
Imagens de MEV de partículas de sílica pura e partículas de sílica ligadas a ligantes são mostradas na Figura 2. As imagens de MEV de partículas de sílica pura (A, B) mostram um formato esférico no qual as partículas são alongadas ou apresentam simetria irregular em comparação com nossos estudos anteriores. A superfície das partículas de sílica ligadas ao ligante (C, D) é mais lisa do que a das partículas de sílica pura, o que pode ser devido às cadeias de poliestireno que recobrem a superfície das partículas de sílica.
Micrografias eletrônicas de varredura de partículas de sílica pura (A, B) e partículas de sílica ligadas ao ligante (C, D).
A distribuição do tamanho de partícula de partículas de sílica pura e partículas de sílica ligadas a ligantes é mostrada na Fig. 2.3(A). As curvas de distribuição volumétrica do tamanho de partícula mostraram que o tamanho de partícula de sílica aumentou após a modificação química (Fig. 3A). Os dados de distribuição do tamanho de partícula de sílica do estudo atual e do estudo anterior são comparados na Tabela 1(A). O tamanho de partícula volumétrico d(0,5) de PMP foi de 3,36 µm, comparado ao valor ad(0,5) de 3,05 µm em nosso estudo anterior (partículas de sílica ligadas a poliestireno)34. Devido à mudança na proporção de PEG, ureia, TMOS e ácido acético na mistura de reação, a distribuição do tamanho de partícula deste lote foi mais estreita em comparação ao nosso estudo anterior. O tamanho de partícula da fase PMP é ligeiramente maior do que o da fase de partículas de sílica ligadas a poliestireno que estudamos anteriormente. Isso significa que a funcionalização da superfície das partículas de sílica com estireno depositou apenas uma camada de poliestireno (0,97 µm) na superfície da sílica, enquanto na fase PMP a espessura da camada foi de 1,38 µm.
Distribuição do tamanho de partículas (A) e distribuição do tamanho de poros (B) de partículas de sílica pura e partículas de sílica ligadas ao ligante.
O tamanho dos poros, o volume dos poros e a área de superfície das partículas de sílica usadas neste estudo são mostrados na Tabela 1 (B). Os perfis de PSD das partículas de sílica pura e das partículas de sílica ligadas ao ligante são mostrados na Figura 3 (B). Os resultados foram comparáveis ​​aos do nosso estudo anterior34. Os tamanhos dos poros das partículas de sílica pura e ligada ao ligante foram 310 Å e 241 Å, respectivamente, indicando que, após a modificação química, o tamanho dos poros diminuiu em 69 Å, conforme mostrado na Tabela 1 (B), e a curva de deslocamento é mostrada na Figura 1. A área de superfície específica das partículas de sílica no estudo atual é de 116 m²/g, o que é comparável ao nosso estudo anterior (124 m²/g). Conforme mostrado na Tabela 1 (B), a área de superfície (m²/g) das partículas de sílica após a modificação química também diminuiu de 116 m²/g para 105 m²/g.
Os resultados da análise elementar da fase estacionária são apresentados na Tabela 2. O teor de carbono da fase estacionária atual é de 6,35%, o que é menor do que em nosso estudo anterior (partículas de sílica associadas ao poliestireno, 7,93%35 e 10,21%, respectivamente) 42. O teor de carbono da fase estacionária atual abaixo, uma vez que alguns ligantes polares, como fenilmaleimida metil vinil isocianato (PCMP) e 4-hidroxi-TEMPO foram usados ​​além do estireno na preparação de SP. A porcentagem em peso de nitrogênio na fase estacionária atual é de 2,21% em comparação com 0,1735 e 0,85% em estudos anteriores42. Isso significa que a fase estacionária atual tem uma alta porcentagem em peso de nitrogênio devido à fenilmaleimida. Da mesma forma, os produtos (4) e (5) têm um teor de carbono de 2,7% e 2,9%, respectivamente, enquanto o produto final (6) tem um teor de carbono de 6,35%, conforme mostrado na Tabela 2. A análise termogravimétrica (TGA) foi usada na fase estacionária do PMP para testar a perda de peso, e a curva TGA é mostrada na Figura 4. A curva TGA mostra uma perda de peso de 8,6%, o que está em boa concordância com o teor de carbono (6,35%), uma vez que os ligantes contêm não apenas C, mas também N, O e H.
