Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript.
Morfogeneza intestinală umană stabilește caracteristicile cript-vilus ale microarhitecturii epiteliale 3D și ale organizării spațiale. Această structură unică este necesară pentru menținerea homeostaziei intestinale prin protejarea nișei celulelor stem din cripta bazală de antigenele microbiene exogene și metaboliții acestora. În plus, vilozitățile intestinale și mucusul secretor prezintă celule epiteliale diferențiate funcțional, cu o barieră protectoare pe suprafața mucoasei intestinale. Prin urmare, recrearea structurilor epiteliale 3D este crucială pentru construirea de modele intestinale in vitro. În special, intestinul pe cip mimetic organic poate induce morfogeneza 3D spontană a epiteliului intestinal cu funcții fiziologice și biomecanică îmbunătățite. Aici, oferim un protocol reproductibil pentru a induce robust morfogeneza intestinală în intestin pe un cip microfluidic, precum și pe un cip hibrid încorporat Transwell. Descriem metode detaliate pentru fabricarea dispozitivelor, cultivarea celulelor epiteliale organoide intestinale Caco-2 sau în medii convenționale, precum și pe o platformă microfluidică, inducerea morfogenezei 3D și caracterizarea epiteliilor 3D stabilite. utilizând mai multe modalități de imagistică. Acest protocol realizează regenerarea microarhitecturii intestinale funcționale prin controlul fluxului de fluid bazolateral timp de 5 zile. Metoda noastră de morfogeneză in vitro utilizează stres de forfecare relevant din punct de vedere fiziologic și mișcare mecanică și nu necesită inginerie celulară complexă sau manipulare, ceea ce poate depăși alte tehnici existente. Ne așteptăm ca protocolul propus să aibă implicații largi pentru comunitatea de cercetare biomedicală, oferind o metodă de regenerare a straturilor epiteliale intestinale 3D in vitro pentru aplicații biomedicale, clinice și farmaceutice.
Experimentele demonstrează că celulele epiteliale intestinale Caco-2 cultivate în dispozitive microfluidice bistrat sau gut-on-a-chip1,2,3,4,5 pot suferi morfogeneză 3D spontană in vitro fără o înțelegere clară a mecanismului care stă la baza lor. În studiul nostru recent, am constatat că îndepărtarea antagoniștilor morfogeni secretați bazolateral din dispozitivele de cultură este necesară și suficientă pentru a induce morfogeneza epitelială 3D in vitro, lucru demonstrat de Caco-2 și organoizi intestinali derivați de la pacient. Celulele epiteliale au fost validate. În acest studiu, ne-am concentrat în mod specific pe producția celulară și distribuția concentrației unui antagonist Wnt puternic, Dickkopf-1 (DKK-1), în dispozitive gut-on-a-chip și dispozitive microfluidice modificate care conțin inserții Transwell, denumite „cip hibrid”. Demonstrăm că adăugarea de antagoniști Wnt exogeni (cum ar fi DKK-1, represorul Wnt 1, proteina secretată frizzled-related 1 sau Soggy-1) la intestinul on-chip inhibă morfogeneza sau perturbă stratul epitelial 3D prestructurat, sugerând că stresul antagonist în timpul culturii este responsabil pentru morfogeneza intestinală in vitro. Prin urmare, o abordare practică pentru a obține o morfogeneză robustă la interfața epitelială este de a elimina sau menține minimal nivelurile de antagoniști Wnt în compartimentul bazolateral prin spălare activă (de exemplu, în platforme gut-on-a-chip sau hybrid-on-a-chip) sau difuzie. Medii bazolaterale (de exemplu, din inserții Transwell în rezervoare bazolaterale mari în godeuri).
În acest protocol, oferim o metodă detaliată pentru fabricarea de microdispozitive gut-on-a-chip și cipuri hibride Transwell-inserabile (etapele 1-5) pentru cultivarea celulelor epiteliale intestinale pe membrane poroase pe bază de polidimetilsiloxan (PDMS) (etapele 6A, 7A, 8, 9) sau membrane de poliester cu inserții Transwell (etapele 6B, 7B, 8, 9) și morfogeneza 3D indusă in vitro (etapa 10). De asemenea, am identificat caracteristici celulare și moleculare care indică histogeneza specifică țesutului și diferențierea celulară dependentă de linie celulară prin aplicarea mai multor modalități de imagistică (etapele 11-24). Inducem morfogeneza folosind celule epiteliale intestinale umane, cum ar fi Caco-2 sau organoide intestinale, în două formate de cultură, cu detalii tehnice, inclusiv modificarea suprafeței membranelor poroase, crearea de monostraturi 2D și biochimica intestinală și reproducerea micromediului biomecanic in vitro. Pentru a induce morfogeneza 3D din monostraturi epiteliale 2D, am îndepărtat antagoniștii morfogeni din ambele culturi. se formează prin curgerea mediului în compartimentul bazolateral al culturii. În cele din urmă, oferim o reprezentare a utilității unui strat epitelial 3D regenerabil care poate fi utilizat pentru a modela creșterea epitelială dependentă de morfogen, co-culturile longitudinale gazdă-microbiom, infecția cu agenți patogeni, leziunile inflamatorii, disfuncția barierei epiteliale și terapiile bazate pe probiotice. Exemplu de influențe.
