Vă mulțumim că vizitați Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript.
Morfogeneza intestinului uman stabilește caracteristicile cripto-vilozității microarhitecturii epiteliale 3D și organizării spațiale. Această structură unică este necesară pentru a menține homeostazia intestinală prin protejarea nișei de celule stem din cripta bazală de antigenele microbiene exogene și metaboliții acestora. Structurile epiteliale D sunt cruciale pentru construirea modelelor intestinale in vitro. În special, intestinul mimetic organic pe cip poate induce morfogeneza 3D spontană a epiteliului intestinal cu funcții fiziologice și biomecanică îmbunătățite. Aici, oferim un protocol reproductibil pentru a induce în mod robust morfogeneza intestinală în cipurile intestinale, precum și metoda hibridă de transpare, precum și o metodă de fabricație detaliată a cipului de intestin. , cultivarea Caco-2 sau a celulelor epiteliale organoide intestinale în setări convenționale, precum și pe o platformă microfluidică, inducerea morfogenezei 3D și caracterizarea epiteliilor 3D stabilite folosind mai multe modalități de imagistică. Acest protocol realizează regenerarea microarhitecturii intestinale funcționale prin controlul fluxului de fluid bazolateral pentru 5 zile. necesită inginerie sau manipulare celulară complexă, care poate depăși alte tehnici existente. Ne imaginăm că protocolul nostru propus ar putea avea implicații largi pentru comunitatea de cercetare biomedicală, oferind o metodă de regenerare a straturilor epiteliale intestinale 3D in vitro pentru aplicații biomedicale, clinice și farmaceutice.
Experimentele demonstrează că celulele epiteliale intestinale Caco-2 cultivate în intestin-on-a-chip1,2,3,4,5 sau dispozitive microfluidice cu două straturi6,7 pot suferi morfogeneză 3D spontană in vitro fără o înțelegere clară a mecanismului de bază. În studiul nostru recent, am constatat că îndepărtarea de la dispozitivul basolateral secretat este necesară și suficientă în culturile epiteliale secretate3. morfogeneza in vitro, care a fost demonstrată de Caco-2 și organoizi intestinali derivați de la pacient.Celulele epiteliale au fost validate. În acest studiu, ne-am concentrat în mod special pe producția celulară și distribuția concentrației unui antagonist Wnt puternic, Dickkopf-1 (DKK-1), în intestin-on-a-chip și dispozitive microfluidice modificate care conțin inserții Transwell, denumite „Hybrid Chip”. -proteina 1, sau Soggy-1) la nivelul intestinului de pe cip inhibă morfogeneza sau perturbă stratul epitelial 3D prestructurat, sugerând că stresul antagonist în timpul culturii este responsabil pentru morfogeneza intestinală in vitro. Prin urmare, o abordare practică pentru a realiza o morfogeneză robustă la nivelul epiteliului este menținerea nivelului basantagonului activ sau a interfeței epiteliale prin eliminarea minimă a interfeței laterale. (de exemplu, în platforme gut-on-a-chip sau hibrid-pe-a-chip) sau difuzie. Medii bazolaterale (de exemplu, din inserții Transwell în rezervoare bazolaterale mari din puțuri).
În acest protocol, oferim o metodă detaliată pentru fabricarea de microdispozitive gut-on-a-chip și cipuri hibride inserabile Transwell (pașii 1-5) pentru a cultiva celule epiteliale intestinale pe membrane poroase pe bază de polidimetilsiloxan (PDMS) (etașii 6A, 7A, 8, 9) sau membrane poliester induse ale Transwell 3, 8B, 7B induse și membranele 7B, 38B, 8B induse. morfogeneza in vitro (pasul 10). Am identificat, de asemenea, caracteristici celulare și moleculare care indică histogeneza specifică țesuturilor și diferențierea celulară dependentă de linie prin aplicarea mai multor modalități de imagistică (pașii 11-24). Inducem morfogeneza folosind celule epiteliale intestinale umane, cum ar fi Caco-2 sau organoizi intestinali, în două formate de cultură, modificări de suprafață și reproducere biochimică a membranelor intestinale, modificări de suprafață și reproducere monochimică. a micromediului biomecanic.in vitro.Pentru a induce morfogeneza 3D din monostraturi epiteliale 2D, am eliminat antagoniştii morfogenului din ambele forme de cultură prin curgerea mediului în compartimentul bazolateral al culturii. În cele din urmă, oferim o reprezentare a utilităţii unui model 3D regenerabil de epiteliu 3D regenerabil care poate fi utilizat în stratul epitelial comorfomic de creştere longitudinală, gazdă co-dependentă, stratul epitelial comorfomic. -culturi, infecție cu patogeni, leziuni inflamatorii, disfuncție a barierei epiteliale și terapii pe bază de probiotice Exemplu.influențe.
