Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Utilizați o versiune de browser cu suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).În plus, pentru a asigura suport continuu, arătăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Afișează un carusel de trei diapozitive simultan.Utilizați butoanele Anterior și Următorul pentru a vă deplasa prin trei diapozitive simultan sau utilizați butoanele glisante de la sfârșit pentru a vă deplasa prin trei diapozitive simultan.
Bariera hemato-encefalică și bariera hemato-encefalică împiedică agenții bioterapeutici să-și atingă țintele în sistemul nervos central, împiedicând astfel tratamentul eficient al bolilor neurologice.Pentru a descoperi noi transportatori ai creierului in vivo, am introdus o bibliotecă de peptide fagice T7 și am colectat în serie sânge și lichid cefalorahidian (CSF) folosind un model canulat conștient de grup mare de șobolani.Clonele fagilor specifice au fost foarte îmbogățite în LCR după patru runde de selecție.Testarea peptidelor candidate individuale a relevat o îmbogățire de peste 1000 de ori în LCR.Bioactivitatea eliberării mediate de peptide către creier a fost confirmată printr-o reducere cu 40% a nivelului de amiloid-β din lichidul cefalorahidian utilizând un inhibitor peptidic BACE1 legat de noua peptidă de tranzit identificată.Aceste rezultate sugerează că peptidele identificate prin metodele de selecție a fagilor in vivo pot fi vehicule utili pentru livrarea sistemică a macromoleculelor la creier cu efect terapeutic.
Cercetarea terapiei țintite asupra sistemului nervos central (SNC) s-a concentrat în mare parte pe identificarea medicamentelor și agenților optimizați care prezintă proprietăți de direcționare a SNC, cu mai puțin efort pentru descoperirea mecanismelor care conduc la livrarea activă a medicamentelor către creier.Acest lucru începe să se schimbe acum, deoarece livrarea medicamentelor, în special moleculele mari, este o parte integrantă a dezvoltării moderne de medicamente în neuroștiință.Mediul sistemului nervos central este bine protejat de sistemul de barieră cerebrovasculară, constând din bariera hemato-encefalică (BBB) ​​și bariera hemato-encefalică (BCBB)1, ceea ce face dificilă livrarea medicamentelor către creier1,2.Se estimează că aproape toate medicamentele cu molecule mari și mai mult de 98% dintre medicamentele cu molecule mici sunt eliminate din creier3.De aceea, este foarte important să se identifice noi sisteme de transport cerebral care asigură livrarea eficientă și specifică a medicamentelor terapeutice către SNC 4,5.Cu toate acestea, BBB și BCSFB prezintă, de asemenea, o oportunitate excelentă pentru livrarea medicamentelor, deoarece pătrund și pătrund în toate structurile creierului prin vascularizația sa extinsă.Astfel, eforturile actuale de a utiliza metode non-invazive de livrare la creier se bazează în mare măsură pe mecanismul de transport mediat de receptor (PMT) folosind receptorul endogen BBB6.În ciuda progreselor cheie recente folosind calea receptorului transferinei7,8, este necesară dezvoltarea în continuare a unor noi sisteme de livrare cu proprietăți îmbunătățite.În acest scop, scopul nostru a fost să identificăm peptide capabile să medieze transportul LCR, deoarece acestea ar putea fi utilizate în principiu pentru a furniza macromolecule în SNC sau pentru a deschide noi căi de receptor.În special, receptorii și transportorii specifici ai sistemului cerebrovascular (BBB și BSCFB) pot servi ca ținte potențiale pentru livrarea activă și specifică a medicamentelor bioterapeutice.Lichidul cefalorahidian (LCR) este un produs secretor al plexului coroid (CS) și este în contact direct cu lichidul interstițial al creierului prin spațiul subarahnoidian și spațiul ventricular4.Recent s-a demonstrat că lichidul cefalorahidian subarahnoidian difuzează excesiv în interstitiul creierului9.Sperăm să accesăm spațiul parenchimatos folosind acest tract de flux subarahnoidian sau direct prin BBB.Pentru a realiza acest lucru, am implementat o strategie robustă de selecție a fagilor in vivo care identifică în mod ideal peptidele transportate prin oricare dintre aceste două căi distincte.
Descriem acum o metodă secvențială de screening in vivo a fagilor cu eșantionare de LCR cuplată cu secvențiere cu randament ridicat (HTS) pentru a monitoriza rundele inițiale de selecție cu cea mai mare diversitate de bibliotecă.Screeningul a fost efectuat pe șobolani conștienți cu o canulă de cisterna mare (CM) implantată permanent pentru a evita contaminarea sângelui.Important, această abordare selectează atât țintirea creierului, cât și peptidele cu activitate de transport prin bariera cerebrovasculară.Am folosit fagii T7 datorită dimensiunilor lor mici (~60 nm)10 și am sugerat că sunt potriviți pentru transportul veziculelor care permit traversarea transcelulară a barierei endoteliale și/sau epitelial-medulare.După patru runde de analiză, populațiile de fagi au fost izolate, prezentând o puternică îmbogățire in vivo a LCR și asociere cu microvasele cerebrale.Foarte important, am putut confirma descoperirile noastre demonstrând că cele mai bune peptide candidate preferate și sintetizate chimic sunt capabile să transporte încărcătura proteică în lichidul cefalorahidian.În primul rând, efectele farmacodinamice ale SNC au fost stabilite prin combinarea unei peptide de tranzit lider cu un inhibitor al peptidei BACE1.În plus față de demonstrarea faptului că strategiile de screening funcțional in vivo pot identifica noi peptide de transport cerebral ca purtători de mărfuri proteice eficienți, ne așteptăm ca abordări similare de selecție funcțională să devină importante în identificarea căilor noi de transport cerebral.
