Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Evoluția paraziților microbieni implică o contraacțiune între selecția naturală, care determină îmbunătățirea paraziților, și deriva genetică, care face ca paraziții să piardă gene și să acumuleze mutații dăunătoare.Aici, pentru a înțelege cum se produce această acțiune la scara unei singure macromolecule, descriem structura crio-EM a ribozomului Encephalitozoon cuniculi, un organism eucariot cu unul dintre cei mai mici genomi din natură.Reducerea extremă a ARNr-ului în ribozomii E. cuniculi este însoțită de modificări structurale fără precedent, cum ar fi evoluția linkerilor de ARNr fuzionați necunoscuti anterior și a ARNr-ului fără umflături.În plus, ribozomul E. cuniculi a supraviețuit pierderii de fragmente și proteine ​​de ARNr prin dezvoltarea capacității de a utiliza molecule mici ca imitații structurale ale fragmentelor și proteinelor de ARNr degradate.În general, arătăm că structurile moleculare considerate mult timp a fi reduse, degenerate și supuse mutațiilor debilitante au o serie de mecanisme compensatorii care le mențin active în ciuda contracțiilor moleculare extreme.
Deoarece majoritatea grupurilor de paraziți microbieni au instrumente moleculare unice pentru a-și exploata gazdele, adesea trebuie să dezvoltăm terapii diferite pentru diferite grupuri de paraziți1,2.Cu toate acestea, noi dovezi sugerează că unele aspecte ale evoluției paraziților sunt convergente și în mare măsură previzibile, indicând o bază potențială pentru intervenții terapeutice ample în paraziții microbieni3,4,5,6,7,8,9.
Lucrările anterioare au identificat o tendință evolutivă comună în paraziții microbieni numită reducerea genomului sau degradarea genomului10,11,12,13.Cercetările actuale arată că atunci când microorganismele renunță la stilul lor de viață liber și devin paraziți intracelulari (sau endosimbioți), genomul lor suferă metamorfoze lente, dar uimitoare de-a lungul a milioane de ani9,11.Într-un proces cunoscut sub numele de degradare a genomului, paraziții microbieni acumulează mutații dăunătoare care transformă multe gene importante anterior în pseudogene, ducând la pierderea treptată a genelor și la colapsul mutațional14,15.Acest colaps poate distruge până la 95% din genele celor mai vechi organisme intracelulare în comparație cu speciile care trăiesc libere strâns înrudite.Astfel, evoluția paraziților intracelulari este un remorcher între două forțe opuse: selecția naturală darwiniană, care duce la ameliorarea paraziților, și prăbușirea genomului, aruncând paraziții în uitare.Modul în care parazitul a reușit să iasă din acest remorcher și să păstreze activitatea structurii sale moleculare rămâne neclar.
Deși mecanismul dezintegrarii genomului nu este pe deplin înțeles, pare să apară în principal din cauza derivei genetice frecvente.Deoarece paraziții trăiesc în populații mici, asexuate și limitate genetic, ei nu pot elimina în mod eficient mutațiile dăunătoare care apar uneori în timpul replicării ADN-ului.Acest lucru duce la acumularea ireversibilă a mutațiilor dăunătoare și reducerea genomului parazitului.Drept urmare, parazitul nu pierde doar gene care nu mai sunt necesare supraviețuirii sale în mediul intracelular.Incapacitatea populațiilor de paraziți de a elimina în mod eficient mutațiile dăunătoare sporadice este cea care face ca aceste mutații să se acumuleze în tot genomul, inclusiv genele lor cele mai importante.
O mare parte din înțelegerea noastră actuală a reducerii genomului se bazează exclusiv pe comparații ale secvențelor genomului, cu mai puțină atenție la modificările moleculelor reale care îndeplinesc funcții de menaj și servesc ca potențiale ținte de droguri.Studiile comparative au arătat că sarcina mutațiilor microbiene intracelulare dăunătoare pare să predispună proteinele și acizii nucleici la pliere și agregare greșită, făcându-le mai dependente de chaperonă și hipersensibile la căldură19,20,21,22,23.În plus, diferiți paraziți – evoluție independentă uneori separate de până la 2,5 miliarde de ani – au experimentat o pierdere similară a centrelor de control al calității în sinteza proteinelor5,6 și mecanismele de reparare a ADN-ului24.Cu toate acestea, se știe puțin despre impactul stilului de viață intracelular asupra tuturor celorlalte proprietăți ale macromoleculelor celulare, inclusiv adaptarea moleculară la o povară tot mai mare a mutațiilor dăunătoare.
În această lucrare, pentru a înțelege mai bine evoluția proteinelor și acizilor nucleici ai microorganismelor intracelulare, am determinat structura ribozomilor parazitului intracelular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi este un organism asemănător ciupercilor aparținând unui grup de microsporidii parazite care au genomi eucariote neobișnuit de mici și, prin urmare, sunt folosite ca organisme model pentru a studia degradarea genomului25,26,27,28,29,30.Recent, structura ribozomului crio-EM a fost determinată pentru genomurile moderat reduse ale Microsporidia, Paranosema locustae și Vairimorpha necatrix31,32 (~ 3,2 Mb genom).Aceste structuri sugerează că o anumită pierdere a amplificării ARNr este compensată de dezvoltarea de noi contacte între proteinele ribozomale învecinate sau de achiziționarea de noi proteine ​​ribozomale msL131,32.Speciile Encephalitozoon (genomul ~ 2,5 milioane bp), împreună cu cea mai apropiată rudă a lor Ordospora, demonstrează gradul final de reducere a genomului la eucariote - au mai puțin de 2000 de gene care codifică proteine ​​și este de așteptat ca ribozomii lor să nu fie doar lipsiți de fragmente de expansiune a ARNr (rARN) de fragmente de proteină ribozomală care disting, de asemenea, patru ribozomi de bacterii ribozomale. s din cauza lipsei lor de omologi în genomul E. cuniculi26,27,28.Prin urmare, am ajuns la concluzia că ribozomul E. cuniculi poate dezvălui strategii necunoscute anterior pentru adaptarea moleculară la degradarea genomului.
