Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Recent, a fost dezvoltată o platformă antimicrobiană fără substanțe chimice, bazată pe nanotehnologie, utilizând nanostructuri artificiale de apă (EWNS). EWNS au o sarcină superficială ridicată și sunt saturate cu specii reactive de oxigen (ROS) care pot interacționa cu și inactiva o serie de microorganisme, inclusiv agenți patogeni transmiși prin alimente. Aici se demonstrează că proprietățile lor în timpul sintezei pot fi ajustate fin și optimizate pentru a le spori și mai mult potențialul antibacterian. Platforma de laborator EWNS a fost concepută pentru a ajusta fin proprietățile EWNS prin modificarea parametrilor de sinteză. Caracterizarea proprietăților EWNS (sarcina, dimensiunea și conținutul de ROS) utilizând metode analitice moderne. În plus, acestea au fost evaluate pentru potențialul lor de inactivare microbiană împotriva microorganismelor transmise prin alimente, cum ar fi Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum și Saccharomyces cerevisiae. Rezultatele prezentate aici demonstrează că proprietățile EWNS pot fi ajustate fin în timpul sintezei, rezultând o creștere exponențială a eficienței inactivării. În special, sarcina superficială a crescut cu un factor de patru, iar speciile reactive de oxigen au crescut. Rata de eliminare microbiană a fost dependentă de microbi și a variat de la 1,0 la 3,8 log după o expunere de 45 de minute la o doză de aerosol de 40.000 #/cc EWNS.
Contaminarea microbiană este principala cauză a bolilor transmise prin alimente, cauzate de ingerarea de agenți patogeni sau a toxinelor acestora. Numai în Statele Unite, bolile transmise prin alimente cauzează aproximativ 76 de milioane de boli, 325.000 de internări în spital și 5.000 de decese în fiecare an1. În plus, Departamentul Agriculturii al Statelor Unite (USDA) estimează că creșterea consumului de produse proaspete este responsabilă pentru 48% din totalul bolilor transmise prin alimente raportate în Statele Unite2. Costul bolilor și al deceselor cauzate de agenți patogeni transmisi prin alimente în Statele Unite este foarte mare, estimat de Centrele pentru Controlul și Prevenirea Bolilor (CDC) la peste 15,6 miliarde de dolari americani pe an3.
În prezent, intervențiile antimicrobiene chimice4, radiative5 și termice6 pentru a asigura siguranța alimentară se efectuează în mare parte la puncte critice de control (CCP) limitate de-a lungul lanțului de producție (de obicei după recoltare și/sau în timpul ambalării), mai degrabă decât continuu. Prin urmare, acestea sunt predispuse la contaminare încrucișată. 7. Un control mai bun al bolilor transmise prin alimente și al alterării alimentelor necesită intervenții antimicrobiene care pot fi aplicate pe tot parcursul continuumului de la fermă la consumator, reducând în același timp impactul asupra mediului și costurile.
Recent, a fost dezvoltată o platformă antimicrobiană fără substanțe chimice, bazată pe nanotehnologie, care poate inactiva bacteriile de suprafață și cele din aer folosind nanostructuri artificiale de apă (EWNS). EWNS a fost sintetizat folosind două procese paralele, electropulverizare și ionizare a apei (Fig. 1a). Studiile anterioare au arătat că EWNS au un set unic de proprietăți fizice și biologice8,9,10. EWNS au o medie de 10 electroni per structură și o dimensiune medie la scară nanometrică de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. În plus, rezonanța de spin electronic (ESR) a arătat că EWNS conține o cantitate mare de specii reactive de oxigen (ROS), în principal radicali hidroxil (OH•) și superoxid (O2-) (Fig. 1c)8. EVNS se află în aer pentru o perioadă lungă de timp și se pot ciocni cu microorganismele suspendate în aer și prezente la suprafață, livrând sarcina lor ROS și provocând inactivarea microorganismelor (Fig. 1d). Aceste studii timpurii au arătat, de asemenea, că EWNS pot interacționa cu și pot inactiva diverse bacterii gram-negative și gram-pozitive, inclusiv micobacterii, pe suprafețe și în aer. Microscopia electronică de transmisie a arătat că inactivarea a fost cauzată de perturbarea membranei celulare. În plus, studiile privind inhalarea acută au arătat că dozele mari de EWNS nu provoacă leziuni pulmonare sau inflamații 8.