Protocolul nostru poate fi util pentru o gamă largă de oameni de știință în cercetarea de bază (de exemplu, biologia mucoasei intestinale, biologia celulelor stem și biologia dezvoltării) și aplicată (de exemplu, testarea preclinice a medicamentelor, modelarea bolii, ingineria țesuturilor și gastroenterologie) impact larg. s studiază dinamica semnalizării celulare în timpul dezvoltării intestinale, regenerării sau homeostaziei. În plus, protocolul nostru este util pentru interogarea infecției sub diferiți agenți infecțioși, cum ar fi Norovirus 8, Sindromul respirator acut sever Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 sau Vibrio cholerae.Publicul patologiei și patogenezei bolii sunt, de asemenea, utile. Utilizarea unui sistem de microfiziologie intestinală pe cip poate permite co-cultura longitudinală 10 și evaluarea ulterioară a apărării gazdei, a răspunsurilor imune și a reparării leziunilor legate de patogen în tractul gastrointestinal (GI) 11. Alte tulburări gastrointestinale asociate cu leaky intestin, boala crochita, boala intestinului permeabil, boala crochita, boala intestinului permeabil, sau sindromul intestinului iritabil poate fi simulat atunci când straturile epiteliale intestinale 3D sunt pregătite folosind straturile epiteliale intestinale 3D ale pacientului, aceste boli includ atrofia vilozității, scurtarea criptelor, leziuni ale mucoasei sau afectarea barierei epiteliale. tipuri, cum ar fi celulele mononucleare din sângele periferic al pacientului (PBMC), până la modele care conțin microarhitecturi 3D de vilozitate intestinală-criptă.celule imune specifice țesuturilor, 5.
Deoarece microstructura epitelială 3D poate fi fixată și vizualizată fără procesul de secționare, privitorii care lucrează la transcriptomica spațială și la imagini de înaltă rezoluție sau super-rezoluție pot fi interesați de maparea noastră a dinamicii spațiotemporale a genelor și proteinelor pe nișele epiteliale.Interesat de tehnologie. Răspuns la stimuli microbieni sau imunitari. În plus, diafonia longitudinală gazdă-microbiom 10, 14 care coordonează homeostazia intestinală poate fi stabilită în stratul 3D al mucoasei intestinale prin co-cultivarea diverselor specii microbiene, comunități microbiene sau microbiotei fecale, în special în intestin-pe-a-chip.Această abordare este deosebit de atractivă pentru publicul care studiază imunologia mucoasei, gastroenterologia, microbiomul uman, culturomica și microbiologia clinică care caută să cultive microbiota intestinală necultivată anterior în laborator. Dacă protocolul nostru de morfogeneză in vitro poate fi adaptat la formate de cultură scalabile, cum ar fi inserții cu mai multe godeuri în plăci laterale sau inserții laterale care reînnoiesc în mod continuu 249 plăci laterale. protocolul poate fi, de asemenea, diseminat celor care dezvoltă platforme farmaceutice, biomedicale sau de screening sau validare de mare capacitate pentru industria alimentară. Ca o dovadă a principiului, am demonstrat recent fezabilitatea unui sistem de morfogeneză multiplex de mare debit scalabil la un format de placă cu 24 de godeuri. Metoda de morfogeneză poate fi accelerată și potențial adoptată de multe laboratoare de cercetare, industrie sau agenții guvernamentale și de reglementare pentru a înțelege reprogramarea celulară a morfogenezei intestinale in vitro la nivel transcriptomic pentru a testa medicamente sau bioterapice.
Un număr limitat de modele experimentale relevante pentru om au fost folosite pentru a studia morfogeneza epitelială intestinală, în principal din cauza lipsei de protocoale implementabile pentru a induce morfogeneza 3D in vitro. Aceste modele sunt, de asemenea, foarte limitate în capacitatea lor de a fi testate într-o manieră scalabilă în mai multe moduri. Prin urmare, protocolul nostru de regenerare a structurilor de țesut 3D in vitro depășește modelele animale in vivo, precum și alte modele tradiționale statice de cultură celulară 2D. După cum s-a descris anterior, utilizarea structurilor epiteliale 3D ne-a permis să examinăm răspunsul diferențiat al celulelor spatiale pentru a examina diferitele tipuri de răspunsuri spatiale ale celulelor. mucoase sau stimuli imunitari. Straturile epiteliale 3D pot oferi un spațiu pentru a studia modul în care celulele microbiene concurează pentru a forma nișe spațiale și evoluția ecologică ca răspuns la factorii gazdă (de exemplu, straturile de mucus interior versus exterior, secreția de IgA și peptide antimicrobiene). de exemplu, acizi grași cu lanț scurt) care modelează organizarea celulară și nișele de celule stem în criptele bazale. Aceste caracteristici pot fi demonstrate numai atunci când straturile epiteliale 3D sunt stabilite in vitro.
În plus față de metoda noastră de a crea structuri epiteliale intestinale 3D, există mai multe metode in vitro. Cultura organoide intestinale este o tehnică de ultimă generație de inginerie tisulară bazată pe cultivarea celulelor stem intestinale în condiții de morfogene specifice23,24,25. Cu toate acestea, utilizarea modelelor organoide 3D pentru analiza de transport sau microcultura este adesea închisă în lumenul intestinal și este deseori inclus în microcultura intestinală. prin urmare, introducerea componentelor luminale precum celulele microbiene sau antigenele exogene este limitată.Accesul la lumenii organoizi poate fi îmbunătățit utilizând un microinjector,26,27, dar această metodă este invazivă și necesită o forță de muncă intensă și necesită cunoștințe specializate pentru a efectua.
