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Existe a necessidade de um sistema in vitro confiável que possa reproduzir com precisão o ambiente fisiológico do coração para testes de drogas.A disponibilidade limitada de sistemas de cultura de tecido cardíaco humano levou a interpretações imprecisas dos efeitos cardíacos das drogas.Aqui, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido cardíaco (CTCM) que estimula eletromecanicamente fatias de coração e sofre estiramento fisiológico durante as fases sistólica e diastólica do ciclo cardíaco.Após 12 dias de cultura, essa abordagem melhorou parcialmente a viabilidade dos cortes cardíacos, mas não preservou totalmente sua integridade estrutural.Portanto, após a triagem de moléculas pequenas, descobrimos que a adição de 100 nM de triiodotironina (T3) e 1 μM de dexametasona (Dex) ao nosso meio manteve a microestrutura dos cortes por 12 dias.Em combinação com o tratamento T3/Dex, o sistema CTCM manteve perfis transcricionais, viabilidade, atividade metabólica e integridade estrutural no mesmo nível do tecido cardíaco fresco por 12 dias.Além disso, o estiramento excessivo do tecido cardíaco em cultura induz a sinalização cardíaca hipertrófica, fornecendo evidências da capacidade da CTCM de imitar condições hipertróficas induzidas pelo estiramento cardíaco.Em conclusão, CTCM pode modelar a fisiologia e fisiopatologia do coração em cultura por longos períodos de tempo, permitindo triagem confiável de drogas.
Antes da pesquisa clínica, são necessários sistemas in vitro confiáveis ​​que possam reproduzir com precisão o ambiente fisiológico do coração humano.Esses sistemas devem imitar o alongamento mecânico alterado, frequência cardíaca e propriedades eletrofisiológicas.Modelos animais são comumente usados ​​como uma plataforma de triagem para fisiologia cardíaca com confiabilidade limitada em refletir os efeitos de drogas no coração humano1,2.Em última análise, o Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) é um modelo altamente sensível e específico para várias intervenções terapêuticas e farmacológicas, reproduzindo com precisão a fisiologia e fisiopatologia do coração humano3.A ausência de tal sistema limita a descoberta de novos tratamentos para insuficiência cardíaca4,5 e tem levado a cardiotoxicidade de drogas como uma das principais razões para a saída do mercado6.
Na última década, oito drogas não cardiovasculares foram retiradas do uso clínico por causarem prolongamento do intervalo QT levando a arritmias ventriculares e morte súbita7.Assim, há uma necessidade crescente de estratégias de triagem pré-clínica confiáveis ​​para avaliar a eficácia e a toxicidade cardiovascular.O uso recente de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS-CM) na triagem de drogas e testes de toxicidade fornece uma solução parcial para esse problema.No entanto, a natureza imatura dos hiPS-CMs e a falta de complexidade multicelular do tecido cardíaco são as principais limitações desse método.Estudos recentes mostraram que essa limitação pode ser parcialmente superada usando hiPS-CM precoce para formar hidrogéis de tecido cardíaco logo após o início das contrações espontâneas e aumentando gradualmente a estimulação elétrica ao longo do tempo.No entanto, esses microtecidos hiPS-CM carecem das propriedades eletrofisiológicas e contráteis maduras do miocárdio adulto.Além disso, o tecido cardíaco humano possui uma estrutura mais complexa, constituída por uma mistura heterogênea de diferentes tipos celulares, incluindo células endoteliais, neurônios e fibroblastos estromais, interligados por conjuntos específicos de proteínas da matriz extracelular.Essa heterogeneidade de populações não cardiomiócitos11,12,13 no coração de mamíferos adultos é uma grande barreira para modelar o tecido cardíaco usando tipos de células individuais.Essas principais limitações enfatizam a importância do desenvolvimento de métodos para cultura de tecido miocárdico intacto em condições fisiológicas e patológicas.
Seções finas (300 µm) cultivadas do coração humano provaram ser um modelo promissor de miocárdio humano intacto.Este método fornece acesso a um sistema multicelular 3D completo semelhante ao tecido cardíaco humano.No entanto, até 2019, o uso de cortes de coração cultivados era limitado pela curta sobrevida (24 h) da cultura.Isso se deve a vários fatores, incluindo a falta de alongamento físico-mecânico, a interface ar-líquido e o uso de meios simples que não atendem às necessidades do tecido cardíaco.Em 2019, vários grupos de pesquisa demonstraram que a incorporação de fatores mecânicos em sistemas de cultura de tecidos cardíacos pode prolongar a vida útil da cultura, melhorar a expressão cardíaca e imitar a patologia cardíaca.Dois estudos elegantes 17 and 18 mostram que a carga mecânica uniaxial tem um efeito positivo no fenótipo cardíaco durante a cultura.No entanto, esses estudos não usaram a carga físico-mecânica tridimensional dinâmica do ciclo cardíaco, uma vez que as seções cardíacas foram carregadas com forças de tração isométricas 17 ou cargas auxotônicas lineares 18 .Esses métodos de alongamento de tecidos resultaram na supressão de muitos genes cardíacos ou na superexpressão de genes associados a respostas de estiramento anormais.Notavelmente, Pitoulis et al.19 desenvolveram um banho dinâmico de cultura de fatias de coração para reconstrução do ciclo cardíaco usando feedback de transdutor de força e acionamentos de tensão.Embora esse sistema permita uma modelagem in vitro do ciclo cardíaco mais precisa, a complexidade e o baixo rendimento do método limitam a aplicação desse sistema.Nosso laboratório desenvolveu recentemente um sistema de cultura simplificado usando estimulação elétrica e um meio otimizado para manter a viabilidade de cortes de tecido cardíaco suíno e humano por até 6 dias20,21.
No manuscrito atual, descrevemos um modelo de cultura de tecido cardíaco (CTCM) usando seções do coração suíno que incorpora pistas humorais para recapitular fisiologia cardíaca tridimensional e distensão fisiopatológica durante o ciclo cardíaco.Este CTCM pode aumentar a precisão da previsão de medicamentos pré-clínicos a um nível nunca antes alcançado, fornecendo um sistema cardíaco econômico e de médio rendimento que imita a fisiologia/fisiopatologia do coração de mamíferos para testes de medicamentos pré-clínicos.
Os sinais mecânicos hemodinâmicos desempenham um papel crítico na manutenção da função dos cardiomiócitos in vitro 22,23,24.No manuscrito atual, desenvolvemos uma CTCM (Figura 1a) que pode imitar o ambiente cardíaco adulto induzindo estimulação elétrica e mecânica em frequências fisiológicas (1,2 Hz, 72 batimentos por minuto).Para evitar estiramento excessivo do tecido durante a diástole, um dispositivo de impressão 3D foi usado para aumentar o tamanho do tecido em 25% (Fig. 1b).A estimulação elétrica induzida pelo sistema C-PACE foi cronometrada para iniciar 100 ms antes da sístole usando um sistema de aquisição de dados para reproduzir totalmente o ciclo cardíaco.O sistema de cultura de tecidos usa um atuador pneumático programável (LB Engineering, Alemanha) para expandir ciclicamente uma membrana de silicone flexível para causar a expansão das fatias do coração na câmara superior.O sistema foi conectado a uma linha de ar externa por meio de um transdutor de pressão, o que permitiu ajustar com precisão a pressão (± 1 mmHg) e o tempo (± 1 ms) (fig. 1c).
