Achiziția și distribuția nutrienților integrează căutarea de hrană de către insecte și trăsăturile ciclului de viață. Pentru a compensa deficiențele în nutrienți specifici în diferite etape ale vieții, insectele pot obține acești nutrienți prin hrănire suplimentară, de exemplu, hrănindu-se cu secreții de vertebrate într-un proces cunoscut sub numele de bălți. Țânțarul Anopheles arabiani pare să fie malnutrit și, prin urmare, necesită nutrienți atât pentru metabolism, cât și pentru reproducere. Scopul acestui studiu a fost de a evalua dacă agitația lui An. arabiensis pe urina de vacă pentru achiziția de nutrienți îmbunătățește caracteristicile ciclului de viață.
Asigurați-vă că este sigur. *E. arabiensis* a fost atrasă de mirosul urinei proaspete de vacă, de 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore, iar femelele care căutau gazdă și cele hrănite cu sânge (la 48 de ore după masa de sânge) au fost măsurate într-un olfactometru cu tub în Y, iar femelele gestante au fost evaluate pentru testul de depunere a icrelor. Apoi, s-a utilizat o analiză chimică și electrofiziologică combinată pentru a identifica compușii bioactivi din urina de vacă la toate cele patru clase de vârstă. Amestecurile sintetice de compuși bioactivi au fost evaluate în studii cu tub în Y și pe teren. Pentru a investiga urina de vacă și principalul său compus care conține azot, ureea, ca potențiale diete suplimentare pentru vectorii malariei, s-au măsurat parametrii de hrănire și caracteristicile ciclului de viață. Au fost evaluate proporția de țânțari femele și cantitatea de urină de vacă și uree absorbită. După hrănire, femelele au fost evaluate pentru supraviețuire, zbor legat și reproducere.
Căutați sângele și hrana gazdei. În studiile de laborator și de teren, arabii au fost atrași de mirosul natural și sintetic al urinei de vacă proaspete și învechite. Femelele gestante au fost indiferente la reacțiile urinei de vacă la locurile de depunere a icrelor. Femelele care caută gazdă și cele care sug sânge absorb în mod activ urina și ureea de vacă și alocă aceste resurse în funcție de compromisurile din ciclul de viață, în funcție de starea fiziologică pentru zbor, supraviețuire sau reproducere.
Achiziționarea și distribuția urinei de vacă de către Anopheles arabinis pentru îmbunătățirea caracteristicilor ciclului de viață. Suplimentarea cu urină de vacă afectează capacitatea vectorilor direct prin creșterea supraviețuirii zilnice și a densității vectorilor și indirect prin modificarea activității de zbor și, prin urmare, ar trebui luată în considerare în modelele viitoare.
Achiziționarea și distribuția nutrienților integrează caracteristicile insectelor legate de căutarea de hrană și de ciclul de viață [1,2,3]. Insectele sunt capabile să selecteze și să achiziționeze hrană și să efectueze hrănire compensatorie pe baza disponibilității hranei și a cerințelor nutrienților [1, 3]. Distribuția nutrienților depinde de procesul de ciclu de viață și poate duce la cerințe diferite privind calitatea și cantitatea dietei în diferite stadii de viață ale insectelor [1, 2]. Pentru a compensa deficiențele în nutrienți specifici, insectele pot obține acești nutrienți prin hrănire suplimentară, cum ar fi cu noroi, diverse excremente și secreții ale vertebratelor și hoituri, un proces cunoscut sub numele de bălți [2]. Deși o varietate de specii de fluturi și molii sunt descrise în principal, găurile de adăpare apar și la alte ordine de insecte, iar atragerea și hrănirea cu aceste tipuri de resurse pot avea efecte semnificative asupra sănătății și a altor trăsături ale ciclului de viață [2, 4, 5, 6], 7]. Țânțarul malariei Anopheles gambiae sensu lato (sl) apare ca un adult „malnutrit” [8], așa că adăparea poate juca un rol important în caracteristicile sale de ciclu de viață, dar acest comportament a avut atât de mult... a fost departe neglijată. Utilizarea agitării ca mijloc de creștere a aportului de nutrienți în acest important vehicul merită atenție, deoarece aceasta poate avea consecințe epidemiologice importante.
Aportul de azot la țânțarii Anopheles femele adulte este limitat din cauza rezervelor calorice scăzute, transportate din stadiul larvar și a utilizării ineficiente a făinii de sânge [9]. Femela Ann.gambiae sl compensează de obicei acest lucru prin suplimentarea cu făini suplimentare de sânge [10, 11], expunând astfel mai mulți oameni riscului de a contracta boala și expunând țânțarii la un risc mai mare de prădare. Alternativ, țânțarii pot folosi hrănirea suplimentară cu excremente de vertebrate pentru a dobândi compuși azotați care sporesc adaptarea și manevrabilitatea zborului, așa cum este demonstrat de alte insecte [2]. În acest sens, atracția puternică și distinctă a uneia dintre speciile surori din cadrul complexului de specii An. Gambian sl, Anopheles arabinis, prin urină de vacă proaspătă și învechită [12,13,14], este interesantă. Anopheles arabinis este oportunist în preferințele sale de gazdă și este cunoscut pentru asocierea și hrănirea cu bovine. Urina de vacă este o resursă bogată în compuși azotați, ureea reprezentând 50-95% din azotul total din urina proaspătă [15, 16]. Pe măsură ce urina de vacă îmbătrânește, microorganismele utilizează aceste resurse pentru a reduce complexitatea compușilor azotați în decurs de 24 de ore [15]. Odată cu creșterea rapidă a amoniacului, asociată cu o scădere a azotului organic, microorganismele alcalofile (multe dintre ele produc compuși toxici pentru țânțari) prosperă [15], dintre care femela de Ann. arabiensis este atrasă preferențial de urina în vârstă de 24 de ore sau mai puțin [13, 14].
În acest studiu, au fost căutați țânțari gazdă și țânțari hrăniți cu sânge. În timpul primului său ciclu de gonadotropină, țânțarii arabiensis au fost evaluați pentru achiziționarea de compuși azotați, inclusiv uree, prin amestecarea urinei. În continuare, au fost efectuate o serie de experimente pentru a evalua modul în care țânțarii femele alocă această resursă potențială de nutrienți pentru o supraviețuire, reproducere și căutare ulterioară de hrană îmbunătățite. În cele din urmă, a fost evaluat mirosul urinei de vacă proaspătă și învechită pentru a determina dacă acestea oferă indicii fiabile pentru țânțarii gazdă și țânțarii hrăniți cu sânge. În căutarea acestei potențiale resurse nutriționale, țânțarii arabiensis au descoperit corelații chimice în spatele atractivității diferențiale observate. Amestecurile de mirosuri sintetice de compuși organici volatili (COV) identificați în urina învechită de 24 de ore au fost evaluate în continuare în condiții de teren, extinzând rezultatele obținute în condiții de laborator și demonstrând efectul mirosului urinei bovine asupra diferitelor stări fiziologice. Atracția țânțarilor. Rezultatele obținute confirmă faptul că țânțarii arabiensis achiziționează și distribuie compuși azotați găsiți în urina vertebratelor pentru a influența caracteristicile ciclului de viață. Aceste rezultate sunt discutate în contextul potențialelor consecințe epidemiologice și al modului în care pot fi utilizate pentru supravegherea și controlul vectorilor.