Alte abordări utilizate de mai multe grupuri de cercetare utilizează schele de hidrogel 3D prestructurate pentru a imita structura epitelială intestinală prin cultivarea celulelor intestinale umane izolate pe suprafața gelului. Fabricați schele de hidrogel folosind matrițe imprimate 3D, micro-frezate sau fabricate litografic. Această metodă arată aranjamentul celular auto-organizat, în gradienți morfologici, stabiliti în vitro. Cu toate acestea, natura schelelor prestructurate poate împiedica afișarea procesului morfogenetic spontan în sine. Aceste modele, de asemenea, nu oferă flux luminal sau interstițial dinamic, lipsind stresul de forfecare fluid de care au nevoie celulele intestinale pentru a câștiga funcția hidromorfogenetică utilizată recent în studiul morfogenetic al celulelor intestinale. o platformă microfluidică și structuri epiteliale intestinale modelate folosind tehnici de gravare cu laser. Organoizii intestinali de șoarece urmează modele gravate pentru a forma structuri tubulare intestinale, iar fluxul de fluid intraluminal poate fi recapitulat folosind un modul de microfluidic. În ciuda fabricării complexe a diferitelor segmente intestinale în interiorul tubului, acest model nu are, de asemenea, fluxul de fluid luminal și deformarea mecanică. În plus, operabilitatea modelului poate fi limitată, mai ales după ce procesul de bioimprimare este complet, perturbând condițiile experimentale sau interacțiunile celulă la celulă. În schimb, protocolul nostru propus oferă morfogeneză intestinală spontană, stres fiziologic independent, accesibilitate fiziologică independentă a stresului molecular, accesibilitatea miologică independentă a intestinului. prin urmare, protocolul nostru de morfogeneză 3D in vitro poate oferi o abordare complementară pentru a depăși provocările metodelor existente.
Protocolul nostru este axat în întregime pe morfogeneza epitelială 3D, cu numai celule epiteliale în cultură și fără alte tipuri de celule înconjurătoare, cum ar fi celulele mezenchimale, celulele endoteliale și celulele imune. După cum s-a descris anterior, nucleul protocolului nostru este inducerea morfogenezei epiteliale prin îndepărtarea inhibitorilor morfogenei laterali ai morfogenezei noastre laterale robuste. on-a-chip și hibrid-on-a-chip ne permit să recreăm stratul epitelial 3D ondulat, complexități biologice suplimentare, cum ar fi interacțiunile epitelial-mezenchimale33,34, depunerea matricei extracelulare (ECM) 35 și, în modelul nostru, caracteristicile cript-vilus care transportă nișele celulelor stem, de exemplu, celulele stem, ramase în nișele celulelor stem, de exemplu, nișele fibroblastelor mezenchimale considerate mai departe în celulele stem. chimul joacă un rol cheie în producerea proteinelor ECM și în reglarea morfogenezei intestinale in vivo35,37,38. Adăugarea de celule mezenchimale la modelul nostru a îmbunătățit procesul morfogenetic și eficiența atașării celulelor. Stratul endotelial (adică, capilarele sau limfatice) joacă un rol important în reglarea transportului molecular39 și a componentelor imunitare, micro-intestinale și imunologice. pot fi conectate între modelele de țesut reprezintă o condiție prealabilă atunci când modelele de țesut sunt proiectate pentru a demonstra interacțiunile multi-organe. Prin urmare, celulele endoteliale ar putea fi necesare pentru a modela caracteristici fiziologice mai precise cu rezoluție la nivel de organ. Celulele imune derivate de la pacient sunt, de asemenea, esențiale pentru afișarea răspunsurilor imune înnăscute, prezentarea antigenului, adaptarea imunității încrucișate și mimarea contextului imun specific intestinal. boala.
Utilizarea cipurilor hibride este mai simplă decât gut-on-a-chip, deoarece configurarea dispozitivului este mai simplă, iar utilizarea inserțiilor Transwell permite cultura scalabilă a epiteliului intestinal. În general, proprietățile statice din compartimentul apical permit rareori co-cultura bacteriană pe termen lung în cipurile hibride. Deși putem induce morfogeneza 3D în inserții Transwell atunci când folosim cipuri hibride, lipsa biomecanicii relevante din punct de vedere fiziologic și a fluxului de fluid apical poate limita fezabilitatea platformelor de cip hibrid pentru aplicații potențiale.
Reconstrucțiile la scară completă ale axei criptei umane în culturile intestin-pe-cip și hibrid-pe-cip nu au fost pe deplin stabilite. Deoarece morfogeneza începe de la un monostrat epitelial, microarhitecturile 3D nu oferă neapărat similitudini morfologice cu criptele in vivo. cripta și regiunile viloase nu au fost clar delimitate. Deși canalele superioare superioare de pe cip duc la creșterea înălțimii epiteliului microinginerească, înălțimea maximă este încă limitată la ~300–400 µm. Adâncimea reală a criptelor intestinale umane din intestinul subțire și gros este de ~135 µm și, respectiv, de ~ 400 µm și, respectiv, înălțimea intestinală subțire este de ~400 µm, respectiv 400 µm.