Pe baza unităților de formare a plăcii (PFU), după etapa de ambalare a fagilor, a fost proiectată și creată o bibliotecă de peptide aleatorii de fagi T7 liniare 12-meri cu o diversitate de aproximativ 109 (vezi Materiale și Metode).Este important de reținut că am analizat cu atenție această bibliotecă înainte de panning in vivo.Amplificarea prin PCR a probelor bibliotecii de fagi folosind primeri modificați a generat ampliconi care au fost aplicabili direct la HTS (Figura suplimentară 1a).Datorită a) erorilor de secvențiere HTS11, b) impactului asupra calității primerilor (NNK) 1-12 și c) prezenței fagului de tip sălbatic (wt) (inserții de schelet) în biblioteca de așteptare, a fost implementată o procedură de filtrare a secvenței pentru a extrage doar informațiile de secvență verificate (Figura 1b suplimentară).Acești pași de filtrare se aplică tuturor bibliotecilor de secvențiere HTS.Pentru biblioteca standard, au fost obținute un total de 233.868 de citiri, dintre care 39% au trecut de criteriile de filtru și au fost utilizate pentru analiza bibliotecii și selecția pentru rundele ulterioare (Figura suplimentară 1c–e).Citirile au fost în principal multipli de 3 perechi de baze în lungime, cu un vârf la 36 de nucleotide (Fig. 1c suplimentară), confirmând designul bibliotecii (NNK) 1-12.În special, aproximativ 11% dintre membrii bibliotecii au conținut o inserție PAGISRELVDKL de tip sălbatic (wt) cu 12 dimensiuni și aproape jumătate din secvențe (49%) au conținut inserții sau deleții.HTS al bibliotecii de bibliotecă a confirmat diversitatea ridicată a peptidelor din bibliotecă: mai mult de 81% din secvențele de peptide au fost găsite o singură dată și doar 1,5% au apărut în ≥4 copii (Fig. 2a suplimentară).Frecvențele aminoacizilor (aa) la toate cele 12 poziții din repertoriu s-au corelat bine cu frecvențele așteptate pentru numărul de codoni generați de repertoriul degenerat NKK (Fig. 2b suplimentară).Frecvența observată a reziduurilor aa codificate de aceste inserții s-a corelat bine cu frecvența calculată (r = 0,893) (Fig. 2c suplimentară).Prepararea bibliotecilor de fagi pentru injectare include etapele de amplificare și îndepărtare a endotoxinei.S-a demonstrat anterior că aceasta reduce potențial diversitatea bibliotecilor de fagi12,13.Prin urmare, am secvențiat o bibliotecă de fagi amplificată pe placă care a suferit îndepărtarea endotoxinei și am comparat-o cu biblioteca originală pentru a estima frecvența AA.S-a observat o corelație puternică (r = 0,995) între pool-ul inițial și pool-ul amplificat și purificat (Figura 2d suplimentară), indicând faptul că competiția dintre clonele amplificate pe plăci folosind fagul T7 nu a cauzat prejudecăți majore.Această comparație se bazează pe frecvența motivelor tripeptidice din fiecare bibliotecă, deoarece diversitatea bibliotecilor (~ 109) nu poate fi captată complet chiar și cu HTS.Analiza frecvenței aa la fiecare poziție a relevat o mică părtinire dependentă de poziție în ultimele trei poziții ale repertoriului introdus (Figura suplimentară 2e).În concluzie, am ajuns la concluzia că calitatea și diversitatea bibliotecii au fost acceptabile și au fost observate doar modificări minore ale diversității datorită amplificării și pregătirii bibliotecilor de fagi între mai multe runde de selecție.
Prelevarea în serie a lichidului cefalorahidian poate fi efectuată prin implantarea chirurgicală a unei canule în CM al șobolanilor conștienți pentru a facilita identificarea fagului T7 injectat intravenos (iv) prin BBB și/sau BCSFB (Fig. 1a-b).Am folosit două brațe de selecție independente (brațele A și B) în primele trei runde de selecție in vivo (Fig. 1c).Am crescut treptat stringența selecției prin scăderea cantității totale de fagi introduse în primele trei runde de selecție.Pentru a patra rundă de panning, am combinat mostre din ramurile A și B și am efectuat trei selecții independente suplimentare.Pentru a studia proprietățile in vivo ale particulelor de fagi T7 în acest model, fagul de tip sălbatic (inserție principală PAGISRELVDKL) a fost injectat la șobolani prin vena cozii.Recuperarea fagilor din lichidul cefalorahidian și din sânge la diferite momente de timp a arătat că fagii icosaedrici T7 relativ mici au avut o fază inițială rapidă de eliminare din compartimentul sanguin (Figura 3 suplimentară).Pe baza titrurilor administrate și a volumului de sânge al șobolanilor, am calculat că doar aproximativ 1% în greutate.fagul din doza administrată a fost detectat în sânge la 10 minute după injectarea intravenoasă.După această scădere rapidă inițială, a fost măsurat un clearance primar mai lent cu un timp de înjumătățire de 27,7 minute.Este important că doar foarte puțini fagi au fost recuperați din compartimentul CSF, indicând un fundal scăzut pentru migrarea fagilor de tip sălbatic în compartimentul CSF (Figura 3 suplimentară).În medie, doar aproximativ 1 x 10-3% titruri de fag T7 în sânge și 4 x 10-8% din fagii perfuzați inițial au fost detectate în lichidul cefalorahidian pe întreaga perioadă de prelevare (0-250 min).În special, timpul de înjumătățire (25,7 min) al fagului de tip sălbatic în lichidul cefalorahidian a fost similar cu cel observat în sânge.Aceste date demonstrează că bariera care separă compartimentul CSF de sânge este intactă la șobolanii canulați cu CM, permițând selecția in vivo a bibliotecilor de fagi pentru a identifica clonele care sunt ușor transportate din sânge în compartimentul CSF.