Anopheles arabicans (tulpina Dongola) a fost menținut la 25 ± 2 °C, 65 ± 5% umiditate relativă și un ciclu lumină:întuneric de 12:12 ore. Larvele au fost crescute în tăvi de plastic (20 cm × 18 cm × 7 cm) umplute cu apă distilată și hrănite cu hrană pentru pești Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Germania). Pupele au fost colectate în cupe de 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) și apoi transferate în cuști Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) pentru a permite emergența adulților. Adulților li s-a administrat o soluție de zaharoză 10% ad libitum până la 4 zile după emergență (dpe), moment în care femelelor care căutau gazdă li s-a oferit hrană imediat înainte de experiment sau au fost înfometate peste noapte cu apă distilată înainte de experiment, așa cum este descris mai jos. Femelele utilizate pentru experimentele cu tuburi de zbor au fost înfometate doar 4-6 ore cu apă ad libitum. Pentru a pregăti țânțarii care sug sânge pentru biotestele ulterioare, 4 femele dpe au fost administrate cu sânge de oaie defibrotic (Håtunalab, Bro, SE) folosind un sistem de hrănire cu membrană (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Marea Britanie). Femelele complet congestionate au fost apoi transferate în cuști individuale și li s-a administrat hrană direct, așa cum este descris mai jos, sau zaharoză 10% ad libitum timp de 3 zile înainte de experimentele descrise mai jos. Ultimele femele au fost utilizate pentru biotestele cu tuburi de zbor și transferate în laborator, apoi au avut apă distilată ad libitum timp de 4-6 ore înainte de experiment.
Testele de hrănire au fost utilizate pentru a cuantifica consumul de urină și uree la femelele adulte An.Arab. Femelelor care căutau gazdă și celor hrănite cu sânge li s-a administrat o dietă conținând 1% urină diluată de vacă proaspătă și maturată, diferite concentrații de uree și două grupuri de control (10% zaharoză și apă) timp de 48 de ore. În plus, colorant alimentar (1 mg ml-1 cianură de xilen FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) a fost adăugat în dietă și furnizat într-o matrice de 4 × 4 în tuburi de microcentrifugă de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, SUA; Figura 1A). Umpleți până la margine (~300 µl). Pentru a evita concurența dintre țânțari și potențialele efecte ale colorantului, plasați 10 țânțari într-o placă Petri mare (12 cm în diametru și 6 cm înălțime; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) în întuneric complet la 25 ± 2 cm °C și 65 ± 5% umiditate relativă. Aceste experimente au fost repetate de 5 până la 10 ori. După expunerea la dietă, țânțarii au fost plasați la -20 °C până la analize ulterioare.
Căutați urina bovină și ureea absorbite de gazdă și de femela Anopheles arabianus, care suge sânge. În studiul de hrănire (A), țânțarilor femele li s-a administrat o dietă constând din urină de vacă proaspătă și maturată, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O). Femelele care caută gazdă (B) și cele hrănite cu sânge (C) au absorbit mai multă zaharoză decât orice altă dietă testată. Rețineți că femelele care caută gazdă au absorbit urina de vacă din 72 de ore mai puțin decât urina de vacă din 168 de ore (B). Conținutul total mediu de azot (± deviația standard) din urină este reprezentat în inserție. Femelele care caută gazdă (D, F) și cele care suge sânge (E, G) absorb ureea într-un mod dependent de doză. Volumele medii inhalate (D, E) cu nume diferite de litere au fost semnificativ diferite unele de altele (ANOVA unidirecțională folosind analiza post-hoc a lui Tukey; p < 0,05). Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei (BE). Linia punctată dreaptă reprezintă linia de regresie log-liniară. (F, G)
Pentru a elibera hrana absorbită, țânțarii au fost plasați individual în tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml conținând 230 µl de apă distilată, iar țesutul a fost dizolvat folosind un pistil de unică folosință și un motor fără fir (VWR International, Lund, SE), urmat de centrifugare la 10 krpm timp de 10 minute. Supernatantul (200 µl) a fost transferat pe o microplacă cu 96 de godeuri (Sigma-Aldrich), iar absorbanța (λ620) a fost determinată folosind un cititor de microplacă bazat pe spectrofotometru (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativ, țânțarii au fost măcinați în 1 ml de apă distilată, din care 900 µl au fost transferați într-o cuvă pentru analiză spectrofotometrică (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Pentru a cuantifica aportul alimentar, s-a preparat o curbă standard prin diluție serială pentru a obține 0,2 µl până la 2,4 µl de 1 mg ml-1 cianură de xilen. Apoi, densitatea optică a concentrațiilor cunoscute de colorant a fost utilizată pentru a determina cantitatea de hrană ingerat de fiecare țânțar.
Datele privind volumul au fost analizate utilizând analiza varianței într-o singură direcție (ANOVA), urmată de comparații post-hoc pe perechi ale lui Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA, 1989–2007). Analizele de regresie liniară au descris aportul de uree dependent de concentrație și au comparat răspunsurile dintre țânțarii care caută gazdă și cei care sug sânge (GraphPad Prism v8.0.0 pentru Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, SUA).
Aproximativ 20 µl de probe de urină de la fiecare grupă de vârstă au fost legate pe Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) și încapsulate în capsule de staniu (8 mm × 5 mm). Capsulele au fost introduse în camera de ardere a unui analizor CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) pentru a determina conținutul de azot din urina proaspătă și maturată, conform protocolului producătorului. Azotul total (g N l-1) a fost cuantificat pe baza concentrațiilor de uree cunoscute, utilizate ca standard.
