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O tremoço Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) é uma leguminosa utilizada para produção de alimentos e melhoramento do solo.A expansão global da NLL como cultura atraiu muitos fungos patogênicos, incluindo a antracnose do tremoço, que causa a devastadora doença da antracnose.Dois alelos, Lanr1 e AnMan, que conferem maior resistência, foram usados ​​na reprodução de NLL, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos.Neste estudo, os marcadores Lanr1 e AnMan foram usados ​​para rastrear amostras europeias de NLL.O teste da vacina em um ambiente controlado confirmou a eficácia de ambos os doadores resistentes.O perfil de expressão gênica diferencial foi realizado em linhagens resistentes e suscetíveis representativas.A resistência à antracnose foi associada à superexpressão dos termos da ontologia gênica “GO:0006952 Resposta de Defesa”, “GO:0055114 Processo Redox” e “GO:0015979 Fotossíntese”.Além disso, a linhagem Lanr1(83A:476) apresentou reprogramação significativa do transcriptoma rapidamente após a inoculação, enquanto as outras linhagens apresentaram um atraso nessa resposta em cerca de 42 horas.As respostas de defesa estão associadas aos genes TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, 10 proteínas envolvidas na patogênese, proteínas de transferência de lipídios, endoglucana-1,3-β-glucosidase, proteínas da parede celular rica em glicina e genes da via reativa do oxigênio.As primeiras respostas a 83A:476, incluindo supressão cuidadosa de genes associados à fotossíntese, coincidiram com proteção bem-sucedida durante a fase de crescimento vegetativo da biologia fúngica, sugerindo que um efetor desencadeia a imunidade.A reação de Mandeloop é desacelerada, assim como o arrasto horizontal geral.
O tremoço de folhas estreitas (NLL, Lupinus angustifolius L.) é um cereal rico em proteínas originário da região mediterrânea ocidental1,2.Atualmente é cultivada como uma cultura alimentar para animais e humanos.Também é considerado adubo verde em sistemas de rotação de culturas devido à fixação de nitrogênio por bactérias simbióticas fixadoras de nitrogênio e melhoria geral da estrutura do solo.NLL passou por um rápido processo de domesticação no século passado e ainda está sob alta pressão reprodutiva3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Com o cultivo generalizado de NLL, a sucessão de fungos patogênicos desenvolveu novos nichos agrícolas e causou novas doenças destruidoras de culturas. O mais marcante para os produtores e criadores de tremoços foi o aparecimento da antracnose, causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O mais marcante para os produtores e criadores de tremoços foi o aparecimento da antracnose, causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного пат огенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O mais notável para os produtores e criadores de tremoços foi o surgimento da antracnose causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说,最引人注目的是炭疽病的出现,它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Fei ler & Hagedorn13 引起的。Cabelo ed。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемог о патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O mais impressionante para os produtores e criadores de tremoços é o surgimento da antracnose causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Os primeiros relatos da doença vieram do Brasil e dos Estados Unidos, com sintomas típicos aparecendo em 1912 e 1929, respectivamente.No entanto, após cerca de 30 anos, o patógeno foi designado como Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld em Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .e H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。e H. Schlenk, .A fenotipagem preliminar da doença feita em meados do século 20 mostrou alguma resistência em acessos NLL e tremoço amarelo (L. luteus L.), mas todos os acessos de tremoço branco (L. albus L.) testados eram altamente suscetíveis15,16.Estudos demonstraram que o desenvolvimento da antracnose está associado ao aumento da precipitação (umidade do ar) e temperatura (na faixa de 12-28°C), levando a uma violação da resistência em temperaturas mais altas17,18.Assim, o aquecimento global em curso levou à propagação da antracnose.No entanto, a doença foi observada na França (1982) e na Ucrânia (1983) como um prenúncio de uma ameaça iminente, mas aparentemente foi ignorada pela indústria do tremoço na época20,21.Alguns anos depois, essa doença devastadora se espalhou pelo mundo e também afetou os principais países produtores de tremoço, como Austrália, Polônia e Alemanha22,23,24.Após um surto de antracnose em meados da década de 1990, uma extensa triagem resultou na identificação de vários doadores resistentes em amostras de NLL19.A resistência de NLL à antracnose é controlada por dois alelos dominantes separados encontrados em diferentes fontes de germoplasma: Lanr1 na cultivar Tanjil e Wonga e AnMan na cultivar.Mandalay 25, 26. Esses alelos complementam os marcadores moleculares que dão suporte à seleção de germoplasma resistente em programas de melhoramento25,26,27,28,29,30.A linhagem resistente 83A:476 carregando o alelo Lanr1 foi cruzada com a linha selvagem suscetível P27255 para obter uma população RIL segregando para resistência à antracnose, o que tornou possível atribuir o locus Lanr1 ao cromossomo NLL-1131, 32, 33. cromossomo (NLL-11), mas em posições diferentes29,34,35.No entanto, devido ao pequeno número de RILs e à grande distância genética entre marcadores e alelos correspondentes, nenhuma conclusão confiável pode ser tirada sobre seus genes subjacentes.Por outro lado, o uso da genética reversa em tremoços é difícil devido ao seu baixíssimo potencial de regeneração, o que torna a manipulação genética incômoda37.
O desenvolvimento de germoplasma domesticado portador do alelo desejado em estado homozigoto, como 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), abriu as portas para o estudo da resistência à antracnose diante da presença de combinações opostas de alelos em populações silvestres.Possibilidades de mecanismos moleculares.Compare as respostas de defesa geradas por genótipos específicos.Este estudo avaliou a resposta inicial do transcriptoma de NLL à vacinação com C. lupini.Primeiro, um painel europeu de germoplasma NLL contendo 215 linhagens foi rastreado usando marcadores moleculares que marcam os alelos Lanr1 e AnMan.A fenotipagem da antracnose foi então realizada em 50 linhagens NLL, previamente selecionadas para marcadores moleculares, sob condições controladas.Com base nesses experimentos, quatro linhagens que diferem na resistência à antracnose e na composição alélica Lanr1/AnMan foram selecionadas para perfis de expressão gênica de defesa diferencial usando duas abordagens complementares: sequenciamento de RNA de alto rendimento e quantificação por PCR em tempo real.