Structura noastră crio-EM reprezintă cel mai mic ribozom citoplasmatic eucariotic care trebuie caracterizat și oferă o perspectivă asupra modului în care gradul final de reducere a genomului afectează structura, asamblarea și evoluția mașinării moleculare care este parte integrantă a celulei.Am descoperit că ribozomul E. cuniculi încalcă multe dintre principiile conservate pe scară largă ale plierii ARN și asamblarii ribozomului și am descoperit o nouă proteină ribozomală, necunoscută anterior.În mod destul de neașteptat, arătăm că ribozomii microsporidiilor au evoluat capacitatea de a lega molecule mici și emitem ipoteza că trunchiurile în ARNr și proteine ​​declanșează inovații evolutive care pot conferi în cele din urmă calități utile ribozomului.
Pentru a ne îmbunătăți înțelegerea evoluției proteinelor și acizilor nucleici în organismele intracelulare, am decis să izolăm sporii de E. cuniculi din culturi de celule de mamifere infectate pentru a le purifica ribozomii și a determina structura acestor ribozomi.Este dificil să se obțină un număr mare de microsporidii parazitare deoarece microsporidiile nu pot fi cultivate într-un mediu nutritiv.În schimb, cresc și se reproduc numai în interiorul celulei gazdă.Prin urmare, pentru a obține biomasa de E. cuniculi pentru purificarea ribozomilor, am infectat linia celulară de rinichi de mamifer RK13 cu spori de E. cuniculi și am cultivat aceste celule infectate timp de câteva săptămâni pentru a permite E. cuniculi să crească și să se înmulțească.Folosind un monostrat de celule infectate de aproximativ o jumătate de metru pătrat, am reușit să purificăm aproximativ 300 mg de spori de Microsporidia și să-i folosim pentru a izola ribozomii.Apoi am întrerupt sporii purificați cu perle de sticlă și am izolat ribozomii bruti folosind fracționarea treptată a polietilenglicolului a lizatelor.Acest lucru ne-a permis să obținem aproximativ 300 µg de ribozomi bruti de E. cuniculi pentru analiza structurală.
Apoi am colectat imagini crio-EM folosind mostrele de ribozomi rezultate și am procesat aceste imagini folosind măști corespunzătoare subunității ribozomale mari, capului subunității mici și subunității mici.În timpul acestui proces, am colectat imagini cu aproximativ 108.000 de particule ribozomale și am calculat imagini crio-EM cu o rezoluție de 2,7 Å (Figurile suplimentare 1-3).Apoi am folosit imagini cryoEM pentru a modela ARNr, proteina ribozomală și factorul de hibernare Mdf1 asociat cu ribozomii E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Structura ribozomului E. cuniculi în complex cu factorul de hibernare Mdf1 (pdb id 7QEP).b Harta factorului de hibernare Mdf1 asociat cu ribozomul E. cuniculi.c Harta structurii secundare care compară ARNr recuperat la speciile de Microsporidian cu structurile ribozomale cunoscute.Panourile arată locația fragmentelor de ARNr amplificate (ES) și a situsurilor active ale ribozomului, inclusiv site-ul de decodificare (DC), bucla sarcinicin (SRL) și centrul peptidil transferazei (PTC).d Densitatea electronică corespunzătoare centrului peptidil transferazei al ribozomului E. cuniculi sugerează că acest situs catalitic are aceeași structură în parazitul E. cuniculi și gazdele sale, inclusiv H. sapiens.e, f Densitatea electronică corespunzătoare a centrului de decodificare (e) și structura schematică a centrului de decodificare (f) indică faptul că E. cuniculi are reziduuri U1491 în loc de A1491 (numerotarea E. coli) în multe alte eucariote.Această modificare sugerează că E. cuniculi poate fi sensibil la antibioticele care vizează acest site activ.
Spre deosebire de structurile stabilite anterior ale ribozomilor V. necatrix și P. locustae (ambele structuri reprezintă aceeași familie de microsporidii Nosematidae și sunt foarte asemănătoare între ele), 31,32 ribozomii E. cuniculi suferă numeroase procese de fragmentare a ARNr și proteine.Denaturare ulterioară (Figurile suplimentare 4-6).În ARNr, cele mai izbitoare modificări au inclus pierderea completă a fragmentului de ARNr 25S amplificat ES12L și degenerarea parțială a elicelor h39, h41 și H18 (Fig. 1c, Fig. 4 suplimentară).Printre proteinele ribozomale, cele mai izbitoare modificări au inclus pierderea completă a proteinei eS30 și scurtarea proteinelor eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 și eS7 (Figurile suplimentare 4, 5).