O ligante fenilmaleimida-metilvinil isocianato foi escolhido para modificar a superfície das partículas de sílica devido aos seus grupos polares fenilmaleimida e vinilisocianato. Os grupos vinilisocianato podem reagir ainda mais com o estireno por polimerização radicalar viva. A segunda razão é inserir um grupo que tenha interações moderadas com o analito e nenhuma interação eletrostática forte entre o analito e a fase estacionária, uma vez que a porção fenilmaleimida não tem carga virtual em pH normal. A polaridade da fase estacionária pode ser controlada pela quantidade ideal de estireno e pelo tempo de reação da polimerização radicalar livre. A etapa final da reação (polimerização radicalar livre) é crítica, pois altera a polaridade da fase estacionária. A análise elementar foi realizada para verificar o teor de carbono nessas fases estacionárias. Observou-se que o aumento da quantidade de estireno e do tempo de reação aumenta o teor de carbono da fase estacionária e vice-versa. SPs preparados com diferentes concentrações de estireno têm diferentes cargas de carbono. Da mesma forma, essas fases estacionárias foram colocadas em colunas de aço inoxidável e suas características cromatográficas (seletividade, resolução, valor N, etc.) foram verificadas. Com base nesses experimentos, foi escolhida uma composição otimizada para a preparação da fase estacionária PMP, a fim de proporcionar polaridade controlada e boa retenção do analito.
A coluna PMP também foi avaliada para a análise de cinco misturas de peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) usando a capacidade da fase móvel. 60/40 (v/v) ACN/água (0,1% TFA) a uma vazão de 80 µl/min. Sob condições ótimas de eluição (200.000 placas/m), o número teórico de placas (N) por coluna (100 × 1,8 mm) é de 20.000 ± 100. Os valores de N para as três colunas PMP são mostrados na Tabela 3 e os cromatogramas são mostrados na Figura 5A. Análise rápida em alta vazão (700 µl/min) em coluna PMP, cinco peptídeos eluídos em um minuto, excelente valor de N de 13.500 ± 330 por coluna (100 x 1,8 mm de diâmetro), equivalente a 135.000 placas/m (Fig. 5B). Três colunas do mesmo tamanho (diâmetro interno de 100 x 1,8 mm) foram preenchidas com três lotes diferentes de fase estacionária PMP para testar a reprodutibilidade. Os analitos foram registrados para cada coluna, separando a mesma mistura de teste em cada coluna usando condições de eluição ótimas, número teórico de placas N e tempo de retenção. Os dados de reprodutibilidade para as colunas PMP são mostrados na Tabela 4. A reprodutibilidade da coluna PMP correlacionou-se bem com valores de %RSD muito baixos, como mostrado na Tabela 3.
Separação de misturas de peptídeos em uma coluna PMP (B) e uma coluna Ascentis Express RP-Amide (A), fase móvel 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensões da coluna PMP (100 x 1,8 mm id), ordem de eluição dos compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (encefalina de ácido leucico).
Uma coluna PMP (diâmetro interno de 100 x 1,8 mm) foi avaliada para a separação do hidrolisado tríptico da albumina sérica humana por HPLC. O cromatograma da Figura 6 mostra que as amostras são bem separadas, com resolução muito boa. As soluções de HSA foram analisadas usando uma vazão de 100 μl/min, uma fase móvel de 70/30 acetonitrila/água e 0,1% de TFA. A clivagem da HSA foi dividida em 17 picos, conforme mostrado no cromatograma (Fig. 6), correspondendo a 17 peptídeos. As eficiências de separação de picos individuais do hidrolisado de HSA foram calculadas e os valores são mostrados na Tabela 5.