Protocolul nostru poate fi util unei game largi de oameni de știință în cercetarea fundamentală (de exemplu, biologia mucoasei intestinale, biologia celulelor stem și biologia dezvoltării) și aplicată (de exemplu, testarea preclinică a medicamentelor, modelarea bolilor, ingineria tisulară și gastroenterologie), cu impact larg. Datorită reproductibilității și robusteții protocolului nostru de a induce morfogeneza 3D a epiteliului intestinal in vitro, preconizăm că strategia noastră tehnică poate fi diseminată către publicul care studiază dinamica semnalizării celulare în timpul dezvoltării, regenerării sau homeostaziei intestinale. În plus, protocolul nostru este util pentru investigarea infecțiilor sub diverși agenți infecțioși, cum ar fi Norovirusul 8, Coronavirusul sindromului respirator acut sever 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 sau Vibrio cholerae. Publicul țintă al patologiei și patogenezei bolilor este, de asemenea, util. Utilizarea unui sistem de microfiziologie intestinală pe cip poate permite co-cultura longitudinală 10 și evaluarea ulterioară a apărării gazdei, a răspunsurilor imune și a reparării leziunilor legate de agenții patogeni în tractul gastrointestinal (GI) 11. Alte tulburări GI asociate cu sindromul intestinului permeabil, boala celiacă, boala Crohn, colita ulcerativă, pouchita sau sindromul intestinului iritabil pot fi simulate atunci când straturile epiteliale intestinale 3D sunt preparate folosind straturile epiteliale intestinale 3D ale pacientului, aceste boli includ atrofia viloasă, scurtarea criptelor, leziunile mucoasei sau afectarea barierei epiteliale. Biopsie sau organoide intestinale derivate din celule stem 12,13. Pentru a modela mai bine complexitatea mai mare a mediului bolii, cititorii pot lua în considerare adăugarea de tipuri de celule relevante pentru boală, cum ar fi celulele mononucleare din sângele periferic al pacientului (PBMC), la modelele care conțin microarhitecturi 3D viloase-cripte intestinale. celule imune specifice țesuturilor, 5.
Întrucât microstructura epitelială 3D poate fi fixată și vizualizată fără procesul de secționare, cei care lucrează la transcriptomică spațială și imagistică de înaltă rezoluție sau super-rezoluție ar putea fi interesați de cartografierea dinamicii spatiotemporale a genelor și proteinelor pe nișe epiteliale. Interesați de tehnologie. Răspuns la stimuli microbieni sau imuni. În plus, interacțiunea longitudinală gazdă-microbiom 10, 14 care coordonează homeostazia intestinală poate fi stabilită în stratul mucosal intestinal 3D prin co-cultivarea diferitelor specii microbiene, comunități microbiene sau microbiotă fecală, în special în intestinul pe cip. în platformă. Această abordare este deosebit de atractivă pentru publicul care studiază imunologia mucoaselor, gastroenterologia, microbiomul uman, culturomica și microbiologia clinică și care doresc să cultive microbiota intestinală necultivată anterior în laborator. Dacă protocolul nostru de morfogeneză in vitro poate fi adaptat la formate de cultură scalabile, cum ar fi inserții multi-godeuri în plăci cu 24, 96 sau 384 de godeuri care reaprovizionează continuu compartimentele bazolaterale, protocolul poate fi, de asemenea, diseminat către cei care dezvoltă platforme farmaceutice, biomedicale sau de screening sau validare de mare randament pentru industria alimentară. Ca dovadă de principiu, am demonstrat recent fezabilitatea unui sistem multiplex de morfogeneză de mare randament scalabil la un format de placă cu 24 de godeuri. În plus, au fost comercializate mai multe produse organ-on-a-chip16,17,18. Prin urmare, validarea metodei noastre de morfogeneză in vitro poate fi accelerată și potențial adoptată de multe laboratoare de cercetare, industrie sau agenții guvernamentale și de reglementare pentru a înțelege reprogramarea celulară a morfogenezei intestinale in vitro la nivel transcriptomic pentru a testa medicamente sau Bioterapii Absorbția și transportul candidaților la medicamente au fost evaluate utilizând surogate intestinale 3D sau modele organ-on-a-chip personalizate sau comerciale pentru a evalua reproductibilitatea procesului de morfogeneză intestinală.
Un număr limitat de modele experimentale relevante pentru om au fost utilizate pentru a studia morfogeneza epitelială intestinală, în principal din cauza lipsei unor protocoale implementabile pentru a induce morfogeneza 3D in vitro. De fapt, o mare parte din cunoștințele actuale despre morfogeneza intestinală se bazează pe studii pe animale (de exemplu, pește zebră20, șoareci21 sau pui22). Cu toate acestea, acestea necesită multă muncă și costuri, pot fi discutabile din punct de vedere etic și, cel mai important, nu determină cu precizie procesele de dezvoltare umană. Aceste modele sunt, de asemenea, foarte limitate în capacitatea lor de a fi testate într-o manieră scalabilă în mai multe direcții. Prin urmare, protocolul nostru pentru regenerarea structurilor tisulare 3D in vitro depășește modelele animale in vivo, precum și alte modele tradiționale statice de cultură celulară 2D. Așa cum s-a descris anterior, utilizarea structurilor epiteliale 3D ne-a permis să examinăm localizarea spațială a celulelor diferențiate în axa cript-vilus ca răspuns la diverși stimuli mucoși sau imuni. Straturile epiteliale 3D pot oferi un spațiu pentru a studia modul în care celulele microbiene concurează pentru a forma nișe spațiale și evoluția ecologică ca răspuns la factorii gazdă (de exemplu, straturile de mucus interne versus externe, secreția). de IgA și peptide antimicrobiene). În plus, morfologia epitelială 3D ne poate permite să înțelegem modul în care microbiota intestinală își structurează comunitățile și produce sinergic metaboliți microbieni (de exemplu, acizi grași cu lanț scurt) care modelează organizarea celulară și nișele celulelor stem din criptele bazale. Aceste caracteristici pot fi demonstrate doar atunci când straturile epiteliale 3D sunt stabilite in vitro.
Pe lângă metoda noastră de creare a structurilor epiteliale intestinale 3D, există mai multe metode in vitro. Cultura organoidă intestinală este o tehnică de inginerie tisulară de ultimă generație, bazată pe cultivarea celulelor stem intestinale în condiții morfogene specifice23,24,25. Cu toate acestea, utilizarea modelelor organoide 3D pentru analiza transportului sau co-culturi gazdă-microbiom este adesea dificilă, deoarece lumenul intestinal este închis în interiorul organoidului și, prin urmare, introducerea componentelor luminale, cum ar fi celulele microbiene sau antigenele exogene, este limitată. Accesul la lumenul organoid poate fi îmbunătățit folosind un microinjector,26,27, dar această metodă este invazivă și necesită multă muncă și necesită cunoștințe specializate pentru a fi efectuată. În plus, culturile tradiționale de organoide menținute în schele de hidrogel în condiții statice nu reflectă cu exactitate biomecanica activă in vivo.