Astfel, reducerea extremă a genomului speciilor de Encephalotozoon/Ordospora se reflectă în structura lor ribozomală: ribozomii E. cuniculi experimentează cea mai dramatică pierdere a conținutului de proteine ​​în ribozomii citoplasmatici eucarioți supuși caracterizării structurale și nici măcar nu au acele rARN și fragmente proteice care nu sunt doar conservate în cele trei domenii ale eukaryote, ci și pe scară largă.Structura ribozomului E. cuniculi oferă primul model molecular pentru aceste modificări și dezvăluie evenimente evolutive care au fost trecute cu vederea atât de genomica comparativă, cât și de studiile structurii biomoleculare intracelulare (Figura 7 suplimentară).Mai jos, descriem fiecare dintre aceste evenimente împreună cu originile lor evolutive probabile și impactul lor potențial asupra funcției ribozomilor.
Am descoperit apoi că, pe lângă trunchiurile mari de ARNr, ribozomii E. cuniculi au variații de ARNr la unul dintre situsurile lor active.Deși centrul de peptidil transferază al ribozomului E. cuniculi are aceeași structură ca și alți ribozomi eucarioți (Fig. 1d), centrul de decodificare diferă datorită variației secvenței la nucleotida 1491 (numerotarea E. coli, Fig. 1e, f).Această observație este importantă deoarece situsul de decodificare al ribozomilor eucarioți conține în mod obișnuit reziduurile G1408 și A1491 în comparație cu resturile de tip bacterian A1408 și G1491.Această variație stă la baza sensibilității diferite a ribozomilor bacterieni și eucarioți la familia de aminoglicozide a antibioticelor ribozomale și alte molecule mici care vizează locul de decodificare.La locul de decodificare al ribozomului E. cuniculi, reziduul A1491 a fost înlocuit cu U1491, creând potențial o interfață unică de legare pentru moleculele mici care vizează acest site activ.Aceeași variantă A14901 este prezentă și în alte microsporidii, cum ar fi P. locustae și V. necatrix, ceea ce sugerează că este răspândită printre speciile de microsporidii (Fig. 1f).
Deoarece probele noastre de ribozom E. cuniculi au fost izolate din spori inactivi metabolic, am testat harta crio-EM a E. cuniculi pentru legarea ribozomului descrisă anterior în condiții de stres sau de foame.Factori de hibernare 31,32,36,37, 38. Am corelat structura stabilită anterior a ribozomului hibernant cu harta crio-EM a ribozomului E. cuniculi.Pentru andocare, ribozomii S. cerevisiae au fost utilizați în complex cu factorul de hibernare Stm138, ribozomi de salcâm în complex cu factorul Lso232 și ribozomi V. necatrix în complex cu factorii Mdf1 și Mdf231.În același timp, am găsit densitatea crio-EM corespunzătoare factorului de repaus Mdf1.Similar cu legarea Mdf1 de ribozomul V. necatrix, Mdf1 se leagă și de ribozomul E. cuniculi, unde blochează site-ul E al ribozomului, ajutând posibil să facă disponibili ribozomii atunci când sporii paraziților devin inactivi metabolic la inactivarea corpului (Figura 2).).
Mdf1 blochează locul E al ribozomului, care pare să ajute la inactivarea ribozomului atunci când sporii paraziților devin inactivi metabolic.În structura ribozomului E. cuniculi, am descoperit că Mdf1 formează un contact necunoscut anterior cu tulpina ribozomului L1, partea ribozomului care facilitează eliberarea ARNt deacilat din ribozom în timpul sintezei proteinelor.Aceste contacte sugerează că Mdf1 se disociază de ribozom folosind același mecanism ca ARNt deacetilat, oferind o posibilă explicație pentru modul în care ribozomul elimină Mdf1 pentru a reactiva sinteza proteinelor.
Cu toate acestea, structura noastră a relevat un contact necunoscut între Mdf1 și piciorul ribozomului L1 (partea ribozomului care ajută la eliberarea ARNt deacilat din ribozom în timpul sintezei proteinelor).În special, Mdf1 utilizează aceleași contacte ca și segmentul cot al moleculei de ARNt deacilat (Fig. 2).Această modelare moleculară necunoscută anterior a arătat că Mdf1 se disociază de ribozom folosind același mecanism ca ARNt deacetilat, ceea ce explică modul în care ribozomul elimină acest factor de hibernare pentru a reactiva sinteza proteinelor.
La construirea modelului de ARNr, am constatat că ribozomul E. cuniculi are fragmente de ARNr pliate anormal, pe care le-am numit ARNr fuzionat (Fig. 3).În ribozomii care acoperă cele trei domenii ale vieții, ARNr-ul se pliază în structuri în care majoritatea bazelor ARNr fie se perechează și se pliază între ele, fie interacționează cu proteinele ribozomale38,39,40.Cu toate acestea, în ribozomii E. cuniculi, ARNr-urile par să încalce acest principiu de pliere prin conversia unora dintre elicele lor în regiuni de ARNr desfășurate.
Structura helixului ARNr H18 25S în S. cerevisiae, V. necatrix și E. cuniculi.De obicei, în ribozomi care se întind pe cele trei domenii de viață, acest linker se înfășoară într-o spirală de ARN care conține 24 până la 34 de reziduuri.În Microsporidia, în contrast, acest linker ARNr este redus treptat la doi linkeri monocatenar bogat în uridină care conțin doar 12 reziduuri.Majoritatea acestor reziduuri sunt expuse la solvenți.Figura arată că microsporidiile parazitare par să încalce principiile generale ale plierii ARNr, unde bazele ARNr sunt de obicei cuplate cu alte baze sau implicate în interacțiunile ARNr-proteină.În microsporidia, unele fragmente de ARNr iau o pliu nefavorabil, în care fostul helix de ARNr devine un fragment monocatenar alungit aproape în linie dreaptă.Prezența acestor regiuni neobișnuite permite ARNr-ului microsporidiei să lege fragmente de ARNr îndepărtate folosind un număr minim de baze ARN.