a Prenda a seção de tecido ao anel de suporte de 7 mm, mostrado em azul, dentro da câmara de cultura do dispositivo.A câmara de cultura é separada da câmara de ar por uma fina membrana flexível de silicone.Coloque uma junta entre cada câmara para evitar vazamentos.A tampa do dispositivo contém eletrodos de grafite que fornecem estimulação elétrica.b Representação esquemática do dispositivo de tecidos grandes, anel guia e anel de suporte.As seções de tecido (marrom) são colocadas no dispositivo superdimensionado com o anel guia colocado na ranhura na borda externa do dispositivo.Usando o guia, coloque cuidadosamente o anel de suporte revestido com adesivo acrílico tecidual sobre a seção de tecido cardíaco.c Gráfico mostrando o tempo de estimulação elétrica em função da pressão da câmara de ar controlada por um atuador pneumático programável (PPD).Um dispositivo de aquisição de dados foi usado para sincronizar a estimulação elétrica usando sensores de pressão.Quando a pressão na câmara de cultura atinge o limite definido, um sinal de pulso é enviado ao C-PACE-EM para acionar a estimulação elétrica.d Imagem de quatro CTCMs colocados na prateleira de uma incubadora.Quatro dispositivos são conectados a um PPD por meio de um circuito pneumático e sensores de pressão são inseridos na válvula hemostática para monitorar a pressão no circuito pneumático.Cada dispositivo contém seis seções de tecido.
Usando um único atuador pneumático, fomos capazes de controlar 4 dispositivos CTCM, cada um dos quais pode conter 6 seções de tecido (Fig. 1d).Na CTCM, a pressão do ar na câmara de ar é convertida em pressão síncrona na câmara de fluido e induz a expansão fisiológica da fatia do coração (Figura 2a e Filme Suplementar 1).Avaliação do estiramento do tecido a 80 mm Hg.Arte.mostrou estiramento das seções de tecido em 25% (Fig. 2b).Foi demonstrado que esse alongamento percentual corresponde a um comprimento fisiológico do sarcômero de 2,2–2,3 µm para a contratilidade normal da seção cardíaca17,19,25.O movimento do tecido foi avaliado usando configurações de câmera personalizadas (Figura complementar 1).A amplitude e a velocidade do movimento do tecido (Fig. 2c, d) corresponderam ao alongamento durante o ciclo cardíaco e ao tempo durante a sístole e a diástole (Fig. 2b).O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contração e relaxamento permaneceram constantes por 12 dias em cultura (Fig. 2f).Para avaliar o efeito da estimulação elétrica na contratilidade durante a cultura, desenvolvemos um método para determinar a deformidade ativa usando um algoritmo de sombreamento (Suplementar Fig. 2a,b) e fomos capazes de distinguir entre deformidades com e sem estimulação elétrica.A mesma seção do coração (Fig. 2f).Na região móvel do corte (R6-9), a voltagem durante a estimulação elétrica foi 20% maior do que na ausência de estimulação elétrica, o que indica a contribuição da estimulação elétrica para a função contrátil.
Traços representativos da pressão da câmara de ar, pressão da câmara de fluido e medições de movimento do tecido confirmam que a pressão da câmara altera a pressão da câmara de fluido, causando um movimento correspondente da fatia de tecido.b Traços representativos do alongamento percentual (azul) de seções de tecido correspondentes ao alongamento percentual (laranja).c O movimento medido do corte cardíaco é consistente com a velocidade medida do movimento.(d) Trajetórias representativas de movimento cíclico (linha azul) e velocidade (linha pontilhada laranja) em uma fatia do coração.e Quantificação do tempo de ciclo (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), tempo de contração (n = 19 fatias por grupo), tempo de relaxamento (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), movimento do tecido (n = 25).fatias)/grupo de diferentes porcos), velocidade sistólica máxima (n = 24(D0), 25(D12) fatias/grupo de diferentes porcos) e taxa de relaxamento máxima (n=24(D0), 25(D12) fatias/grupo de diferentes porcos).O teste t de Student bicaudal não mostrou diferença significativa em nenhum parâmetro.f Traços representativos da análise de tensão de seções de tecido com (vermelho) e sem (azul) estimulação elétrica, dez áreas regionais de seções de tecido da mesma seção.Os painéis inferiores mostram a quantificação da diferença percentual de tensão em seções de tecido com e sem estimulação elétrica em dez áreas de diferentes seções. (n = 8 fatias/grupo de suínos diferentes, é realizado o teste t de Student bicaudal; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 fatias/grupo de suínos diferentes, é realizado o teste t de Student bicaudal; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,0 5). (n = 8 seções/grupo de suínos diferentes, teste t de Student bicaudal; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 cortes/grupo, de suínos diferentes, teste t de Student bicaudal; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Em nosso sistema anterior de cultura biomimética de fatias de coração [20, 21], mantivemos a viabilidade, função e integridade estrutural das fatias de coração por 6 dias, aplicando estimulação elétrica e otimizando a composição do meio.No entanto, após 10 dias, esses números caíram drasticamente.Faremos referência a seções cultivadas em nosso sistema de cultura biomimética estática anterior 20, 21 condições de controle (Ctrl) e usaremos nosso meio previamente otimizado como condições MC e cultura sob estimulação mecânica e elétrica simultânea (CTCM).chamado .Primeiro, determinamos que a estimulação mecânica sem estimulação elétrica era insuficiente para manter a viabilidade do tecido por 6 dias (Fig. 3a,b).Curiosamente, com a introdução da estimulação físico-mecânica e elétrica usando STCM, a viabilidade dos cortes de coração de 12 dias permaneceu a mesma dos cortes de coração a fresco em condições MS, mas não em condições Ctrl, como mostrado pela análise MTT (Fig. 1).3a).Isso sugere que a estimulação mecânica e a simulação do ciclo cardíaco podem manter as seções de tecido viáveis ​​pelo dobro do tempo relatado em nosso sistema de cultura estática anterior.No entanto, a avaliação da integridade estrutural das seções de tecido por imunomarcação da troponina T cardíaca e da conexina 43 mostrou que a expressão da conexina 43 foi significativamente maior nos tecidos MC no dia 12 do que nos controles no mesmo dia.No entanto, a expressão uniforme da conexina 43 e a formação do disco Z não foram totalmente mantidas (Fig. 3b).Usamos uma estrutura de inteligência artificial (IA) para quantificar a integridade estrutural do tecido26, um pipeline de aprendizado profundo baseado em imagem baseado na coloração de troponina-T e conexina43 para quantificar automaticamente a integridade estrutural e a fluorescência das fatias do coração em termos de força de localização.Este método usa uma Rede Neural Convolucional (CNN) e uma estrutura de aprendizado profundo para quantificar de forma confiável a integridade estrutural do tecido cardíaco de maneira automatizada e imparcial, conforme descrito na referência.26. O tecido MC mostrou semelhança estrutural melhorada no dia 0 em comparação com as seções de controle estático.Além disso, a coloração tricrômica de Masson revelou uma porcentagem significativamente menor de fibrose em condições de MS em comparação com as condições de controle no dia 12 de cultura (Fig. 3c).Embora a CTCM tenha aumentado a viabilidade das seções de tecido cardíaco no dia 12 para um nível semelhante ao do tecido cardíaco fresco, não melhorou significativamente a integridade estrutural das seções cardíacas.