Din punct de vedere imagistic, imagistica in situ de super-rezoluție a microarhitecturii 3D poate fi limitată la intestinul de pe un cip, deoarece distanța de lucru necesară de la lentila obiectiv la stratul epitelial este de ordinul a câțiva milimetri. Pentru a depăși această problemă, poate fi necesar un obiectiv la distanță. microfabricarea intestinului pe un cip implică aderența permanentă între fiecare strat, este extrem de dificil să deschideți sau să îndepărtați stratul superior pentru a examina structura de suprafață a stratului epitelial. De exemplu, prin utilizarea unui microscop electronic cu scanare (SEM).
Hidrofobicitatea PDMS a fost un factor limitativ în studiile pe bază de microfluidice care se ocupă cu moleculele mici hidrofobe, deoarece PDMS poate adsorbi nespecific astfel de molecule hidrofobe. Alternativele la PDMS pot fi luate în considerare cu alte materiale polimerice. În mod alternativ, modificarea suprafeței PDMS (de exemplu, acoperirea cu materiale lipofile poate fi considerată pentru a reduce la minimum etilglicol 43) molecule fobice.
În cele din urmă, metoda noastră nu a fost bine caracterizată în ceea ce privește furnizarea unui screening de mare capacitate sau a unei platforme experimentale „one-size-fits-all” ușor de utilizat. Protocolul actual necesită o pompă cu seringă per microdispozitiv, care ocupă spațiu într-un incubator cu CO2 și previne experimentele la scară largă. Această limitare poate fi îmbunătățită semnificativ prin scalabilitatea formatelor inovatoare de cultură care permit reumplerea și îndepărtarea continuă a mediilor bazolaterale).
Pentru a induce morfogeneza 3D a epiteliului intestinal uman in vitro, am folosit un dispozitiv intestinal cu cip microfluidic care conține două microcanale paralele și o membrană poroasă elastică între ele pentru a crea o interfață lumen-capilară. De asemenea, demonstrăm utilizarea unui dispozitiv microfluidic cu un singur canal (un cip hibrid) care asigură un flux bazolateral continuu sub diferitele straturi polarizate ale epiteliului intestinal uman. celulele epiteliale pot fi demonstrate prin aplicarea manipulării direcționale a fluxului pentru a elimina antagoniștii morfogenului din compartimentul bazolateral. Întreaga procedură experimentală (Figura 1) constă din cinci părți: (i) microfabricarea cipului intestinal sau cipului hibrid inserabil Transwell (pașii 1-5; Caseta 1), (ii) prepararea celulelor intestinale epiteliale sau organoide intestinale umane;casetele 2-5), (iii) cultura de celule epiteliale intestinale pe cipuri intestinale sau cipuri hibride (etașii 6-9), (iv) inducerea morfogenezei 3D in vitro (pasul 10) și (v)) pentru a caracteriza microstructura epitelială 3D (etașii 11-24). morfogeneza telială la controale spațiale, temporale, condiționate sau procedurale.
Am folosit două platforme de cultură diferite: gut-on-a-chip cu canale drepte sau canale neliniare contorte, sau cipuri hibride care conțin inserții Transwell (TW) într-un dispozitiv microfluidic, fabricat așa cum este descris în Caseta 1, iar pasul 1-5 „Device Fabrication” arată pașii principali în realizarea unui singur cip sau a unui cip hibrid. ) și procedura de cultură utilizată în acest protocol „Morfogeneza in vitro” arată pașii generali în care celulele epiteliale Caco-2 sau derivate din organoide sunt cultivate pe un cip intestinal sau pe inserții Transwell ale unui cip hibrid, urmată de inducerea morfogenezei 3D și formarea unei structuri epiteliale caracterizate. în caracterizarea diferențierii celulare, studiile de fiziologie intestinală, stabilirea ecosistemelor gazdă-microbiom și modelarea bolii. Imaginile de imunofluorescență în „Diferențierea celulelor” care arată nucleele, F-actina și MUC2 exprimate în stratul epitelial 3D Caco-2 generat pe cipul intestinal. Fiziologia arată mucusul produs prin colorarea reziduurilor de acid sialic și N-acetilglucozamină folosind aglutinină fluorescentă din germeni de grâu. Cele două imagini suprapuse din „Co-culturi gazdă-microbe” arată co-culturi reprezentative de microbiom-gazdă în intestin pe un cip. Panoul din stânga arată co-cultura de E. Panoul din dreapta arată localizarea GFP E. coli co-cultivate cu celule epiteliale 3D Caco-2, urmată de colorarea imunofluorescență cu F-actină (roșu) și nuclei (albastru). Modelarea bolii ilustrează intestinul sănătos versus permeabil în cipurile inflamatorii intestinale (de exemplu, provocarea antiinflamatoare a intestinului cu cipuri antiinflamatorii, bacterii lipozide și LPH) celule (de exemplu, PBMC;verde). Celulele Caco-2 au fost cultivate pentru a stabili un strat epitelial 3D. Bară de scară, 50 µm. Imagini din rândul de jos: „Diferențiarea celulelor” adaptată cu permisiunea de referință.2.Presa Universitatii Oxford;Reproduce cu permisiunea Ref.5.NAS;„Host-Microbe Co-Culture” adaptat cu permisiunea de la ref.3.NAS;„Disease Modeling” adaptat cu permisiunea de la referință.5.NAS.