A triagem de um conjunto de germoplasma NLL (N = 215) com marcadores Lanr1 (Anseq3 e Anseq4) e AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) mostrou que apenas uma linha (95726, perto de Salamanca-b) amplifica o alelo “resistência” para todos os marcadores, enquanto “Presença de alelos 'suscetíveis'” encontrou a proporção de todos os marcadores em 158 (~73,5 %) linhas.Treze linhagens produziram dois alelos “resistentes” do marcador Lanr1 e 8 linhagens produziram alelos “resistentes” de Lanr1.marcador.O alelo de “resistência” do marcador AnMan (Tabela Suplementar S1).Duas linhagens eram heterozigotas para o marcador Anseq3 e uma heterozigota para o marcador AnManM1.42 linhagens (19,5%) carregavam fases opostas dos alelos Anseq3 e Anseq4, indicando uma alta frequência de recombinação entre esses dois loci.Fenótipos de antracnose sob condições controladas (Tabela Suplementar S2) revelaram variabilidade na resistência dos genótipos testados, o que se refletiu na gravidade da antracnose.As diferenças nas pontuações médias variaram de 1,8 (moderadamente resistente) a 6,9 (suscetível) e as diferenças de peso da planta variaram de 0,62 (suscetível) a 4,45 g (resistente). Houve uma correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para escores de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para peso da planta, P < 0,0001) e também entre esses dois parâmetros (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). Houve correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para escores de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para peso da planta, P < 0,0001) e também entre esses dois parâmetros (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), e а также между этими двумя параметр ами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Foi encontrada uma correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para escores de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para peso da planta, P < 0,0001), bem como entre esses dois parâmetros (- 0,59 e -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51，P = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。0,5 1, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001)和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тя жести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0 ,77, P <0,0001. Houve uma correlação significativa entre os valores observados em duplicata (escore de gravidade da doença 0,51, P = 0,00017 e peso da planta 0,61, P < 0,0001) e entre esses dois parâmetros (-0,59 e -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Os sintomas típicos observados em plantas suscetíveis incluem torção e torção do caule semelhante a uma estrutura de “arco de pastor”, seguida de lesões ovais com esporozoítos laranja/rosa (Fig. 1 complementar).Os acessos australianos portadores dos genes Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) são moderadamente resistentes, 0,0331 e 0,0036).Algumas linhagens que também carregam os alelos Lanr1 e/ou AnMan “resistentes” apresentam sintomas da doença.
Curiosamente, algumas linhagens NLL sem qualquer alelo marcador “resistente” revelaram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor P < 0,0001 para pontuação e 0,001 para peso da planta) e População B-549/79b (valor P < 0,0001 para pontuação e não significativo nt para peso). Curiosamente, algumas linhagens NLL sem qualquer alelo marcador “resistente” revelaram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor P < 0,0001 para pontuação e 0,001 para peso da planta) e População B-549/79b (valor P < 0,0001 para pontuação e não significativo nt para peso). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высоки й уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популя ции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosamente, várias linhagens NLL sem qualquer alelo marcador 'resistente' mostraram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor P < 0,0001 para avaliação e 0,001 para peso da planta) e população B-549/79b (valor P < 0,0001 para avaliação e não significativo para peso).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.0 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 É interessante que alguns sistemas NLL que não possuem marcadores “antigênicos” apresentam alta resistência horizontal (equivalente aos genes Lanr1 ou AnMan ou superior), como Boregine (ambos os parâmetros P < 0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso da planta 0,001) e cepa B-549/79b (valor P < 0,0001, peso não significativo). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие у ровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обои х параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) e популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, ма сса незначительна). Curiosamente, algumas linhagens NLL sem alelos marcadores de 'resistência' mostraram altos níveis de resistência à antracnose (comparável ou superior aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P para ambos os parâmetros <0,0001), Bojar (valor P <0,0001, peso da planta 0,001) e população B-549/79b (valor P <0,0001, peso não significativo).Este fenômeno sugere a possibilidade de uma nova fonte genética de resistência, explicando a observada falta de correlação entre os genótipos marcadores e os fenótipos da doença (valores de P de ~0,42 a ~0,98).Assim, o teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou que os dados sobre resistência à antracnose foram distribuídos aproximadamente normalmente para pontuações (valores de P 0,25 e 0,11) e massa da planta (valores de P 0,47 e 0,55), sugerindo que eu hipotetize que mais alelos do que Lanr1 e AnMan estão envolvidos.
Com base nos resultados da triagem de resistência à antracnose, 4 linhagens foram selecionadas para análise do transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e População 22660. Essas linhagens foram retestadas para resistência ao antraz em experimentos de inoculação por sequenciamento de RNA, desde que fossem as mesmas do teste anterior.Os valores da pontuação foram os seguintes: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e população 22660 (6,11 ± 1,29).
O protocolo Illumina NovaSeq 6000 alcançou uma média de 40,5 pares Mread por amostra (29,7 a 54,4 Mreads) (Tabela Suplementar S3).As pontuações de alinhamento na sequência de referência variaram de 75,5% a 88,6%.A correlação média dos dados de contagem de leitura entre variantes experimentais entre réplicas biológicas variou de 0,812 a 0,997 (média de 0,959). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não revelaram expressão e os outros 4.785 genes foram expressos em nível insignificante (média base < 5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não revelaram expressão e os outros 4.785 genes foram expressos em nível insignificante (média base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировалис ь на незначительном уровне (базовое среднее <5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não mostraram expressão e os 4.785 genes restantes foram expressos em um nível insignificante (média de base <5).在分析的35,170 个基因中, 2917 个没有表达,其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительну ю экспрессию (базовое среднее значение <5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não foram expressos e os 4.785 genes restantes tiveram expressão insignificante (média base <5).Assim, o número de genes considerados expressos (média base ≥ 5) durante o experimento foi de 27.468 (78,1%) (Tabela Suplementar S4).
Desde o primeiro momento, todas as linhagens NLL responderam à inoculação de C. lupini (cepa Col-08) reprogramando o transcriptoma (Tabela 1), entretanto, diferenças significativas foram observadas entre as linhagens.Assim, a linha de resistência 83A:476 (carregando o gene Lanr1) mostrou uma reprogramação significativa do transcriptoma no primeiro ponto de tempo (6 hpi) com um aumento de 31 a 69 vezes no número de genes up e down isolados em comparação com outros pontos de tempo neste ponto de tempo.Além disso, esse pico foi de curta duração, pois a expressão de apenas alguns genes permaneceu significativamente alterada no segundo ponto de tempo (12 hpi).Curiosamente, o Boregine, que também apresentou um alto nível de resistência no teste do enxerto, não passou por uma reprogramação transcricional tão massiva durante o experimento.No entanto, o número de genes diferencialmente expressos (DEG) foi o mesmo para Boregine e 83A:476 a 12 HPI.Tanto Mandelup quanto a população 22660 apresentaram picos de DEG no último ponto de tempo (48 l/s), indicando um atraso relativo nas respostas de defesa.