Cel mai frapant exemplu al acestei tranziții evolutive poate fi observat în helixul ARNr H18 25S (Fig. 3).La speciile de la E. coli la om, bazele acestui helix de ARNr conțin 24-32 de nucleotide, formând un helix ușor neregulat.În structurile ribozomale identificate anterior din V. necatrix și P. locustae,31,32 bazele helixului H18 sunt parțial desfășurate, dar împerecherea bazelor nucleotidelor este păstrată.Cu toate acestea, în E. cuniculi acest fragment de ARNr devine cei mai scurti linkeri 228UUUUUU232 și 301UUUUUUUU307.Spre deosebire de fragmentele tipice de ARNr, acești linkeri bogati în uridină nu se rotesc și nu fac contact extins cu proteinele ribozomale.În schimb, ei adoptă structuri deschise cu solvent și complet desfășurate în care catenele de ARNr sunt extinse aproape drept.Această conformație întinsă explică modul în care E. cuniculi utilizează doar 12 baze ARN pentru a umple golul de 33 Å dintre elicele ARNr H16 și H18, în timp ce alte specii necesită cel puțin de două ori mai multe baze ARNr pentru a umple golul.
Astfel, putem demonstra că, prin pliere nefavorabilă din punct de vedere energetic, microsporidiile parazitare au dezvoltat o strategie de a contracta chiar și acele segmente de ARNr care rămân conservate pe scară largă între specii în cele trei domenii ale vieții.Aparent, prin acumularea de mutații care transformă elice de ARNr în linkeri poli-U scurti, E. cuniculi poate forma fragmente neobișnuite de ARNr care conțin cât mai puține nucleotide pentru ligatura fragmentelor distale de ARNr.Acest lucru ajută la explicarea modului în care microsporidia a realizat o reducere dramatică a structurii lor moleculare de bază fără a-și pierde integritatea structurală și funcțională.
O altă caracteristică neobișnuită a ARNr-ului E. cuniculi este apariția ARNr fără îngroșări (Fig. 4).Bulges-urile sunt nucleotide fără perechi de baze care se răsucesc din helixul ARN în loc să se ascundă în ea.Majoritatea proeminențelor de ARNr acționează ca adezivi moleculari, ajutând la legarea proteinelor ribozomale adiacente sau a altor fragmente de ARNr.Unele dintre umflături acționează ca balamale, permițând helixului ARNr să se îndoaie și să se plieze optim pentru sinteza productivă a proteinelor 41 .
a O proeminență de ARNr (numerotarea S. cerevisiae) este absentă din structura ribozomului E. cuniculi, dar este prezentă în majoritatea celorlalte eucariote b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens și E. cuniculi ribozomi interni.paraziților le lipsesc multe dintre umflăturile ARNr antice, foarte conservate.Aceste îngroșări stabilizează structura ribozomului;prin urmare, absența lor în microsporidii indică o stabilitate redusă a plierii ARNr la paraziții microsporidiilor.Comparația cu tulpinile P (tulpini L7/L12 în bacterii) arată că pierderea denivelărilor de ARNr coincide uneori cu apariția unor noi denivelări lângă umflăturile pierdute.Helixul H42 din ARNr 23S/28S are o umflătură antică (U1206 în Saccharomyces cerevisiae) estimată a avea o vechime de cel puțin 3,5 miliarde de ani datorită protecției sale în trei domenii ale vieții.În microsporidia, această umflătură este eliminată.Cu toate acestea, lângă umflătura pierdută a apărut o nouă umflătură (A1306 în E. cuniculi).
În mod surprinzător, am constatat că ribozomilor E. cuniculi le lipsesc majoritatea umflăturilor ARNr găsite la alte specii, inclusiv mai mult de 30 de umflături conservate la alte eucariote (Fig. 4a).Această pierdere elimină multe contacte dintre subunitățile ribozomale și elicele de ARNr adiacente, creând uneori goluri mari în ribozom, făcând ribozomul E. cuniculi mai poros în comparație cu ribozomii mai tradiționali (Fig. 4b).În special, am constatat că majoritatea acestor umflături s-au pierdut și în structurile ribozomilor V. necatrix și P. locustae identificate anterior, care au fost trecute cu vederea de analizele structurale anterioare31,32.
Uneori, pierderea umflăturilor ARNr este însoțită de dezvoltarea de noi umflături lângă umflătura pierdută.De exemplu, tulpina P ribozomală conține o umflătură U1208 (în Saccharomyces cerevisiae) care a supraviețuit de la E. coli la om și, prin urmare, se estimează că are o vechime de 3,5 miliarde de ani.În timpul sintezei proteinelor, această umflătură ajută tulpina P să se miște între conformațiile deschise și închise, astfel încât ribozomul să poată recruta factori de translație și să-i livreze la locul activ.La ribozomii E. cuniculi, această îngroșare este absentă;totuși, o nouă îngroșare (G883) situată doar în trei perechi de baze poate contribui la restabilirea flexibilității optime a tulpinii P (Fig. 4c).
Datele noastre despre ARNr fără umflături sugerează că minimizarea ARNr nu se limitează la pierderea elementelor ARNr de pe suprafața ribozomului, ci poate implica și nucleul ribozomului, creând un defect molecular specific parazitului care nu a fost descris în celulele care trăiesc liber.se observă specii vii.