Atât cipurile gut-on-chip, cât și cele hibride au fost fabricate folosind replici PDMS care au fost deformate din matrițe de siliciu prin litografie moale1,44 și modelate cu SU-8. Designul microcanalelor din fiecare cip este determinat prin luarea în considerare a hidrodinamicii, cum ar fi efortul de forfecare și presiunea hidrodinamică1,4,12. , a evoluat într-un intestin complex pe cip (Date extinse Fig. 1b) care include o pereche de microcanale curbate pentru a induce un timp de rezidență crescut al fluidului, modele de curgere neliniare și deformarea multiaxială a celulelor cultivate (Fig. 2a-f) 12. Când intestine mai complexe, avem nevoie să fie recreate biomecanica complexă a intestinului. Gut-Chip voluted, de asemenea, induce puternic morfogeneza 3D într-un interval de timp similar, cu un grad similar de creștere epitelială în comparație cu Gut-Chip original, indiferent de tipul de celule cultivate. Prin urmare, pentru a induce morfogeneza 3D, modelele intestinale liniare și complexe pe cip sunt interschimbabile.2a). Pentru a fabrica intestinul pe un cip, stratul PDMS superior pregătit a fost lipit secvenţial de un film PDMS poros şi apoi aliniat cu stratul inferior PDMS prin lipire ireversibilă utilizând un tratator corona (Fig. 2b-f). Pentru a fabrica cipuri hibride, replicile PDMS întărite au fost legate de lame de sticlă care ar putea crea dispozitive microfluidice și inserții transmodale (Fig. 2b-f). Date extinse Fig. 2). Procesul de lipire se realizează prin tratarea suprafețelor replicii și sticlei PDMS cu plasmă de oxigen sau tratament corona. După sterilizarea dispozitivului microfabricat atașat la tubul de silicon, configurația dispozitivului a fost gata să efectueze morfogeneza 3D a epiteliului intestinal (Figura 2g).
a, Ilustrare schematică a pregătirii pieselor PDMS din matrițe de silicon cu model SU-8. Soluția de PDMS neîntărită a fost turnată pe o matriță de siliciu (stânga), întărită la 60 °C (în mijloc) și deformată (dreapta). PDMS deformat a fost tăiat în bucăți și curățat pentru utilizare ulterioară. d, O serie de fotografii ale componentelor PDMS superioare și inferioare și a dispozitivului intestinal asamblat pe cip.e, Schema alinierii componentelor PDMS superioare, membranare și inferioare. Fiecare strat este lipit ireversibil prin tratament cu plasmă sau corona. Cultură celulară idică. Intestinul fabricat pe un cip asamblat cu un tub de silicon și o seringă a fost plasat pe o lamă. Dispozitivul cu cip a fost plasat pe capacul unei plăci Petri de 150 mm pentru procesare. Liantul este folosit pentru a închide tubul de silicon. introdus în cip hibrid pentru a induce morfogeneza 3D intestinală. Mediul este perfuzat prin microcanale sub stratul celular stabilit pe insertul Transwell. Bară de scară, 1 cm.h Retipărit cu permisiunea de la referință.4.Elsevier.
În acest protocol, linia celulară Caco-2 și organoizii intestinali au fost utilizate ca surse epiteliale (Fig. 3a). Ambele tipuri de celule au fost cultivate independent (caseta 2 și caseta 5) și utilizate pentru însămânțarea microcanalelor acoperite cu ECM ale intestinului pe cip sau inserții Transwell. 50) în baloane T sunt recoltate pentru a prepara suspensii celulare disociate prin lichid de tripsinizare (caseta 2). Organoizii intestinali umani din biopsii intestinale sau rezecții chirurgicale au fost cultivați în domuri de schelă Matrigel în plăci cu 24 de godeuri pentru a susține micromediul structural. a fost suplimentat o dată la două zile, până când organoizii au crescut la ~500 µm în diametru. Organoizii complet crescuți sunt recoltați și disociați în celule unice pentru însămânțare pe intestin sau inserții Transwell pe un cip (caseta 5). După cum am raportat anterior, poate fi diferențiat în funcție de tipul de boală12,13 (de exemplu, boala ulcerativă, cancerul colorectal sau cancerul normal (ex. leziune versus zona nelezionată) și localizarea gastrointestinală în tract (de exemplu, duoden, jejun, ileon, cecum, colon sau rect). Oferim un protocol optimizat în Caseta 5 pentru cultivarea organoidelor colonice (coloizi) care necesită de obicei concentrații mai mari de morfogeni decât organoizii intestinali subțiri.