Pentru a evalua efectul dietei asupra supraviețuirii femelelor care caută gazdă și sug sânge, țânțarii au fost plasați individual în vase Petri mari (12 cm în diametru și 6 cm înălțime; Semadeni) cu o gaură acoperită cu plasă în capac (3 cm în diametru) pentru ventilație și aprovizionare cu hrană. Dietele au fost administrate direct după 4 zile de expectorație și au inclus 1% urină de vacă proaspătă și maturată diluată, patru concentrații de uree și două controale, 10% zaharoză și apă. Fiecare dietă a fost pipetată pe un tampon dentar (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) introdus într-o seringă de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), pistonul a fost îndepărtat și plasat deasupra unei vase Petri (figura 1).1A). Schimbați-vă dieta în fiecare zi. Mențineți laboratorul așa cum este descris mai sus. Țânțarii supraviețuitori au fost numărați de două ori pe zi, în timp ce țânțarii morți au fost aruncați până când ultimul țânțar a murit (n = 40 per tratament). Supraviețuirea țânțarilor hrăniți cu diverse diete a fost analizată statistic folosind curbele de supraviețuire Kaplan-Meyer. și teste log-rank pentru a compara distribuția supraviețuirii între diete (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
O moară zburătoare personalizată pentru țânțari, bazată pe Attisano și colab.[17], realizată din panouri acrilice transparente cu grosimea de 5 mm (10 cm lățime x 10 cm lungime x 10 cm înălțime), fără panouri frontale și posterioare (Fig. 3: sus). Un ansamblu pivotant cu un tub vertical realizat dintr-o coloană de cromatografie gazoasă (diametru interior 0,25 mm; lungime 7,5 cm) cu capete lipite de un ac de insectă suspendat între o pereche de magneți din neodim la o distanță de 9 cm. Un tub orizontal realizat din același material (lungime 6,5 cm) bisectează tubul vertical pentru a forma un braț legat și un braț care purta o mică bucată de folie de aluminiu ca semnal de întrerupere a luminii.
Femelele înfometate timp de 24 de ore au primit dieta de mai sus timp de 30 de minute înainte de imobilizare. Țânțarii femele complet hrăniți au fost apoi anesteziați individual pe gheață timp de 2-3 minute și atașați la ace pentru insecte cu ceară de albine (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) și apoi legați de brațele tuburilor orizontale. Moara zburătoare. Rotațiile pe zbor au fost înregistrate de un înregistrator de date personalizat, apoi stocate și afișate folosind software-ul PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Moara zburătoare a fost plasată într-o cameră cu temperatură controlată (12 h:12 h, lumină: întuneric, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% UR).
Pentru a vizualiza modelul activității de zbor, distanța totală parcursă (m) și numărul total de activități de zbor consecutive au fost calculate pe oră pe o perioadă de 24 de ore. În plus, distanțele medii parcurse de femele individuale au fost comparate între tratamente și analizate utilizând ANOVA unidirecțională și analiza post-hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), unde distanța medie a fost considerată o variabilă dependentă, în timp ce tratamentul este un factor independent. În plus, numărul mediu de runde este calculat în trepte de 10 minute.
Pentru a evalua efectul dietei asupra performanței reproductive a exemplarelor de An.arabiensis, șase femele (4 dpe) au fost transferate direct în cuști Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) după recoltarea de sânge și apoi li s-a administrat dieta experimentală timp de 48 de ore, așa cum s-a descris mai sus. Dietele au fost apoi îndepărtate, iar în a treia zi s-au furnizat cupe de depunere a ouălor (30 ml; Nolato Hertila) umplute cu 20 ml de apă distilată, timp de 48 de ore, schimbându-se la fiecare 24 de ore. Fiecare regim alimentar s-a repetat de 20-50 de ori. Ouăle au fost numărate și înregistrate pentru fiecare cușcă experimentală. Subprobe de ouă au fost utilizate pentru a evalua dimensiunea medie și variația lungimii ouălor individuale (n ≥ 200 per dietă) utilizând un microscop Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) echipat cu o cameră Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Germania). Ouăle rămase au fost ținute într-o cameră cu climat controlat, în condiții standard de creștere, timp de 24 de ore, și s-a măsurat o subeșantionă de larve de stadiul I recent apărute (n ≥ 200 per dietă), așa cum s-a descris mai sus. Numărul de ouă și dimensiunea ouălor și larvelor au fost comparate între tratamente și utilizând ANOVA unidirecțională și analiza post-hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Compozițiile volatile din spațiul de cap (headspace) din urină proaspătă (1 oră după prelevare), maturată la 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore au fost colectate din probele colectate de la bovine din rasele Zebu și Arsi. Pentru comoditate, probele de urină au fost colectate dimineața devreme, în timp ce vacile se aflau încă în grajd. Probele de urină au fost colectate de la 10 indivizi, iar 100-200 ml din fiecare probă au fost transferați în pungi individuale de copt din poliamidă (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Germania) în butoaie de poliamidă de 3 l cu capac, în butoaie din plastic cu clorură de vinil. Compozițiile volatile din spațiul de cap (headspace) din fiecare probă de urină bovină au fost colectate fie direct (proaspătă), fie după maturarea la temperatura camerei timp de 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore, adică fiecare probă de urină a fost reprezentativă pentru fiecare grupă de vârstă.
Pentru colectarea substanțelor volatile din spațiul de cap (headspace), s-a utilizat un sistem cu buclă închisă pentru a circula un flux de gaz filtrat cu carbon activ (100 ml min-1) printr-o pungă de poliamidă către coloana de adsorbție timp de 2,5 ore, utilizând o pompă de vid cu diafragmă (KNF Neuberger, Freiburg, Germania). Ca și control, colectarea din spațiul de cap a fost efectuată dintr-o pungă de poliamidă goală. Coloana de adsorbție a fost realizată din tuburi de teflon (5,5 cm x 3 mm ind) conținând 35 mg de Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, SUA) între dopuri de vată de sticlă. Înainte de utilizare, coloana a fost spălată cu 1 ml de n-hexan redistilat (Merck, Darmstadt, Germania) și 1 ml de pentan (solvent pur 99,0%, grad GC, Sigma Aldrich). Substanțele volatile adsorbite au fost eluate cu 400 μl de pentan. Colecțiile din spațiul de cap au fost reunite și apoi depozitate la -20°C până la utilizarea pentru analize ulterioare.