După modelarea proteinelor ribozomale canonice și ARNr, am descoperit că componentele ribozomale convenționale nu pot explica cele trei părți ale imaginii crio-EM.Două dintre aceste fragmente sunt molecule de dimensiuni mici (Fig. 5, Fig. 8 suplimentară).Primul segment este cuprins între proteinele ribozomale uL15 și eL18 într-o poziție ocupată de obicei de capătul C-terminal al eL18, care este scurtat în E. cuniculi.Deși nu putem determina identitatea acestei molecule, dimensiunea și forma acestei insule de densitate este bine explicată prin prezența moleculelor de spermidină.Legarea sa de ribozom este stabilizată de mutații specifice microsporidiilor în proteinele uL15 (Asp51 și Arg56), care par să mărească afinitatea ribozomului pentru această moleculă mică, deoarece permit uL15 să învelească molecula mică într-o structură ribozomală.Figura suplimentară 2).8, date suplimentare 1, 2).
Imagistica crio-EM care arată prezența nucleotidelor în afara ribozei legate de ribozomul E. cuniculi.În ribozomul E. cuniculi, această nucleotidă ocupă același loc ca nucleotida 25S ARNr A3186 (numărarea Saccharomyces cerevisiae) în majoritatea celorlalți ribozomi eucarioți.b În structura ribozomală a E. cuniculi, această nucleotidă este situată între proteinele ribozomale uL9 și eL20, stabilizând astfel contactul dintre cele două proteine.Analiza conservării secvenței cd eL20 printre speciile de microsporidi.Arborele filogenetic al speciilor de Microsporidia (c) și alinierea secvenței multiple a proteinei eL20 (d) arată că resturile de legare a nucleotidelor F170 și K172 sunt conservate în majoritatea Microsporidia tipice, cu excepția S. lophii, cu excepția ramificării timpurii Microsporidia, care a păstrat extensia ES39 ARN-ului.e Această figură arată că resturile de legare a nucleotidelor F170 și K172 sunt prezente numai în eL20 al genomului microsporidiei foarte redus, dar nu și în alte eucariote.În general, aceste date sugerează că ribozomii Microsporidian au dezvoltat un situs de legare a nucleotidelor care pare să lege moleculele de AMP și să le folosească pentru a stabiliza interacțiunile proteină-proteină în structura ribozomală.Conservarea ridicată a acestui sit de legare în Microsporidia și absența sa în alte eucariote sugerează că acest sit poate oferi un avantaj selectiv de supraviețuire pentru Microsporidia.Astfel, buzunarul de legare a nucleotidelor din ribozomul microsporidiei nu pare a fi o caracteristică degenerată sau o formă finală a degradării ARNr așa cum a fost descris anterior, ci mai degrabă o inovație evolutivă utilă care permite ribozomului microsporidiei să lege direct moleculele mici, folosindu-le ca blocuri moleculare.blocuri de construcție pentru ribozomi.Această descoperire face ca ribozomul microsporidiei să fie singurul ribozom cunoscut că folosește o singură nucleotidă ca bloc structural.f Cale evolutivă ipotetică derivată din legarea nucleotidelor.
A doua densitate cu greutate moleculară mică este situată la interfața dintre proteinele ribozomale uL9 și eL30 (Fig. 5a).Această interfață a fost descrisă anterior în structura ribozomului Saccharomyces cerevisiae ca un loc de legare pentru nucleotida 25S a ARNr-ului A3186 (parte a extensiei ARNr ES39L)38.S-a demonstrat că în ribozomii degenerați de P. locustae ES39L, această interfață leagă o singură nucleotidă 31 necunoscută și se presupune că această nucleotidă este o formă finală redusă de ARNr, în care lungimea ARNr este de ~130-230 de baze.ES39L este redusă la o singură nucleotidă 32,43.Imaginile noastre crio-EM susțin ideea că densitatea poate fi explicată prin nucleotide.Cu toate acestea, rezoluția mai mare a structurii noastre a arătat că această nucleotidă este o moleculă extraribozomală, posibil AMP (Fig. 5a, b).
Am întrebat apoi dacă locul de legare a nucleotidelor a apărut în ribozomul E. cuniculi sau dacă a existat anterior.Deoarece legarea nucleotidelor este mediată în principal de resturile Phe170 și Lys172 din proteina ribozomală eL30, am evaluat conservarea acestor reziduuri în 4396 de eucariote reprezentative.Ca și în cazul uL15 de mai sus, am constatat că resturile Phe170 și Lys172 sunt foarte conservate doar în Microsporidia tipice, dar absente în alte eucariote, inclusiv în Microsporidia Mitosporidium și Amphiamblys atipice, în care fragmentul ARNr ES39L nu este redus 44, 45, 454c6.-e).
Luate împreună, aceste date susțin ideea că E. cuniculi și, eventual, alte microsporidii canonice au evoluat capacitatea de a capta eficient un număr mare de metaboliți mici în structura ribozomilor pentru a compensa scăderea nivelurilor de ARNr și proteine.Procedând astfel, ei au dezvoltat o capacitate unică de a lega nucleotidele în afara ribozomului, arătând că structurile moleculare parazitare compensează prin captarea metaboliților mici abundenți și folosindu-i ca imitații structurale ale fragmentelor de ARN și proteine ​​degradate..