Alte abordări utilizate de mai multe grupuri de cercetare utilizează schele de hidrogel 3D prestructurate pentru a imita structura epitelială intestinală prin cultivarea celulelor intestinale umane izolate pe suprafața gelului. Fabricați schele de hidrogel folosind matrițe imprimate 3D, micro-frezate sau fabricate litografic. Această metodă arată aranjamentul auto-organizat al celulelor epiteliale izolate in vitro cu gradienți morfogenici relevanți fiziologic, stabilind o structură epitelială cu raport de aspect ridicat și o interdiafonie stroma-epiteliu prin includerea celulelor stromale în schelă. Cu toate acestea, natura schelelor prestructurate poate împiedica afișarea procesului morfogenetic spontan în sine. Aceste modele nu oferă, de asemenea, flux luminal sau interstițial dinamic, lipsindu-le tensiunea de forfecare a fluidului de care celulele intestinale au nevoie pentru a suferi morfogeneză și a dobândi funcția fiziologică. Un alt studiu recent a folosit schele de hidrogel într-o platformă microfluidică și a modelat structuri epiteliale intestinale folosind tehnici de gravare cu laser. Organoizii intestinali de șoarece urmează modele gravate pentru a forma structuri tubulare intestinale, iar fluxul de fluid intraluminal poate fi recapitulat folosind un modul microfluidic. Cu toate acestea, acest model nici... nu prezintă procese morfogenetice spontane și nici nu include mișcări mecanobiologice intestinale. Tehnicile de imprimare 3D din același grup au reușit să creeze tuburi intestinale miniaturale cu procese morfogenetice spontane. În ciuda fabricării complexe a diferitelor segmente intestinale în interiorul tubului, acestui model îi lipsește și fluxul de fluid luminal și deformarea mecanică. În plus, operabilitatea modelului poate fi limitată, mai ales după finalizarea procesului de bioprintare, perturbând condițiile experimentale sau interacțiunile celulă-celulă. În schimb, protocolul nostru propus oferă morfogeneză intestinală spontană, stres de forfecare relevant din punct de vedere fiziologic, biomecanică care imită motilitatea intestinală, accesibilitate la compartimente apicale și bazolaterale independente și recrearea micromediilor biologice complexe de modularitate. Prin urmare, protocolul nostru de morfogeneză 3D in vitro poate oferi o abordare complementară pentru a depăși provocările metodelor existente.
Protocolul nostru este concentrat în întregime pe morfogeneza epitelială 3D, cu doar celule epiteliale în cultură și fără alte tipuri de celule înconjurătoare, cum ar fi celulele mezenchimale, celulele endoteliale și celulele imune. Așa cum s-a descris anterior, nucleul protocolului nostru este inducerea morfogenezei epiteliale prin eliminarea inhibitorilor morfogeni secretați pe partea bazolaterală a mediului introdus. Deși modularitatea robustă a metodelor noastre gut-on-a-chip și hybrid-on-a-chip ne permite să recreăm stratul epitelial 3D ondulat, complexități biologice suplimentare, cum ar fi interacțiunile epitelio-mezenchimale33,34, depunerea matricei extracelulare (MEC)35 și, în modelul nostru, caracteristicile cript-vilus care transmit nișe de celule stem în criptele bazale, rămân de luat în considerare în continuare. Celulele stromale (de exemplu, fibroblastele) din mezenchim joacă un rol cheie în producerea de proteine ​​ECM și în reglarea morfogenezei intestinale in vivo35,37,38. Adăugarea de celule mezenchimale la modelul nostru a îmbunătățit procesul morfogenetic. și eficiența atașării celulare. Stratul endotelial (adică capilarele sau limfaticele) joacă un rol important în reglarea transportului molecular39 și a recrutării celulelor imune40 în micromediul intestinal. În plus, componentele vascularizației care pot fi conectate între modelele de țesuturi sunt o condiție prealabilă atunci când modelele de țesuturi sunt concepute pentru a demonstra interacțiuni multi-organ. Prin urmare, celulele endoteliale pot fi incluse pentru a modela caracteristici fiziologice mai precise cu rezoluție la nivel de organ. Celulele imune derivate de la pacient sunt, de asemenea, esențiale pentru afișarea răspunsurilor imune înnăscute, prezentarea antigenului, diafonia imună adaptivă înnăscută și imunitatea specifică țesutului în contextul mimării bolilor intestinale.
Utilizarea cipurilor hibride este mai simplă decât cea a metodei „gut-on-a-chip”, deoarece configurarea dispozitivului este mai simplă, iar utilizarea inserțiilor Transwell permite o cultură scalabilă a epiteliului intestinal. Cu toate acestea, inserțiile Transwell disponibile comercial cu membrane de poliester nu sunt elastice și nu pot simula mișcări de tip peristaltic. În plus, compartimentul apical al inserției Transwell plasate în cipul hibrid a rămas staționar, fără tensiune de forfecare pe partea apicală. În mod evident, proprietățile statice din compartimentul apical permit rareori co-cultura bacteriană pe termen lung în cipuri hibride. Deși putem induce robust morfogeneza 3D în inserțiile Transwell atunci când utilizăm cipuri hibride, lipsa biomecanicii relevante din punct de vedere fiziologic și a fluxului de fluid apical poate limita fezabilitatea platformelor de cipuri hibride pentru aplicații potențiale.
Reconstrucțiile la scară completă ale axei cripto-vilus uman în culturile intestin-pe-cip și hibrid-pe-cip nu au fost complet stabilite. Deoarece morfogeneza începe dintr-un monostrat epitelial, microarhitecturile 3D nu oferă neapărat similaritate morfologică cu criptele in vivo. Deși am caracterizat populația de celule proliferante în apropierea domeniului bazal al criptelor în epiteliul 3D microinginerizat, regiunile criptelor și viloase nu au fost clar delimitate. Deși canalele superioare mai înalte de pe cip duc la o creștere a înălțimii epiteliului microinginerizat, înălțimea maximă este încă limitată la ~300-400 µm. Adâncimea reală a criptelor intestinale umane în intestinul subțire și gros este de ~135 µm și respectiv ~400 µm, iar înălțimea vilozităților intestinale subțiri este de ~600 µm41.