a O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade MTT de fatias de coração fresco (D0) ou cultura de fatias de coração por 12 dias em cultura estática (D12 Ctrl) ou em CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via é realizado; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). a O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade MTT de fatias de coração fresco (D0) ou cultura de fatias de coração por 12 dias em cultura estática (D12 Ctrl) ou em CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via é realizado; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl).o histograma mostra a quantificação da viabilidade de seções de coração fresco MTT (D0) ou cultura de seções de coração por 12 dias em cultura estática (controle D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controle D12). ) ), 12 (D12 MC) seções/grupo de diferentes porcos, um teste de ANOVA unidirecional é realizado;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#### p < 0,0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC).histograma mostrando a quantificação da viabilidade do MTT em seções de coração fresco (D0) ou seções de coração cultivadas por 12 dias em cultura estática (controle D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controle D12)), 12 (D12 MC) seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 em comparação com D0, **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (vermelho) e DAPI (azul) em seções de coração isoladas recentemente (D0) ou seções de coração cultivadas em condições estáticas (Ctrl) ou condições de CTCM (MC) por 12 dias) de imagens representativas de imunofluorescência (escala em branco = 100 µm). Quantificação de inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo cada de porco diferente, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p <0,0001 em comparação com D0 e ****p <0,0001 em comparação com D12 Ctrl). Quantificação de inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo cada de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,000 1 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco por inteligência artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seções/grupos de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 vs. com D0 e ****p < 0,0001 comparado com D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo cada de porco diferente, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo cada um dos diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 ( D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Inteligência artificial para quantificar a integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seções/grupo cada um dos diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional; ####p<0,0001 vs .D0 Para comparação ****p <0,0001 em comparação com D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) para fatias de coração coradas com coloração tricrômica de Masson (escala simples = 500 µm) (n = 10 fatias/grupo cada de porco diferente, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p <0,0001 em comparação com D0 e ***p <0,001 em comparação com D12 Ctrl). c Imagens representativas (à esquerda) e quantificação (à direita) para fatias de coração coradas com coloração de tricrômico de Masson (escala simples = 500 µm) (n = 10 fatias/grupo cada de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional é realizado; #### p <0,0001 em comparação com D0 e ***p <0,001 em comparação com D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромн ым красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de seções cardíacas coradas com tricrômico de Masson (escala não revestida = 500 µm) (n = 10 seções/grupo de suínos diferentes, teste ANOVA unidirecional realizado; #### p <0,0001 em comparação com D0 e ***p <0,001 em comparação com D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 pedreiro 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de seções cardíacas coradas com tricrômico de Masson (branco = 500 µm) (n = 10 seções/grupo, cada uma de um porco diferente, testadas por análise de variância unidirecional;### # p <0,0001 em comparação com D0, ***p <0,001 em comparação com D12 Ctrl).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Nossa hipótese é que, adicionando pequenas moléculas ao meio de cultura, a integridade dos cardiomiócitos poderia ser melhorada e o desenvolvimento de fibrose reduzido durante a cultura da CTCM.Portanto, rastreamos moléculas pequenas usando nossas culturas de controle estático20,21 devido ao pequeno número de fatores de confusão.Dexametasona (Dex), triiodotironina (T3) e SB431542 (SB) foram escolhidos para esta triagem.Essas pequenas moléculas foram usadas anteriormente em culturas hiPSC-CM para induzir a maturação de cardiomiócitos aumentando o comprimento do sarcômero, os túbulos T e a velocidade de condução.Além disso, tanto o Dex (um glicocorticóide) quanto o SB são conhecidos por suprimir a inflamação29,30.Portanto, testamos se a inclusão de uma ou uma combinação dessas pequenas moléculas melhoraria a integridade estrutural dos cortes cardíacos.Para triagem inicial, a dose de cada composto foi selecionada com base nas concentrações comumente usadas em modelos de cultura celular (1 μM Dex27, 100 nM T327 e 2,5 μM SB31).Após 12 dias de cultivo, a combinação de T3 e Dex resultou em ótima integridade estrutural dos cardiomiócitos e mínima remodelação fibrosa (Figuras complementares 4 e 5).Além disso, o uso do dobro ou do dobro dessas concentrações de T3 e Dex produziu efeitos deletérios em comparação com as concentrações normais (Fig. 6a,b).
Após a triagem inicial, realizamos uma comparação direta de 4 condições de cultura (Figura 4a): Ctrl: cortes de coração cultivados em nossa cultura estática descrita anteriormente usando nosso meio otimizado;20.21 TD: T3 e Ctrl s Adicionado Dex na quarta-feira;MC: cortes de coração cultivados em CTCM usando nosso meio previamente otimizado;e MT: CTCM com T3 e Dex adicionados ao meio.Após 12 dias de cultivo, a viabilidade dos tecidos MS e MT permaneceu a mesma que nos tecidos frescos avaliados pelo ensaio MTT (Fig. 4b).Curiosamente, a adição de T3 e Dex às culturas transwell (TD) não resultou em uma melhora significativa na viabilidade em comparação com as condições Ctrl, indicando um papel importante da estimulação mecânica na manutenção da viabilidade dos cortes cardíacos.
um diagrama de projeto experimental representando as quatro condições de cultura usadas para avaliar os efeitos da estimulação mecânica e da suplementação de T3/Dex no meio por 12 dias. b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во в сех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl , D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,0 01 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0 相比，**p < 0,01与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срез ами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ## ##p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma mostrando todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), de diferentes suínos 12 (D12 MC) seções/grupo, teste ANOVA de uma via; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,0 1 vs. controle D12). c O gráfico de barras mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 6 fatias/grupo de suínos diferentes, teste ANOVA unidirecional é realizado; ###p <0,001, em comparação com D0 e ***p <0,001 em comparação com D12 Ctrl). c O gráfico de barras mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 6 fatias/grupo de suínos diferentes, teste ANOVA unidirecional é realizado; ###p <0,001, em comparação com D0 e ***p <0,001 em comparação com D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во вс ех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC e MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/груп пу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c O histograma mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 6 seções/grupo de suínos diferentes, teste ANOVA unidirecional realizado; ###p <0,001 em comparação com D0 e ***p <0,001 em comparação com D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 , 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行 ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/ группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по ср авнению с D12 (контроль). c Histograma mostrando a quantificação do fluxo de glicose aos 12 dias pós-cultura para todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 6 seções/grupo, de porcos diferentes, foram realizados testes ANOVA unilaterais, ###p <0,001 em comparação com D0, ***p <0,001 em comparação com D12 (controle).d Gráficos de análise de tensão de tecidos frescos (azul), dia 12 MC (verde) e dia 12 MT (vermelho) em dez pontos de seção de tecido regional (n = 4 fatias/grupo, teste ANOVA unidirecional; não houve diferença significativa entre os grupos).e Gráfico de vulcão mostrando genes expressos diferencialmente em seções de coração fresco (D0) em comparação com seções de coração cultivadas em condições estáticas (Ctrl) ou em condições MT (MT) por 10 a 12 dias.f Heatmap de genes de sarcômero para seções de coração cultivadas em cada uma das condições de cultura.As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
A dependência metabólica da mudança da oxidação de ácidos graxos para a glicólise é uma marca registrada da desdiferenciação de cardiomiócitos.Cardiomiócitos imaturos utilizam principalmente glicose para produção de ATP e possuem mitocôndrias hipoplásicas com poucas cristas5,32.As análises de utilização de glicose mostraram que sob condições de MC e MT, a utilização de glicose foi semelhante à dos tecidos do dia 0 (Figura 4c).No entanto, as amostras Ctrl mostraram um aumento significativo na utilização de glicose em comparação com o tecido fresco.Isso indica que a combinação de CTCM e T3/Dex aumenta a viabilidade do tecido e preserva o fenótipo metabólico de cortes de coração cultivados por 12 dias.Além disso, a análise de tensão mostrou que os níveis de tensão permaneceram os mesmos do tecido cardíaco fresco por 12 dias em condições de MT e MS (Fig. 4d).