A treia parte nesimulată a hărții noastre crio-EM, găsită în subunitatea ribozomală mare.Rezoluția relativ mare (2,6 Å) a hărții noastre sugerează că această densitate aparține proteinelor cu combinații unice de reziduuri mari de lanț lateral, ceea ce ne-a permis să identificăm această densitate ca o proteină ribozomală necunoscută anterior pe care am identificat-o ca fiind numită msL2 (proteina specifică Microsporidia L2) (metode, figura 6).Căutarea noastră de omologie a arătat că msL2 este conservat în clada Microsporidia din genul Encephaliter și Orosporidium, dar absent la alte specii, inclusiv la alte Microsporidia.În structura ribozomală, msL2 ocupă un gol format prin pierderea ARNr-ului ES31L extins.În acest gol, msL2 ajută la stabilizarea plierii ARNr și poate compensa pierderea ES31L (Figura 6).
a Densitatea electronică și modelul proteinei ribozomale specifice Microsporidia msL2 găsite în ribozomii E. cuniculi.b Majoritatea ribozomilor eucarioți, inclusiv ribozomul 80S al lui Saccharomyces cerevisiae, au amplificarea ARNr ES19L pierdută la majoritatea speciilor de Microsporidian.Structura stabilită anterior a ribozomului V. necatrix microsporidia sugerează că pierderea ES19L la acești paraziți este compensată de evoluția noii proteine ​​ribozomale msL1.În acest studiu, am descoperit că ribozomul E. cuniculi a dezvoltat, de asemenea, o proteină suplimentară imitativă a ARN-ului ribozomal ca o compensație aparentă pentru pierderea ES19L.Cu toate acestea, msL2 (adnotat în prezent ca proteina ipotetică ECU06_1135) și msL1 au origini structurale și evolutive diferite.c Această descoperire a generării de proteine ​​ribozomale msL1 și msL2 neînrudite evolutiv sugerează că, dacă ribozomii acumulează mutații dăunătoare în ARNr-ul lor, ei pot atinge niveluri fără precedent de diversitate compozițională chiar și într-un subset mic de specii strâns înrudite.Această descoperire ar putea ajuta la clarificarea originii și evoluției ribozomului mitocondrial, care este cunoscut pentru ARNr-ul foarte redus și variabilitatea anormală a compoziției proteinelor între specii.
Apoi am comparat proteina msL2 cu proteina msL1 descrisă anterior, singura proteină ribozomală specifică microsporidiei cunoscută găsită în ribozomul V. necatrix.Am vrut să testăm dacă msL1 și msL2 sunt legate evolutiv.Analiza noastră a arătat că msL1 și msL2 ocupă aceeași cavitate în structura ribozomală, dar au structuri primare și terțiare diferite, ceea ce indică originea lor evolutivă independentă (Fig. 6).Astfel, descoperirea noastră a msL2 oferă dovezi că grupurile de specii eucariote compacte pot evolua în mod independent proteine ​​ribozomale distincte structural pentru a compensa pierderea fragmentelor de ARNr.Această constatare este notabilă prin faptul că majoritatea ribozomilor eucariotici citoplasmatici conțin o proteină invariantă, inclusiv aceeași familie de 81 de proteine ​​ribozomale.Apariția msL1 și msL2 în diferite clade de microsporidii ca răspuns la pierderea segmentelor de ARNr extinse sugerează că degradarea arhitecturii moleculare a parazitului determină paraziții să caute mutații compensatorii, care în cele din urmă pot duce la achiziționarea lor în diferite populații de paraziți.structurilor.
În cele din urmă, când modelul nostru a fost finalizat, am comparat compoziția ribozomului E. cuniculi cu cea prezisă din secvența genomului.Mai multe proteine ​​ribozomale, inclusiv eL14, eL38, eL41 și eS30, au fost considerate anterior a lipsi din genomul E. cuniculi din cauza absenței aparente a omologilor lor din genomul E. cuniculi.Pierderea multor proteine ​​ribozomale este, de asemenea, prezisă în majoritatea celorlalți paraziți intracelulari și endosimbioți foarte redusi.De exemplu, deși majoritatea bacteriilor cu viață liberă conțin aceeași familie de 54 de proteine ​​ribozomale, doar 11 dintre aceste familii de proteine ​​au omologi detectabili în fiecare genom analizat al bacteriilor restricționate de gazdă.În sprijinul acestei noțiuni, s-a observat experimental o pierdere de proteine ​​ribozomale în microsporidia V. necatrix și P. locustae, cărora le lipsesc proteinele eL38 și eL4131,32.
Cu toate acestea, structurile noastre arată că numai eL38, eL41 și eS30 sunt de fapt pierdute în ribozomul E. cuniculi.Proteina eL14 a fost conservată și structura noastră a arătat de ce această proteină nu a putut fi găsită în căutarea de omologie (Fig. 7).În ribozomii E. cuniculi, cea mai mare parte a situsului de legare a eL14 este pierdută din cauza degradării ES39L amplificat cu ARNr.În absența ES39L, eL14 și-a pierdut cea mai mare parte a structurii sale secundare și doar 18% din secvența eL14 a fost identică în E. cuniculi și S. cerevisiae.Această conservare slabă a secvenței este remarcabilă, deoarece chiar și Saccharomyces cerevisiae și Homo sapiens - organisme care au evoluat la 1,5 miliarde de ani una dintre ele - au peste 51% din aceleași reziduuri în eL14.Această pierdere anormală a conservării explică de ce E. cuniculi eL14 este în prezent adnotat ca proteină presupusă M970_061160 și nu ca proteină ribozomală eL1427.