Din punct de vedere al imagisticii, imagistica in situ de super-rezoluție a microarhitecturilor 3D poate fi limitată la intestinul de pe un cip, deoarece distanța de lucru necesară de la lentila obiectiv la stratul epitelial este de ordinul câtorva milimetri. Pentru a depăși această problemă, poate fi necesar un obiectiv la distanță. În plus, realizarea de secțiuni subțiri pentru pregătirea specimenelor de imagistică este dificilă din cauza elasticității ridicate a PDMS. În plus, deoarece microfabricarea strat cu strat a intestinului pe un cip implică o aderență permanentă între fiecare strat, este extrem de dificil să se deschidă sau să se îndepărteze stratul superior pentru a examina structura de suprafață a stratului epitelial. De exemplu, prin utilizarea unui microscop electronic cu scanare (SEM).
Hidrofobicitatea PDMS a fost un factor limitativ în studiile bazate pe microfluidice care tratează molecule mici hidrofobe, deoarece PDMS poate adsorbi nespecific astfel de molecule hidrofobe. Alternative la PDMS pot fi luate în considerare cu alte materiale polimerice. Alternativ, modificarea suprafeței PDMS (de exemplu, acoperirea cu materiale lipofile 42 sau poli(etilen glicol) 43) poate fi luată în considerare pentru a minimiza adsorbția moleculelor hidrofobe.
În cele din urmă, metoda noastră nu a fost bine caracterizată în ceea ce privește furnizarea unei platforme experimentale ușor de utilizat pentru screening cu randament ridicat sau de tip „universal”. Protocolul actual necesită o pompă de seringă per microdispozitiv, ceea ce ocupă spațiu într-un incubator cu CO2 și previne experimentele la scară largă. Această limitare poate fi îmbunătățită semnificativ prin scalabilitatea formatelor de cultură inovatoare (de exemplu, inserții poroase cu 24 de godeuri, 96 de godeuri sau 384 de godeuri care permit reaprovizionarea și îndepărtarea continuă a mediilor bazolaterale).
Pentru a induce morfogeneza 3D a epiteliului intestinal uman in vitro, am utilizat un dispozitiv intestinal cu cip microfluidic care conține două microcanale paralele și o membrană poroasă elastică între ele pentru a crea o interfață lumen-capilară. De asemenea, demonstrăm utilizarea unui dispozitiv microfluidic cu un singur canal (un cip hibrid) care asigură flux bazolateral continuu sub straturile epiteliale polarizate crescute pe inserții Transwell. În ambele platforme, morfogeneza diferitelor celule epiteliale intestinale umane poate fi demonstrată prin aplicarea manipulării direcționale a fluxului pentru a elimina antagoniștii morfogenului din compartimentul bazolateral. Întreaga procedură experimentală (Figura 1) constă din cinci părți: (i) microfabricarea cipului intestinal sau a cipului hibrid inserabil Transwell (etapele 1-5; Caseta 1), (ii) prepararea celulelor epiteliale intestinale (celule Caco-2) sau a organoizilor intestinali umani; casetele 2-5), (iii) cultura celulelor epiteliale intestinale pe cipuri intestinale sau cipuri hibride (etapele 6-9), (iv) inducerea morfogenezei 3D in vitro (etapa 10) și (v)) pentru a caracteriza microstructura epitelială 3D (etapele 11-24). În cele din urmă, a fost conceput un grup de control adecvat (discutat mai departe) pentru a valida eficacitatea morfogenezei in vitro prin compararea morfogenezei epiteliale cu controalele spațiale, temporale, condiționate sau procedurale.
Am utilizat două platforme de cultură diferite: gut-on-a-chip cu canale drepte sau canale convolute neliniare sau cipuri hibride care conțin inserții Transwell (TW) într-un dispozitiv microfluidic, fabricate așa cum este descris în Caseta 1, iar etapele 1-5. „Fabricarea dispozitivului” prezintă principalele etape în realizarea unui singur cip sau a unui cip hibrid. „Cultura celulelor epiteliale intestinale umane” explică sursa celulară (Caco-2 sau organoide intestinale umane) și procedura de cultură utilizată în acest protocol. „Morfogeneza in vitro” prezintă etapele generale în care celulele epiteliale derivate din Caco-2 sau organoide sunt cultivate pe un cip intestinal sau pe inserții Transwell ale unui cip hibrid, urmată de inducerea morfogenezei 3D și formarea unei structuri epiteliale caracterizate. Numărul etapei programului sau numărul casetei este afișat sub fiecare săgeată. Aplicația oferă exemple despre cum pot fi utilizate straturile epiteliale intestinale stabilite, de exemplu, în caracterizarea diferențierii celulare, studii de fiziologie intestinală, stabilirea ecosistemelor gazdă-microbiom și modelarea bolilor. Imagini cu imunofluorescență în „Cell „Diferențiere” care prezintă nuclei, F-actină și MUC2 exprimate în stratul epitelial 3D Caco-2 generat pe cipul intestinal. Semnalarea MUC2 este prezentă în celulele caliciforme și mucusul secretat de suprafețele mucoase. Imaginile fluorescente din Fiziologia Intestinului prezintă mucus produs prin colorarea pentru acid sialic și reziduuri de N-acetilglucozamină folosind aglutinină fluorescentă din germeni de grâu. Cele două imagini suprapuse din „Co-culturi gazdă-microb” prezintă co-culturi reprezentative gazdă-microbiom în intestin pe un cip. Panoul din stânga prezintă co-cultura E. coli care exprimă proteina fluorescentă verde (GFP) cu celule epiteliale 3D Caco-2 microinginerizate. Panoul din dreapta prezintă localizarea GFP E. coli co-cultivată cu celule epiteliale 3D Caco-2, urmată de colorarea prin imunofluorescență cu F-actină (roșu) și nuclei (albastru). Modelarea bolilor ilustrează intestinul sănătos versus intestinul permeabil în cipuri de inflamație intestinală sub provocare fiziologică cu antigene bacteriene (de exemplu, lipopolisaharide, LPS) și celule imune (de exemplu, PBMC; verde). Celulele Caco-2 au fost cultivate pentru a stabili un strat epitelial 3D. Bara de scală, 50 µm. Imagini din rândul de jos: „Diferențierea celulelor” adaptată cu permisiunea din referință. 2. Oxford University Press; Reprodus cu permisiunea din Ref. 5. NAS; „Co-cultura gazdă-microb” adaptată cu permisiunea din ref. 3. NAS; „Modelare a bolilor” adaptată cu permisiunea din referință. 5. NAS.