Para analisar o impacto geral da CTCM e T3/Dex na paisagem transcricional global do tecido cardíaco, realizamos RNAseq em cortes cardíacos de todas as quatro condições de cultura diferentes (dados complementares 1).Curiosamente, as seções MT mostraram alta similaridade transcricional com o tecido do coração fresco, com apenas 16 diferencialmente expressos de 13.642 genes.No entanto, como mostramos anteriormente, as fatias Ctrl exibiram 1.229 genes diferencialmente expressos após 10 a 12 dias em cultura (Fig. 4e).Esses dados foram confirmados por qRT-PCR dos genes do coração e dos fibroblastos (Fig. Complementar 7a-c).Curiosamente, as seções Ctrl mostraram downregulation de genes cardíacos e do ciclo celular e ativação de programas de genes inflamatórios.Esses dados sugerem que a desdiferenciação, que normalmente ocorre após o cultivo de longo prazo, é completamente atenuada sob condições de MT (Fig. 8a, b).Um estudo cuidadoso dos genes do sarcômero mostrou que apenas sob condições MT os genes que codificam o sarcômero (Fig. 4f) e o canal iônico (Fig. 9 suplementar) são preservados, protegendo-os da supressão sob condições Ctrl, TD e MC.Esses dados demonstram que, com uma combinação de estimulação mecânica e humoral (T3/Dex), o transcriptoma da fatia de coração pode permanecer semelhante a fatias de coração fresco após 12 dias de cultura.
Esses achados transcricionais são apoiados pelo fato de que a integridade estrutural dos cardiomiócitos em seções cardíacas é melhor preservada em condições de MT por 12 dias, conforme mostrado pela conexina 43 intacta e localizada (Fig. 5a).Além disso, a fibrose nas seções do coração sob condições MT foi significativamente reduzida em comparação com o Ctrl e semelhante às seções do coração a fresco (Fig. 5b).Esses dados demonstram que a combinação de estimulação mecânica e tratamento com T3/Dex preserva efetivamente a estrutura cardíaca em seções de coração em cultura.
a Imagens representativas de imunofluorescência de troponina-T (verde), conexina 43 (vermelho) e DAPI (azul) em cortes de coração isolados recentemente (D0) ou cultivados por 12 dias em todas as quatro condições de cultura de cortes de coração (barra de escala = 100 µm).). Quantificação de inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). Quantificação de inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional é realizado; #### p < 0,0001 em comparação com D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 e D12 Ctrl ), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнен ию с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco usando inteligência artificial (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; #### p < 0,0001 em comparação com D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或**** p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或**** p < 0,0001 与D12 Ctrl相比）。Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco usando inteligência artificial em diferentes suínos (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seções/grupo) com um teste ANOVA de uma via;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 em comparação com D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de fatias de coração coradas com coloração tricrômica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fatias/grupo de suínos diferentes, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de fatias de coração coradas com coloração tricrômica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fatias/grupo de suínos diferentes, teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных синей, вы полняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de seções cardíacas coradas com tricrômico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) seções/grupo de suínos diferentes, realizada ANOVA unidirecional; ####p < 0,0001 vs. D0 e ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化(比例尺= 500 µm)（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001，或**** p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctr l, d12 td e d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001，或**** p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масш табная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ A NOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de seções cardíacas coradas com tricrômico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) seções de diferentes porcos/grupo, um método ANOVA; ####p < 0,0001 em comparação com D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 em comparação com D 12 Ctrl).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Finalmente, a capacidade da CTCM de imitar a hipertrofia cardíaca foi avaliada aumentando o estiramento do tecido cardíaco.Na TCCM, o pico de pressão da câmara de ar aumentou de 80 mmHg para 80 mmHg.Arte.(estiramento normal) até 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Isso corresponde a um aumento de 32% no alongamento (Fig. 6b), que foi mostrado anteriormente como o percentual correspondente de alongamento necessário para que os cortes do coração atinjam um comprimento do sarcômero semelhante ao observado na hipertrofia.O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contração e relaxamento permaneceram constantes durante seis dias de cultura (Fig. 6c).O tecido cardíaco das condições MT foi submetido a condições de estiramento normal (MT (Normal)) ou superestiramento (MT (OS)) por seis dias.Já após quatro dias em cultura, o biomarcador hipertrófico NT-ProBNP foi significativamente elevado no meio sob condições MT (OS) em comparação com condições MT (normais) (Fig. 7a).Além disso, após seis dias de cultivo, o tamanho da célula em MT (OS) (Fig. 7b) aumentou significativamente em comparação com seções de coração MT (normal).Além disso, a translocação nuclear NFATC4 foi significativamente aumentada em tecidos sobrecarregados (Fig. 7c).Esses resultados mostram o desenvolvimento progressivo da remodelação patológica após hiperdistensão e sustentam o conceito de que o dispositivo CTCM pode ser usado como uma plataforma para estudar a sinalização de hipertrofia cardíaca induzida por estiramento.
Traços representativos da pressão da câmara de ar, pressão da câmara de fluido e medições de movimento do tecido confirmam que a pressão da câmara altera a pressão da câmara de fluido, causando um movimento correspondente da fatia de tecido.b Percentual de alongamento representativo e curvas de taxa de alongamento para seções de tecido normalmente alongadas (laranja) e superestiradas (azul).c Gráfico de barras mostrando o tempo do ciclo (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), tempo de contração (n = 18-19 fatias por grupo, de diferentes porcos), tempo de relaxamento (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos)), amplitude do movimento do tecido (n = 14 fatias/grupo, de diferentes porcos), pico de velocidade sistólica (n = 14 fatias/grupo, de diferentes porcos) e pico de taxa de relaxamento (n = 14 (D0), 15 (D6) ) seções/grupos) de diferentes porcos), o teste t de Student bicaudal não mostrou diferença significativa em nenhum parâmetro, indicando que esses parâmetros permaneceram constantes durante 6 dias de cultivo com sobretensão.As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
a Quantificação do gráfico de barras da concentração de NT-ProBNP em meios de cultura de fatias de coração cultivadas em condições de estiramento normal MT (Norm) ou estiramento excessivo (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, ANOVA de duas vias é realizada; **p <0,01 em comparação com o estiramento normal). uma quantificação do gráfico de barras da concentração de NT-ProBNP em meios de cultura de fatias de coração cultivadas em condições de estiramento normal MT (Norm) ou estiramento excessivo (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, ANOVA de duas vias é realizada; **p <0,01 em comparação com o estiramento normal).Histograma quantitativo da concentração de NT-ProBNP no meio de cultura de fatias de coração cultivadas em condições de estiramento MT normal (norma) ou superestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4).MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, análise de variância de dois fatores é realizada;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 em relação ao alongamento normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析;** p < 0,01）。 a Quantificação da concentração de NT-ProBNP em fatias de coração cultivadas em condições de alongamento normal MT (Norm) ou overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de diferentes 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **comparado com alongamento normal, p < 0,01).histograma Quantificação das concentrações de NT-ProBNP em fatias de coração cultivadas em condições de estiramento MT normal (norma) ou superestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, análise de variância bidirecional;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 em relação ao alongamento normal). b Imagens representativas para fatias de coração coradas com troponina-T e WGA (esquerda) e quantificação do tamanho da célula (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 fatias diferentes de porcos diferentes, o teste t de Student bicaudal é realizado; ****p <0,0001 em comparação com o alongamento normal). b Imagens representativas para fatias de coração coradas com troponina-T e WGA (esquerda) e quantificação do tamanho da célula (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 fatias diferentes de porcos diferentes, o teste t de Student bicaudal é realizado; ****p <0,0001 em comparação com o alongamento normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного о пределения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свине й, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imagens representativas de seções cardíacas coradas com troponina-T e AZP (esquerda) e quantificação do tamanho da célula (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 seções diferentes de porcos diferentes, foi realizado o teste t de Student bicaudal; ****p <0,0001 em comparação com a cepa normal). b 用肌钙蛋白-T e WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS） ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Imagens representativas de fatias cardíacas coradas com calcareína-T e WGA (esquerda) e tamanho da célula (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 fatias diferentes (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生 teste t；comparado com alongamento normal，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная о ценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) e 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа , двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imagens representativas de seções cardíacas coradas com troponina-T e AZP (esquerda) e quantificação do tamanho da célula (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 seções diferentes de suínos diferentes) Células/grupo, critério bicaudal t de Student;****p < 0,0001 em comparação com a deformação normal). c Imagens representativas para fatias de coração MTOS de dia 0 e dia 6 imunomarcadas para troponina-T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 para os núcleos de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de porcos diferentes, teste t de Student bicaudal é realizado; *p <0,05). c Imagens representativas para fatias de coração MTOS de dia 0 e dia 6 imunomarcadas para troponina-T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 para os núcleos de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de porcos diferentes, teste t de Student bicaudal é realizado; *p <0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 e 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и ко NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свин ей , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagens representativas para seções de coração em 0 e 6 dias MTOS, imunomarcadas para troponina-T e NFATC4, e quantificação da translocação de NFATC4 no núcleo de células cavernosas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos) realizado teste t de Student bicaudal;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T e NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Imagens representativas de calcanina-T e imunomarcação de NFATC4 第0天和第6天MTOS fatias de coração e NFATC4 de diferentes NFATC4 易位至CM quantidade de núcleo celular的(n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и коли чественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-кр итерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagens representativas de fatias de coração MTOS nos dias 0 e 6 para imunomarcação de troponina-T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 no núcleo de CM de diferentes porcos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo, critério t bicaudal de Student; *p <0,05).As barras de erro representam média ± desvio padrão.