a, Flux de lucru pentru inducerea morfogenezei intestinale în cipul intestinal. Epiteliul intestinal uman Caco-2 și organoizii intestinali sunt utilizați în acest protocol pentru a demonstra morfogeneza 3D. Celulele epiteliale izolate au fost însămânțate în dispozitivul preparat gut-on-a-chip (prepararea cipului). Odată ce celulele sunt însămânțate (semănate și atașate la membrană), atașate (PDMS) în ziua cu semințe (PDMS) fluxul ical (AP) este inițiat și menținut în primele 2 zile (flux, AP, D0-D2). Fluxul bazolateral (BL) este de asemenea inițiat împreună cu mișcări ciclice de întindere (întindere, flux, AP și BL) atunci când se formează un monostrat complet 2D. fiecare pas experimental sau punct de timp (grafic cu bare, 100 µm). Patru diagrame schematice care ilustrează cascadele corespunzătoare ale morfogenezei intestinale (dreapta sus). Săgețile întrerupte din schematică reprezintă direcția fluxului fluidului.b, imagine SEM care arată topologia suprafeței epiteliului Caco-2 3D stabilit (stânga). stratul (dreapta).c, Vedere frontală orizontală a Caco-2 3D, claudină (ZO-1, roșu) și membranelor de margine cu perie continuă etichetate F-actină (verde) și nuclee (albastru) Imunofluorescență Vizualizare confocală a celulelor epiteliale pe cipurile intestinale. Săgețile îndreptate către planul central al culturii de mijloc indică locația planului focal al culturii de mijloc. d pe un cip obținut prin microscopie cu contrast de fază în zilele 3, 7, 9, 11 și 13. Inserul (dreapta sus) arată mărirea mare a imaginii furnizate.magenta), celule caliciforme (MUC2; verde), F-actină (gri) și nuclee (cian) crescute pe cipuri intestinale timp de 3 zile, respectiv (stânga) și, respectiv, 13 zile (mijloc) organoizi pe stratul epitelial. Vezi și Date extinse Figura 3, care evidențiază semnalizarea LGR5 fără imaginile de semnalizare a epitelii MUC2 (microstructura) de microfluorescență. id epiteliul stabilit în intestin pe un cip prin colorarea membranei plasmatice cu colorant CellMask (dreapta) în ziua 13 de cultură.Bara de scară este de 50 μm dacă nu se specifică altfel.b Retipărit cu permisiunea de la referință.2.Presa Universitatii Oxford;c Adaptat cu permisiunea de la Referință.2.Presa Universitatii Oxford;e și f adaptate cu permisiunea prin referință.12 Sub Creative Commons License CC BY 4.0.
În intestinul pe un cip, este necesar să se modifice suprafața hidrofobă a membranei poroase PDMS pentru o acoperire cu succes ECM. În acest protocol, aplicăm două metode diferite pentru a modifica hidrofobicitatea membranelor PDMS. Pentru cultivarea celulelor Caco-2, activarea suprafeței prin tratament UV/ozon a fost suficientă pentru a reduce hidrofobicitatea suprafeței PDMS și a celulelor PDMS, atașăm microfluxul la membrana PDMS, atașăm celulele Caco-2. Cultura idică a epiteliului organoid necesită funcționalizarea suprafeței pe bază de substanțe chimice pentru a obține o depunere eficientă a proteinelor ECM prin aplicarea secvențială de polietilenimină (PEI) și glutaraldehidă pe microcanalele PDMS. După modificarea suprafeței, proteinele ECM au fost depuse pentru a acoperi suprafața funcționalizată a PDMS și apoi introduse în epiteliul de celule izolate, culturile celulare încep doar prin microfluidouri. mediu în microcanalul superior până când celulele formează un monostrat complet, în timp ce microcanalul inferior menține condiții statice. Această metodă optimizată pentru activarea suprafeței și acoperirea ECM permite atașarea epiteliului organoid pentru a induce morfogeneza 3D pe suprafața PDMS.
Culturile Transwell necesită, de asemenea, acoperire cu ECM înainte de însămânțarea celulelor;cu toate acestea, culturile Transwell nu necesită pași complexe de pretratare pentru a activa suprafața inserțiilor poroase. Pentru creșterea celulelor Caco-2 pe inserții Transwell, acoperirea ECM pe inserțiile poroase accelerează atașarea celulelor Caco-2 disociate (<1 oră) și formarea barierei de joncțiune strânsă (<1-2 zile). suprafața membranei (<3 h) și menținută până când organoizii formează un monostrat complet cu integritate de barieră .Culturile Transwell se efectuează în plăci cu 24 de godeuri fără utilizarea cipurilor hibride.
Morfogeneza 3D in vitro poate fi inițiată prin aplicarea fluxului de fluid pe aspectul bazolateral al unui strat epitelial stabilit. În intestinul pe un cip, morfogeneza epitelială a început atunci când mediul a fost perfuzat în microcanalele superioare și inferioare (Fig. 3a). Așa cum s-a descris anterior, este esențial să se introducă fluxul de fluid în compartimentul inferior (directie laterală basogenă), pentru a asigura suficient secret. nutrienții și serul la celulele legate de membranele poroase și generează stres de forfecare luminal, aplicăm de obicei flux dublu în intestin pe un cip. În cipurile hibride, inserțiile Transwell conținând monostraturi epiteliale au fost introduse în cipurile hibride. Apoi, mediul a fost aplicat sub partea bazolaterală a inserției poroase Transwell prin microcanal.