(a) Stabilirea unei metode pentru reeșantionarea lichidului cefalorahidian (LCR) dintr-un bazin mare.(b) Diagrama care arată locația celulară a barierei sistemului nervos central (SNC) și strategia de selecție utilizată pentru a identifica peptidele care traversează bariera hemato-encefalică (BBB) ​​și bariera hemato-encefalică.(c) Diagramă de screening in vivo a fagilor.În fiecare rundă de selecție, fagii (identificatori de animale din interiorul săgeților) au fost injectați intravenos.Două ramuri alternative independente (A, B) sunt păstrate separat până la a patra rundă de selecție.Pentru rundele de selecție 3 și 4, fiecare clonă de fag extrasă din LCR a fost secvențiată manual.(d) Cinetica fagului izolat din sânge (cercuri roșii) și lichidul cefalorahidian (triunghiuri verzi) în timpul primei runde de selecție la doi șobolani canulați după injectarea intravenoasă a bibliotecii de peptide T7 (2 x 1012 fagi/animal).Pătratele albastre indică concentrația inițială medie de fag în sânge, calculată din cantitatea de fag injectat, luând în considerare volumul total de sânge.Pătratele negre indică punctul de intersecție al liniei y extrapolat din concentrațiile de fagi din sânge.(e,f) Prezentați frecvența relativă și distribuția tuturor motivelor tripeptidice suprapuse posibile găsite în peptidă.Este afișat numărul de motive găsite în 1000 de citiri.În mod semnificativ (p < 0,001) motivele îmbogățite sunt marcate cu puncte roșii.(e) Graficul de împrăștiere a corelației care compară frecvența relativă a motivului tripeptidic al bibliotecii injectate cu fagul derivat din sânge de la animalele #1.1 și #1.2.(f) Graficul de împrăștiere a corelației care compară frecvențele relative ale motivelor tripeptidei fagilor animale #1.1 și #1.2 izolate în sânge și lichidul cefalorahidian.(g, h) Reprezentarea ID de secvență a fagului îmbogățit în sânge (g) față de biblioteci injectate și fag îmbogățit în LCR (h) față de sânge după o rundă de selecție in vivo la ambele animale.Mărimea codului cu o literă indică cât de des apare acel aminoacid în acea poziție.Verde = polar, violet = neutru, albastru = bazic, roșu = acid și negru = aminoacizi hidrofobi.Figura 1a, b a fost proiectată și produsă de Eduard Urich.
Am injectat o bibliotecă de peptide fagice în doi șobolani instrument CM (cladele A și B) și am izolat fagul din lichidul cefalorahidian și sânge (Figura 1d).Clearance-ul rapid inițial al bibliotecii a fost mai puțin pronunțat în comparație cu fagul de tip sălbatic.Timpul mediu de înjumătățire al bibliotecii injectate la ambele animale a fost de 24,8 minute în sânge, similar cu fagul de tip sălbatic, și de 38,5 minute în LCR.Probele de fagi de sânge și lichid cefalorahidian de la fiecare animal au fost supuse HTS și toate peptidele identificate au fost analizate pentru prezența unui motiv tripeptidic scurt.Motivele tripeptidice au fost alese deoarece oferă o bază minimă pentru formarea structurii și interacțiunile peptidă-proteină14,15.Am găsit o corelație bună în distribuția motivelor între biblioteca de fagi injectați și clonele extrase din sângele ambelor animale (Fig. 1e).Datele indică faptul că compoziția bibliotecii este doar marginal îmbogățită în compartimentul de sânge.Frecvențele de aminoacizi și secvențele consens au fost analizate în continuare la fiecare poziție folosind o adaptare a software-ului Weblogo16.În mod interesant, am găsit o îmbogățire puternică a reziduurilor de glicină din sânge (Fig. 1g).Când sângele a fost comparat cu clonele selectate din LCR, s-a observat o selecție puternică și o oarecare deselectare a motivelor (Fig. 1f), iar anumiți aminoacizi au fost prezenți de preferință în poziții predeterminate în cei 12 membri (Fig. 1h).În mod remarcabil, animalele individuale diferă semnificativ în lichidul cefalorahidian, în timp ce îmbogățirea cu glicină din sânge a fost observată la ambele animale (Fig. 4a-j suplimentară).După filtrarea strictă a datelor de secvență în lichidul cefalorahidian al animalelor #1.1 și #1.2, s-au obținut un total de 964 și 420 de peptide unice 12-mer (Fig. 1d-e suplimentară).Clonele de fagi izolate au fost amplificate și supuse unei a doua runde de selecție in vivo.Fagii extrași din a doua rundă de selecție au fost supuși HTS la fiecare animal și toate peptidele identificate au fost utilizate ca intrare la un program de recunoaștere a motivelor pentru a analiza apariția motivelor tripeptidice (Fig. 2a, b, ef).În comparație cu primul ciclu al fagului recuperat din LCR, am observat selecția și deselectarea ulterioară a multor motive în LCR în ramurile A și B (Fig. 2).A fost aplicat un algoritm de identificare a rețelei pentru a determina dacă acestea au reprezentat diferite modele de secvență consistentă.A fost observată o asemănare clară între secvențele cu 12 dimensiuni recuperate de CSF în clada alternativă A (Fig. 2c, d) și clada B (Fig. 2g, h).Analiza combinată din fiecare ramură a relevat profiluri de selecție diferite pentru peptidele 12-mer (Figura suplimentară 5c, d) și o creștere a raportului titrului CSF/sânge în timp pentru clonele reunite după a doua rundă de selecție în comparație cu prima rundă de selecție (Figura suplimentară 5e).).
Îmbogățirea motivelor și peptidelor în lichidul cefalorahidian prin două runde succesive de selecție de afișare a fagilor funcționali in vivo.
Toți fagii lichidului cefalorahidian recuperați din prima rundă a fiecărui animal (animalele #1.1 și #1.2) au fost reuniți, amplificați, secvențiați HT și reinjectați împreună (2 x 1010 fagi/animal) 2 șobolani canulați SM (#1.1 → #).2.1 și 2.2, 1.2 → 2.3 și 2.4).(a,b,e,f) Diagrame de împrăștiere de corelație care compară frecvența relativă a motivelor tripeptidice ale tuturor fagilor derivați din LCR în prima și a doua rundă de selecție.Frecvența relativă și distribuția motivelor reprezentând toate tripeptidele suprapuse posibile găsite în peptide în ambele orientări.Este afișat numărul de motive găsite în 1000 de citiri.Motivele care au fost semnificativ (p < 0,001) selectate sau excluse într-una dintre bibliotecile comparate sunt evidențiate cu puncte roșii.(c, d, g, h) Reprezentarea logo-ului secvenței a tuturor secvențelor lungi de 12 aminoacizi bogate în CSF pe baza rundelor 2 și 1 de selecție in vivo.Mărimea codului cu o literă indică cât de des apare acel aminoacid în acea poziție.Pentru a reprezenta logo-ul, se compară frecvența secvențelor LCR extrase de la animale individuale între două runde de selecție și sunt afișate secvențele îmbogățite din a doua rundă: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 și (h) #1.2–#2.4.Cei mai îmbogățiți aminoacizi la o poziție dată la animalele (c, d) nr.2.1 și nr.2.2 sau (g, h) la animale nr.2.3 și nr.2.4 sunt prezentate color.Verde = polar, violet = neutru, albastru = bazic, roșu = acid și negru = aminoacizi hidrofobi.