Răspunsurile comportamentale ale țânțarilor An care caută gazdă și care se hrănesc cu sânge. Extractele volatile Headspace colectate din urină proaspătă, maturată pe 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore au fost analizate pentru extracte volatile de la țânțarii Arabidopsis utilizând un olfactometru cu tub de sticlă drept [18]. Experimentele au fost efectuate în timpul ZT 13-15, perioada de vârf a activității de căutare a gazdei de către An. Arab [19]. Un olfactometru cu tub de sticlă (80 cm × 9,5 cm id) a fost iluminat cu 3 ± 1 lx de lumină roșie de sus. Fluxul de aer filtrat cu cărbune și umidificat (25 ± 2 °C, 65 ± 2% umiditate relativă) a trecut prin biotest la 30 cm s-1. Aerul este trecut printr-o serie de site din oțel inoxidabil, creând un flux laminar și o structură uniformă a penei. Dispenser de tampoane dentare (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspendat de o bobină de 5 cm la capătul orientat spre vânt al... olfactometru, cu schimbarea stimulatorului la fiecare 5 minute. Pentru analiză, s-au folosit ca stimul 10 μl din fiecare extract din spațiul de cap, diluat 1:10. O cantitate egală de pentan a fost utilizată ca și control. Țânțarii individuali care caută gazdă sau sug sânge au fost plasați în cuști individuale de eliberare cu 2-3 ore înainte de începerea experimentului. Cușca de eliberare a fost plasată pe partea dinspre vânt a olfactometrului, iar țânțarii au fost lăsați să se aclimatizeze timp de 1 minut, apoi valva fluture a cuștii a fost deschisă pentru eliberare. Atracția față de tratament sau control a fost analizată ca proporția de țânțari care au intrat în contact cu sursa în termen de 5 minute de la eliberare. Fiecare extract volatil din spațiul de cap și control au fost replicate de cel puțin 30 de ori și, pentru a evita efectele oricărei zile, același număr de tratamente și controale a fost testat în fiecare zi experimentală. Răspunsurile de căutare de la gazdă și de la cei hrăniți cu sânge. Resp. Seturile arabice versus spațiul de cap au fost analizate folosind regresia logistică nominală, urmată de comparații perechi pentru rapoartele de șanse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Răspunsul lui An la depunerea icrelor. Extractele de urină de vacă proaspătă și maturată din spațiul de cap au fost analizate în cuști Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Substratul de depunere a icrelor a fost folosit în colțuri opuse ale cuștii, la o distanță de 24 cm. Cupele de tratament au fost ajustate cu 10 μl din fiecare extract de spațiu de cap la o diluție de 1:10. O cantitate egală de pentan a fost utilizată pentru ajustarea cupei de control. Cupele de tratament și de control au fost schimbate între fiecare experiment pentru a controla efectele de poziție. Zece femele hrănite cu sânge au fost eliberate în cuști experimentale la ZT 9-11, iar ouăle din cupe au fost numărate 24 de ore mai târziu. Formula pentru calcularea indicelui de depunere a icrelor este: (numărul de ouă depuse în cupa de tratament – ​​numărul de ouă depuse în cupa de control)/(numărul total de ouă depuse). Fiecare tratament a fost repetat de 8 ori.
Analiza cromatografică gazoasă și detecția modelului de antenă electronică (GC-EAD) a femelei de An. arabiensis a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [20]. Pe scurt, extractele volatile proaspete din spațiul de cap au fost separate utilizând un aparat Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, SUA) echipat cu o coloană HP-5 (30 m × 0,25 mm diametru interior, grosimea filmului de 0,25 μm, Agilent Technologies). și urină îmbătrânită. Hidrogenul a fost utilizat ca fază mobilă cu un debit liniar mediu de 45 cm s-1. Fiecare probă (2 μl) a fost injectată timp de 30 de secunde în mod splitless cu o temperatură de intrare de 225 °C. Temperatura cuptorului GC a fost programată de la 35 °C (menținere 3 minute) la 300 °C (menținere 10 minute) la 10 °C min-1. În divizorul de efluent GC, s-au adăugat 4 psi de azot și s-a divizat 1:1 într-un Gerstel 3D/2 low mort volume cross (Gerstel, Mülheim, DE) între detectorul de ionizare cu flacără și EAD. Capilarul efluent GC pentru EAD a fost trecut printr-o linie de transfer Gerstel ODP-2, care urmărește temperatura cuptorului GC plus 5 °C, într-un tub de sticlă (10 cm × 8 mm), unde a fost amestecat cu aer umidificat filtrat cu carbon (1,5 l min-1). Antena a fost plasată 0,5 cm de la ieșirea tubului. Fiecare țânțar individual a reprezentat o replică, iar pentru țânțarii care caută gazdă, s-au efectuat cel puțin trei replici pe probe de urină de fiecare vârstă.
Identificarea compușilor bioactivi în colecțiile de urină bovină proaspătă și maturată din spațiul de cap utilizând un spectrometru combinat GC și de masă (GC-MS; 6890 GC și 5975 MS; Agilent Technologies) pentru a obține răspunsuri antenale în analiza GC-EAD, funcționând în modul de ionizare prin impact electronic la 70 eV. GC a fost echipat cu o coloană capilară din silice topită acoperită cu UI HP-5MS (diametru interior 60 m × 0,25 mm, grosimea filmului 0,25 μm) utilizând heliu ca fază mobilă cu un debit liniar mediu de 35 cm s-1. O probă de 2 μl a fost injectată utilizând aceleași setări ale injectorului și temperatură a cuptorului ca pentru analiza GC-EAD. Compușii au fost identificați pe baza timpului de retenție (indicele Kovát) și a spectrelor de masă în comparație cu biblioteca personalizată și biblioteca NIST14 (Agilent). Compușii identificați au fost confirmați prin injectarea de standarde autentice (Fișier suplimentar 1: Tabelul S2). Pentru cuantificare, s-a utilizat acetat de heptil (10 ng, puritate chimică 99,8%, Aldrich) a fost injectat ca standard extern.