(a) Electropulverizarea are loc atunci când se aplică o tensiune înaltă între un tub capilar care conține lichid și un contraelectrod. (b) Aplicarea unei presiuni înalte are ca rezultat două fenomene diferite: (i) electropulverizarea apei și (ii) formarea de specii reactive de oxigen (ioni) prinse în EWNS. (c) Structura unică a EWNS. (d) Datorită naturii lor nanoscalare, EWNS sunt foarte mobile și pot interacționa cu agenții patogeni din aer.
Capacitatea platformei antimicrobiene EWNS de a inactiva microorganismele transmise prin alimente de la suprafața alimentelor proaspete a fost, de asemenea, demonstrată recent. De asemenea, s-a demonstrat că sarcina superficială a EWNS în combinație cu un câmp electric poate fi utilizată pentru a obține o livrare țintită. Mai mult, rezultatele preliminare pentru roșiile organice după o expunere de 90 de minute la un EWNS de aproximativ 50.000 #/cm3 au fost încurajatoare, observându-se diverse microorganisme transmise prin alimente, cum ar fi E. coli și Listeria 11. În plus, testele organoleptice preliminare nu au arătat efecte senzoriale în comparație cu roșiile de control. Deși aceste rezultate inițiale de inactivare sunt încurajatoare pentru aplicațiile de siguranță alimentară chiar și la doze foarte mici de EWNS de 50.000 #/cm3, este clar că un potențial de inactivare mai mare ar fi mai benefic pentru a reduce în continuare riscul de infecție și alterare.
Aici, ne vom concentra cercetarea pe dezvoltarea unei platforme de generare EWNS pentru a permite reglarea fină a parametrilor de sinteză și optimizarea proprietăților fizico-chimice ale EWNS pentru a le spori potențialul antibacterian. În special, optimizarea s-a concentrat pe creșterea sarcinii lor superficiale (pentru a îmbunătăți livrarea țintită) și a conținutului de ROS (pentru a îmbunătăți eficiența inactivării). Caracterizarea proprietăților fizico-chimice optimizate (dimensiune, sarcină și conținut de ROS) folosind metode analitice moderne și utilizarea microorganismelor alimentare comune, cum ar fi E. .
EVNS a fost sintetizat prin electropulverizare și ionizare simultană a apei de înaltă puritate (18 MΩ cm–1). Nebulizatorul electric 12 este utilizat de obicei pentru atomizarea lichidelor și sinteza particulelor polimerice și ceramice 13 și a fibrelor 14 de dimensiuni controlate.
Așa cum s-a detaliat în publicațiile anterioare 8, 9, 10, 11, într-un experiment tipic, s-a aplicat o tensiune înaltă între un capilar metalic și un contraelectrod legat la masă. În timpul acestui proces, au loc două fenomene diferite: i) electropulverizare și ii) ionizarea apei. Un câmp electric puternic între cei doi electrozi determină acumularea de sarcini negative la suprafața apei condensate, rezultând formarea de conuri Taylor. Drept urmare, se formează picături de apă puternic încărcate, care continuă să se descompună în particule mai mici, ca în teoria Rayleigh16. În același timp, câmpurile electrice puternice determină divizarea și îndepărtarea electronilor (ionizarea) unor molecule de apă, ceea ce duce la formarea unei cantități mari de specii reactive de oxigen (ROS)17. ROS18 generat simultan a fost încapsulat în EWNS (Fig. 1c).