și ribozomul Microsporidia a pierdut extensia ARNr ES39L, care a eliminat parțial locul de legare a proteinei ribozomale eL14.În absența ES39L, proteina microspore eL14 suferă o pierdere a structurii secundare, în care fostul α-helix de legare a ARNr degenerează într-o buclă de lungime minimă.b Alinierea secvențelor multiple arată că proteina eL14 este foarte conservată la speciile eucariote (identitate de secvență de 57% între omologii umani și drojdii), dar slab conservată și divergentă în microsporidii (în care nu mai mult de 24% din reziduuri sunt identice cu omologul eL14).din S. cerevisiae sau H. sapiens).Această conservare slabă a secvenței și variabilitatea structurii secundare explică de ce omologul eL14 nu a fost niciodată găsit în E. cuniculi și de ce se crede că această proteină a fost pierdută în E. cuniculi.În schimb, E. cuniculi eL14 a fost adnotat anterior ca o proteină presupusă M970_061160.Această observație sugerează că diversitatea genomului microsporidiilor este în prezent supraestimată: unele gene considerate în prezent a fi pierdute în microsporidia sunt de fapt păstrate, deși în forme foarte diferențiate;în schimb, se crede că unii codifică genele microsporidiei pentru proteine ​​specifice viermilor (de exemplu, proteina ipotetică M970_061160) codifică de fapt proteinele foarte diverse găsite în alte eucariote.
Această descoperire sugerează că denaturarea ARNr poate duce la o pierdere dramatică a conservării secvenței în proteinele ribozomale adiacente, făcând aceste proteine ​​nedetectabile pentru căutările de omologie.Astfel, putem supraestima gradul real de degradare moleculară în organisme cu genom mic, deoarece unele proteine ​​despre care se crede că s-au pierdut de fapt persistă, deși în forme foarte modificate.
Cum pot paraziții să-și păstreze funcția mașinilor lor moleculare în condiții de reducere extremă a genomului?Studiul nostru răspunde la această întrebare prin descrierea structurii moleculare complexe (ribozom) a E. cuniculi, un organism cu unul dintre cei mai mici genomi eucarioți.
Se știe de aproape două decenii că moleculele de proteine ​​și ARN din paraziții microbieni diferă adesea de moleculele lor omoloage la speciile care trăiesc liber, deoarece nu au centre de control al calității, sunt reduse la 50% din dimensiunea lor la microbii care trăiesc liber etc.multe mutații debilitante care afectează plierea și funcționarea.De exemplu, se așteaptă ca ribozomilor organismelor cu genom mic, inclusiv mulți paraziți intracelulari și endosimbioți, să le lipsească mai multe proteine ​​ribozomale și până la o treime din nucleotide ARNr, în comparație cu speciile care trăiesc liber 27, 29, 30, 49. Cu toate acestea, modul în care aceste molecule funcționează în parazit, rămâne în principal un parazit mai mare, studiat comparativ.
Studiul nostru arată că structura macromoleculelor poate dezvălui multe aspecte ale evoluției care sunt dificil de extras din studiile genomice comparative tradiționale ale paraziților intracelulari și ale altor organisme restrictive de gazdă (Figura 7 suplimentară).De exemplu, exemplul proteinei eL14 arată că putem supraestima gradul real de degradare a aparatului molecular la speciile parazite.Se crede acum că paraziții encefalitici au sute de gene specifice microsporidiei.Cu toate acestea, rezultatele noastre arată că unele dintre aceste gene aparent specifice sunt de fapt doar variante foarte diferite de gene care sunt comune la alte eucariote.Mai mult, exemplul proteinei msL2 arată cum trecem cu vederea noile proteine ​​ribozomale și subestimăm conținutul mașinilor moleculare parazitare.Exemplul moleculelor mici arată cum putem trece cu vederea cele mai ingenioase inovații în structurile moleculare parazitare care le pot oferi o nouă activitate biologică.
Luate împreună, aceste rezultate ne îmbunătățesc înțelegerea diferențelor dintre structurile moleculare ale organismelor cu restricții de gazdă și omologii lor din organismele cu viață liberă.Arătăm că mașinile moleculare, considerate mult timp a fi reduse, degenerate și supuse diferitelor mutații debilitante, au în schimb un set de caracteristici structurale neobișnuite neglijate sistematic.
Pe de altă parte, fragmentele de ARNr care nu sunt voluminoase și fragmentele fuzionate pe care le-am găsit în ribozomii E. cuniculi sugerează că reducerea genomului poate schimba chiar și acele părți ale mecanismului molecular de bază care sunt conservate în cele trei domenii ale vieții - după aproape 3,5 miliarde de ani.evoluția independentă a speciilor.
Fragmentele de ARNr fără umflături și fuzionate din ribozomii E. cuniculi prezintă un interes deosebit în lumina studiilor anterioare ale moleculelor de ARN din bacteriile endosimbiotice.De exemplu, în endosimbiontul afidă Buchnera aphidicola, s-a demonstrat că moleculele de ARNr și ARNt au structuri sensibile la temperatură datorită prejudiciului de compoziție A+T și a unei proporții mari de perechi de baze non-canonice20,50.Aceste modificări ale ARN-ului, precum și modificările moleculelor de proteine, sunt acum considerate a fi responsabile pentru dependența excesivă a endosimbioților de parteneri și incapacitatea endosimbioților de a transfera căldură 21, 23.Deși ARNr-ul microsporidiei parazitare are modificări structurale distincte, natura acestor modificări sugerează că stabilitatea termică redusă și dependența mai mare de proteinele însoțitoare pot fi caracteristici comune ale moleculelor de ARN la organismele cu genomi redusi.