Evaluarea eficacității unui amestec de miros sintetic constând din compuși bioactivi identificați în urina proaspătă și învechită pentru a atrage Ans.arabiensis, care caută gazde și suge sânge, utilizând același olfactometru și protocol ca mai sus. Amestecurile sintetice au imitat compoziția și proporțiile compușilor din extractele volatile mixte din spațiul de vârf ale urinei proaspete, învechite la 24 de ore, 48 de ore, 72 de ore și 168 de ore (Figura 5D-G; Fișier suplimentar 1: Tabelul S2). Pentru analiză, se utilizează 10 μl dintr-o diluție 1:100 a amestecului complet sintetic, cu o rată totală de eliberare cuprinsă între aproximativ 140-2400 ng h-1, pentru a evalua atractivitatea pentru țânțarii gazdă și cei care sug sânge. Ulterior, testul se efectuează pe amestecuri complete, în care se elimină amestecurile subtractive ale compușilor individuali ai amestecului complet. Răspunsurile de căutare de la țânțarii gazdă și cei hrăniți cu sânge. Amestecurile arabe vs. sintetice și subtractive au fost analizate utilizând regresia logistică nominală, urmată de comparații perechi pentru impare. rapoarte (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Pentru a evalua dacă urina de vacă ar putea servi drept indiciu de habitat pentru țânțarii malariei, urina de vacă proaspătă și maturată, colectată așa cum s-a descris mai sus, împreună cu apa, au fost plasate în găleți cu plasă de 3 l (100 ml) și așezate în capcane momeală pentru gazde. (Versiunea BG-HDT; BioGents, Regensburg, Germania). Zece capcane au fost plasate la o distanță de 50 m pe pășune, la 400 m de comunitatea sătească (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) și fără vite, pe terenuri permanente de reproducere și în sate. Cinci capcane au fost încălzite pentru a simula prezența unei gazde, în timp ce cinci capcane au fost lăsate neîncălzite. Fiecare locație de tratament este rotită în fiecare noapte, timp de un total de cinci nopți. Numărul de țânțari capturați în capcanele cu momeală pentru urină de diferite vârste a fost comparat folosind regresia logistică cu o distribuție binomială beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Într-un sat endemic de malarie din apropierea orașului Maki, regiunea Oromia, Etiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). Studiul a fost realizat între mijlocul lunii august și mijlocul lunii septembrie, înainte de pulverizarea anuală reziduală în interior, alături de un sezon ploios lung. Pentru studiu au fost selectate cinci perechi de case (la 20-50 m distanță) situate la periferia satului (Fig. 6A). Criteriile utilizate pentru selectarea caselor au fost: nu era permis accesul animalelor în casă, nu era permis gătitul în interior (folosirea lemnelor de foc sau a cărbunelui) (cel puțin în perioada de probă) și case cu maximum doi locuitori, care dormeau în spații neinsecticide. sub plasa de țânțari tratată. Aprobarea etică a fost acordată de Comitetul de Etică a Cercetării Instituționale (IRB/022/2016) al Facultății de Științe Naturale (CNS-IRB), Universitatea Addis Abeba, în conformitate cu liniile directoare stabilite de Declarația Asociației Medicale Mondiale de la Helsinki. Consimțământul fiecărui cap de familie a fost obținut cu asistența personalului de extindere a sănătății. Întregul proces este aprobat de administrațiile locale la nivel de district și secție („kebele”). Designul experimental a urmat un design pătrat latin 2 × 2, în care amestecurile sintetice și controalele au fost atribuite caselor pereche în prima noapte și schimbate între case în următoarea noapte experimentală. Acest proces a fost repetat de zece ori. În plus, pentru a estima activitatea țânțarilor în casele selectate, capcanele CDC au fost setate să funcționeze cinci nopți consecutive la începutul, mijlocul și sfârșitul studiului pe teren, la aceeași oră a zilei.
Un amestec sintetic conținând șase compuși bioactivi a fost dizolvat în heptan (solvent 97,0% grad GC, Sigma Aldrich) și eliberat la 140 ng h-1 folosind un dozator de fitil de bumbac [20]. Dozatorul de fitil a permis eliberarea tuturor compușilor în proporții constante pe parcursul experimentului de 12 ore. Heptanul a fost utilizat ca martor. Fiola a fost suspendată lângă punctul de intrare al capcanei luminoase a Centrelor pentru Controlul și Prevenirea Bolilor (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, SUA; Figura 6A). Capcanele au fost atârnate la 0,8 – 1 m deasupra solului, lângă piciorul patului, iar un voluntar a dormit sub o plasă de țânțari netratată și a fost operat între orele 18:00 și 06:30. Țânțarii capturați în funcție de sex și stare fiziologică (nehrăniți, hrăniți, semi-gestați și gestanți [21]) au fost ulterior analizați folosind analiza reacției în lanț a polimerazei (PCR) pentru a identifica speciile identificate morfologic ca A. gambiae sl. Membrii complexului [23]. În În studiul de teren, capcanele pentru casele perechi au fost analizate utilizând un model de ajustare logistică nominală, unde atracția a fost variabila dependentă, iar tratamentul (amestec sintetic vs. control) a fost efectul fix (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Aici, raportăm valorile χ2 și p din testul raportului de probabilitate.
Evaluați dacă este sigur. *E. arabiensis* a reușit să obțină urină, principala sa sursă de azot, ureea, prin hrănire directă, în termen de 48 de ore de la administrare, timp de 4 zile după (dpe), studiile de hrănire cu femele care caută gazdă și cu sânge (Fig. 1A). Atât femelele care caută gazdă, cât și cele care sug sânge au absorbit semnificativ mai multă zaharoză decât orice altă dietă sau apă (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 și F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respectiv; Fig. 1B,C). În plus, femelele care caută gazdă au mâncat mai puțin în urină la 72 de ore comparativ cu urina la 168 de ore (Fig. 1B). Când li s-a oferit o dietă care conține uree, femelele care caută gazdă au absorbit o cantitate semnificativ mai mare de uree la 2,69 mM comparativ cu toate celelalte concentrații și apă, deși imposibil de distins de zaharoza 10%. (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Acest lucru a fost în contrast cu răspunsul femelelor hrănite cu sânge, care de obicei au absorbit diete care conțin uree semnificativ mai mult decât apă, deși semnificativ mai puțin de 10% zaharoză (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1).1E). În plus, atunci când s-a comparat între cele două stări fiziologice, femelele flebotomizate au absorbit mai multă uree decât femelele care caută gazdă la cele mai mici concentrații, iar aceste femele au absorbit cantități similare de uree la concentrații mai mari (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). În timp ce aportul dintr-o dietă care conține uree părea să aibă valori optime (Fig. 1D, E), femelele în ambele stări fiziologice au fost capabile să moduleze cantitatea de uree absorbită pe întregul interval de concentrații de uree într-o manieră log-liniară (Fig. 1F,G). În mod similar, se pare că țânțarii își controlează absorbția de azot prin reglarea cantității de urină absorbită, deoarece cantitatea de azot din urină se reflectă în cantitatea absorbită (Figura 1B, inserțiile C și B).