După a treia rundă de selecție, am identificat 124 de secvențe de peptide unice (# 3.1 și # 3.2) din 332 clone de fagi reconstituite cu CSF izolate de la două animale (Figura suplimentară 6a).Secvența LGSVS (18,7%) a avut cea mai mare proporție relativă, urmată de inserțiile de tip sălbatic PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) și SARGSWREIVSLS (2,2%).În a patra rundă finală, am reunit două ramuri selectate independent de la trei animale separate (Fig. 1c).Dintre cele 925 de clone de fagi secvențiate recuperate din LCR, în a patra rundă am găsit 64 de secvențe de peptide unice (Figura suplimentară 6b), printre care proporția relativă de fagi de tip sălbatic a scăzut la 0,8%.Cele mai comune clone de LCR din runda a patra au fost LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) și RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Intervalul de lungime al peptidelor selectate se datorează inserțiilor/delețiilor de nucleotide sau codonilor de oprire prematură din primerii bibliotecii atunci când se utilizează codoni degenerați pentru proiectarea bibliotecii NNK.Codonii stop prematuri generează peptide mai scurte și sunt selectați deoarece conțin motivul favorabil aa.Peptidele mai lungi pot rezulta din inserții/deleții în primerii bibliotecilor sintetice.Aceasta poziționează codonul de oprire proiectat în afara cadrului și îl citește până când apare un nou codon de oprire în aval.În general, am calculat factori de îmbogățire pentru toate cele patru runde de selecție, comparând datele de intrare cu datele de ieșire ale eșantionului.Pentru prima rundă de screening, am folosit titruri de fagi de tip sălbatic ca referință de fond nespecifică.Interesant, selecția negativă a fagilor a fost foarte puternică în primul ciclu de LCR, dar nu și în sânge (Fig. 3a), ceea ce se poate datora probabilității scăzute de difuzie pasivă a majorității membrilor bibliotecii de peptide în compartimentul LCR sau fagii relativi tind să fie reținuți sau eliminați mai eficient din sânge decât bacteriofagii.Cu toate acestea, în a doua rundă de panning, s-a observat o selecție puternică de fagi în LCR în ambele clade, ceea ce sugerează că runda anterioară a fost îmbogățită în fagi care prezintă peptide care promovează absorbția LCR (Fig. 3a).Din nou, fără o îmbogățire semnificativă a sângelui.De asemenea, în a treia și a patra rundă, clonele de fagi au fost semnificativ îmbogățite în LCR.Comparând frecvența relativă a fiecărei secvențe unice de peptide între ultimele două runde de selecție, am constatat că secvențele au fost și mai îmbogățite în a patra rundă de selecție (Fig. 3b).Un total de 931 de motive tripeptidice au fost extrase din toate cele 64 de secvențe unice de peptide folosind ambele orientări peptidice.Cele mai îmbogățite motive din a patra rundă au fost examinate mai îndeaproape pentru profilurile lor de îmbogățire în toate rundele în comparație cu biblioteca injectată (limită: îmbogățire de 10%) (Figura suplimentară 6c).Modelele generale de selecție au arătat că majoritatea motivelor studiate au fost îmbogățite în toate rundele anterioare ale ambelor ramuri de selecție.Cu toate acestea, unele motive (de exemplu SGL, VSG, LGS GSV) au fost predominant din clada alternativă A, în timp ce altele (de exemplu, FGW, RTN, WGF, NTR) au fost îmbogățite în cladă alternativă B.
Validarea transportului LCR al peptidelor afișate cu fagi îmbogățiți cu LCR și peptidelor lider biotinilate conjugate cu încărcături utile de streptavidină.
(a) Rapoarte de îmbogățire calculate în toate cele patru runde (R1-R4) pe baza titrurilor de fagi (PFU) injectate (intrare = I) și titruri de fagi LCR determinate (ieșire = O).Factorii de îmbogățire pentru ultimele trei runde (R2-R4) au fost calculați prin comparație cu runda anterioară și cu prima rundă (R1) cu date de greutate.Barele deschise sunt lichidul cefalorahidian, barele umbrite sunt plasmă.(***p<0,001, pe baza testului t Student).(b) Lista celor mai abundente peptide fagice, clasificate în funcție de proporția lor relativă față de toți fagii colectați în LCR după runda 4 de selecție.Cele mai comune șase clone de fagi sunt evidențiate în culoare, numerotate și factorii lor de îmbogățire între rundele 3 și 4 de selecție (inserții).( c, d ) Cele șase clone de fagi cele mai îmbogățite, biblioteci de fagi goale și de peptide de fagi parentale din runda 4 au fost analizate individual într-un model de eșantionare CSF.LCR și probe de sânge au fost colectate la momentele de timp indicate.(c) Cantități egale de 6 clone de fagi candidati (2 x 1010 fagi/animale), fagi goali (#1779) (2 x 1010 fagi/animale) și biblioteci de peptide fagilor stoc (2 x 1012 fagi/animale).Este prezentată farmacocinetica CSF a fiecărei clone de fagi injectate și a bibliotecii de peptide fagice în timp.(d) arată raportul mediu LCR/sânge pentru toți fagii recuperați/mL pe parcursul timpului de prelevare.(e) Patru peptide lider sintetice și un control amestecat au fost legate cu biotină de streptavidină prin capătul lor N-terminal (afișare tetramer), urmată de injectare (vena coadă iv, 10 mg streptavidină/kg).Cel puțin trei șobolani intubați (N = 3).).Probele de LCR au fost colectate la punctele de timp indicate și concentrațiile de streptavidină au fost măsurate prin ELISA anti-streptavidină de LCR (nd = nedetectat).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, pe baza testului ANOVA).(f) Comparația secvenței de aminoacizi a celei mai îmbogățite clone de peptide fagice #2002 (violet) cu alte clone de peptide fagice selectate din a patra rundă de selecție.Fragmentele de aminoacizi identice și similare sunt codificate prin culori.