Atât cipurile gut-on-chip, cât și cele hibride au fost fabricate folosind replici PDMS care au fost demulate din matrițe de siliciu prin litografie moale1,44 și modelate cu SU-8. Designul microcanalelor din fiecare cip este determinat luând în considerare hidrodinamica, cum ar fi tensiunea de forfecare și presiunea hidrodinamică1,4,12. Designul original gut-on-a-chip (Date extinse Fig. 1a), care consta din două microcanale paralele drepte juxtapuse, a evoluat într-un gut-on-a-chip complex (Date extinse Fig. 1b) care include o pereche de microcanale curbate pentru a induce un timp de rezidență al fluidului crescut, modele de flux neliniare și deformare multiaxială a celulelor cultivate (Fig. 2a-f)12. Atunci când este necesară recrearea unei biomecanici intestinale mai complexe, se pot alege gut-on-a-chip-uri complexe. Am demonstrat că Gut-Chip-ul complicat induce, de asemenea, puternic morfogeneza 3D într-un interval de timp similar, cu un grad similar de creștere epitelială în comparație cu originalul. Gut-Chip, indiferent de tipul de celulă cultivată. Prin urmare, pentru a induce morfogeneza 3D, modelele liniare și complexe ale intestinului pe cip sunt interschimbabile. Replicile PDMS întărite pe matrițe de siliciu cu modele SU-8 au prezentat caracteristici negative după demulare (Fig. 2a). Pentru a fabrica intestinul pe un cip, stratul superior de PDMS preparat a fost lipit secvențial de o peliculă poroasă de PDMS și apoi aliniat cu stratul inferior de PDMS prin lipire ireversibilă folosind un aparat de tratare corona (Fig. 2b-f). Pentru a fabrica cipuri hibride, replicile PDMS întărite au fost lipite pe lame de sticlă pentru a crea dispozitive microfluidice cu un singur canal care puteau găzdui inserții Transwell (Fig. 2h și Date extinse Fig. 2). Procesul de lipire se realizează prin tratarea suprafețelor replicii PDMS și sticlei cu plasmă de oxigen sau tratament corona. După sterilizarea dispozitivului microfabricat atașat la tubul de silicon, configurația dispozitivului era gata pentru a efectua morfogeneza 3D a epiteliului intestinal (Figura 2g).
a, Ilustrație schematică a preparării pieselor de PDMS din matrițe de siliciu cu model SU-8. Soluția de PDMS nepolimerizată a fost turnată într-o matriță de siliciu (stânga), polimerizată la 60 °C (mijloc) și demulată (dreapta). PDMS demulat a fost tăiat în bucăți și curățat pentru utilizare ulterioară. b, Fotografie a matriței de siliciu utilizată pentru prepararea stratului superior de PDMS. c, Fotografie a matriței de siliciu utilizată pentru fabricarea membranei poroase de PDMS. d, O serie de fotografii ale componentelor PDMS superioare și inferioare și ale dispozitivului intestinal on-chip asamblat. e, Schemă a alinierii componentelor PDMS superioare, membranei și inferioare. Fiecare strat este legat ireversibil prin tratament cu plasmă sau corona. f, Schemă a dispozitivului gut-on-a-chip fabricat cu microcanale convolute suprapuse și camere de vid. g, Configurarea gut-on-a-chip pentru cultura celulară microfluidică. Intestinul pe cip fabricat, asamblat cu un tub de silicon și o seringă, a fost plasat pe o lamelă. Dispozitivul cu cip a fost plasat pe capacul unei plăci Petri de 150 mm pentru procesare. Liantul este utilizat pentru a închide tubul de silicon. h, Instantanee vizuale ale fabricării cipurilor hibride și morfogenezei 3D folosind cipuri hibride. Inserțiile Transwell preparate independent pentru cultivarea monostraturilor 2D de celule epiteliale intestinale au fost inserate în cipul hibrid pentru a induce morfogeneza intestinală 3D. Mediul este perfuzat prin microcanale sub stratul celular stabilit pe insertul Transwell. Bara de scală, 1 cm. h Retipărit cu permisiunea referinței. 4. Elsevier.
În acest protocol, linia celulară Caco-2 și organoizii intestinali au fost utilizați ca surse epiteliale (Fig. 3a). Ambele tipuri de celule au fost cultivate independent (Caseta 2 și Caseta 5) și utilizate pentru însămânțarea microcanalelor acoperite cu ECM ale intestinului on-chip sau inserțiilor Transwell. Când celulele sunt confluente (acoperire >95% în flacoane), celulele Caco-2 cultivate în mod obișnuit (între pasajele 10 și 50) în flacoane T sunt recoltate pentru a prepara suspensii celulare disociate prin fluid de tripsinizare (caseta 2). Organoizii intestinali umani din biopsii intestinale sau rezecții chirurgicale au fost cultivați în cupole Matrigel în plăci cu 24 de godeuri pentru a susține micromediul structural. Mediul care conține morfogeni esențiali (cum ar fi Wnt, R-spondin și Noggin) și factori de creștere preparați așa cum este descris în Caseta 3 a fost suplimentat o dată la două zile până când organoizii au crescut la aproximativ 500 µm în diametru. Organoizii complet crescuți sunt recoltați și disociați în celule individuale pentru însămânțare pe... Inserții intestinale sau Transwell pe un cip (Caseta 5). După cum am raportat anterior, acestea pot fi diferențiate în funcție de tipul bolii12,13 (de exemplu, colită ulcerativă, boala Crohn, cancer colorectal sau donator normal), locul leziunii (de exemplu, leziune versus zonă nelezionată) și localizarea gastrointestinală în tract (de exemplu, duoden, jejun, ileon, cecum, colon sau rect). În Caseta 5 oferim un protocol optimizat pentru cultivarea organoizilor colonici (coloizilor) care necesită de obicei concentrații mai mari de morfogeni decât organoizii intestinali subțiri.