În figura 2a este prezentat sistemul de generare EWNS dezvoltat și utilizat în sinteza EWNS din acest studiu. Apa purificată stocată într-o sticlă închisă a fost introdusă printr-un tub de teflon (diametru interior de 2 mm) într-un ac din oțel inoxidabil de 30G (capilar metalic). Debitul de apă este controlat de presiunea aerului din interiorul sticlei, așa cum se arată în Figura 2b. Acul este montat pe o consolă de teflon și poate fi reglat manual la o anumită distanță față de contraelectrod. Contraelectrodul este un disc de aluminiu lustruit cu o gaură în centru pentru prelevare de probe. Sub contraelectrod se află o pâlnie de prelevare de probe din aluminiu, care este conectată la restul configurației experimentale printr-un orificiu de prelevare de probe (Fig. 2b). Pentru a evita acumularea de sarcină care ar putea perturba funcționarea prelevatorului de probe, toate componentele prelevatorului de probe sunt legate la împământare electric.
(a) Sistem de generare a nanostructurilor de apă proiectate (EWNS). (b) Secțiune transversală a prelevătorului și a electropulverizării, prezentând cei mai importanți parametri. (c) Configurație experimentală pentru inactivarea bacteriilor.
Sistemul de generare EWNS descris mai sus este capabil să modifice parametrii cheie de funcționare pentru a facilita reglarea fină a proprietăților EWNS. Ajustați tensiunea aplicată (V), distanța dintre ac și contraelectrod (L) și debitul de apă (φ) prin capilar pentru a regla fin caracteristicile EWNS. Simbol utilizat pentru a reprezenta diferite combinații: [V (kV), L (cm)]. Ajustați debitul de apă pentru a obține un con Taylor stabil cu un anumit set [V, L]. În scopul acestui studiu, diametrul aperturii contraelectrodului (D) a fost menținut la 0,5 inci (1,29 cm).
Din cauza geometriei limitate și a asimetriei, intensitatea câmpului electric nu poate fi calculată din principii fundamentale. În schimb, s-a utilizat software-ul QuickField™ (Svendborg, Danemarca)19 pentru calcularea câmpului electric. Câmpul electric nu este uniform, așadar valoarea câmpului electric la vârful capilarului a fost utilizată ca valoare de referință pentru diverse configurații.
În timpul studiului, au fost evaluate mai multe combinații de tensiune și distanță dintre ac și contraelectrod în ceea ce privește formarea conului Taylor, stabilitatea conului Taylor, stabilitatea producției EWNS și reproductibilitatea. Diverse combinații sunt prezentate în tabelul suplimentar S1.
Rezultatul sistemului de generare EWNS a fost conectat direct la un analizor de dimensiune a particulelor cu mobilitate prin scanare (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) pentru măsurarea concentrației numerice a particulelor, precum și la un electrometru Faraday pentru aerosoli (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). ) pentru curenții de aerosoli a fost măsurată așa cum este descris în publicația noastră anterioară. Atât SMPS, cât și electrometrul de aerosoli au prelevat eșantion la un debit de 0,5 L/min (debit total al eșantionului 1 L/min). Concentrația numerică a particulelor și debitul de aerosoli au fost măsurate timp de 120 de secunde. Măsurarea se repetă de 30 de ori. Pe baza măsurătorilor de curent, se calculează încărcătura totală de aerosoli și se estimează încărcătura medie EWNS pentru un număr total dat de particule EWNS selectate. Costul mediu al EWNS poate fi calculat folosind ecuația (1):
unde IEl este curentul măsurat, NSMPS este concentrația digitală măsurată cu SMPS, iar φEl este debitul per electrometru.
Deoarece umiditatea relativă (UR) afectează sarcina superficială, temperatura și (UR) au fost menținute constante în timpul experimentului la 21°C și, respectiv, 45%.
Microscopia cu forță atomică (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) și sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Japonia) au fost utilizate pentru a măsura dimensiunea și durata de viață a EWNS. Frecvența de scanare AFM a fost de 1 Hz, zona de scanare a fost de 5 μm × 5 μm și 256 de linii de scanare. Toate imaginile au fost supuse unei alinieri de ordinul 1 a imaginilor folosind software-ul Asylum (intervalul măștii 100 nm, pragul 100 pm).