Dintre toți fagii îmbogățiți din a patra rundă (Fig. 3b), șase clone candidate au fost selectate pentru o analiză individuală ulterioară în modelul de eșantionare CSF.Au fost injectate cantități egale de șase biblioteci de fagi candidati, fagi goale (fără inserare) și peptide profage în trei animale CM canulate, iar farmacocinetica a fost determinată în testele CSF (Fig. 3c) și sânge (Figura 7 suplimentară).Toate clonele de fagi testate au vizat compartimentul LCR la un nivel de 10-1000 de ori mai mare decât cel al fagului martor gol (#1779).De exemplu, clonele #2020 și #2077 au avut titruri de LCR de aproximativ 1000 de ori mai mari decât fagul martor.Profilul farmacocinetic al fiecărei peptide selectate este diferit, dar toate au o capacitate ridicată de homing CSF.Am observat o scădere constantă în timp pentru clonele #1903 și #2011, în timp ce pentru clonele #2077, #2002 și #2009 o creștere în primele 10 minute ar putea indica transport activ, dar trebuie verificată.Clonele #2020, #2002 și #2077 s-au stabilizat la niveluri ridicate, în timp ce concentrația LCR a clonei #2009 a scăzut lent după creșterea inițială.Apoi am comparat frecvența relativă a fiecărui candidat CSF cu concentrația sa în sânge (Fig. 3d).Corelația titrului mediu al fiecărui candidat de LCR cu titrul său de sânge la toate momentele de prelevare a arătat că trei dintre cei șase candidați au fost semnificativ îmbogățiți în LCR de sânge.În mod interesant, clona #2077 a arătat o stabilitate mai mare a sângelui (Figura suplimentară 7).Pentru a confirma că peptidele în sine sunt capabile să transporte în mod activ încărcături, altele decât particulele fagice, în compartimentul LCR, am sintetizat patru peptide lider derivatizate cu biotină la capătul N-terminal unde peptidele se atașează de particula fagului.Peptidele biotinilate (nr. 2002, 2009, 2020 și 2077) au fost conjugate cu streptavidină (SA) pentru a obține forme multimerice care mimează oarecum geometria fagului.Acest format ne-a permis, de asemenea, să măsurăm expunerea SA în sânge și lichidul cefalorahidian ca peptide proteice care transportă marfă.Este important că datele fagilor ar putea fi adesea reproduse atunci când peptidele sintetice au fost administrate în acest format conjugat cu SA (Fig. 3e).Peptidele amestecate au avut o expunere inițială mai mică și o eliminare mai rapidă a LCR, cu niveluri nedetectabile în 48 de ore.Pentru a obține o perspectivă asupra căilor de livrare a acestor clone de fagi peptidici în spațiul CSF, am analizat localizarea loviturilor individuale de peptide fagice folosind imunohistochimia (IHC) pentru a detecta direct particulele de fagi la 1 oră după injectarea intravenoasă in vivo.În special, clonele #2002, #2077 și #2009 au putut fi detectate prin colorare puternică în capilarele creierului, în timp ce fagul de control (#1779) și clona #2020 nu au fost detectate (Figura 8 suplimentară).Acest lucru sugerează că aceste peptide contribuie la efectul asupra creierului tocmai prin traversarea BBB.Este necesară o analiză detaliată suplimentară pentru a testa această ipoteză, deoarece ruta BSCFB poate fi, de asemenea, implicată.Când se compară secvența de aminoacizi a celei mai îmbogățite clone (#2002) cu alte peptide selectate, s-a observat că unele dintre ele au extensii similare de aminoacizi, ceea ce poate indica un mecanism de transport similar (Fig. 3f).
Datorită profilului său unic de plasmă și a creșterii semnificative a LCR în timp, clona de afișare fagică #2077 a fost explorată în continuare pe o perioadă mai lungă de 48 de ore și a reușit să reproducă creșterea rapidă a LCR observată în asociere cu niveluri susținute de SA (Fig. 4a).În ceea ce privește alte clone de fagi identificate, #2077 s-a colorat puternic pentru capilarele creierului și a arătat o colocalizare semnificativă cu lectina marker capilar atunci când a fost văzut la rezoluție mai mare și, posibil, o anumită colorare în spațiul parenchimatos (Figura 4b).Pentru a investiga dacă efectele farmacologice mediate de peptide pot fi obținute în SNC, am efectuat un experiment în care versiunile biotinilate ale i) peptidei de tranzit #2077 și ii) peptidei inhibitoare BACE1 au fost amestecate cu SA în două rapoarte diferite.Pentru o combinație am folosit doar inhibitorul peptidic BACE1, iar pentru cealaltă am folosit un raport de 1:3 dintre inhibitorul peptidic BACE1 și peptida #2077.Ambele probe au fost administrate intravenos și s-au măsurat în timp nivelurile din sânge și lichidul cefalorahidian ale peptidei beta-amiloid 40 (Abeta40).Abeta40 a fost măsurat în LCR deoarece reflectă inhibarea BACE1 în parenchimul creierului.După cum era de așteptat, ambele complexe au redus semnificativ nivelurile sanguine de Abeta40 (Fig. 4c, d).Cu toate acestea, numai probele care conțin un amestec de peptidă nr.2077 și un inhibitor al peptidei BACE1 conjugată cu SA au provocat o scădere semnificativă a Abeta40 în lichidul cefalorahidian (Fig. 4c).Datele arată că peptida nr.2077 este capabil să transporte proteina SA de 60 kDa în SNC și, de asemenea, induce efecte farmacologice cu inhibitori conjugați cu SA ai peptidei BACE1.