A pesquisa cardiovascular translacional requer modelos celulares que reproduzam com precisão o ambiente cardíaco.Neste estudo, foi desenvolvido e caracterizado um dispositivo CTCM que pode estimular seções ultrafinas do coração.O sistema CTCM inclui estimulação eletromecânica fisiologicamente sincronizada e enriquecimento de fluido T3 e Dex.Quando as seções de coração suíno foram expostas a esses fatores, sua viabilidade, integridade estrutural, atividade metabólica e expressão transcricional permaneceram as mesmas do tecido de coração fresco após 12 dias de cultura.Além disso, o estiramento excessivo do tecido cardíaco pode causar hipertrofia do coração causada pela hiperextensão.No geral, esses resultados apóiam o papel crítico das condições de cultura fisiológica na manutenção de um fenótipo cardíaco normal e fornecem uma plataforma para triagem de drogas.
Muitos fatores contribuem para criar um ambiente ideal para o funcionamento e sobrevivência dos cardiomiócitos.Os mais óbvios desses fatores estão relacionados a (1) interações intercelulares, (2) estimulação eletromecânica, (3) fatores humorais e (4) substratos metabólicos.As interações fisiológicas célula a célula requerem redes tridimensionais complexas de vários tipos de células suportadas por uma matriz extracelular.Essas interações celulares complexas são difíceis de reconstruir in vitro por co-cultura de tipos de células individuais, mas podem ser facilmente alcançadas usando a natureza organotípica das seções do coração.
O alongamento mecânico e a estimulação elétrica dos cardiomiócitos são fundamentais para a manutenção do fenótipo cardíaco33,34,35.Embora a estimulação mecânica tenha sido amplamente utilizada para o condicionamento e maturação do hiPSC-CM, vários estudos elegantes tentaram recentemente a estimulação mecânica de fatias do coração em cultura usando carga uniaxial.Esses estudos mostram que a carga mecânica uniaxial 2D tem um efeito positivo no fenótipo do coração durante a cultura.Nesses estudos, as seções do coração foram carregadas com forças de tração isométricas17, cargas auxotônicas lineares18 ou o ciclo cardíaco foi recriado usando feedback do transdutor de força e impulsos de tensão.No entanto, esses métodos usam estiramento de tecido uniaxial sem otimização ambiental, resultando na supressão de muitos genes cardíacos ou na superexpressão de genes associados a respostas anormais de estiramento.O CTCM descrito aqui fornece um estímulo eletromecânico 3D que imita o ciclo cardíaco natural em termos de tempo de ciclo e alongamento fisiológico (25% de alongamento, 40% de sístole, 60% de diástole e 72 batimentos por minuto).Embora esta estimulação mecânica tridimensional por si só não seja suficiente para manter a integridade do tecido, uma combinação de estimulação humoral e mecânica usando T3/Dex é necessária para manter adequadamente a viabilidade, função e integridade do tecido.
Fatores humorais desempenham um papel importante na modulação do fenótipo cardíaco adulto.Isso foi destacado em estudos HiPS-CM nos quais T3 e Dex foram adicionados ao meio de cultura para acelerar a maturação celular.O T3 pode influenciar o transporte de aminoácidos, açúcares e cálcio através das membranas celulares36.Além disso, o T3 promove a expressão de MHC-α e a regulação negativa de MHC-β, promovendo a formação de miofibrilas de contração rápida em cardiomiócitos maduros em comparação com miofibrilas de contração lenta em CM fetal.A deficiência de T3 em pacientes com hipotireoidismo resulta na perda de bandas miofibrilares e em uma taxa reduzida de desenvolvimento do tônus37.A Dex atua nos receptores de glicocorticóides e demonstrou aumentar a contratilidade miocárdica em corações perfundidos isolados;38 acredita-se que essa melhora esteja relacionada ao efeito na entrada de depósitos de cálcio (SOCE) 39,40.Além disso, a Dex liga-se aos seus receptores, causando uma ampla resposta intracelular que suprime a função imune e a inflamação30.
Nossos resultados indicam que a estimulação físico-mecânica (MS) melhorou o desempenho geral da cultura em comparação com o Ctrl, mas falhou em manter a viabilidade, integridade estrutural e expressão cardíaca ao longo de 12 dias em cultura.Em comparação com Ctrl, a adição de T3 e Dex às culturas de CTCM (MT) melhorou a viabilidade e manteve perfis de transcrição, integridade estrutural e atividade metabólica semelhantes com tecido cardíaco fresco por 12 dias.Além disso, ao controlar o grau de estiramento do tecido, um modelo de hipertrofia cardíaca induzida por hiperextensão foi criado usando o STCM, ilustrando a versatilidade do sistema STCM.Deve-se notar que, embora a remodelação cardíaca e a fibrose geralmente envolvam órgãos intactos cujas células circulantes podem fornecer as citocinas apropriadas, bem como a fagocitose e outros fatores de remodelação, as seções do coração ainda podem imitar o processo fibrótico em resposta ao estresse e ao trauma.em miofibroblastos.Isso foi avaliado anteriormente neste modelo de corte cardíaco.Deve-se observar que os parâmetros da CTCM podem ser modulados alterando a pressão/amplitude elétrica e a frequência para simular muitas condições, como taquicardia, bradicardia e suporte circulatório mecânico (coração sem carga mecânica).Isso torna o sistema um rendimento médio para testes de drogas.A capacidade da CTCM de modelar hipertrofia cardíaca induzida por esforço excessivo abre caminho para testar esse sistema para terapia personalizada.Em conclusão, o presente estudo demonstra que o alongamento mecânico e a estimulação humoral são essenciais para manter a cultura de cortes de tecido cardíaco.