Como 83A:476 sofreu reprogramação massiva do transcriptoma em resposta a C. lupini em 6 HPI em comparação com todas as outras linhagens, ~91% dos DEGs observados neste ponto de tempo eram específicos da linhagem (Fig. 1).No entanto, houve alguma sobreposição nas respostas iniciais entre as linhas de estudo, como 68,5%, 50,9% e 52,6% DEG em Boregine, Mandelup e população 22660, respectivamente, sobrepostos aos encontrados em 83A:476 em determinados pontos no tempo.No entanto, esses DEGs representam apenas uma pequena fração (0,97-1,70%) de todos os DEGs atualmente detectados usando 83A:476.Além disso, 11 DEGs de todas as linhagens eram coerentes neste momento (Tabelas Suplementares S4-S6), incluindo componentes comuns das respostas de defesa da planta: proteína de transferência de lipídios (TanjilG_32225), enzima endoglucana-1,3-β-glicosídeo (TanjilG_23384), duas proteínas induzidas por estresse como SAM22 (TanjilG_31528 e TanjilG_31531), proteína básica do látex ( TanjilG_32352) e duas proteínas estruturais da parede celular ricas em glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702).Houve também uma sobreposição relativamente elevada nas respostas do transcriptoma entre 83A:476 e Boregine a 24 HPI (total 16-38% DEG) e entre Mandelup e População 22660 a 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagrama de Venn mostrando o número de genes expressos diferencialmente (DEG) em linhagens de tremoço de folhas estreitas (NLL) inoculadas com Colletotrichum lupini (cepa Col-08 obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, 1999).As linhagens NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan) e população 22660 (muito suscetível).A abreviação hpi significa horas após a vacinação.Os valores zero foram removidos para simplificar o gráfico.
O conjunto de genes superexpressos em 6 hpi foi analisado quanto à presença de domínios gênicos R canônicos (Tabela Suplementar S7).Este estudo revelou a indução do transcriptoma de genes clássicos de resistência a doenças com domínios NBS-LRR apenas em 83A:476.Este conjunto consistia em um gene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinco genes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162) e quatro NBS-LR, Tanjilg_16162) e quatro NBS-LRRE (tanjilg _16162), bem como Quatro NBS-Lrr (tanjilg_16162) e Quatro NBS-LRR (TANJILG_16162).Todos esses genes possuem domínios canônicos arranjados em sequências conservadas.Além dos genes do domínio NBS-LRR, várias RLL cinases foram ativadas a 6 hpi, ou seja, uma em Boregine (Tanjilg_19877), duas em Mandelup (Tanjilg_07141 e Tanjilg_19877 e na população 22660 (Tanjilg_09014014014014 e Tanjilg.
Genes com expressão significativamente alterada em resposta à inoculação com C. lupini (cepa Col-08) foram submetidos à análise de enriquecimento Gene Ontology (GO) (Tabela Suplementar S8). O termo do processo biológico mais frequentemente super-representado foi “GO:0006952 resposta de defesa” que apareceu em 6 das 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor P < 0,001) (Fig. 2). O termo do processo biológico mais frequentemente super-representado foi “GO:0006952 resposta de defesa” que apareceu em 6 das 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ », который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). O termo do processo biológico mais freqüentemente super-representado foi 'GO:0006952 resposta de defesa', que apareceu em 6 de 16 combinações (tempo × linhagem) com alta significância (valor de P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 O termo de processo biológico mais representativo é “GO:0006952 resposta de defesa”, que aparece em 6 das 16 (时间×线) combinações, com alta significância (valor P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который по являлся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). O termo do processo biológico mais freqüentemente super-representado foi 'GO:0006952 Resposta de Defesa', que apareceu em 6 das 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor P < 0,001) (Fig. 2).Este termo foi super-representado em dois pontos de tempo em 83A: 476 e Boregine (6 e 24 hpi) e em um ponto de tempo em Mandelup e População 22660 (12 e 6 hpi, respectivamente).Este é um resultado esperado, destacando a resposta antifúngica das linhagens resistentes.Além disso, 83A:476 respondeu a C. lupini induzindo rapidamente genes relacionados ao surto oxidativo representado pelo termo “GO:0055114 redox process”, indicando uma resposta de defesa específica, enquanto Boregine revelou respostas de defesa específicas, relacionadas ao termo 'GO'.:0006950 Resposta ao estresse”.A população 22660 ativou a resposta de resistência horizontal envolvendo metabólitos secundários, destacando o número excessivo de termos “GO:0016104 Processo de biossíntese de triterpenos” e “GO:0006722 Processo de metabolismo de triterpenos” (ambos os termos pertencem ao mesmo conjunto de genes), levando em consideração os resultados da análise de enriquecimento de termos GO, a estabilidade da reação de Mandelup ficou entre Boregine e População 22660. Além disso, reação precoce 83A :476 (6 hpi) e reação retardada Mandelup e População 22660 incluem o termo GO:0015979 'fotossíntese' e outros processos biológicos relacionados.
Os termos da ontologia do gene de bioprocesso selecionados na anotação de genes expressos diferencialmente durante as respostas do transcriptoma de tremoço de folhas estreitas (NLL) inoculado com tremoço de antraz (cepa Col-08 obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, em 1999) são muito exagerados.As linhagens NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e população 22660 (suscetível).
Como este estudo teve como objetivo identificar genes que contribuem para a resistência à antracnose, os genes atribuídos aos termos GO “GO: 0006952 Respostas defensivas” e “GO: 0055114 Processos redox” foram analisados ​​com pontos de corte, pois médias basais ≥ 30 com pelo menos uma linha.× ponto no tempo combinando valores estatisticamente significativos de log2 (variação de dobra).O número de genes que atendem a esses critérios foi 65 para GO:0006952 e 524 para GO:0055114.
83A:476 revelou dois picos de DEG anotados com o termo GO:0006952, o primeiro em 6 genes por polegada (64 genes, regulação ascendente e descendente) e o segundo em 24 genes por polegada (15 genes, apenas regulação ascendente).Boregine também mostrou que GO:0006952 atingiu o pico no mesmo ponto de tempo, mas com menos DEG (11 e 8) e ativação preferencial.Mandeloop apresentou dois picos de GO:0006952 em 12 e 48 HPI, ambos carregando 12 genes (o primeiro com genes ativadores e o segundo apenas com genes supressores), enquanto a população 22660 em 6 HPI (13 genes) teve maior predominância do pico de aumento.regulamento.Deve-se notar que 96,4% de GO:0006952 DEG nestes picos tiveram o mesmo tipo de resposta (para cima ou para baixo), indicando uma sobreposição significativa nas respostas de defesa, apesar das diferenças no número de genes envolvidos.O maior grupo de sequências relacionado ao termo GO:0006952 codifica a Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), que pertence ao clado da proteína associada à patogênese da classe 10 (PR-10) e ao núcleo da proteína látex.proteína semelhante (semelhante a MLP) (Fig. 3).Os dois grupos diferiam na natureza da expressão e na direção da resposta.Os genes que codificam proteínas semelhantes a SAM22 mostraram indução consistente e significativa nos primeiros pontos de tempo (6 ou 12 hpi) e geralmente não responderam ao final do experimento (48 hpi), enquanto as proteínas semelhantes a MLP mostraram coordenação em 6 hpi.hpi.83A:476 e Mandelup a 48 hp/in, quase todos os outros pontos de dados não responderam.Além disso, as diferenças nos perfis de expressão de genes de proteínas do tipo SAM22 seguiram a variabilidade observada na resistência à antracnose, pois as linhagens mais resistentes tiveram mais pontos de tempo induzindo significativamente esses genes do que os genes mais suscetíveis.Outro gene PR-10 semelhante a LlR18A/B mostrou um padrão de expressão muito semelhante ao gene da proteína semelhante a SAM22.