a, Flux de lucru pentru inducerea morfogenezei intestinale în cipul intestinal. Epiteliul intestinal uman Caco-2 și organoidele intestinale sunt utilizate în acest protocol pentru a demonstra morfogeneza 3D. Celulele epiteliale izolate au fost însămânțate în dispozitivul gut-on-a-chip preparat (prepararea cipului). Odată ce celulele sunt însămânțate și atașate la membrana poroasă PDMS în ziua 0 (D0), fluxul apical (AP) este inițiat și menținut pentru primele 2 zile (flux, AP, D0-D2). Fluxul bazolateral (BL) este, de asemenea, inițiat împreună cu mișcări ciclice de întindere (întindere, flux, AP și BL) atunci când se formează un monostrat 2D complet. Morfogeneza 3D intestinală a avut loc spontan după 5 zile de cultură microfluidică (morfogeneză, D5). Imaginile cu contrast de fază arată o morfologie reprezentativă a celulelor Caco-2 la fiecare etapă experimentală sau punct de timp (grafic cu bare, 100 µm). Patru diagrame schematice care ilustrează cascadele corespunzătoare ale morfogenezei intestinale (dreapta sus). Săgețile punctate În schemă, se reprezintă direcția curgerii fluidului. b, Imagine SEM care prezintă topologia suprafeței epiteliului 3D Caco-2 stabilit (stânga). Inserția care evidențiază zona mărită (caseta albă punctată) arată microvilii regenerați pe stratul 3D Caco-2 (dreapta). c, Vedere frontală orizontală a membranei Caco-2 3D stabilite, claudină (ZO-1, roșu) și membranelor continue cu margine în perie marcate cu F-actină (verde) și nuclei (albastru). Vizualizare confocală cu imunofluorescență a celulelor epiteliale pe cipuri intestinale. Săgețile care indică spre schema din mijloc indică locația planului focal pentru fiecare vedere confocală. d, Evoluția în timp a modificărilor morfologice la organoizii cultivați pe un cip obținută prin microscopie cu contrast de fază în zilele 3, 7, 9, 11 și 13. Inserția (dreapta sus) arată mărirea mare a imaginii furnizate. e, Microfotografie DIC a epiteliului 3D organoid stabilit în intestin pe o secțiune luată în ziua 7. f, Suprapus Imagini cu imunofluorescență care prezintă markeri pentru celule stem (LGR5; magenta), celule caliciforme (MUC2; verde), F-actină (gri) și nuclee (cian) cultivate pe cipuri intestinale timp de 3 zile, respectiv (stânga) și organoide de 13 zile (mijloc) pe stratul epitelial. Vezi și Figura 3 cu date extinse, care evidențiază semnalizarea LGR5 fără semnalizarea MUC2. Imagini cu fluorescență care prezintă microstructura epitelială (dreapta) a epiteliului organoid 3D stabilit în intestin pe un cip prin colorarea membranei plasmatice cu colorantul CellMask (dreapta) în ziua 13 de cultură. Bara de scală este de 50 μm, cu excepția cazului în care se specifică altfel. b Retipărit cu permisiunea de la referință. 2. Oxford University Press; c Adaptat cu permisiunea de la Reference. 2. Oxford University Press; e și f adaptate cu permisiunea de la referință. 12 Sub licență Creative Commons CC BY 4.0.
În intestinul pe cip, este necesară modificarea suprafeței hidrofobe a membranei poroase PDMS pentru o acoperire ECM reușită. În acest protocol, aplicăm două metode diferite pentru a modifica hidrofobicitatea membranelor PDMS. Pentru cultivarea celulelor Caco-2, activarea suprafeței prin tratament UV/ozon a fost suficientă pentru a reduce hidrofobicitatea suprafeței PDMS, a acoperi ECM și a atașa celulele Caco-2 la membrana PDMS. Cu toate acestea, cultura microfluidică a epiteliului organoid necesită funcționalizarea suprafeței pe bază de substanțe chimice pentru a realiza depunerea eficientă a proteinelor ECM prin aplicarea secvențială de polietilenimină (PEI) și glutaraldehidă pe microcanalele PDMS. După modificarea suprafeței, proteinele ECM au fost depuse pentru a acoperi suprafața PDMS funcționalizată și apoi introduse în epiteliul organoid izolat. După ce celulele sunt atașate, cultura celulară microfluidică începe prin perfuzarea doar a mediului în microcanalul superior până când celulele formează un monostrat complet, în timp ce microcanalul inferior menține condiții statice. Această metodă optimizată pentru activarea suprafeței și acoperirea ECM permite atașarea organoidelor. epiteliu pentru a induce morfogeneza 3D pe suprafața PDMS.
Culturile Transwell necesită, de asemenea, acoperire cu ECM înainte de însămânțarea celulelor; cu toate acestea, culturile Transwell nu necesită etape complexe de pretratare pentru a activa suprafața inserțiilor poroase. Pentru creșterea celulelor Caco-2 pe inserții Transwell, acoperirea cu ECM pe inserțiile poroase accelerează atașarea celulelor Caco-2 disociate (<1 oră) și formarea barierei de joncțiune strânsă (<1-2 zile). Pentru a cultiva organoizi pe inserții Transwell, organoizii izolați sunt însămânțați pe inserții acoperite cu ECM, atașați la suprafața membranei (<3 h) și menținuți până când organoizii formează un monostrat complet cu integritate a barierei. Culturile Transwell sunt efectuate în plăci cu 24 de godeuri fără utilizarea de cipuri hibride.
Morfogeneza 3D in vitro poate fi inițiată prin aplicarea unui flux de fluid pe aspectul bazolateral al unui strat epitelial stabilit. În intestinul pe un cip, morfogeneza epitelială a început atunci când mediul a fost perfuzat în microcanalele superioare și inferioare (Fig. 3a). Așa cum s-a descris anterior, este esențial să se introducă fluxul de fluid în compartimentul inferior (bazolateral) pentru îndepărtarea continuă a inhibitorilor morfogeni secretați direcțional. Pentru a furniza suficiente nutrienți și ser celulelor legate de membranele poroase și pentru a genera stres de forfecare luminală, aplicăm de obicei flux dublu în intestinul pe un cip. În cipurile hibride, inserțiile Transwell care conțin monostraturi epiteliale au fost introduse în cipurile hibride. Apoi, mediul a fost aplicat sub partea bazolaterală a insertului poros Transwell prin microcanal. Morfogeneza intestinală a avut loc la 3-5 zile după inițierea fluxului bazolateral în ambele platforme de cultură.