Caracteristicile morfologice ale straturilor epiteliale 3D microproiectate pot fi analizate prin aplicarea diferitelor modalități de imagistică, inclusiv microscopia cu contrast de fază, microscopia cu interferență diferențială (DIC), SEM sau microscopia confocală cu imunofluorescență (Figurile 3 și 4). În ceea ce privește transparența optică a filmelor PDMS și poliester, atât platformele gut-on-a-chip, cât și cele hibride cu cip pot oferi imagini in situ în timp real, fără a fi nevoie de secționarea sau dezasamblarea dispozitivului. Atunci când se efectuează imagistica prin imunofluorescență (Figurile 1, 3c, f și 4b, c), celulele sunt de obicei fixate cu PF/4% (fixate PF) -100 și 2% (gr/vol) ) albumină serică bovină (BSA), în ordine. În funcție de tipul de celulă, pot fi utilizați diferiți fixativi, permeabilizatori și agenți de blocare. Anticorpii primari care vizează markerii de celule sau regiune dependenți de descendență sunt utilizați pentru a evidenția celulele imobilizate in situ pe cip, urmate de anticorpi secundari, care țintă fie nucleul țintă, fie nucleul midi-6′, 6′, 6′ -fenilen) indol, DAPI) sau F-actină (de exemplu, faloidină marcată fluorescent). Imagistica live pe bază de fluorescență poate fi, de asemenea, efectuată in situ pentru a detecta producția de mucus (Fig.1, „Diferențierea celulelor” și „Fiziologia intestinului”), colonizarea aleatorie a celulelor microbiene (Fig. 1, „Co-cultură gazdă-microb”), recrutarea celulelor imune (Fig. 1, „Modelarea bolii”) sau contururile morfologiei epiteliale 3D (Fig. 3c, suprafața intestinului se modifică de la cip, suprafață și suprafață). stratul inferior de microcanal, așa cum este descris în ref. După cum se arată în Fig. 2, morfologia epitelială 3D, precum și microvilozitățile de pe marginea periei apicale pot fi vizualizate prin SEM (Fig. 3b). Expresia markerilor de diferențiere poate fi evaluată prin efectuarea de PCR5 cantitativă sau secvențierea ARN unicelular. învestite prin tripsinizare și apoi utilizate pentru analize moleculare sau genetice.
a, Flux de lucru pentru inducerea morfogenezei intestinale într-un cip hibrid. Caco-2 și organoizi intestinali sunt utilizați în acest protocol pentru a demonstra morfogeneza 3D într-o platformă de cip hibrid. Celulele epiteliale disociate au fost însămânțate în inserții Transwell pregătite (pregătirea TW; vezi figura de mai jos). Odată ce celulele au fost însămânțate (însămânțate) și toate au fost atașate la membrană poliesterică în condiții de membrană transstatică. Cultură W). După 7 zile, un singur insert Transwell care conține un monostrat 2D de celule epiteliale a fost integrat într-un cip hibrid pentru a introduce un flux bazolateral (Flow, BL), care a condus în cele din urmă la generarea unui strat epitelial 3D (morfogeneză). .Schemele din straturile superioare ilustrează configurația experimentală pentru fiecare pas.b, Cipurile hibride (schema din stânga) pot duce la morfogeneza 3D a celulelor epiteliale organoide cu vederi microscopice confocale de sus în jos luate în diferite poziții Z (sus, mijloc și inferioară);vezi schema din dreapta și liniile punctate corespunzătoare).au prezentat caracteristici morfologice evidente. F-actină (cian), nucleu (gri).c, Micrografii confocale cu fluorescență (vedere unghiulară 3D) ale celulelor epiteliale derivate din organoide cultivate în Transwell static (TW; încadrat în caseta punctată albă) versus cip hibrid (cea mai mare fotografie completă) comparând 2D cu perechea de morfologie verticală, respectiv 3D în pereche încrucișată. colțul din dreapta sus; „XZ”) arată și caracteristici 2D și 3D.Bară de scară, 100 µm.c Retipărit cu permisiunea de la referință.4.Elsevier.
Controalele pot fi pregătite prin cultivarea acelorași celule (Caco-2 sau celule epiteliale organoide intestinale) în monostraturi bidimensionale în condiții de cultură statică convențională. În special, epuizarea nutrienților poate rezulta din cauza capacității de volum limitate a microcanalelor (adică ~4 µL în canalul superior pe designul original al cipului intestinal).
Procesul de litografie moale ar trebui efectuat într-o cameră curată. Pentru fiecare strat de pe cip (straturi superioare și inferioare și membrane) și cipuri hibride, au fost utilizate și fabricate diferite fotomăști pe plăci de siliciu separate, deoarece înălțimile microcanalelor au fost diferite. Înălțimile țintă ale microcanalelor superioare și inferioare ale intestinului de pe cip sunt 500 µm și, respectiv, înălțimea canalului hibrid este de 500 µm, respectiv cipul hibrid. µm.
Puneți o napolitană de siliciu de 3 inci într-un vas cu acetonă. Învârtiți ușor placa timp de 30 de secunde, apoi uscați napolitana la aer. Transferați napolitana pe o placă cu IPA, apoi rotește placa timp de 30 de secunde pentru a curăța.