Foram identificados os principais componentes do termo do processo biológico “GO:0006952 Resposta de Defesa” e os padrões de expressão dos genes candidatos dos alelos Lanr1 e AnMan.A escala Log2 representa os valores log2 (mudança de dobra) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtidas de campos de tremoço, Wizhenica, Polônia, 1999) e plantas de controle (inoculadas com simulação) no mesmo ponto de tempo.As seguintes linhagens de tremoço de folhas estreitas foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e população 22660 (suscetível).
Além disso, os perfis de expressão dos genes candidatos a RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) foram avaliados (Fig. 3).O gene TanjilG_05042 mostrou uma resposta significativa (ativação) em 83A:476 apenas no primeiro ponto de tempo (6 hpi), enquanto TanjilG_12861 foi significativo em Mandeloop apenas em dois pontos de tempo: 6 hpi (regulação para baixo) e 24 hpi (6 hpi).Com.).ajustável)).
Os genes mais superexpressos no termo GO:0055114 “processo redox” foram genes que codificam proteínas do citocromo P450 e peroxidase (Fig. 4).Para amostras isoladas de 83A:476 a 6 HPI, geralmente foram observados valores máximos ou mínimos de log2 (fold change) (para 86,6% dos genes) entre plantas inoculadas e controle, destacando a alta resposta desse genótipo ao sexo inoculante.83A:476 mostrou o GO mais significativo: 0055114 DEG em 6 hpi (503 genes), enquanto o restante das linhagens em 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; e Population 22660, 78 genes)).Na maioria dos genes da família GO:0055114 foram observados dois tipos de respostas à vacinação (ativação e inibição).Curiosamente, até 97,6% dos DEGs identificados para o termo GO: 0055114 em Mandelupe a 48 hpEm Boregine e Population 22660, essa convergência é menor em 51,6% e 75,6%, respectivamente.
Os padrões de expressão dos principais componentes do termo do processo biológico “GO:0055114 Redox process” foram revelados.A escala Log2 representa os valores log2 (mudança de dobra) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtidas de campos de tremoço, Wizhenica, Polônia, 1999) e plantas de controle (inoculadas com simulação) no mesmo ponto de tempo.As seguintes linhagens de tremoço de folhas estreitas foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e população 22660 (suscetível).
83A:476 As respostas transcriptômicas à inoculação com C. lupini (cepa Col-08) também incluíram o silenciamento coordenado de genes atribuídos ao termo GO:0015979 “fotossíntese” e outros processos biológicos relacionados (FIG. 5).Este conjunto GO:0015979 DEG continha 105 genes que foram significativamente reprimidos a 6 hpi a 83A:476.Neste subconjunto, 37 genes também foram regulados negativamente em Mandelup em 48 HPI e 35 no mesmo ponto de tempo na população 22660, incluindo 19 DEGs comuns a ambos os genótipos.Nenhum DEG relacionado ao termo GO: 0015979 foi significativamente ativado em qualquer combinação (linha x tempo).
Foram revelados os padrões de expressão dos principais componentes do termo do processo biológico “GO:0015979 Fotossíntese”.A escala Log2 representa os valores log2 (mudança de dobra) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtidas de campos de tremoço, Wizhenica, Polônia, 1999) e plantas de controle (inoculadas com simulação) no mesmo ponto de tempo.As seguintes linhagens de tremoço de folhas estreitas foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e população 22660 (suscetível).
Com base nos resultados da análise de expressão diferencial e presumivelmente envolvidos em respostas de defesa contra fungos patogênicos, esse conjunto de sete genes foi selecionado para quantificação de perfis de expressão por PCR em tempo real (Tabela Suplementar S9).
O gene da proteína putativa TanjilG_10657 foi significativamente induzido em todas as linhagens e pontos de tempo estudados em comparação com as plantas de controle (miméticas) (Tabelas Suplementares S10, S11).Além disso, o perfil de expressão de TanjilG_10657 mostrou uma tendência crescente ao longo do experimento para todas as linhagens.A população 22660 apresentou a maior sensibilidade de TanjilG_10657 à inoculação com ativação de 114 vezes e o maior nível de expressão relativa (4,4 ± 0,4) a 24 HPI (Fig. 6a).O gene da proteína PR10 LlR18A TanjilG_27015 também mostrou ativação em todas as linhagens e pontos de tempo, com significância estatística na maioria dos pontos de dados (Fig. 6b).Semelhante a TanjilG_10657, o nível de expressão relativa mais alto de TanjilG_27015 foi observado na população inoculada com 22660 a 24 HPI (19,5 ± 2,4).O gene da endoquitinase ácida TanjilG_04706 foi significativamente regulado positivamente em todas as linhagens e em todos os pontos de tempo, exceto para Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Foi fortemente induzido no primeiro ponto de tempo (6 HPI) em 83A:476 (em 10,5 vezes) e aumentou moderadamente em outras linhagens (em 6,6-7,5 vezes).Durante o experimento, a expressão de TanjilG_04706 permaneceu em níveis semelhantes em 83A:476 e Boregine, enquanto em Mandelup e na População 22660 aumentou significativamente, atingindo valores relativamente altos (5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5, respectivamente).O gene semelhante à endoglucana-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 mostrou alta ativação nos dois primeiros pontos de tempo (6 e 12 hpi) em todas as linhagens, exceto na população 22660 (Fig. 6d).Os maiores níveis de expressão relativa de TanjilG_23384 foram observados no segundo ponto de tempo (12 hpi) em Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1).Aos 24 HPI, a expressão de TanjilG_23384 foi relativamente baixa em todas as linhagens estudadas (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfis de expressão de genes selecionados (ag) revelados por PCR quantitativo.Os números 6, 12 e 24 representam horas após a vacinação.Os genes LanDExH7 e LanTUB6 foram usados ​​para normalização e LanTUB6 foi usado para calibração inter-séries.As barras de erro representam o desvio padrão com base em três réplicas biológicas, cada uma das quais é a média de três réplicas técnicas. A significância estatística das diferenças nos níveis de expressão entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 do campo de tremoço em Wierzenica, Polônia) e as plantas de controle (simuladamente inoculadas) são marcadas acima dos pontos de dados (* valor P < 0,05, ** valor P ≤ 0,01, *** valor P ≤ 0,001). A significância estatística das diferenças nos níveis de expressão entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 do campo de tremoço em Wierzenica, Polônia) e as plantas de controle (simuladamente inoculadas) são marcadas acima dos pontos de dados (* valor P < 0,05, ** valor P ≤ 0,01, *** valor P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полу чен в 1999 г.с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечен а над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtidas em 1999 de um campo de tremoço em Wierzhenice, Polônia) e plantas de controle (inoculadas com simulação) são observadas acima dos pontos de dados (* valor P < 0,05, ** valor P ≤ 0,01, *** valor P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученн ый с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отме чены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtidas de campos de tremoço em Verzhenice, Polônia, em 1999) e plantas de controle (inoculadas com simulação) são observadas acima dos pontos de dados (* valor P < 0,05, ** valor P ≤ 0,01, *** valor P ≤ 0,001).As linhagens NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido) e população 22660 (suscetível).