Embora os dados aqui apresentados sugiram que CTCM é uma plataforma muito promissora para modelar miocárdio intacto, este método de cultura tem algumas limitações.A principal limitação da cultura CTCM é que ela impõe tensões mecânicas dinâmicas contínuas nas fatias, o que impede a capacidade de monitorar ativamente as contrações da fatia cardíaca durante cada ciclo.Além disso, devido ao pequeno tamanho das seções cardíacas (7 mm), a capacidade de avaliar a função sistólica fora dos sistemas de cultura usando sensores de força tradicionais é limitada.No manuscrito atual, superamos parcialmente essa limitação avaliando a tensão óptica como um indicador da função contrátil.No entanto, essa limitação exigirá mais trabalho e poderá ser abordada no futuro com a introdução de métodos de monitoramento óptico da função de fatias cardíacas em cultura, como o mapeamento óptico usando corantes sensíveis à voltagem e cálcio.Outra limitação do CTCM é que o modelo de trabalho não manipula o estresse fisiológico (pré-carga e pós-carga).Na CTCM, a pressão foi induzida em direções opostas para reproduzir 25% de estiramento fisiológico na diástole (estiramento total) e na sístole (comprimento da contração durante a estimulação elétrica) em tecidos muito grandes.Essa limitação deve ser removida em projetos futuros de CTCM por pressão adequada no tecido cardíaco de ambos os lados e aplicando as relações exatas de pressão-volume que ocorrem nas câmaras do coração.
A remodelação induzida por overstretch relatada neste manuscrito é limitada a imitar sinais de hiperestiramento hipertrófico.Assim, este modelo pode auxiliar no estudo da sinalização hipertrófica induzida pelo estiramento sem a necessidade de fatores humorais ou neurais (que não existem neste sistema).Mais estudos são necessários para aumentar a multiplicidade de CTCM, por exemplo, co-cultivo com células imunes, fatores humorais plasmáticos circulantes e inervação quando co-cultivo com células neuronais melhorará as possibilidades de modelagem de doenças com CTCM.
Treze porcos foram usados ​​neste estudo.Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Louisville.O arco aórtico foi clampeado e o coração perfundido com 1 L de cardioplegia estéril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparina, pH até 7,4); os corações foram preservados em solução cardioplégica gelada até serem transportados para o laboratório em gelo, que geralmente é <10 min. os corações foram preservados em solução cardioplégica gelada até serem transportados para o laboratório em gelo, que geralmente é <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно з Duração <10 minutos. os corações foram armazenados em solução cardioplégica gelada até o transporte para o laboratório em gelo, o que geralmente leva <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Mantenha os corações em cardioplegia de gelo até o transporte para o laboratório em gelo, geralmente <10 min.
O dispositivo CTCM foi desenvolvido no software de desenho assistido por computador (CAD) SolidWorks.As câmaras de cultura, divisórias e câmaras de ar são feitas de plástico acrílico transparente CNC.O anel de apoio de 7 mm de diâmetro é feito de polietileno de alta densidade (HDPE) no centro e possui uma ranhura de anel de vedação para acomodar o anel de vedação de silicone usado para vedar a mídia por baixo.Uma fina membrana de sílica separa a câmara de cultura da placa de separação.A membrana de silicone é cortada a laser de uma folha de silicone de 0,02″ de espessura e tem uma dureza de 35A.As juntas de silicone inferior e superior são cortadas a laser de uma folha de silicone de 1/16" de espessura e têm uma dureza de 50A.Parafusos de aço inoxidável 316L e porcas borboleta são usados ​​para fixar o bloco e criar uma vedação hermética.
Uma placa de circuito impresso (PCB) dedicada foi projetada para ser integrada ao sistema C-PACE-EM.Os soquetes do conector da máquina suíça no PCB são conectados aos eletrodos de grafite por fios de cobre banhados a prata e parafusos de bronze 0-60 aparafusados ​​nos eletrodos.A placa de circuito impresso é colocada na tampa da impressora 3D.
O dispositivo CTCM é controlado por um atuador pneumático programável (PPD) que cria uma pressão circulatória controlada semelhante a um ciclo cardíaco.À medida que a pressão dentro da câmara de ar aumenta, a membrana de silicone flexível se expande para cima, forçando o meio sob o local do tecido.A área de tecido será então esticada por essa expulsão de fluido, imitando a expansão fisiológica do coração durante a diástole.No pico do relaxamento, foi aplicada estimulação elétrica por meio de eletrodos de grafite, que reduziu a pressão na câmara de ar e provocou a contração dos cortes teciduais.Dentro do tubo há uma válvula hemostática com um sensor de pressão para detectar a pressão no sistema de ar.A pressão detectada pelo sensor de pressão é aplicada a um coletor de dados conectado ao laptop.Isso permite o monitoramento contínuo da pressão dentro da câmara de gás.Quando a pressão máxima da câmara foi atingida (padrão 80 mmHg, 140 mmHg OS), o dispositivo de aquisição de dados foi solicitado a enviar um sinal ao sistema C-PACE-EM para gerar um sinal de tensão bifásica por 2 ms, definido para 4 V.
As seções do coração foram obtidas e as condições de cultura em 6 poços foram realizadas da seguinte forma: Transferir os corações colhidos do vaso de transferência para uma bandeja contendo cardioplegia fria (4° C).O ventrículo esquerdo foi isolado com lâmina estéril e cortado em pedaços de 1-2 cm3.Esses blocos de tecido foram fixados a suportes de tecido com adesivo de tecido e colocados em um banho de tecido de micrótomo vibratório contendo solução de Tyrode e continuamente oxigenados (3 g/L monooxima de 2,3-butanodiona (BDM), NaCl 140 mM (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glicose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM gCl2 (1 ml de solução 1 M), CaCl2 1,8 mM (1,8 ml de solução 1 M), até 1 L de ddH2O).O micrótomo vibratório foi ajustado para cortar fatias de 300 µm de espessura a uma frequência de 80 Hz, uma amplitude de vibração horizontal de 2 mm e uma taxa de avanço de 0,03 mm/s.O banho de tecido foi envolvido por gelo para manter a solução fria e a temperatura foi mantida a 4°C.Transfira as seções de tecido do banho do micrótomo para um banho de incubação contendo solução de Tyrode continuamente oxigenada no gelo até obter seções suficientes para uma placa de cultura.Para culturas transwell, as seções de tecido foram anexadas a suportes de poliuretano estéreis de 6 mm de largura e colocadas em 6 ml de meio otimizado (meio 199, 1x suplemento ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalino e 2X antibiótico-antifúngico).A estimulação elétrica (10 V, frequência 1,2 Hz) foi aplicada aos cortes de tecido por meio do C-Pace.Para condições TD, T3 e Dex frescos foram adicionados a 100 nM e 1 μM a cada troca de meio.O meio é saturado com oxigênio antes da substituição 3 vezes ao dia.As seções de tecido foram cultivadas em uma incubadora a 37°C e 5% de CO2.