Pentru a evalua efectele urinei și ureei asupra supraviețuirii țânțarilor care caută gazdă și cei care sug sânge, femelelor li s-au administrat urină de toate cele patru vârste (proaspătă, la 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore după depunere), iar o gamă de concentrații de uree, precum și apă distilată și zaharoză 10% au servit drept control (Figura 2A). Această analiză a supraviețuirii a arătat că dieta a avut un efect semnificativ asupra supraviețuirii generale la femelele care caută gazdă (urină: χ2 = 108,5, dl = 5, p < 0,0001; uree: χ2 = 122,8, dl = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) și la femelele hrănite cu sânge (urină: χ2 = 93,0, dl = 5, p < 0,0001; uree: χ2 = 137,9, dl = 5, p < 0,0001; Figura 2D,E). În toate experimentele, femelele hrănite cu o dietă de urină, uree și apă au avut rate de supraviețuire semnificativ mai mici în comparație cu femelele hrănite cu o dietă de zaharoză (Figura 2B-E). Femelele care caută gazdă și care au primit urină proaspătă și veche au prezentat rate de supraviețuire diferite, cele hrănite cu urină veche de 72 de ore (p = 0,016) având cea mai mică probabilitate de supraviețuire (Fig. 2B). În plus, femelele care caută gazdă și care au primit urină veche de 72 de ore au supraviețuit mai mult decât grupul de control cu ​​apă (p < 0,04) (Fig. 2C). Comparativ cu apa, femeile hrănite cu urină proaspătă și urină de 24 de ore au supraviețuit mai mult (p = 0,001 și respectiv p = 0,012; Figura 2D), în timp ce femeile hrănite cu urină de 72 de ore au supraviețuit mai mult decât cele hrănite cu urină proaspătă scurtă de femele și urină veche de 24 de ore (p < 0,0001 și respectiv p = 0,013; Figura 2D). Când au fost hrănite cu 135 mM uree, femelele hrănite cu sânge au supraviețuit mai mult decât toate celelalte concentrații de uree și apă (p < 0,013; Figura 2E).
Supraviețuirea femelelor de Anopheles arabinis, gazdă și hematopoietă, care se hrănesc cu urină de vacă și uree. În biotestul (A), femelelor de țânțari li s-a administrat o dietă constând din urină de vacă proaspătă și maturată, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O). Supraviețuirea țânțarilor care caută gazdă (B, C) și hematopoieți (D, E) a fost înregistrată la fiecare 12 ore până când toate femelele hrănite cu urină (B, D) și uree (C, E), iar grupul de control, zaharoză și apă, sunt moarte.
Distanța totală și numărul de runde determinate în testul morii de zbor pe o perioadă de 24 de ore au diferit între țânțarii care caută gazdă și cei care sug sânge, care au prezentat în general o activitate de zbor mai mică (Fig. 3). Țânțarii care caută gazdă și care au furnizat urină proaspătă și maturată sau zaharoză și apă au prezentat modele distincte de zbor (Fig. 3), femelele care s-au hrănit cu urină proaspătă fiind mai active în zori, în timp ce cele hrănite cu urină de 24 și 168 de ore. Țânțarii care s-au hrănit cu urină au prezentat modele de zbor diferite și au fost în principal diurni. Țânțarii femele care au furnizat zaharoză sau urină de 72 de ore au prezentat activitate pe parcursul perioadei de 24 de ore, în timp ce femelele care au furnizat apă au fost mai active la mijlocul perioadei. Țânțarii hrăniți cu zaharoză au prezentat cele mai ridicate niveluri de activitate noaptea târziu și dimineața devreme, în timp ce cei care au ingerat urină de 72 de ore au înregistrat o scădere constantă a activității pe parcursul a 24 de ore (Figura 3).
Performanța de zbor a femelelor de Anopheles arabinis, care caută gazde și sug sânge, și care se hrănesc cu urină de vacă și uree. În testul cu moara de zbor, femelele de țânțari s-au hrănit cu urină de vacă proaspătă și maturată, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O) au fost legate de brațe orizontale, care se rotesc liber (sus). Pentru femelele care caută gazde (stânga) și cele care sug sânge (dreapta), au fost înregistrate distanța totală și numărul de zboruri pe oră pentru fiecare dietă pe o perioadă de 24 de ore (întunecat: gri; deschis: alb). Distanța medie și numărul mediu de atacuri sunt afișate în dreapta graficului activității circadiene. Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei. Analiza statistică, vezi textul.
În general, activitatea generală de zbor a femelelor care caută gazdă a urmat un model similar cu cel al distanței de zbor pe o perioadă de 24 de ore. Distanța medie de zbor a fost afectată semnificativ de dieta ingerată (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), iar femelele care caută gazdă și care au ingerat 72 de ore de urină au zburat distanțe semnificativ mai lungi în comparație cu toate celelalte diete (p < 0,0001), iar țânțarii hrăniți cu zaharoză au zburat mai mult decât țânțarii proaspeți (p = 0,022) și cei hrăniți cu urină maturată pe 24 de ore (p = 0,022). Spre deosebire de modelul de activitate de zbor descris de dieta cu urină, femelele care caută gazdă și care au hrănit cu uree au prezentat o activitate de zbor persistentă pe o perioadă de 24 de ore, atingând vârful în a doua jumătate a fazei întunecate (Fig. 3). Deși modelele de activitate au fost similare, femelele care caută gazdă și care au hrănit cu uree au crescut semnificativ distanța medie de zbor în funcție de concentrația absorbită (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Femelele care căutau gazdă, hrănite cu orice concentrație de uree, au zburat mai mult decât femelele hrănite fie cu apă, fie cu zaharoză (p < 0,03).
Activitatea generală de zbor a țânțarilor hrăniți cu sânge a fost stabilă și menținută pe parcursul a 24 de ore în toate dietele, cu o activitate urinară crescută în a doua jumătate a perioadei de întuneric atât pentru femelele hrănite cu apă, cât și pentru femelele hrănite proaspăt și la vârsta de 24 de ore (imaginea 3). În timp ce dieta cu urină a afectat semnificativ distanța medie de zbor la femelele hrănite cu sânge (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), dieta cu uree nu a făcut-o (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) în comparație cu altă urină și dieta de control (proaspătă, p = 0,0091; 72 de ore, p = 0,0022; 168 de ore, p = 0,001; zaharoză, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Efectele hrănirii cu urină și uree asupra parametrilor reproductivi au fost evaluate în bioteste de depunere a ouălor (Figura 4A) și au fost investigate în funcție de numărul de ouă depuse de fiecare femelă, dimensiunea ouălor și larvele din primul stadiu larvar nou eclozate. Numărul de ouă depuse. Femelele arabe hrănite cu urină au variat în funcție de dietă (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Femelele hrănite cu o făină de sânge și urină din 24 de ore au depus semnificativ mai multe ouă decât femelele hrănite cu alte diete cu urină și au fost similare cu cele hrănite cu zaharoză (Fig. 4B). De asemenea, dimensiunea ouălor depuse de femelele hrănite cu urină a variat în funcție de dietă (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), femelele hrănite cu urină din 24 de ore și zaharoză depunând ouă semnificativ mai mari decât femelele hrănite cu apă, în timp ce ouăle femelelor hrănite cu urină din 168 de ore au fost semnificativ mai mici (Fig. 4C). În plus, dieta cu urină a afectat semnificativ dimensiunea larvelor (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), larvele semnificativ mai mari ieșind din ouăle depuse de femele hrănite cu urină în vârstă de 24 și 72 de ore decât din ouăle depuse de larve. Femele hrănite cu apă și femele hrănite cu urină în vârstă de 168 de ore (Figura 4D).