O gene candidato TanjilG_05042 no locus Lanr1 mostrou um padrão de expressão marcadamente diferente dos perfis obtidos a partir de estudos de RNA-seq (Fig. 6e).Ativação significativa desse gene foi observada em Mandelup e na população 22660 (até 39,7 e 11,7 vezes, respectivamente), resultando em níveis de expressão relativamente altos (até 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3, respectivamente).83A:476 também revelou alguma regulação positiva do gene TanjilG_05042 (até 3,8 vezes), no entanto, os níveis de expressão relativos alcançados (0,044 ± 0,002) foram mais de 30 vezes menores do que os observados em Mandelup e na população 22660.analisados ​​por qPCR mostraram diferenças significativas nos níveis de expressão entre os genótipos em variantes simuladas (controle), atingindo uma diferença de 58 vezes entre as populações 22660 e 83A:476, bem como entre as populações 22660 e 22660. Uma diferença de duas vezes foi alcançada entre Boregine e Mandalup.
O gene candidato no locus AnMan, TanjilG_12861, foi ativado em resposta à vacinação em 83A:476 e Mandelup, foi neutro na população 22660 e foi regulado negativamente em Boregine (Fig. 6f).A expressão relativa do gene TanjilG_12861 foi maior no 83A inoculado: 476 (0,14±0,01).O gene da proteína de choque térmico classe I de 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 apresentou níveis de expressão relativos mais baixos em todas as cepas e pontos de tempo estudados (Fig. 6g).O valor mais alto foi observado em 24 HPI na população 22660 (0,14 ± 0,02, um aumento de oito vezes em resposta à vacinação).
A comparação dos perfis de expressão gênica (Fig. 7) revelou uma alta correlação entre TanjilG_10657 e quatro outros genes: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) e TanjilG_04706 (r = 0,79).Tais resultados podem indicar a co-regulação desses genes durante as respostas de defesa.Os genes TanjilG_12861 e TanjilG_23384 apresentaram diferentes perfis de expressão com valores de coeficiente de correlação de Pearson mais baixos (de 0,08 a 0,43 e -0,19 a 0,28, respectivamente) em comparação com outros genes.
As correlações entre os perfis de expressão gênica foram detectadas usando PCR quantitativo.As seguintes linhagens de tremoço de folha estreita foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan), Boregine (resistente, antecedentes genéticos desconhecidos) e população 22660 (suscetível).Três pontos de tempo foram calculados (6, 12 e 24 horas após a inoculação), incluindo plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtidas de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, em 1999) e controle (inoculação simulada).A escala mostra o valor do coeficiente de correlação de Pearson.
Com base nos dados obtidos a 6 cavalos de potência por polegada, o WGCNA foi realizado em 9981 DEG identificado comparando plantas inoculadas e controle para focar nas respostas de defesa iniciais (Tabela Suplementar S12).Vinte e dois módulos gênicos (clusters) foram encontrados com perfis de expressão correlacionados (positivos ou negativos) entre genótipos e variantes experimentais. Em média, os níveis de expressão gênica foram decrescentes na ordem 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle). Em média, os níveis de expressão gênica foram decrescentes na ordem 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Em média, os níveis de expressão gênica diminuíram na ordem 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> população 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта тенде нция была сильнее у контрольных растений). Em média, os níveis de expressão gênica diminuíram na série 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (no entanto, em ambas as variantes, essa tendência foi mais forte nas plantas controle).A vacinação resultou em regulação positiva da expressão gênica, especialmente nos módulos 18, 19, 14, 6 e 1 (em ordem decrescente de efeito), regulação negativa (por exemplo, módulos 9 e 20) ou com efeitos neutros (por exemplo, módulos 11, 22, 8 e 13).A análise de enriquecimento do termo GO (Tabela Suplementar S13) revelou "GO: 0006952 Respostas protetoras" para o módulo inoculado (18) com ativação máxima, incluindo genes analisados ​​por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015), bem como muitos módulos de fotossíntese mais suprimidos do Inoculate (9).O concentrador do módulo 18 (Fig. 8) foi identificado como o gene TanjilG_26536 que codifica a proteína LlR18B semelhante a PR-10, e o concentrador do módulo 9 foi identificado como o gene TanjilG_28955 que codifica a proteína PsbQ do fotossistema II.Um gene candidato de resistência à antracnose Lanr1, TanjilG_05042, foi encontrado no módulo 22 (Fig. 9) e está associado aos termos “GO:0044260 Processos metabólicos macromoleculares celulares” e “GO:0006355 Regulação transcricional, modelo de DNA” carregando o hub TanjilG_01212.o gene codifica o fator de transcrição de estresse térmico A-4a (HSFA4a).
Análise de rede ponderada de co-expressão gênica de módulos com termos de processo biológico super-representados “GO: 0006952 Respostas de defesa”.A ligação foi simplificada para destacar os quatro genes analisados ​​por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Análise de rede ponderada de co-expressão gênica de um módulo com um termo de processo biológico super-representado "GO: 0006355: Regulação transcricional, modelo de DNA" e carregando um gene candidato de resistência à antracnose Lanr1 TanjilG_05042.A ligação foi simplificada para isolar o gene TanjilG_05042 e o gene central TanjilG_01212.