Para as culturas de CTCM, as seções de tecido foram colocadas em uma impressora 3D personalizada em uma placa de Petri contendo solução de Tyrode modificada.O dispositivo foi projetado para aumentar o tamanho da fatia do coração em 25% da área do anel de suporte.Isso é feito para que as seções do coração não se estiquem após serem transferidas da solução de Tyrode para o meio e durante a diástole.Utilizando cola histoacrílica, seções de 300 µm de espessura foram fixadas em um anel de suporte de 7 mm de diâmetro.Depois de anexar as seções de tecido ao anel de suporte, corte as seções de tecido em excesso e coloque as seções de tecido anexadas de volta no banho de solução de Tyrode no gelo (4°C) até que seções suficientes tenham sido preparadas para um dispositivo.O tempo total de processamento para todos os dispositivos não deve exceder 2 horas.Depois que 6 seções de tecido foram fixadas em seus anéis de suporte, o dispositivo CTCM foi montado.A câmara de cultura CTCM é pré-preenchida com 21 ml de meio pré-oxigenado.Transfira as seções de tecido para a câmara de cultura e remova cuidadosamente quaisquer bolhas de ar com uma pipeta.A seção de tecido é então guiada para dentro do orifício e pressionada suavemente no lugar.Finalmente, coloque a tampa do eletrodo no dispositivo e transfira o dispositivo para a incubadora.Em seguida, conecte o CTCM ao tubo de ar e ao sistema C-PACE-EM.O atuador pneumático abre e a válvula de ar abre o CTCM.O sistema C-PACE-EM foi configurado para fornecer 4 V a 1,2 Hz durante a estimulação bifásica por 2 ms.O meio foi trocado duas vezes ao dia e os eletrodos uma vez ao dia para evitar o acúmulo de grafite nos eletrodos.Se necessário, as seções de tecido podem ser removidas de seus poços de cultura para expelir quaisquer bolhas de ar que possam ter caído sob eles.Para condições de tratamento MT, T3/Dex foi adicionado fresco com cada mudança de meio com 100 nM de T3 e 1 μM de Dex.Os dispositivos CTCM foram cultivados em uma incubadora a 37°C e 5% de CO2.
Para obter trajetórias esticadas de fatias de coração, um sistema de câmera especial foi desenvolvido.Uma câmera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tóquio, Japão) foi usada com uma lente macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).A visualização foi realizada à temperatura ambiente após a substituição do meio por meio fresco.A câmera é posicionada em um ângulo de 51° e o vídeo é gravado a 30 quadros por segundo.Primeiro, o software de código aberto (MUSCLEMOTION43) foi usado com o Image-J para quantificar o movimento das fatias do coração.A máscara foi criada usando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) para definir regiões de interesse para batimentos cardíacos para evitar ruídos.Máscaras segmentadas manualmente são aplicadas a todas as imagens em uma sequência de quadros e depois passadas para o plug-in MUSCLEMOTION.O Muscle Motion usa a intensidade média dos pixels em cada quadro para quantificar seu movimento em relação ao quadro de referência.Os dados foram registrados, filtrados e usados ​​para quantificar o tempo do ciclo e avaliar o estiramento do tecido durante o ciclo cardíaco.O vídeo gravado foi pós-processado usando um filtro digital de fase zero de primeira ordem.Para quantificar o estiramento do tecido (pico a pico), a análise pico a pico foi realizada para distinguir entre picos e depressões no sinal registrado.Além disso, a eliminação de tendências é realizada usando um polinômio de 6ª ordem para eliminar o desvio do sinal.O código do programa foi desenvolvido em MATLAB para determinar o movimento global do tecido, o tempo de ciclo, o tempo de relaxamento e o tempo de contração (código suplementar do programa 44).
Para análise de tensão, usando os mesmos vídeos criados para avaliação de alongamento mecânico, primeiro traçamos duas imagens representando picos de movimento (os pontos de movimento mais altos (superiores) e mais baixos (inferiores)) de acordo com o software MUSCLEMOTION.Em seguida, segmentamos as regiões de tecido e aplicamos uma forma de algoritmo de sombreamento ao tecido segmentado (Fig. 2a complementar).O tecido segmentado foi então dividido em dez subsuperfícies, e a tensão em cada superfície foi calculada usando a seguinte equação: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, onde Sup e Sdown são as distâncias da forma das sombras superior e inferior do tecido, respectivamente (Fig. .2b complementar).
Os cortes cardíacos foram fixados em paraformaldeído a 4% por 48 horas.Os tecidos fixados foram desidratados em sacarose a 10% e 20% por 1 hora, depois em sacarose a 30% durante a noite.As seções foram então embebidas em composto de temperatura ótima de corte (composto OCT) e gradualmente congeladas em um banho de isopentano/gelo seco.Armazene os blocos de incorporação de OCT a -80 ° C até a separação.As lâminas foram preparadas como cortes com espessura de 8 μm.
Para remover a OCT das seções do coração, aqueça as lâminas em um bloco de aquecimento a 95 °C por 5 min.Adicione 1 ml de PBS a cada lâmina e incube por 30 minutos em temperatura ambiente, depois permeie as seções definindo 0,1% de Triton-X em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente.Para evitar que anticorpos não específicos se liguem à amostra, adicione 1 ml de solução de BSA a 3% às lâminas e incube por 1 hora em temperatura ambiente.A BSA foi então removida e as lâminas foram lavadas com PBS.Marque cada amostra com um lápis.Anticorpos primários (diluídos 1:200 em 1% BSA) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) foram adicionados ao longo de 90 minutos, então anticorpos secundários (diluídos 1:200 em 1% BSA) contra mouse Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16 079), contra coelho Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) por mais 90 minutos Lavado 3 vezes com PBS Para distinguir a coloração alvo do fundo, usamos apenas o anticorpo secundário como controle. Finalmente, o corante nuclear DAPI foi adicionado e as lâminas foram colocadas em um vectashield (Vector Laboratories) e seladas com esmalte de unhas. -x de aumento) e microscópio Keyence com aumento de 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml em PBS foi usado para coloração WGA e aplicado a seções fixas por 30 minutos em temperatura ambiente.As lâminas foram então lavadas com PBS e Sudan black foi adicionado a cada lâmina e incubadas por 30 minutos.As lâminas foram então lavadas com PBS e o meio de inclusão vectashield foi adicionado.As lâminas foram visualizadas em um microscópio Keyence com ampliação de 40x.
OCT foi removido das amostras conforme descrito acima.Depois de remover a OCT, mergulhe as lâminas na solução de Bouin durante a noite.As lâminas foram então enxaguadas com água destilada por 1 hora e então colocadas em uma solução de fucsina ácida Bibrich aloe por 10 minutos.Em seguida, as lâminas foram lavadas com água destilada e colocadas em solução de fosfomolibdênio 5%/ácido fosfotungstico 5% por 10 minutos.Sem enxaguar, transfira as lâminas diretamente para a solução de azul de anilina por 15 minutos.Em seguida, as lâminas foram lavadas com água destilada e colocadas em solução de ácido acético 1% por 2 minutos.As lâminas foram secas em etanol 200 N e transferidas para xileno.As lâminas coradas foram visualizadas usando um microscópio Keyence com uma objetiva de 10x.A porcentagem da área de fibrose foi quantificada usando o software Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catálogo V13154, de acordo com o protocolo do fabricante com algumas modificações.Em particular, um punção cirúrgico com um diâmetro de 6 mm foi usado para garantir tamanho de tecido uniforme durante a análise MTT.Os tecidos foram semeados individualmente nos poços de uma placa de 12 poços contendo substrato MTT de acordo com o protocolo do fabricante.Os cortes são incubados a 37° C por 3 horas e o tecido vivo metaboliza o substrato MTT para formar um composto formazano roxo.Substitua a solução de MTT por 1 ml de DMSO e incube a 37 °C por 15 minutos para extrair o formazan roxo das seções do coração.As amostras foram diluídas 1:10 em DMSO em placas de fundo transparente de 96 poços e a intensidade da cor púrpura foi medida a 570 nm usando um leitor de placas Cytation (BioTek).As leituras foram normalizadas para o peso de cada fatia do coração.