Os hidrolisados ​​trípticos de HSA foram separados em uma coluna PMP (diâmetro interno 100 x 1,8 mm), vazão (100 μl/min), fase móvel 60/40 acetonitrila/água e 0,1% TFA.
onde L é o comprimento da coluna, η é a viscosidade da fase móvel, ΔP é a contrapressão da coluna e u é a velocidade linear da fase móvel. A permeabilidade da coluna PMP foi de 2,5 × 10–14 m2, a vazão foi de 25 µl/min, 60/40 v/v foi usado. ACN/água. A permeabilidade da coluna PMP (ID 100 × 1,8 mm) foi semelhante à do nosso estudo Ref.34 anterior. A permeabilidade de uma coluna preenchida com partículas superficialmente porosas é de 1,7 × 10 .6 µm, 2,5 × 10-14 m2 para partículas de 5 µm43. Portanto, a permeabilidade da fase PMP é semelhante à permeabilidade de partículas núcleo-casca com um tamanho de 5 µm.
onde Wx é a massa da coluna preenchida com clorofórmio, Wy é a massa da coluna preenchida com metanol e ρ é a densidade do solvente. Densidade do metanol (ρ = 0,7866) e do clorofórmio (ρ = 1,484). A porosidade total da coluna de partículas de sílica-C18 (100 × 1,8 mm DI)34 e da nossa coluna de C18-ureia31 previamente estudada foi de 0,63 e 0,55, respectivamente. Isso significa que a presença de ligantes de ureia reduz a permeabilidade da fase estacionária. Por outro lado, a porosidade total da coluna PMP (diâmetro interno de 100 × 1,8 mm) é de 0,60. As colunas PMP são menos permeáveis ​​do que colunas preenchidas com partículas de sílica ligadas a C18 porque nas fases estacionárias do tipo C18 os ligantes C18 estão ligados às partículas de sílica em cadeias lineares, enquanto nas fases estacionárias do tipo poliestireno um polímero relativamente espesso é formado ao redor das partículas. camada A. Em um experimento típico, a porosidade da coluna é calculada da seguinte forma:
As figuras 7A e B mostram os gráficos de Van Deemter para uma coluna PMP (diâmetro interno 100 x 1,8 mm) e uma coluna Ascentis Express RP-Amide (diâmetro interno 100 x 1,8 mm) sob as mesmas condições de eluição, 60/40 ACN/H2O e 0,1% TFA de 20 µl/min a 800 µl/min em ambas as colunas. Os valores mínimos de HETP na vazão ótima (80 µl/min) foram 2,6 µm e 3,9 µm para a coluna PMP e a coluna Ascentis Express RP-Amide, respectivamente. Os valores de HETP mostram que a eficiência de separação da coluna PMP (diâmetro interno 100 x 1,8 mm) é muito maior do que a da coluna Ascentis Express RP-Amide comercialmente disponível (diâmetro interno 100 x 1,8 mm). O gráfico de van Deemter na Figura 7(A) mostra que a diminuição do valor de N não é significativamente maior com o aumento do fluxo em comparação com nosso estudo anterior. A maior eficiência de separação da coluna PMP (di 100 × 1,8 mm) em comparação com a coluna Ascentis Express RP-Amide se baseia na forma e no tamanho aprimorados das partículas e no sofisticado procedimento de empacotamento da coluna utilizado no trabalho atual34.
(A) Diagrama de Van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido em uma coluna PMP (id 100 x 1,8 mm) em 60/40 ACN/H2O com 0,1% de TFA. (B) Diagrama de Van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido em uma coluna Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) em 60/40 ACN/H2O com 0,1% de TFA.
Uma fase estacionária polar de poliestireno intercalado foi preparada e avaliada para a separação de uma mistura de peptídeos sintéticos e hidrolisado tríptico de albumina sérica humana (HSA) em cromatografia líquida de alta eficiência. O desempenho cromatográfico das colunas PMP para misturas de peptídeos é excelente em termos de eficiência de separação e resolução. A eficiência de separação aprimorada das colunas PMP se deve a vários motivos, como tamanho de partícula de sílica e tamanho de poro, síntese controlada de fases estacionárias e materiais complexos de empacotamento da coluna. Além da alta eficiência de separação, outra vantagem dessa fase estacionária é a baixa contrapressão da coluna em altas vazões. As colunas PMP são altamente reprodutíveis e podem ser usadas para analisar misturas de peptídeos e digestão tríptica de várias proteínas. Pretendemos usar essa coluna para a separação de compostos bioativos de produtos naturais, extratos de plantas medicinais e cogumelos em cromatografia líquida. No futuro, as colunas PMP também serão avaliadas para a separação de proteínas e anticorpos monoclonais.
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