A triagem de resistência à antracnose coletada na Austrália mostrou que a maioria das cultivares lançadas no início eram suscetíveis;Kalya, Coromup e Mandelup foram descritos como moderadamente resistentes, enquanto Wonga, Tanjil e 83A:476 foram descritos como altamente resistentes26,27,31.tinham o mesmo alelo de resistência, designado Lanr1, e Coromup e Mandelup tinham um alelo diferente, designado AnMan10, 26, 39, enquanto Kalya transmitia um alelo diferente., Lanr2.A triagem para resistência à antracnose na Alemanha resultou na identificação de uma linha resistente Bo7212 com um alelo candidato diferente de Lanr1, designado LanrBo36.
Nosso estudo revelou uma frequência muito baixa (cerca de 6%) do alelo Lanr1 no germoplasma testado.Esta observação é consistente com os resultados da triagem de germoplasma do Leste Europeu usando os marcadores Anseq3 e Anseq4, que mostraram que o alelo Lanr1 está presente em apenas duas linhagens bielorrussas.Isso sugere que o alelo Lanr1 ainda não é amplamente utilizado pelos programas de reprodução locais, ao contrário da Austrália, onde é um dos alelos principais para a reprodução assistida por marcadores.Isso pode ser devido ao menor nível de resistência fornecido pelo alelo Lanr1 em condições de campo europeias em comparação com o relatório australiano.Além disso, estudos de antracnose em áreas de alta pluviosidade na Austrália mostraram que as respostas de resistência mediadas pelo alelo Lanr1 podem não ser efetivas em condições climáticas que favorecem o crescimento e rápido desenvolvimento do patógeno19,42.De fato, no presente estudo, alguns sintomas de antracnose também foram observados em genótipos portadores do alelo Lanr1, sugerindo que a resistência pode desaparecer em condições ideais para o desenvolvimento de C. lupini.Além disso, são possíveis interpretações falso-positivas da presença dos marcadores Anseq3 e Anseq4, que estão a aproximadamente 1 cM do locus Lanr1 28,30,43 .
Nosso estudo mostrou que 83A:476, portador do alelo Lanr1, respondeu à inoculação de C. lupini com reprogramação do transcriptoma em larga escala no primeiro ponto de tempo analisado (6 hpi), enquanto em Mandelup, portador do alelo AnMan, as respostas transcriptômicas foram observadas muito mais tarde.(de 24 a 48 cv).Essas variações temporais nas respostas de defesa estão associadas a diferenças nos sintomas da doença, destacando a importância do reconhecimento precoce do patógeno para uma resposta bem-sucedida à resistência.Para infectar o tecido da planta, os esporos de antraz devem passar por vários estágios de desenvolvimento na superfície do hospedeiro, incluindo germinação, divisão celular e formação de um apressório.Um apêndice é uma estrutura infecciosa que se liga à superfície do hospedeiro e facilita a penetração nos tecidos do hospedeiro.Assim, esporos de C. gloeosporioides em extrato de ervilha apresentaram a primeira divisão do núcleo após 75-90 minutos de incubação, a formação de um tubo germinativo após 90-120 minutos e supressão após 4 horas 45 .A manga C. gloeosporioides apresentou mais de 40% de germinação de conídios após 3 horas de incubação e cerca de 20% de formação de apressores após 4 horas.O gene CAP20 associado à virulência de C. gloeosporioides mostrou atividade transcricional em conídios formadores de epífitas após 3,5 h de incubação em cera de superfície de abacate com altas concentrações de proteína CAP20 após 4 h 46 min.Da mesma forma, a atividade dos genes da biossíntese de melanina em C. trifolii foi induzida durante uma incubação de 2 horas seguida pela formação de um apressório após 1 hora.Estudos de tecidos foliares mostraram que morangos inoculados com C. acutatum têm primeira supressão em 8 hpi, enquanto tomates inoculados com C. coccodes têm primeira supressão em 4 hpi48,49.em grande parte consistente com a escala de tempo de Colletotrichum spp.processo infeccioso.Respostas rápidas de defesa a 83A:476 sugerem envolvimento de resistência de plantas e genes de imunidade desencadeada por efetor (ETI) nesta linha, enquanto as respostas atrasadas de Mandelup suportam a hipótese de imunidade desencadeada por padrão molecular microassociado (MTI) 50. Respostas iniciais a 83A: 476 e Mandelup.A sobreposição parcial entre genes regulados para cima ou para baixo na resposta tardia também apóia esse conceito, pois a ETI é frequentemente considerada uma resposta MTI acelerada e aprimorada que culmina na morte celular programada no local da infecção, conhecida como choque anafilático 51,52 .
A maioria dos genes atribuídos ao termo super-representado Gene Ontology GO:0006952 “Resposta de Defesa” são os 11 homólogos da proteína 22 de mensagem de jejum induzida por estresse (semelhante a SAM22) e as sete principais proteínas semelhantes ao látex (MLPs).As proteínas semelhantes 31, 34, 43 e 423 apresentaram similaridade de sequência.Os genes do tipo SAM22 mostraram ativação significativa que durou mais tempo, mostrando níveis aumentados de resistência à antracnose (83A:476 e Boregine).No entanto, os genes do tipo MLP foram regulados negativamente apenas em linhagens que carregam o alelo de resistência candidato (83A:476/Lanr1 em 6 hpi e Mandelup/AnMan em 24 hpi).Deve-se notar que todos os homólogos do tipo SAM22 identificados se originam de um agrupamento de genes que abrange aproximadamente 105 kb, enquanto os genes do tipo MLP se originam de regiões separadas do genoma.A ativação coordenada de tais genes do tipo SAM22 também foi encontrada em nosso estudo anterior de resistência de NLL à inoculação de Diaporthetoxica, sugerindo que eles estão envolvidos nos componentes horizontais da resposta de defesa.Esta conclusão também é apoiada por relatos de uma resposta positiva de genes semelhantes a SAM22 a lesões ou tratamento com ácido salicílico, indutores fúngicos ou peróxido de hidrogênio.
Genes semelhantes a MLP demonstraram responder a vários estresses abióticos e bióticos, incluindo infecções bacterianas, virais e fúngicas patogênicas em muitas espécies de plantas55.As direções de resposta a certas interações entre plantas e patógenos variaram de fortemente crescentes (isto é, durante a infestação do algodoeiro com Verticillium dahliae) a significativamente decrescentes (isto é, após a infecção da macieira com Alternaria spp.)56,57.Downregulation significativo do gene 423 semelhante a MLP foi observado durante as defesas do abacate à infecção por F. niger e durante a infecção da macieira Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola e Alternaria alternata são patótipos da macieira58,59.Além disso, calos de maçã superexpressando o gene 423 semelhante a MLP apresentaram menor expressão de genes associados à resistência e foram mais suscetíveis a infecções fúngicas59.Após Fusarium oxysporum f, o gene 423 semelhante a MLP também foi suprimido em germoplasma resistente de feijão comum.cn.Infecção do feijão 60.