A mídia da fatia de coração foi substituída por mídia contendo 1 μCi/ml [5-3H]-glicose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EUA) para o ensaio de utilização de glicose conforme descrito anteriormente.Após 4 horas de incubação, adicione 100 µl de meio a um tubo de microcentrífuga aberto contendo 100 µl de HCl 0,2 N.Em seguida, o tubo foi colocado em um tubo de cintilação contendo 500 μl de dH2O para evaporar [3H]2O por 72 horas a 37°C.Em seguida, remova o tubo da microcentrífuga do tubo de cintilação e adicione 10 ml de fluido de cintilação.As contagens de cintilação foram realizadas usando um analisador de cintilação líquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EUA).A utilização de glicose foi então calculada levando em conta a atividade específica da [5-3H]-glicose, equilíbrio incompleto e fundo, diluição de [5-3H]-para glicose não marcada e eficiência do contador de cintilação.Os dados são normalizados para a massa de seções do coração.
Após a homogeneização do tecido em Trizol, o RNA foi isolado das seções do coração usando o Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 de acordo com o protocolo do fabricante.A preparação da biblioteca de RNAsec, sequenciamento e análise de dados foram realizados da seguinte forma:
1 μg de RNA por amostra foi usado como material de partida para a preparação da biblioteca de RNA.As bibliotecas de sequenciamento foram geradas usando o kit de preparação de biblioteca de RNA NEBNext UltraTM para Illumina (NEB, EUA) seguindo as recomendações do fabricante, e os códigos de índice foram adicionados às sequências de atributos para cada amostra.Resumidamente, o mRNA foi purificado a partir do RNA total usando grânulos magnéticos ligados com oligonucleotídeos poli-T.A fragmentação é realizada usando cátions divalentes em alta temperatura em NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).A primeira fita de cDNA foi sintetizada usando primers hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa M-MuLV (RNase H-).A segunda fita de cDNA é então sintetizada usando DNA polimerase I e RNase H. As saliências remanescentes são convertidas em extremidades rombas pela atividade de exonuclease/polimerase.Após a adenilação da extremidade 3' do fragmento de DNA, um Adaptador NEBNext com uma estrutura de loop hairpin é anexado a ele para prepará-lo para a hibridização.Para seleção de fragmentos de cDNA de comprimento preferido 150-200 pb.os fragmentos da biblioteca foram purificados usando o sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA).Em seguida, 3 μl de USER Enzyme (NEB, EUA) com cDNA de tamanho selecionado ligado com um adaptador foram usados ​​por 15 minutos a 37°C e depois por 5 minutos a 95°C antes da PCR.A PCR foi então realizada usando a polimerase de DNA de alta fidelidade Phusion, primers universais de PCR e primers Index (X).Por fim, os produtos de PCR foram purificados (sistema AMPure XP) e a qualidade da biblioteca avaliada em um sistema Agilent Bioanalyzer 2100.A biblioteca de cDNA foi então sequenciada usando um sequenciador Novaseq.Os arquivos de imagem bruta do Illumina foram convertidos em leituras brutas usando o CASAVA Base Calling.Os dados brutos são armazenados em arquivos de formato FASTQ(fq) que contêm sequências de leitura e qualidades básicas correspondentes.Selecione HISAT2 para combinar as leituras de sequenciamento filtradas com o genoma de referência Sscrofa11.1.Em geral, o HISAT2 suporta genomas de qualquer tamanho, incluindo genomas maiores que 4 bilhões de bases, e os valores padrão são definidos para a maioria dos parâmetros.As leituras de splicing de dados de RNA Seq podem ser alinhadas com eficiência usando o HISAT2, o sistema mais rápido atualmente disponível, com a mesma ou melhor precisão do que qualquer outro método.
A abundância de transcritos reflete diretamente o nível de expressão gênica.Os níveis de expressão gênica são avaliados pela abundância de transcritos (contagem de sequenciamento) associados ao genoma ou éxons.O número de leituras é proporcional aos níveis de expressão do gene, comprimento do gene e profundidade de sequenciamento.FPKM (fragmentos por mil pares de base de transcrito sequenciado por milhão de pares de base) foram calculados e os valores P de expressão diferencial foram determinados usando o pacote DESeq2.Em seguida, calculamos a taxa de descoberta falsa (FDR) para cada valor P usando o método Benjamini-Hochberg9 com base na função R integrada “p.adjust”.
O RNA isolado das seções do coração foi convertido em cDNA em uma concentração de 200 ng/μl usando o SuperScript IV Vilo Master mix da Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).A RT-PCR quantitativa foi realizada usando uma placa de reação transparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp de 384 poços (Thermo, cat. no. 4483319) e adesivo óptico microamp (Thermo, cat. no. 4311971).A mistura de reação consistia em 5 µl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer e 3,5 µl de H2O misturados por poço.Ciclos padrão de qPCR foram executados e os valores de CT foram medidos usando um instrumento de PCR em tempo real Applied Biosystems Quantstudio 5 (módulo de 384 poços; produto nº A28135).Os primers Taqman foram adquiridos da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), G ATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Os valores CT de todas as amostras foram normalizados para o gene de limpeza GAPDH.
A liberação de mídia de NT-ProBNP foi avaliada usando o kit NT-ProBNP (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) de acordo com o protocolo do fabricante.Resumidamente, 250 µl de cada amostra e padrão foram adicionados em duplicata a cada poço.Imediatamente após adicionar a amostra, adicione 50 µl de Reagente de Ensaio A a cada poço.Agite suavemente a placa e sele com selante.Em seguida, os comprimidos foram incubados a 37°C durante 1 hora.Em seguida, aspire a solução e lave os poços 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem 1X, incubando a solução de lavagem por 1-2 minutos de cada vez.Em seguida, adicione 100 µl de Reagente de Ensaio B por poço e sele com selante de placa.O comprimido foi agitado suavemente e incubado a 37°C por 30 minutos.Aspire a solução e lave os poços 5 vezes com 350 µl de solução de lavagem 1X.Adicione 90 µl de solução de substrato a cada poço e sele a placa.Incubar a placa a 37°C durante 10-20 minutos.Adicione 50 µl de Stop Solution a cada poço.A placa foi imediatamente medida usando um leitor de placas Cytation (BioTek) ajustado para 450 nm.
Análises de poder foram realizadas para escolher os tamanhos de grupo que fornecerão > 80% de poder para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro com uma taxa de erro Tipo I de 5%. Análises de poder foram realizadas para escolher os tamanhos de grupo que fornecerão > 80% de poder para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro com uma taxa de erro Tipo I de 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаруже ния 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. A análise de poder foi realizada para selecionar tamanhos de grupo que forneceriam > 80% de poder para detectar 10% de alteração de parâmetro absoluto com uma taxa de erro Tipo I de 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обн аружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Uma análise de poder foi realizada para selecionar um tamanho de grupo que forneceria > 80% de poder para detectar 10% de alteração de parâmetro absoluto e 5% de taxa de erro tipo I.As seções de tecido foram selecionadas aleatoriamente antes do experimento.Todas as análises foram condicionadas às cegas e as amostras foram decodificadas somente após todos os dados terem sido analisados.O software GraphPad Prism (San Diego, CA) foi usado para realizar todas as análises estatísticas. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores <0,05. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores <0,05.O teste t de Student bicaudal foi realizado nos dados com apenas 2 comparações.ANOVA de uma ou duas vias foi usada para determinar a significância entre vários grupos.Ao realizar testes post hoc, a correção de Tukey foi aplicada para contabilizar comparações múltiplas.Os dados de RNAsec têm considerações estatísticas especiais ao calcular FDR e p.adjust conforme descrito na seção Métodos.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do Nature Research Report vinculado a este artigo.