Pâlnia de testare a fost îndepărtată, iar suprafața de mică a fost plasată la o distanță de 2,0 cm de contraelectrod pentru un timp de mediere de 120 s pentru a evita aglomerarea particulelor și formarea de picături neregulate pe suprafața micei. EWNS a fost pulverizat direct pe suprafața micei proaspăt tăiate (Ted Pella, Redding, CA). Imagine a suprafeței micii imediat după pulverizarea AFM. Unghiul de contact al suprafeței micei nemodificate proaspăt tăiate este aproape de 0°, astfel încât EVNS este distribuit pe suprafața micei sub forma unei cupole. Diametrul (a) și înălțimea (h) picăturilor difuzante au fost măsurate direct din topografia AFM și utilizate pentru a calcula volumul de difuzie bombat al EWNS folosind metoda noastră validată anterior. Presupunând că EWNS-urile de la bord au același volum, diametrul echivalent poate fi calculat folosind Ecuația (2):
Pe baza metodei noastre dezvoltate anterior, a fost utilizată o capcană de spin cu rezonanță electronică de spin (ESR) pentru a detecta prezența intermediarilor radicalici cu viață scurtă în EWNS. Aerosolii au fost barbotați printr-un barbotor Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) conținând o soluție de 235 mM de DEPMPO(5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirolină-N-oxid) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon). Toate măsurătorile ESR au fost efectuate utilizând un spectrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SUA) și o celulă cu ecran plat. Software-ul Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SUA) a fost utilizat pentru colectarea și analizarea datelor. Determinarea caracteristicilor ROS a fost efectuată numai pentru un set de condiții de operare [-6,5 kV, 4,0 cm]. Concentrațiile de EWNS au fost măsurate utilizând SMPS după luarea în considerare a pierderilor de EWNS în impactor.
Nivelurile de ozon au fost monitorizate utilizând un monitor de ozon cu fascicul dual 205™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Pentru toate proprietățile EWNS, valoarea medie este utilizată ca valoare de măsurare, iar abaterea standard este utilizată ca eroare de măsurare. Testele t au fost efectuate pentru a compara valorile atributelor EWNS optimizate cu valorile corespunzătoare ale EWNS de bază.
Figura 2c prezintă un sistem de „tragere” prin precipitare electrostatică (EPES), dezvoltat și caracterizat anterior, care poate fi utilizat pentru livrarea țintită a EWNS la suprafață. EPES utilizează sarcini EVNS care pot fi „ghidate” direct către suprafața țintei sub influența unui câmp electric puternic. Detalii despre sistemul EPES sunt prezentate într-o publicație recentă a lui Pyrgiotakis și colab. 11. Astfel, EPES constă dintr-o cameră din PVC imprimată 3D cu capete conice și conține două plăci metalice paralele din oțel inoxidabil (oțel inoxidabil 304, acoperit cu oglindă) în centru, la o distanță de 15,24 cm. Plăcile au fost conectate la o sursă externă de înaltă tensiune (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), placa inferioară a fost întotdeauna conectată la tensiune pozitivă, iar placa superioară a fost întotdeauna conectată la masă (masă plutitoare). Pereții camerei sunt acoperiți cu folie de aluminiu, care este împământată electric pentru a preveni pierderea de particule. Camera are o ușă frontală etanșă care permite plasarea suprafețelor de testare pe suporturi din plastic care le ridică deasupra plăcii metalice de jos pentru a evita interferențele de înaltă tensiune.
Eficiența depunerii EWNS în EPES a fost calculată conform unui protocol dezvoltat anterior, detaliat în Figura suplimentară S111.
Ca cameră de control, o a doua cameră de curgere cilindrică a fost conectată în serie la sistemul EPES, în care s-a utilizat un filtru HEPA intermediar pentru a îndepărta EWNS. Așa cum se arată în Figura 2c, aerosolul EWNS a fost pompat prin două camere încorporate. Filtrul dintre camera de control și EPES îndepărtează orice EWNS rămas, rezultând aceeași temperatură (T), umiditate relativă (RH) și niveluri de ozon.