Outros membros da família PR-10 identificados em nosso estudo de RNA-seq foram os genes LlR18A e LlR18B em resposta a upregulation, bem como o gene upregulated (1 gene) ou downregulated (3 genes) para a proteína de transferência lipídica DIR1..Além disso, o WGCNA destaca o gene LlR18B como um hub neste módulo, que é altamente suscetível à vacinação e carrega vários genes de resposta protetora.Os genes LlR18A e LlR18B foram induzidos em folhas de tremoço amarelas em resposta a bactérias patogênicas, bem como em hastes NLL após a inoculação de D. toxica, enquanto o homólogo de arroz desses genes, RSOsPR10, foi rapidamente induzido por uma infecção fúngica presumivelmente envolvida na via de sinalização do ácido jasmônico53,61,62. ).Com o desenvolvimento de reações protetoras, a proteína DIR1 é transportada do foco de infecção através do floema para induzir SAR em órgãos distantes.Curiosamente, o gene TanjilG_02313 DIR1 foi significativamente induzido no primeiro ponto de tempo nas linhagens 84A:476 e População 22660, mas a resistência à antracnose desenvolveu-se com sucesso apenas na linhagem 84A:476.Isso pode indicar alguma subfuncionalização do gene DIR1 em NLL, uma vez que os três homólogos restantes responderam à inoculação apenas na linhagem 83A:476 em 6 hpi, e essa resposta foi direcionada para baixo.
Em nosso estudo, os componentes mais comuns correspondentes ao processo biológico denominado “GO:0055114 Redox process” foram a proteína citocromo P450, peroxidase, ácido linoléico 9S-/13S-lipoxigenase e ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico oxidase.Além disso, nosso WGCNA define o homólogo HSFA4a como um hub que transporta módulos, como o candidato ao gene de resistência Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a é um componente da regulação dependente de redox da transcrição nuclear em plantas.
As proteínas do citocromo P450 são oxidoredutases que catalisam reações de hidroxilação dependentes de NADPH e/ou O2 no metabolismo primário e secundário, incluindo o metabolismo de xenobióticos, bem como hormônios, ácidos graxos, esteróis, componentes da parede celular, biopolímeros e a biossíntese de compostos protetores 69. a um grande número de homólogos alterados (37) e diferenças nos padrões de resposta entre genes específicos, refletindo uma revisão ascendente..Usar apenas dados de RNA-seq para elucidar a função biológica putativa dos genes NLL em uma superfamília de proteínas tão grande seria altamente especulativo.No entanto, vale a pena notar que alguns genes do citocromo P450 estão associados ao aumento da resistência a fungos ou bactérias patogênicas, incluindo uma contribuição para reações alérgicas69,70,71.
As peroxidases de classe III são enzimas vegetais multifuncionais envolvidas em uma ampla gama de processos metabólicos durante o crescimento e desenvolvimento da planta, bem como em resposta a estresses ambientais, como salinidade, seca, alta intensidade de luz e ataque de patógenos72.As peroxidases estão envolvidas na interação de várias espécies de plantas com Anthracis, incluindo Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76.A resposta é muito rápida, às vezes até mesmo em 4 HPI, antes que o fungo penetre no tecido da planta73.O gene da peroxidase também respondeu à inoculação de D. toxica NLL.Além de suas funções típicas para regular a explosão oxidativa ou eliminar o estresse oxidativo, as peroxidases podem interferir no crescimento de patógenos criando barreiras físicas baseadas no reforço da parede celular durante a lignificação, subunidade ou reticulação de compostos específicos.Essa função pode ser atribuída in silico ao gene TanjilG_03329 que codifica uma putativa ânion peroxidase formadora de lignina que foi significativamente regulada positivamente em nosso estudo na linha resistente a 83A:476 em 6 HPI, mas não em outras cepas e pontos de tempo que não responderam.
A 9S-/13S-lipoxigenase do ácido linoléico é o primeiro passo na via oxidativa da biossíntese lipídica78.Os produtos dessa via têm múltiplas funções na defesa vegetal, incluindo o fortalecimento da parede celular por meio da formação de depósitos de calose e pectina e a regulação do estresse oxidativo por meio da produção de espécies reativas de oxigênio79,80,81,82,83.No presente estudo, a expressão da 9S-/13S-lipoxigenase do ácido linoléico foi alterada em todas as cepas, mas na população suscetível 22660, a regulação positiva prevaleceu em diferentes momentos, enquanto nas cepas portadoras de Lanr1 resistente e do alelo AnMan, enfatiza a diversificação da camada de oxilipina nas reações protetoras do antraz entre esses genótipos.
O homólogo de 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidase (ACO) foi significativamente regulado positivamente (9 genes) ou regulado negativamente (2 genes) quando inoculado com tremoço.Com duas exceções, todas essas respostas ocorreram a 6 hp.em 83A:476.A reação enzimática mediada pelas proteínas ACO é a etapa limitante da velocidade na produção de etileno e, portanto, é altamente regulada84.O etileno é um hormônio vegetal que desempenha uma variedade de papéis na regulação do desenvolvimento da planta e na resposta a condições de estresse abiótico e biótico.A indução da transcrição da ACO e a ativação da via de sinalização do etileno estão envolvidas no aumento da resistência do arroz ao fungo hemibiotrófico Oryzae oryzae, regulando a produção de espécies reativas de oxigênio e fitoalexinas.Um processo de infecção foliar muito semelhante encontrado entre M. oryzae e C. lupini88,89, no contexto de uma regulação positiva significativa de homólogos de ACO na linha 83A:476 relatada neste estudo, muda a possibilidade de conferir resistência a NLL antracnose Etileno uma etapa central de sinalização em vias moleculares.
No presente estudo, a supressão em grande escala de muitos genes associados à fotossíntese foi observada em 6 hpi em 83A:476 e em 48 hpi em Mandeloop e na população 22660.A extensão e progressão dessas mudanças é proporcional ao nível.A resistência à antracnose foi observada neste experimento.Recentemente, a repressão forte e precoce de transcritos relacionados à fotossíntese foi relatada em vários modelos de interações planta-patógeno, incluindo bactérias patogênicas e fungos.A pressa (a partir de 2 HPI em algumas interações) e a supressão global de genes associados à fotossíntese em resposta à infecção podem desencadear a imunidade da planta com base na implantação de espécies reativas de oxigênio e sua interação com a via do ácido salicílico para mediar reações alérgicas 90,94.