(a) Injectarea clonală (2 × 10 fagi/animal) de fag T7 care prezintă profiluri farmacocinetice pe termen lung ale peptidei CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) și fagului de control neinjectat (#1779) la cel puțin trei șobolani intubați cu CM.(b) Imagine microscopică confocală a microvaselor corticale reprezentative la șobolani injectați cu fagi (2 × 1010 fagi/animal) care arată contracolorarea peptidei #2077 și a vaselor (lectină).Aceste clone de fagi au fost administrate la 3 șobolani și lăsate să circule timp de 1 oră înainte de perfuzie.Creierele au fost secţionate şi colorate cu anticorpi marcaţi cu FITC policlonali împotriva capsidei fagului T7.Cu zece minute înainte de perfuzie și fixare ulterioară, lectina marcată cu DyLight594 a fost administrată intravenos.Imagini fluorescente care arată colorarea cu lectină (roșu) a părții luminale a microvaselor și fagilor (verde) în lumenul capilarelor și țesutului cerebral perivascular.Bara de scară corespunde la 10 µm.(c, d) Peptida inhibitoare BACE1 biotinilată singură sau în combinație cu peptida de tranzit biotinilată #2077 a fost cuplată la streptavidină urmată de injectarea intravenoasă a cel puțin trei șobolani CM canulați (10 mg streptavidină/kg).Reducerea Aβ40 mediată de inhibitorul peptidei BACE1 a fost măsurată prin ELISA Ap1-40 în sânge (roșu) și lichidul cefalorahidian (portocaliu) la momentele de timp indicate.Pentru o mai bună claritate, pe grafic este trasată o linie punctată la o scară de 100%.(c) Reducerea procentuală a Ap40 în sânge (triunghiuri roșii) și lichidul cefalorahidian (triunghiuri portocalii) la șobolani tratați cu streptavidină conjugată cu peptida de tranzit #2077 și peptida inhibitoare BACE1 într-un raport de 3:1.(d) Reducerea procentuală a Ap40 din sânge (cercuri roșii) și lichidul cefalorahidian (cercuri portocalii) la șobolanii tratați cu streptavidină cuplată numai la o peptidă inhibitoare BACE1.Concentrația Ap în martor a fost de 420 pg/ml (abatere standard = 101 pg/ml).
Afișarea fagilor a fost aplicată cu succes în mai multe domenii ale cercetării biomedicale17.Această metodă a fost utilizată pentru studiile in vivo asupra diversității vasculare18,19, precum și pentru studii care vizează vasele cerebrale20,21,22,23,24,25,26.În acest studiu, am extins aplicarea acestei metode de selecție nu numai la identificarea directă a peptidelor care vizează vasele cerebrale, ci și la descoperirea candidaților cu proprietăți active de transport pentru a traversa bariera hemato-encefalică.Descriem acum dezvoltarea unei proceduri de selecție in vivo la șobolanii intubați cu CM și demonstrăm potențialul său de a identifica peptide cu proprietăți de homing CSF.Folosind fagul T7 care afișează o bibliotecă de peptide aleatoare de 12-mer, am putut demonstra că fagul T7 este suficient de mic (aproximativ 60 nm în diametru)10 pentru a fi adaptat la bariera hematoencefalică, traversând astfel direct bariera hematoencefalică sau plexul coroid.Am observat că recoltarea LCR de la șobolani CM canulați a fost o metodă de screening funcțională in vivo bine controlată și că fagul extras nu numai că s-a legat de vasculatură, ci a funcționat și ca un transportor peste bariera hemato-encefalică.În plus, prin colectarea simultană de sânge și aplicarea HTS la LCR și fagii derivați din sânge, am confirmat că alegerea noastră de LCR nu a fost influențată de îmbogățirea sângelui sau de capacitatea de extindere între rundele de selecție.Cu toate acestea, compartimentul de sânge face parte din procedura de selecție, deoarece fagii capabili să ajungă în compartimentul LCR trebuie să supraviețuiască și să circule în fluxul sanguin suficient de mult pentru a se îmbogăți în creier.Pentru a extrage informații despre secvențe fiabile din datele brute HTS, am implementat filtre adaptate erorilor de secvențiere specifice platformei în fluxul de lucru de analiză.Prin încorporarea parametrilor cinetici în metoda de screening, am confirmat farmacocinetica rapidă a fagilor T7 de tip sălbatic (t½ ~ 28 min) în sânge24, 27, 28 și, de asemenea, am determinat timpul de înjumătățire al acestora în lichidul cefalorahidian (t½ ~ 26 min) pe minut).În ciuda profilurilor farmacocinetice similare în sânge și LCR, doar 0,001% din concentrația sanguină a fagului a putut fi detectată în LCR, indicând o mobilitate scăzută de fundal a fagului T7 de tip sălbatic peste bariera hemato-encefalică.Această lucrare evidențiază importanța primei runde de selecție atunci când se utilizează strategii de panning in vivo, în special pentru sistemele de fagi care sunt eliminate rapid din circulație, deoarece puține clone sunt capabile să ajungă în compartimentul SNC.Astfel, în prima rundă, reducerea diversității bibliotecii a fost foarte mare, deoarece doar un număr limitat de clone au fost colectate în cele din urmă în acest model CSF foarte strict.Această strategie de panning in vivo a inclus mai mulți pași de selecție, cum ar fi acumularea activă în compartimentul CSF, supraviețuirea clonelor în compartimentul sanguin și îndepărtarea rapidă a clonelor fagilor T7 din sânge în primele 10 minute (Fig. 1d și Fig. 4M suplimentară).).Astfel, după prima rundă, diferite clone de fagi au fost identificate în LCR, deși același pool inițial a fost utilizat pentru animale individuale.Acest lucru sugerează că mai mulți pași stricti de selecție pentru bibliotecile sursă cu un număr mare de membri ai bibliotecii au ca rezultat o reducere semnificativă a diversității.Prin urmare, evenimentele aleatorii vor deveni o parte integrantă a procesului inițial de selecție, influențând foarte mult rezultatul.Este probabil ca multe dintre clonele din biblioteca originală să aibă o tendință de îmbogățire a LCR foarte asemănătoare.Cu toate acestea, chiar și în aceleași condiții experimentale, rezultatele selecției pot diferi din cauza numărului mic de fiecare clonă particulară din grupul inițial.