O soluție de piranha (amestec de peroxid de hidrogen și acid sulfuric concentrat, 1:3 (vol/vol)) poate fi utilizată opțional pentru a maximiza îndepărtarea reziduurilor organice de pe suprafața plachetei de siliciu.
Soluția Piranha este extrem de corozivă și generează căldură. Sunt necesare măsuri de siguranță suplimentare. Pentru eliminarea deșeurilor, lăsați soluția să se răcească și transferați într-un recipient curat și uscat pentru deșeuri. Folosiți recipiente secundare și etichetați corespunzător recipientele pentru deșeuri. Vă rugăm să urmați instrucțiunile de siguranță ale unității pentru proceduri mai detaliate.
Deshidratați napolitanele punându-le pe o placă fierbinte la 200 °C timp de 10 minute. După deshidratare, napolitana a fost agitată de cinci ori în aer pentru a se răci.
Se toarnă ~10 g de fotorezist SU-8 2100 în centrul plăcii de siliciu curățate. Utilizați pensete pentru a întinde uniform fotorezistul pe placă. Ocazional, plasați napolitana pe o placă fierbinte la 65°C pentru a face fotorezistul mai puțin lipicios și mai ușor de întins. Nu așezați napolitana direct pe placa fierbinte.
SU-8 a fost distribuit uniform pe plachetă prin rularea stratului de centrifugare. Programați o rotație de intrare a SU-8 timp de 5–10 s pentru a se propaga la 500 rpm la o accelerație de 100 rpm/s. Setați spin principal pentru un model de grosime de 200 µm la 1.500 rpm (sau atingeți o înălțime de µm 500 rpm) intestinul pe cip; vezi „Pașii critici” de mai jos) stabilit la o accelerație de 300 rpm/s 30 de secunde la 1.200 rpm.
Viteza de centrifugare principală poate fi ajustată în funcție de grosimea țintă a modelului SU-8 de pe placa de siliciu.
Pentru a fabrica modele SU-8 cu o înălțime de 500 µm pentru stratul superior al intestinului de pe cip, pașii de acoperire prin rotație și coacere moale a acestei casete (pașii 7 și 8) au fost repeți secvențial (vezi pasul 9) pentru a produce două straturi de 250 µm. .
Coaceți moale napolitanele acoperite cu SU-8, plasând cu grijă napolitanele pe o plită fierbinte la 65 ° C timp de 5 minute, apoi comutați setarea la 95 ° C și incubați încă 40 de minute.
Pentru a obține o înălțime de 500 μm a modelului SU-8 în microcanalul superior, repetați pașii 7 și 8 pentru a genera două straturi SU-8 groase de 250 μm.
Folosind UV Mask Aligner, efectuați un test al lămpii conform instrucțiunilor producătorului pentru a calcula timpul de expunere al plachetei. (timpul de expunere, ms) = (doza de expunere, mJ/cm2)/(puterea lămpii, mW/cm2).
După ce ați determinat timpul de expunere, așezați fotomasca pe suportul de mască al alinierii măștii UV și așezați fotomasca pe waferul acoperit cu SU-8.
Așezați suprafața imprimată a măștii foto direct pe partea acoperită cu SU-8 a plachetei de siliciu pentru a minimiza dispersia UV.
Expuneți napolitana acoperită cu SU-8 și fotomasca vertical la 260 mJ/cm2 de lumină UV pentru timpul de expunere predeterminat (vezi pasul 10 din această casetă).
După expunerea la UV, plachetele de siliciu acoperite cu SU-8 au fost coapte la 65 ° C timp de 5 minute și 95 ° C timp de 15 minute pe fiecare placă fierbinte pentru a fabrica modele cu o înălțime de 200 μm. Extindeți timpul de post-cocere la 95 ° C până la 30 min pentru a fabrica modele cu o înălțime de 500 µm.
Dezvoltatorul este turnat într-un vas de sticlă, iar placa coaptă este plasată în vas.
Clătiți matrița dezvoltată cu ~ 10 ml de revelator proaspăt, urmată de IPA prin pulverizarea soluției folosind o pipetă.
Puneți napolitana într-un dispozitiv de curățare cu plasmă și expuneți-le la plasmă de oxigen (gaz atmosferic, presiune țintă 1 × 10-5 Torr, putere 125 W) timp de 1,5 min.
Plasați napolitana într-un desicator cu vid cu o lamă de sticlă în interior. Placile și lamele pot fi așezate una lângă alta. Dacă desicatorul sub vid este împărțit în mai multe straturi de o placă, plasați lamelele în camera inferioară și plachetele în camera superioară. și se aplică vid pentru silanizare.
Dezghețați un flacon de celule Caco-2 congelate într-o baie de apă la 37°C, apoi transferați celulele dezghețate într-un balon T75 care conține 15 ml de mediu Caco-2 preîncălzit la 37°C.
Pentru a trece celulele Caco-2 la ~90% confluență, mai întâi se încălzește mediu Caco-2, PBS și 0,25% tripsină/1 mM EDTA într-o baie de apă la 37°C.
Aspirați mediul prin aspirație cu vid. Spălați celulele de două ori cu 5 ml de PBS cald prin repetarea aspirației cu vid și adăugarea de PBS proaspăt.