Pe de altă parte, structurile noastre arată că microsporidiile parazite au dezvoltat o capacitate unică de a rezista fragmentelor de ARNr și proteine ​​​​în general conservate, dezvoltând capacitatea de a utiliza metaboliți mici abundenți și ușor disponibili ca imitații structurale ale ARNr-ului și fragmentelor de proteine ​​​​degenerate.Degradarea structurii moleculare..Această opinie este susținută de faptul că moleculele mici care compensează pierderea fragmentelor de proteine ​​din ARNr și ribozomii E. cuniculi se leagă de reziduurile specifice microsporidiilor din proteinele uL15 și eL30.Acest lucru sugerează că legarea moleculelor mici de ribozomi poate fi un produs al selecției pozitive, în care mutațiile specifice Microsporidia în proteinele ribozomale au fost selectate pentru capacitatea lor de a crește afinitatea ribozomilor pentru moleculele mici, ceea ce poate duce la organisme ribozomale mai eficiente.Descoperirea dezvăluie o inovație inteligentă în structura moleculară a paraziților microbieni și ne oferă o mai bună înțelegere a modului în care structurile moleculare ale paraziților își mențin funcția în ciuda evoluției reductive.
În prezent, identificarea acestor molecule mici rămâne neclară.Nu este clar de ce aspectul acestor molecule mici în structura ribozomală diferă între speciile de microsporidii.În special, nu este clar de ce se observă legarea nucleotidelor în ribozomii E. cuniculi și P. locustae și nu în ribozomii lui V. necatrix, în ciuda prezenței restului F170 în proteinele eL20 și K172 ale V. necatrix.Această deleție poate fi cauzată de reziduul 43 uL6 (situat în apropierea pungii de legare a nucleotidelor), care este tirozină în V. necatrix și nu treonină în E. cuniculi și P. locustae.Lanțul lateral aromatic voluminos al Tyr43 poate interfera cu legarea nucleotidelor din cauza suprapunerii sterice.Alternativ, ștergerea aparentă a nucleotidelor se poate datora rezoluției scăzute a imaginilor crio-EM, care împiedică modelarea fragmentelor ribozomale de V. necatrix.
Pe de altă parte, munca noastră sugerează că procesul de dezintegrare a genomului poate fi o forță inventiva.În special, structura ribozomului E. cuniculi sugerează că pierderea de ARNr și a fragmentelor de proteine ​​în ribozomul microsporidia creează o presiune evolutivă care promovează modificări în structura ribozomului.Aceste variante apar departe de locul activ al ribozomului și par să ajute la menținerea (sau restabilirea) ansamblului optim de ribozom care altfel ar fi perturbat de ARNr redus.Acest lucru sugerează că o inovație majoră a ribozomului microsporidia pare să fi evoluat într-o necesitate de a tampona deriva genetică.
Poate că acest lucru este cel mai bine ilustrat de legarea nucleotidelor, care nu a fost niciodată observată la alte organisme până acum.Faptul că reziduurile de legare a nucleotidelor sunt prezente în microsporidiile tipice, dar nu și în alte eucariote, sugerează că locurile de legare a nucleotidelor nu sunt doar relicve care așteaptă să dispară sau locul final pentru ca ARNr-ul să fie restaurat la forma de nucleotide individuale.În schimb, acest site pare o caracteristică utilă care ar fi putut evolua în mai multe runde de selecție pozitivă.Locurile de legare a nucleotidelor pot fi un produs secundar al selecției naturale: odată ce ES39L este degradat, microsporidiile sunt forțate să caute compensații pentru a restabili biogeneza optimă a ribozomului în absența ES39L.Deoarece această nucleotidă poate imita contactele moleculare ale nucleotidei A3186 din ES39L, molecula de nucleotidă devine un bloc de construcție al ribozomului, a cărui legare este îmbunătățită în continuare prin mutația secvenței eL30.
În ceea ce privește evoluția moleculară a paraziților intracelulari, studiul nostru arată că forțele selecției naturale darwiniene și deriva genetică a dezintegrarii genomului nu funcționează în paralel, ci oscilează.În primul rând, deriva genetică elimină caracteristicile importante ale biomoleculelor, făcând compensarea extrem de necesară.Doar atunci când paraziții vor satisface această nevoie prin selecția naturală darwiniană, macromoleculele lor vor avea șansa de a-și dezvolta trăsăturile cele mai impresionante și inovatoare.Foarte important, evoluția situsurilor de legare a nucleotidelor din ribozomul E. cuniculi sugerează că acest model de pierdere pentru câștig al evoluției moleculare nu numai că amortizează mutațiile dăunătoare, dar uneori conferă funcții complet noi macromoleculelor parazite.
Această idee este în concordanță cu teoria echilibrului în mișcare a lui Sewell Wright, care afirmă că un sistem strict de selecție naturală limitează capacitatea organismelor de a inova51,52,53.Cu toate acestea, dacă deriva genetică perturbă selecția naturală, aceste derive pot produce modificări care nu sunt în sine adaptative (sau chiar dăunătoare), dar conduc la schimbări ulterioare care oferă o capacitate mai bună sau o nouă activitate biologică.Cadrul nostru susține această idee ilustrând că același tip de mutație care reduce pliul și funcția unei biomolecule pare a fi principalul declanșator al îmbunătățirii acesteia.În conformitate cu modelul evolutiv win-win, studiul nostru arată că degradarea genomului, privită în mod tradițional ca un proces degenerativ, este, de asemenea, un motor major al inovației, uneori și poate chiar adesea permițând macromoleculelor să dobândească noi activități parazitare.le pot folosi.