S-a descoperit că microorganisme importante transmise prin alimente contaminează alimentele proaspete, cum ar fi E. coli (ATCC #27325), indicator fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), agent patogen transmis prin alimente, Listeria harmful (ATCC #33090), surogat pentru Listeria monocytogenes patogenă, derivată din ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un substitut pentru drojdia de alterare, și o bacterie inactivată mai rezistentă, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Cumpărați cutii aleatorii de roșii organice de la piața locală și păstrați-le la frigider la 4°C până la utilizare (până la 3 zile). Roșiile experimentale aveau toate aceeași dimensiune, aproximativ 1,2 cm în diametru.
Protocoalele de cultură, inoculare, expunere și numărare a coloniilor sunt detaliate în publicația noastră anterioară și detaliate în Datele suplimentare. Eficacitatea EWNS a fost evaluată prin expunerea roșiilor inoculate la 40.000 #/cm3 timp de 45 de minute. Pe scurt, trei roșii au fost utilizate pentru a evalua microorganismele supraviețuitoare la momentul t = 0 min. Trei roșii au fost plasate în EPES și expuse la EWNS la 40.000 #/cc (roșii expuse la EWNS), iar celelalte trei au fost plasate în camera de control (roșii de control). Nu a fost efectuată nicio procesare suplimentară a roșiilor din ambele grupuri. Roșiile expuse la EWNS și roșiile de control au fost îndepărtate după 45 de minute pentru a evalua efectul EWNS.
Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat. Analiza datelor a fost efectuată conform protocolului descris în Datele Suplimentare.
Mecanismele de inactivare au fost evaluate prin sedimentarea probelor EWNS expuse (45 min la o concentrație de aerosol EWNS de 40.000 #/cm3) și a probelor neiradiate de bacterii inofensive E. coli, Salmonella enterica și Lactobacillus. Particulele au fost fixate în glutaraldehidă 2,5%, paraformaldehidă 1,25% și acid picric 0,03% în tampon cacodilat de sodiu 0,1 M (pH 7,4) timp de 2 ore la temperatura camerei. După spălare, s-a efectuat o post-fixare cu tetroxid de osmiu (OsO4) 1%/ferocianură de potasiu (KFeCN6) 1,5% timp de 2 ore, s-a spălat de 3 ori în apă și s-a incubat în acetat de uranil 1% timp de 1 oră, apoi s-a spălat de două ori în apă, apoi s-a deshidratat timp de 10 minute în alcool 50%, 70%, 90%, 100%. Probele au fost apoi plasate în oxid de propilenă timp de 1 oră și impregnate cu un amestec 1:1 de oxid de propilenă și TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Probele au fost încorporate în TAAB Epon și polimerizate la 60°C timp de 48 de ore. Rășina granulară întărită a fost tăiată și vizualizată prin TEM utilizând un microscop electronic cu transmisie convențional JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japonia) echipat cu o cameră CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, SUA).
Toate experimentele au fost efectuate în triplicat. Pentru fiecare punct de timp, spălările bacteriene au fost însămânțate în triplicat, rezultând un total de nouă puncte de date per punct, a căror medie a fost utilizată ca și concentrație bacteriană pentru microorganismul respectiv. Abaterea standard a fost utilizată ca eroare de măsurare. Toate punctele contează.
Logaritmul scăderii concentrației de bacterii față de t = 0 min a fost calculat folosind următoarea formulă:
unde C0 este concentrația de bacterii din proba de control la momentul 0 (adică după ce suprafața s-a uscat, dar înainte de a fi plasată în cameră), iar Cn este concentrația de bacterii de pe suprafață după n minute de expunere.
Pentru a ține cont de degradarea naturală a bacteriilor în timpul expunerii de 45 de minute, reducerea logaritmică comparativ cu controlul după 45 de minute a fost calculată și după cum urmează:
unde Cn este concentrația bacteriilor din proba de control la momentul n, iar Cn-Control este concentrația bacteriilor de control la momentul n. Datele sunt prezentate ca o reducere logaritmică în comparație cu controlul (fără expunere la EWNS).