Motivele îmbogățite în LCR diferă de cele din sânge.Interesant, am observat prima schimbare către peptide bogate în glicină în sângele animalelor individuale.(Fig. 1g, Figurile suplimentare 4e, 4f).Fagii care conțin peptide de glicină pot fi mai stabili și mai puțin probabil să fie scoși din circulație.Cu toate acestea, aceste peptide bogate în glicină nu au fost detectate în probele de lichid cefalorahidian, ceea ce sugerează că bibliotecile curate au trecut prin două etape diferite de selecție: unul în sânge și altul lăsat să se acumuleze în lichidul cefalorahidian.Clonele îmbogățite cu LCR rezultate din a patra rundă de selecție au fost testate pe larg.S-a confirmat că aproape toate clonele testate individual sunt îmbogățite în LCR în comparație cu fagul martor.O lovitură de peptidă (#2077) a fost examinată mai detaliat.A arătat un timp de înjumătățire plasmatică mai lung în comparație cu alte lovituri (Figura 3d și Figura suplimentară 7) și, interesant, această peptidă conținea un reziduu de cisteină la capătul C-terminal.S-a demonstrat recent că adăugarea de cisteină la peptide poate îmbunătăți proprietățile lor farmacocinetice prin legarea de albumină 29 .Acest lucru este în prezent necunoscut pentru peptida #2077 și necesită studii suplimentare.Unele peptide au prezentat o dependență de valență în îmbogățirea LCR (datele nu sunt prezentate), care poate fi legată de geometria suprafeței afișate a capsidei T7.Sistemul T7 pe care l-am folosit a arătat 5-15 copii ale fiecărei peptide per particulă de fag.IHC a fost efectuată pe clone de fagi plumb candidate injectate intravenos în cortexul cerebral al șobolanilor (Figura 8 suplimentară).Datele au arătat că cel puțin trei clone (nr. 2002, nr. 2009 și nr. 2077) au interacționat cu BBB.Rămâne de determinat dacă această interacțiune BBB are ca rezultat acumularea de LCR sau mișcarea acestor clone direct la BCSFB.Important, arătăm că peptidele selectate își păstrează capacitatea de transport a LCR atunci când sunt sintetizate și legate de încărcătura proteică.Legarea peptidelor biotinilate N-terminale la SA repetă în esență rezultatele obținute cu clonele fagice respective în sânge și lichid cefalorahidian (Fig. 3e).În cele din urmă, arătăm că peptida plumb #2077 este capabilă să promoveze acțiunea cerebrală a unui inhibitor peptidic biotinilat al BACE1 conjugat cu SA, provocând efecte farmacodinamice pronunțate în SNC prin reducerea semnificativă a nivelurilor de Abeta40 în LCR (Fig. 4).Nu am reușit să identificăm niciun omolog în baza de date prin efectuarea unei căutări de omologie a secvenței de peptide a tuturor rezultatelor.Este important de reținut că dimensiunea bibliotecii T7 este de aproximativ 109, în timp ce dimensiunea teoretică a bibliotecii pentru 12-meri este de 4 x 1015. Prin urmare, am selectat doar o mică parte din spațiul de diversitate al bibliotecii de peptide de 12-meri, ceea ce poate însemna că peptidele mai optimizate pot fi identificate prin evaluarea spațiului adiacent al secvenței de succes identificate.Ipotetic, unul dintre motivele pentru care nu am găsit omologi naturali ai acestor peptide poate fi deselectarea în timpul evoluției pentru a preveni intrarea necontrolată a anumitor motive peptidice în creier.
Luate împreună, rezultatele noastre oferă o bază pentru lucrările viitoare de identificare și caracterizare mai detaliată a sistemelor de transport ale barierei cerebrovasculare in vivo.Configurația de bază a acestei metode se bazează pe o strategie de selecție funcțională care nu numai că identifică clonele cu proprietăți de legare vasculară cerebrală, dar include și o etapă critică în care clonele de succes au activitate intrinsecă pentru a traversa barierele biologice in vivo în compartimentul SNC.este de a elucida mecanismul de transport al acestor peptide și preferința lor pentru legarea la microvascularizația specifică regiunii creierului.Acest lucru poate duce la descoperirea de noi căi pentru transportul BBB și al receptorilor.Ne așteptăm ca peptidele identificate să se poată lega direct de receptorii cerebrovasculari sau de liganzii circulanți transportați prin BBB sau BCSFB.Vectorii peptidici cu activitate de transport LCR descoperiți în această lucrare vor fi investigați în continuare.În prezent, investigăm specificitatea creierului acestor peptide pentru capacitatea lor de a traversa BBB și/sau BCSFB.Aceste noi peptide vor fi instrumente extrem de valoroase pentru descoperirea potențială de noi receptori sau căi și pentru dezvoltarea de noi platforme extrem de eficiente pentru livrarea de macromolecule, cum ar fi substanțele biologice, către creier.
Canulați cisterna mare (CM) folosind o modificare a metodei descrise anterior.Șobolani Wistar anesteziați (200-350 g) au fost montați pe un aparat stereotaxic și s-a făcut o incizie mediană peste scalpul ras și pregătit aseptic pentru a expune craniul.Faceți două găuri în zona cercevei superioare și fixați șuruburile de fixare în găuri.O gaură suplimentară a fost forată în creasta occipitală laterală pentru ghidarea stereotactică a unei canule din oțel inoxidabil în CM.Aplicați ciment dentar în jurul canulei și fixați-o cu șuruburi.După fotopolimerizare și întărire cu ciment, rana cutanată a fost închisă cu sutură supramidă 4/0.Amplasarea corectă a canulei este confirmată de scurgerea spontană a lichidului cefalorahidian (LCR).Scoateți șobolanul din aparatul stereotaxic, primiți îngrijire postoperatorie adecvată și gestionarea durerii și lăsați-l să se recupereze timp de cel puțin o săptămână până când se observă semne de sânge în lichidul cefalorahidian.Șobolanii Wistar (Crl:WI/Han) au fost obținuți de la Charles River (Franța).Toți șobolanii au fost ținuți în condiții specifice fără agenți patogeni.Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Oficiul veterinar al orașului Basel, Elveția, și au fost efectuate în conformitate cu Licența pentru animale nr. 2474 (Evaluarea transportului activ al creierului prin măsurarea nivelurilor candidaților terapeutici în fluidul cefalorahidian și creierul șobolanului).