Caracteristicile morfologice ale straturilor epiteliale 3D microinginerie pot fi analizate prin aplicarea diferitelor modalități de imagistică, inclusiv microscopia cu contrast de fază, microscopia cu contrast interferențial diferențial (DIC), SEM sau microscopia confocală cu imunofluorescență (Figurile 3 și 4). Imagistica cu contrast de fază sau DIC poate fi efectuată cu ușurință în orice moment al culturii pentru a monitoriza forma și proeminența straturilor epiteliale 3D. Datorită transparenței optice a peliculelor de PDMS și poliester, atât platformele gut-on-a-chip, cât și cele cu cip hibrid pot oferi imagistică in situ în timp real, fără a fi nevoie de secționare sau dezasamblare a dispozitivului. Atunci când se efectuează imagistica cu imunofluorescență (Figurile 1, 3c, f și 4b, c), celulele sunt de obicei fixate cu 4% (greutate/vol) paraformaldehidă (PFA), urmată de Triton X-100 și 2% (greutate/vol) albumină serică bovină (BSA), în această ordine. În funcție de tipul de celulă, se pot utiliza diferiți fixatori, permeabilizatori și agenți de blocare. Anticorpii care vizează markerii celulari sau regionali dependenți de linie celulară sunt utilizați pentru a evidenția celulele imobilizate in situ pe cip, urmați de anticorpi secundari împreună cu un colorant de contracolorare care vizează fie nucleul (de exemplu, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI), fie F-actină (de exemplu, faloidină marcată fluorescent). Imagistica live bazată pe fluorescență poate fi, de asemenea, efectuată in situ pentru a detecta producția de mucus (Fig. 1, „Diferențierea celulară” și „Fiziologia intestinului”), colonizarea aleatorie a celulelor microbiene (Fig. 1, „Co-cultura gazdă-microb”), recrutarea celulelor imune (Fig. 1, „Modelarea bolilor”) sau contururile morfologiei epiteliale 3D (Fig. 3c, f și 4b, c). Atunci când se modifică intestinul pe cip pentru a separa stratul superior de stratul inferior al microcanalului, așa cum este descris în ref. După cum se arată în Fig. 2, morfologia epitelială 3D, precum și microvilii de pe marginea apicală a periei pot fi vizualizate prin SEM (Fig. 3b). Expresia markerilor de diferențiere poate fi evaluată prin efectuarea PCR5 cantitativă sau secvențierea ARN unicelulară. În acest caz, straturile 3D de celule epiteliale cultivate în cipuri intestinale sau cipuri hibride sunt recoltate prin tripsinizare și apoi utilizate pentru analize moleculare sau genetice.
a, Flux de lucru pentru inducerea morfogenezei intestinale într-un cip hibrid. Caco-2 și organoizii intestinali sunt utilizați în acest protocol pentru a demonstra morfogeneza 3D într-o platformă de cipuri hibride. Celulele epiteliale disociate au fost însămânțate în inserții Transwell preparate (pregătire TW; vezi figura de mai jos). Odată ce celulele au fost însămânțate (însămânțate) și atașate la membrane de poliester în inserții Transwell, toate celulele au fost cultivate în condiții statice (cultură TW). După 7 zile, un singur insert Transwell conținând un monostrat 2D de celule epiteliale a fost integrat într-un cip hibrid pentru a introduce un flux bazolateral (Flow, BL), care a dus în cele din urmă la generarea unui strat epitelial 3D (morfogeneză). Micrografii cu contrast de fază care prezintă caracteristicile morfologice ale celulelor epiteliale de organe umane derivate din colonul ascendent donator normal (linia C103) la fiecare etapă experimentală sau punct de timp. Schemele din straturile superioare ilustrează configurația experimentală pentru fiecare etapă. b, Cipurile hibride (schema din stânga) pot duce la morfogeneza 3D a celulelor epiteliale organoide cu vederi de microscopie confocală de sus în jos. luate în diferite poziții Z (superioară, mijlocie și inferioară; vezi schema din dreapta și liniile punctate corespunzătoare). au prezentat caracteristici morfologice evidente. F-actină (cian), nucleu (gri). c, Micrografii confocale cu fluorescență (vedere 3D în unghi) ale celulelor epiteliale derivate din organoide cultivate în Transwell static (TW; inserat în caseta albă punctată) versus cip hibrid (cea mai mare imagine completă) comparând morfologia 2D versus 3D, respectiv. O pereche de vederi transversale verticale 2D (inserate în colțul din dreapta sus; „XZ”) prezintă, de asemenea, caracteristici 2D și 3D. Bara de scară, 100 µm. c Retipărit cu permisiunea referinței. 4. Elsevier.
Controalele pot fi preparate prin cultivarea acelorași celule (Caco-2 sau celule epiteliale organoide intestinale) în monostraturi bidimensionale în condiții de cultură statică convenționale. În special, epuizarea nutrienților poate apărea din cauza capacității volumului limitat a microcanalelor (de exemplu, ~4 µL în canalul superior pe designul original al cipului intestinal). Prin urmare, se poate compara și morfologia epitelială înainte și după aplicarea fluxului bazolateral.
Procesul de litografie moale ar trebui efectuat într-o cameră curată. Pentru fiecare strat de pe cip (straturile superioare și inferioare și membrane) și cipurile hibride, au fost utilizate fotomăști diferite, fabricate pe napolitane de siliciu separate, deoarece înălțimile microcanalelor erau diferite. Înălțimile țintă ale microcanalelor superioare și inferioare ale intestinului de pe cip sunt de 500 µm și, respectiv, 200 µm. Înălțimea canalului țintă al cipului hibrid este de 200 µm.