Performanța reproductivă a femelelor de Anopheles arabinis care se hrănesc cu urină de vacă și uree. Femelele de țânțari hrănite cu sânge au fost hrănite cu diete constând din urină de vacă proaspătă și maturată, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O) timp de 48 de ore înainte de a fi plasate în bioteste și de a obține substraturi pentru depunerea ouălor timp de 48 de ore (A). Numărul de ouă (B, E), dimensiunea ouălor (C, F) și dimensiunea larvelor (D, G) au fost afectate semnificativ de dieta furnizată (urină de vacă: BD; uree: EG). Mediile pentru fiecare parametru măsurat folosind nume de litere diferite au fost semnificativ diferite unele de altele (ANOVA unidirecțională folosind analiza post-hoc a lui Tukey; p < 0,05). Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei.
Fiind principala componentă azotată a urinei, ureea, atunci când a fost administrată ca dietă femelelor hrănite cu sânge, a afectat semnificativ parametrii reproductivi în toate studiile. Numărul de ouă depuse de femelele hrănite cu uree, după o masă cu sânge, în funcție de concentrația de uree (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), femelele hrănite cu concentrații de uree între 134 µM și 1,34 mM au depus mai multe ouă (Figura 4E). Femelele hrănite cu concentrații de uree de 134 µM sau mai mari au depus ouă mai mari decât femelele hrănite cu apă (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F), iar dimensiunea larvelor, deși afectată de concentrații similare de uree la mame (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), a fost mai variabilă (Fig. 4G).
Atracția generală față de extractele volatile din spațiul de cap din urină bovină care caută gazdă. Specia arabiensis evaluată în olfactometrul cu tub de sticlă (Fig. 5A) a fost afectată semnificativ de vârsta urinei (χ2 = 15,9, dl = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). Analiza post-hoc a arătat că mirosul de urină stătută la 24 de ore a cauzat niveluri semnificativ mai mari de atractivitate în comparație cu toate celelalte tratamente (72 de ore: p = 0,0060, 168 de ore: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), cu excepția mirosului de urină proaspătă (p = 0,13; Figura 5B). Deși atracția generală a țânțarilor care sug sânge față de mirosul de urină nu a fost semnificativ diferită (χ2 = 8,78, dl = 4, p = 0,067; Fig. 5C), s-a constatat că aceste femele sunt semnificativ mai atractive față de extractele volatile din spațiul de cap în comparație cu urina învechită la 72 de ore în comparație cu grupul de control (p = 0,0066; Figura 5C).
Răspunsuri comportamentale la mirosurile naturale și sintetice de urină de vacă în căutarea gazdei și a țânțarilor hrăniți cu sânge Anopheles arabianus. Schema olfactometrului cu tub de sticlă (A). Atracția extractelor volatile din spațiul de cap din urină de vacă proaspătă și maturată către țânțarii gazdă (B) și cei care sug sânge (C). Găsiți reacția tentaculară a lui Lord An. Sunt prezentate extracte din spațiul de cap izolate din urină de vacă proaspătă (D), maturată pe 24 de ore (E), 72 de ore (F) și 168 de ore (G). Urmele de detectare a antenei electronice (EAD) arată modificări de tensiune ca răspuns la compușii bioactivi din spațiul de cap eluați din cromatograful de gaze și detectați de un detector de ionizare cu flacără (FID). Bara de scală reprezintă amplitudinea răspunsului (mV) în funcție de timpul de retenție (s). Sunt prezentate proprietățile și ratele de eliberare (µg h-1) ale compușilor biologic activi. Un singur asterisc (*) indică un răspuns constant de amplitudine mică. Asteriscurile duble (**) indică răspunsuri nereproductibile. Găsiți gazda (H) și An. arabiensis, care supt sânge (I), are o aromă diferită față de amestecurile sintetice de mirosuri de urină de vacă proaspătă și învechită. Proporțiile medii de țânțari atrași de nume de litere diferite au fost semnificativ diferite unele de altele (ANOVA unidirecțională folosind analiza post-hoc a lui Tukey; p < 0,05). Barele de eroare reprezintă eroarea standard a scalei
La femela Ann.arabiensis, la 72 h și 120 h după masa de sânge, în timpul depunerii icrelor, nu s-a demonstrat nicio preferință pentru extractele volatile din urină de vacă proaspătă și maturată, comparativ cu grupul de control cu ​​pentan (χ2 = 3,07, p > 0,05; Fișier suplimentar 1: Fig. S1).
Pentru femelele de Ann. arabiensis, analizele GC-EAD și GC-MS au identificat opt, șase, trei și trei compuși bioactivi (Figura 5D-G). Deși s-au observat diferențe în numărul de compuși care au provocat răspunsuri electrofiziologice, majoritatea acestor compuși au fost prezenți în fiecare extract volatil din spațiul de cap colectat din urină proaspătă și maturată. Prin urmare, pentru fiecare extract, doar compușii care au produs un răspuns fiziologic din antenele femele peste prag au fost incluși în analizele ulterioare.
Rata totală de eliberare volatilă a compușilor bioactivi în colectarea din spațiul de cap a crescut de la 29 µg h-1 în urina proaspătă la 242 µg h-1 în urina maturată pe 168 de ore, în principal datorită creșterii concentrațiilor de p-crezol și m-formaldehidă. Fenolul, precum și fenolul, au scăzut odată cu creșterea vârstei urinei, ceea ce s-a corelat cu scăderea observată a intensității semnalului (abundenței) în cromatogramă (Fig. 5D)-G panoul din stânga) și cu răspunsurile fiziologice la acești compuși (Fig. 5D-G panoul din dreapta).
În general, amestecul sintetic a avut un raport natural similar de compuși bioactivi identificați în extractele volatile din spațiile de vârf ale urinei proaspete și învechite (Fig. 5D-G) și nu a părut să provoace un interes semnificativ în căutarea unei gazde (χ2 = 8,15, dl = 4, p = 0,083; Fig. 5H) sau a țânțarilor care sug sânge (χ2 = 4,91, dl = 4, p = 0,30; Fig. 5I). Cu toate acestea, comparațiile post-hoc perechi între tratamente au arătat că țânțarii care căută gazdă au fost semnificativ atractivi pentru amestecul sintetic de urină învechită pe 24 de ore, comparativ cu lotul de control cu ​​pentan (p = 0,0086; Figura 5H).