În timpul studiului, au fost evaluate mai multe combinații de tensiune și distanță dintre ac și contraelectrod în ceea ce privește formarea conului Taylor, stabilitatea conului Taylor, stabilitatea producției EWNS și reproductibilitatea. Diverse combinații sunt prezentate în Tabelul suplimentar S1. Două cazuri care prezintă proprietăți stabile și reproductibile (con Taylor, generarea EWNS și stabilitatea în timp) au fost selectate pentru un studiu cuprinzător. În fig. Figura 3 prezintă rezultatele pentru sarcina, dimensiunea și conținutul de ROS în ambele cazuri. Rezultatele sunt, de asemenea, rezumate în Tabelul 1. Pentru referință, atât Figura 3, cât și Tabelul 1 includ proprietățile EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS de bază) neoptimizate sintetizate anterior. Calculele de semnificație statistică utilizând un test t bilateral sunt republicate în Tabelul suplimentar S2. În plus, datele suplimentare includ studii privind efectul diametrului orificiului de eșantionare a contraelectrodului (D) și distanța dintre electrodul de masă și vârf (L) (Figurile suplimentare S2 și S3).
(ac) Distribuția dimensională măsurată prin AFM. (df) Caracteristica sarcinii superficiale. (g) Caracterizarea ROS a EPR.
De asemenea, este important de menționat că, pentru toate condițiile de mai sus, curentul de ionizare măsurat a fost între 2 și 6 μA, iar tensiunea între -3,8 și -6,5 kV, rezultând un consum de energie mai mic de 50 mW pentru acest modul de contact unic de generare EWNS. Deși EWNS a fost sintetizat la presiune ridicată, nivelurile de ozon au fost foarte scăzute, nedepășind niciodată 60 ppb.
Figura suplimentară S4 prezintă câmpurile electrice simulate pentru scenariile [-6,5 kV, 4,0 cm] și respectiv [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pentru scenariile [-6,5 kV, 4,0 cm] și respectiv [-3,8 kV, 0,5 cm], calculele câmpului sunt 2 × 105 V/m și respectiv 4,7 × 105 V/m. Acest lucru este de așteptat, deoarece în al doilea caz raportul tensiune-distanță este mult mai mare.
În fig. 3a și b este prezentat diametrul EWNS măsurat cu AFM8. Diametrele medii calculate ale EWNS au fost de 27 nm și 19 nm pentru schemele [-6,5 kV, 4,0 cm] și respectiv [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pentru scenariile [-6,5 kV, 4,0 cm] și [-3,8 kV, 0,5 cm], abaterile standard geometrice ale distribuțiilor sunt de 1,41 și respectiv 1,45, indicând o distribuție dimensională îngustă. Atât dimensiunea medie, cât și abaterea standard geometrică sunt foarte apropiate de EWNS de bază, la 25 nm și respectiv 1,41. În fig. 3c este prezentată distribuția dimensională a EWNS de bază măsurată folosind aceeași metodă în aceleași condiții.
În fig. 3d și e sunt prezentate rezultatele caracterizării sarcinii. Datele reprezintă medii ale măsurătorilor a 30 de măsurători simultane ale concentrației (#/cm3) și curentului (I). Analiza arată că sarcina medie pe EWNS este de 22 ± 6 e- și 44 ± 6 e- pentru [-6,5 kV, 4,0 cm] și respectiv [-3,8 kV, 0,5 cm]. Acestea au sarcini de suprafață semnificativ mai mari în comparație cu EWNS de bază (10 ± 2 e-), de două ori mai mari decât scenariul [-6,5 kV, 4,0 cm] și de patru ori mai mari decât [-3,8 kV, 0,5 cm]. Figura 3f prezintă datele privind sarcina pentru EWNS de bază.
Din hărțile de concentrație ale numărului EWNS (Figurile suplimentare S5 și S6), se poate observa că scenariul [-6,5 kV, 4,0 cm] are semnificativ mai multe particule decât scenariul [-3,8 kV, 0,5 cm]. De asemenea, merită menționat faptul că concentrația numărului EWNS a fost monitorizată până la 4 ore (Figurile suplimentare S5 și S6), unde stabilitatea generării EWNS a arătat aceleași niveluri de concentrație a numărului de particule în ambele cazuri.