Așezați o plachetă de siliciu de 3 inci într-un vas cu acetonă. Rotiți ușor placa timp de 30 de secunde, apoi uscați placheta la aer. Transferați placheta pe o placă cu IPA, apoi rotiți placa timp de 30 de secunde pentru a o curăța.
O soluție piranha (amestec de peroxid de hidrogen și acid sulfuric concentrat, 1:3 (vol/vol)) poate fi utilizată opțional pentru a maximiza îndepărtarea reziduurilor organice de pe suprafața plachetei de siliciu.
Soluția Piranha este extrem de corozivă și generează căldură. Sunt necesare măsuri de siguranță suplimentare. Pentru eliminarea deșeurilor, lăsați soluția să se răcească și transferați-o într-un recipient pentru deșeuri curat și uscat. Folosiți recipiente secundare și etichetați corespunzător recipientele pentru deșeuri. Vă rugăm să urmați instrucțiunile de siguranță ale instalației pentru proceduri mai detaliate.
Deshidratați napolitanele plasându-le pe o placă încălzită la 200 °C timp de 10 minute. După deshidratare, napolitana a fost agitată de cinci ori la aer pentru a se răci.
Turnați ~10 g de fotorezist SU-8 2100 în centrul plachetei de siliciu curățate. Folosiți o pensetă pentru a distribui uniform fotorezistul pe plachetă. Ocazional, așezați placheta pe o placă încălzită la 65°C pentru a face fotorezistul mai puțin lipicios și mai ușor de întins. Nu așezați placheta direct pe placa încălzitoare.
SU-8 a fost distribuit uniform pe plachetă prin aplicarea unui strat de acoperire prin centrifugare. Programați o rotație de intrare a SU-8 timp de 5-10 secunde pentru a se propaga la 500 rpm la o accelerație de 100 rpm/s. Setați rotația principală pentru o modelare cu grosimea de 200 µm la 1.500 rpm sau obțineți o grosime de 250 µm (rezultând o înălțime de 500 µm pentru stratul superior al intestinului de pe cip; consultați „Pași critici” mai jos) setați la o accelerație de 300 rpm/s și 30 de secunde la 1.200 rpm.
Viteza principală de rotație poate fi ajustată în funcție de grosimea țintă a modelului SU-8 de pe placheta de siliciu.
Pentru a fabrica modele SU-8 cu o înălțime de 500 µm pentru stratul superior al intestinului de pe cip, etapele de centrifugare și coacere moale din această casetă (etapele 7 și 8) au fost repetate secvențial (vezi etapa 9) pentru a produce două straturi de SU-8 cu o grosime de 250 µm, care pot fi stratificate și unite prin expunere la UV în etapa 12 din această casetă, rezultând un strat cu o înălțime de 500 µm.
Coaceți ușor napolitanele acoperite cu SU-8 plasându-le cu grijă pe o placă fierbinte la 65 °C timp de 5 minute, apoi schimbați setarea la 95 °C și incubați timp de încă 40 de minute.
Pentru a obține o înălțime de 500 μm a modelului SU-8 în microcanalul superior, repetați pașii 7 și 8 pentru a genera două straturi SU-8 cu grosimea de 250 μm.
Folosind dispozitivul de aliniere a măștii UV, efectuați un test cu lampa conform instrucțiunilor producătorului pentru a calcula timpul de expunere al plachetei (timp de expunere, ms) = (doza de expunere, mJ/cm2)/(puterea lămpii, mW/cm2).
După determinarea timpului de expunere, plasați fotomasca pe suportul de mască al dispozitivului de aliniere a măștii UV și plasați fotomasca pe placheta acoperită cu SU-8.
Plasați suprafața imprimată a fotomăștii direct pe partea acoperită cu SU-8 a plachetei de siliciu pentru a minimiza dispersia UV.
Expuneți placheta acoperită cu SU-8 și fotomasca vertical la 260 mJ/cm2 de lumină UV pentru timpul de expunere predeterminat (vezi pasul 10 din acest chenar).
După expunerea la UV, napolitanele de siliciu acoperite cu SU-8 au fost coapte la 65°C timp de 5 minute și la 95°C timp de 15 minute pe fiecare placă încălzitoare pentru a fabrica modele cu o înălțime de 200 μm. Timpul de post-coacere la 95°C s-a extins la 30 de minute pentru a fabrica modele cu o înălțime de 500 µm.
Revelatorul se toarnă într-un vas de sticlă, iar napolitana coaptă se plasează în vas. Volumul de revelator SU-8 poate varia în funcție de dimensiunea plăcii de sticlă. Asigurați-vă că utilizați suficient revelator SU-8 pentru a îndepărta complet SU-8 neexpus. De exemplu, atunci când utilizați un vas de sticlă cu diametrul de 150 mm și o capacitate de 1 litru, utilizați ~300 ml de revelator SU-8. Developați matrița timp de 25 de minute, rotind-o ușor ocazional.
Clătiți matrița dezvoltată cu ~10 ml de revelator proaspăt, urmată de IPA prin pulverizarea soluției folosind o pipetă.
Plasați placheta într-un aparat de curățare cu plasmă și expuneți-o la plasmă de oxigen (gaz atmosferic, presiune țintă 1 × 10−5 Torr, putere 125 W) timp de 1,5 minute.
Plasați napolitana într-un desicator în vid cu o lamă de sticlă în interior. Napolitanele și lamelele pot fi plasate una lângă alta. Dacă desicatorul în vid este împărțit în mai multe straturi de o placă, plasați lamelele în camera inferioară, iar napolitanele în camera superioară. Picurați 100 μL de soluție de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil)silan pe o lamă de sticlă și aplicați vid pentru silanizare.
Dezghețați o fiolă cu celule Caco-2 congelate într-o baie de apă la 37°C, apoi transferați celulele dezghețate într-un balon T75 care conține 15 ml de mediu Caco-2 preîncălzit la 37°C.
Pentru a trece celulele Caco-2 la o confluență de ~90%, mai întâi încălziți mediul Caco-2, PBS și tripsină 0,25%/EDTA 1 mM într-o baie de apă la 37°C.
Aspirați mediul prin aspirație în vid. Spălați celulele de două ori cu 5 ml de PBS cald, repetând aspirația în vid și adăugând PBS proaspăt.