Em conclusão, os mecanismos de resposta de defesa propostos para a linhagem mais resistente (83A:476) incluem o rápido reconhecimento do patógeno pelo gene R (presumivelmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e sinalização de ácido salicílico e etileno mediada por resposta alérgica, seguida pelo estabelecimento de SAR de longo alcance.ação é suportada pela proteína DIR-1.Deve-se notar que o período biotrófico da infecção por C. lupini é muito curto (aproximadamente 2 dias), seguido de crescimento necrótico95.A transição entre esses estágios pode estar associada à necrose e expressão de proteínas induzidas por etileno que atuam como gatilhos para reações de hipersensibilidade em plantas hospedeiras.Portanto, a janela de tempo para a captura bem-sucedida de C. lupini no estágio biotrófico é muito estreita.A reprogramação de genes associados com redox e fotossíntese observada em 83A:476 em 6 hpi é consistente com a progressão de hifas fúngicas e anuncia o desenvolvimento de uma resposta protetora bem-sucedida no estágio biotrófico.As respostas transcriptômicas de Mandelup e da população 22660 podem demorar muito para capturar o fungo antes de mudar para crescimento necrótico, no entanto, Mandelup pode ser mais eficaz do que a população 22660 porque a regulação relativamente rápida da proteína PR-10 promove resistência horizontal.
A ETI, impulsionada pelo gene canônico R, parece ser um mecanismo comum para a resistência do feijoeiro à antracnose.Assim, na leguminosa modelo Medicago truncatula, a resistência à antracnose é conferida pelo gene RCT1, um membro da classe de genes R da planta TIR-NBS-LRR97.Este gene também confere resistência à antracnose de amplo espectro em alfafa quando transferido para plantas suscetíveis.No feijoeiro comum (P. vulgaris), já foram identificados mais de duas dezenas de genes de resistência à antracnose.Alguns desses genes são encontrados em regiões sem genes R canônicos, no entanto, muitos outros estão localizados nas bordas dos cromossomos que carregam o cluster de genes NBS-LRR, incluindo TIR-NBS-LRRs99.O estudo SSR de todo o genoma também confirmou a associação do gene NBS-LRR com a resistência à antracnose no feijoeiro.O gene R canônico também foi encontrado na região genômica carregando o principal locus de resistência à antracnose no tremoço branco 101.
Nosso trabalho mostra que uma reação de resistência imediata, ativada em um estágio inicial da infecção da planta (de preferência não depois de 12 hpi), protege efetivamente o tremoço de folhas estreitas da antracnose causada pelo fungo patogênico Collelotrichum lupini.Usando sequenciamento de alto rendimento, demonstramos perfis de expressão diferencial de genes de resistência à antracnose em plantas NLL mediados pelos genes de resistência Lanr1 e AnMan.A defesa bem-sucedida envolve projetar cuidadosamente os genes para proteínas envolvidas em redox, fotossíntese e patogênese dentro de horas após o primeiro contato da planta com um patógeno.Reações protetoras semelhantes, mas atrasadas no tempo, são muito menos eficazes na proteção de plantas contra doenças.A resistência ao antraz mediada pelo gene Lanr1 se assemelha à resposta rápida típica do gene R (imunidade desencadeada por efetor), enquanto o gene AnMan provavelmente fornece uma resposta horizontal (imunidade desencadeada por um padrão molecular associado a micróbios), fornecendo um nível moderado de sustentabilidade.
As 215 linhagens NLL usadas para rastrear marcadores de antracnose consistiam em 74 cultivares, 60 linhagens obtidas por cruzamento ou melhoramento, 5 mutantes e 76 germoplasmas selvagens ou originais.As linhas vieram de 17 países, principalmente da Polônia (58), Espanha (47), Alemanha (27), Austrália (26), Rússia (19), Belarus (7), Itália (5) e outras linhas.de 10 países.O conjunto também inclui linhas resistentes de referência: 83A:476, Tanjil, Wonga carregando o alelo Lanr1 e Mandelup carregando o alelo AnMan.As linhagens foram obtidas do banco de dados europeu de recursos genéticos de tremoço mantido por Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polônia (Tabela Suplementar S1).
As plantas foram cultivadas em condições controladas (fotoperíodo 16 horas, temperatura 25°C durante o dia e 18°C ​​à noite).Duas réplicas biológicas foram analisadas.O DNA foi isolado de folhas com três semanas de idade usando o DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo.A qualidade e a concentração do DNA isolado foram avaliadas por métodos espectrofotométricos (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).Foram analisados ​​o marcador AnManM1 marcando o gene de resistência à antracnose AnMan (derivado da cv. Mandelup) e os marcadores Anseq3 e Anseq4 flanqueando o gene Lanr1 (derivado da cv. Tanjil) 11,26,28.Homozigotos para o alelo resistente foram pontuados como “1″, suscetíveis – como “0″, e heterozigotos – como 0,5.
Com base nos resultados da triagem dos marcadores AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e na disponibilidade de sementes para experimentos finais de acompanhamento, 50 linhagens NLL foram selecionadas para fenotipagem de resistência à antracnose.A análise foi realizada em duplicata em uma estufa controlada por computador com um fotoperíodo de 14 horas com uma faixa de temperatura de 22°C durante o dia e 19°C à noite.As sementes são raspadas (cortando o revestimento da semente no lado oposto do embrião com uma lâmina afiada) antes da semeadura para evitar a dormência das sementes devido ao revestimento da semente ser muito duro e para garantir uma germinação uniforme.As plantas foram cultivadas em vasos (11 × 11 × 21 cm) com solo estéril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsóvia, Polônia).A inoculação foi realizada com a cepa Colletotrichum lupini Col-08, cultivada em 1999 a partir de caules de tremoços de folhas estreitas cultivadas em um campo em Verzhenitsa, Grande Polônia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Obtenha uma área.Os isolados foram cultivados em meio SNA a 20° C sob luz negra por 21 dias para induzir a esporulação.Quatro semanas após a semeadura, quando as plantas atingiram o estádio de 4-6 folhas, a inoculação foi realizada por pulverização com uma suspensão de conídios na concentração de 0,5 x 106 conídios por ml.Após a inoculação, as plantas foram mantidas no escuro por 24 horas, com umidade em torno de 98% e temperatura de 25°C para facilitar a germinação dos conídios e o processo de infecção.As plantas foram então cultivadas sob um fotoperíodo de 14 horas a 22°C dia/19°C noite e 70% de umidade.O escore da doença foi feito 22 dias após a inoculação e variou de 0 (imune) a 9 (muito suscetível), dependendo da presença ou ausência de lesões necróticas em caules e folhas.Além disso, após a pontuação, mediu-se o peso das plantas.As relações entre os genótipos dos marcadores e os fenótipos da doença foram calculadas como correlações pontuais de duas sequências (ausência de marcadores heterozigotos no conjunto de linhagens para análise do fenótipo de resistência à antracnose).