În fig. 3g este prezentat spectrul EPR după scăderea controlului EWNS optimizat (fundal) la [-6,5 kV, 4,0 cm]. Spectrele ROS au fost, de asemenea, comparate cu scenariul Baseline-EWNS dintr-o lucrare publicată anterior. Numărul de EWNS care reacționează cu capcanele de spin a fost calculat la 7,5 × 104 EWNS/s, ceea ce este similar cu Baseline-EWNS8 publicat anterior. Spectrele EPR au arătat clar prezența a două tipuri de ROS, O2- fiind specia predominantă, iar OH• fiind mai puțin abundent. În plus, o comparație directă a intensităților de vârf a arătat că EWNS optimizate au avut un conținut de ROS semnificativ mai mare în comparație cu EWNS-ul de bază.
În figura 4 este prezentată eficiența depunerii EWNS în EPES. Datele sunt, de asemenea, rezumate în Tabelul I și comparate cu datele EWNS originale. Pentru ambele cazuri de EUNS, depunerea este aproape de 100% chiar și la o tensiune scăzută de 3,0 kV. De obicei, 3,0 kV este suficient pentru o depunere de 100%, indiferent de modificarea sarcinii de suprafață. În aceleași condiții, eficiența de depunere a Baseline-EWNS a fost de doar 56% datorită sarcinii lor mai mici (în medie 10 electroni per EWNS).
În fig. 5 și în tabelul 2 este rezumat valoarea de inactivare a microorganismelor inoculate pe suprafața tomatelor după expunerea la aproximativ 40.000 #/cm3 EWNS timp de 45 de minute la modul optim [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli și Lactobacillus innocuous inoculate au prezentat o reducere semnificativă de 3,8 log în timpul expunerii de 45 de minute. În aceleași condiții, S. enterica a avut o scădere de 2,2 log, în timp ce S. cerevisiae și M. parafortutum au avut o scădere de 1,0 log.
Micrografiile electronice (Figura 6) prezintă modificările fizice induse de EWNS asupra celulelor inofensive de Escherichia coli, Streptococcus și Lactobacillus, ducând la inactivarea acestora. Bacteriile de control aveau membrane celulare intacte, în timp ce bacteriile expuse aveau membrane exterioare deteriorate.
Imagistica microscopică electronică a bacteriilor de control și a celor expuse a relevat deteriorarea membranei.
Datele privind proprietățile fizico-chimice ale EWNS optimizate arată, în mod colectiv, că proprietățile (sarcina superficială și conținutul de ROS) ale EWNS au fost semnificativ îmbunătățite în comparație cu datele de referință EWNS publicate anterior8,9,10,11. Pe de altă parte, dimensiunea lor a rămas în intervalul nanometric, foarte similar cu rezultatele raportate anterior, permițându-le să rămână în aer pentru perioade lungi de timp. Polidispersia observată poate fi explicată prin modificările sarcinii superficiale care determină dimensiunea EWNS, caracterul aleatoriu al efectului Rayleigh și potențiala coalescență. Cu toate acestea, așa cum au detaliat Nielsen și colab.22, sarcina superficială ridicată reduce evaporarea prin creșterea eficientă a energiei/tensiunii superficiale a picăturii de apă. În publicația noastră anterioară8, această teorie a fost confirmată experimental pentru micropicături22 și EWNS. Pierderea de sarcină în timp poate afecta, de asemenea, dimensiunea și poate contribui la distribuția dimensiunilor observată.
În plus, sarcina per structură este de aproximativ 22-44 e-, în funcție de situație, ceea ce este semnificativ mai mare în comparație cu EWNS-ul de bază, care are o sarcină medie de 10 ± 2 electroni per structură. Cu toate acestea, trebuie menționat că aceasta este sarcina medie a EWNS. Seto și colab. S-a demonstrat că sarcina este neomogenă și urmează o distribuție log-normală21. Comparativ cu lucrările noastre anterioare, dublarea sarcinii de suprafață dublează eficiența depunerii în sistemul EPES la aproape 100%11.