Pentru a evalua rolul componentelor individuale în amestecurile sintetice de urină maturată pe 24 de ore, șase amestecuri subtractive au fost evaluate față de amestecuri complete în testul cu tub Y, în care compușii individuali au fost eliminați. Pentru țânțarii care caută gazdă, scăderea compușilor individuali din amestecul complet a avut un efect semnificativ asupra răspunsurilor comportamentale (χ2 = 19,63, dl = 6, p = 0,0032; Fișier suplimentar 1: Figura S2A), toate amestecurile subtractive au fost mai mici decât cele complet amestecate. În schimb, eliminarea compușilor individuali din amestecul complet sintetic nu a afectat răspunsurile comportamentale ale țânțarilor care sug sânge (χ2 = 11,38, dl = 6, p = 0,077), cu excepția decanalului, care a dus la niveluri mai scăzute în comparație cu amestecul complet Attraction (p = 0,022; Fișier suplimentar 1: Figura S2B).
Într-un sat endemic de malarie din Etiopia, eficacitatea unui amestec sintetic de urină de vacă de 24 de ore în atragerea țânțarilor în condiții de teren a fost evaluată timp de zece nopți (Fig. 6A). Un total de 4.861 de țânțari au fost capturați și identificați, dintre care 45,7% au fost Anthropus.gambiae sl, 18,9% au fost Anopheles pharoensis și 35,4% au fost Culex spp. (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Anopheles arabinis este singurul membru al complexului de specii An.Gambian identificat prin analiza PCR. În medie, au fost capturați 320 de țânțari pe noapte, timp în care capcanele cu momeli sintetice au prins mai mulți țânțari decât capcanele pereche fără amestec (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Capcane fără momeală au fost amplasate în fiecare dintre cele cinci nopți de control la începutul, mijlocul și sfârșitul studiului. Un număr similar de țânțari a fost capturat în fiecare pereche de... capcane, indicând lipsa unei diferențe între case (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) și nicio scădere a populației în timpul perioadei de studiu. Comparativ cu capcanele de control, numărul de țânțari prinși în capcanele care conțineau amestecul sintetic a fost semnificativ crescut: căutarea gazdei (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), hrănire recentă cu sânge (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) și sarcină (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Acest lucru se reflectă și în numărul total de țânțari capturați: căutarea gazdei > suptă sânge > gestantă > semi-gestantă > mascul.
Evaluarea pe teren a eficacității unui amestec sintetic de urină de vacă cu miros de 24 de ore. Studiile pe teren au fost efectuate în centrul-sud al Etiopiei (hartă), în apropierea orașului Maki (inserați), utilizând o capcană luminoasă a Centrelor pentru Controlul și Prevenirea Bolilor (CDC) (dreapta) în case pereche, cu un design pătrat latin (imagine aeriană) (A). Fotocapcanele CDC sintetice cu momeală odorizantă atrag și capturează femele de Anopheles arabesques (B), dar nu și Anopheles farroes (C), într-un mod diferit, un efect dependent de starea fiziologică. În plus, aceste capcane au capturat un număr semnificativ crescut de țânțari gazdă Culex. (D) Comparativ cu controlul. Barele din stânga reprezintă indicele mediu de selecție al țânțarilor prinși în perechi de momeală odorizantă (verde) și capcane de control (deschise) (N = 10), în timp ce barele din dreapta reprezintă indicele mediu de selecție în perechi de capcane de control (deschise; N = 5). Asteriscurile indică niveluri de semnificație statistică (*p = 0,01 și ***p < 0,0001)
Cele trei specii au fost capturate diferit în capcane care conțineau amestecuri sintetice. În timpul căutării gazdei (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), al hrănirii cu sânge (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) și al gestației (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), o specie de .arabiensis a fost prinsă în capcană, eliberând amestecul sintetic (Fig. 6B), în timp ce cantitatea de An nu a diferit. S-au găsit specii de Pharoensis în diferite stări fiziologice (Fig. 6C). În cazul Culex, s-a constatat doar o creștere semnificativă a numărului de țânțari care căutau gazde în capcanele cu momeală din amestecul sintetic (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), comparativ cu capcanele de control.
Capcane momeală pentru gazde, amplasate în afara gazdelor potențiale, între locurile de reproducere și comunitățile rurale din Etiopia, au fost utilizate pentru a evalua dacă țânțarii malariei folosesc mirosul de urină de vacă ca indiciu al habitatului gazdă. În absența indiciilor gazdei, a căldurii și cu sau fără prezența mirosului de urină de vacă, nu au fost capturați țânțari (Fișier suplimentar 1: Figura S3). Cu toate acestea, în prezența temperaturilor ridicate și a mirosului de urină de vacă, femelele de țânțari malariei au fost atrase și capturate, deși în număr mic, independent de vârsta urinei (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Fișier suplimentar 1: Figura S3). În schimb, loturile de control cu ​​apă nu au capturat țânțari malariei la temperaturi ridicate (Fișier suplimentar 1: Figura S3).
Țânțarii malariei dobândesc și distribuie compuși care conțin azot prin hrănire compensatorie cu urină de vacă (adică bălți) pentru a îmbunătăți trăsăturile ciclului de viață, similar altor insecte [2, 4, 24, 25, 26]. Urina de vacă este o resursă regenerabilă ușor disponibilă, strâns asociată cu locurile de odihnă pentru vectorii malariei, cum ar fi grajdurile și vegetația înaltă din apropierea caselor rurale și a locurilor de depunere a icrelor. Țânțarii femele localizează această resursă prin miros și sunt capabili să regleze absorbția compușilor azotați din urină, inclusiv ureea, principala componentă azotată din urină [15, 16]. În funcție de starea fiziologică a țânțarului femelă, nutrienții din urină sunt alocați pentru a spori activitatea de zbor și supraviețuirea țânțarilor femele care caută gazdă, precum și caracteristicile de supraviețuire și reproducere ale indivizilor hrăniți cu sânge în timpul primului ciclu gonadotrop. Prin urmare, amestecarea urinei joacă un rol nutrițional important pentru vectorii malariei care sunt închiși, la fel ca adulții malnutriți [8], deoarece oferă țânțarilor femele capacitatea de a dobândi compuși azotați importanți prin hrănirea cu risc scăzut. Această constatare are consecințe epidemiologice semnificative, deoarece femelele își cresc... speranța de viață, activitatea și capacitatea reproductivă, toate acestea afectând capacitatea vectorilor. În plus, acest comportament ar putea fi ținta viitoarelor programe de gestionare a vectorilor.