Țineți ușor șobolanul conștient cu canula CM în mână.Scoateți Datura din canulă și colectați 10 µl de lichid cefalorahidian care curge spontan.Deoarece permeabilitatea canulei a fost în cele din urmă compromisă, în acest studiu au fost incluse numai probe clare de lichid cefalorahidian fără dovezi de contaminare sau decolorare a sângelui.În paralel, aproximativ 10-20 μl de sânge au fost prelevați dintr-o mică incizie de la vârful cozii în tuburi cu heparină (Sigma-Aldrich).LCR și sângele au fost colectate la diferite momente după injectarea intravenoasă a fagului T7.Aproximativ 5-10 μl de lichid au fost aruncați înainte de a fi colectată fiecare probă de LCR, ceea ce corespunde volumului mort al cateterului.
Bibliotecile au fost generate folosind vectorul T7Select 10-3b așa cum este descris în manualul sistemului T7Select (Novagen, Rosenberg și colab., InNovations 6, 1-6, 1996).Pe scurt, o inserție aleatorie de ADN de 12-meri a fost sintetizată în următorul format:
Codonul NNK a fost utilizat pentru a evita codonii dublu stop și supraexprimarea aminoacizilor în insert.N este un raport echimolar amestecat manual al fiecărei nucleotide, iar K este un raport echimolar amestecat manual al nucleotidelor de adenină și citozină.Regiunile monocatenar au fost convertite în ADN dublu catenar prin incubare suplimentară cu dNTP (Novagen) și enzima Klenow (New England Biolabs) în tampon Klenow (New England Biolabs) timp de 3 ore la 37°C.După reacție, ADN-ul dublu catenar a fost recuperat prin precipitare cu EtOH.ADN-ul rezultat a fost digerat cu enzimele de restricție EcoRI și HindIII (ambele de la Roche).Insertul scindat și purificat (QIAquick, Qiagen) (ligaza T4, New England Biolabs) a fost apoi ligat în cadru într-un vector T7 preclivat după aminoacidul 348 al genei capsidei 10B.Reacţiile de ligare au fost incubate la 16°C timp de 18 ore înainte de ambalarea in vitro.Ambalarea fagilor in vitro a fost efectuată conform instrucțiunilor furnizate cu trusa de donare T7Select 10-3b (Novagen) și soluția de ambalare a fost amplificată o dată până la liză folosind Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizatele au fost centrifugate, titrate şi congelate la -80°C ca o soluţie stoc de glicerol.
Amplificarea directă prin PCR a regiunilor variabile de fagi amplificate în bulion sau placă folosind primeri de fuziune brevetați 454/Roche-amplicon.Primerul de fuziune înainte conține secvențe care flanchează regiunea variabilă (NNK) 12 (specific șablonului), adaptorul A din titan GS FLX și o secvență de cheie de bibliotecă cu patru baze (TCAG) (Figura suplimentară 1a):
Primerul de fuziune inversă conține, de asemenea, biotină atașată la bile de captare și adaptorul de titan GS FLX B necesar pentru amplificarea clonală în timpul PCR în emulsie:
Ampliconii au fost apoi supuși pirosecvenței 454/Roche conform protocolului 454 GS-FLX Titanium.Pentru secvențierea manuală Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ADN-ul fagului T7 a fost amplificat prin PCR și secvențiat cu următoarele perechi de primeri:
Inserturile din plăci individuale au fost supuse amplificării prin PCR utilizând kitul Roche Fast Start DNA Polymerase (conform instrucțiunilor producătorului).Efectuați o pornire la cald (10 min la 95 °C) și 35 de cicluri de amplificare (50 s la 95 °C, 1 min la 50 °C și 1 min la 72 °C).
Fagii din biblioteci, fagii de tip sălbatic, fagii salvați din LCR și sânge sau clone individuale au fost amplificați în Escherichia coli BL5615 în bulion TB (Sigma Aldrich) sau în vase de 500 cm2 (Thermo Scientific) timp de 4 ore la 37°C.Fagii au fost extrași din plăci prin clătirea plăcilor cu tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) sau prin colectarea plăcilor cu vârfuri de pipetă sterile.Fagii au fost izolați din supernatantul culturii sau tamponul de extracție cu o rundă de precipitare cu polietilen glicol (PEG 8000) (Promega) și resuspendați în tampon Tris-EDTA.
Fagul amplificat a fost supus la 2-3 runde de îndepărtare a endotoxinei folosind perle de îndepărtare a endotoxinei (Miltenyi Biotec) înainte de injectarea intravenoasă (IV) (500 μl/animal).În prima rundă au fost introduși 2×1012 fagi;în al doilea, 2×1010 fagi;în a treia și a patra rundă de selecție, 2×109 fagi per animal.Conținutul de fagi în LCR și probele de sânge colectate la momentele de timp indicate a fost determinat prin numărarea plăcii conform instrucțiunilor producătorului (manualul sistemului T7Select).Selecția fagilor a fost efectuată prin injectarea intravenoasă de biblioteci purificate în vena cozii sau prin reinjectarea fagului extras din LCR din runda anterioară de selecție, iar recoltele ulterioare au fost efectuate la 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min și, respectiv, 240 min CSF și, respectiv, probe de sânge.Au fost efectuate un total de patru runde de panning in vivo în care cele două ramuri selectate au fost stocate separat și analizate în timpul primelor trei runde de selecție.Toate inserțiile de fagi extrase din LCR din primele două runde de selecție au fost supuse pirosecvenței 454/Roche, în timp ce toate clonele extrase din LCR din ultimele două runde de selecție au fost secvențiate manual.Toți fagii din sânge din prima rundă de selecție au fost, de asemenea, supuși la pirosecvențierea 454/Roche.Pentru injectarea clonelor de fagi, fagii selectați au fost amplificați în E. coli (BL5615) pe plăci de 500 cm2 la 37°C timp de 4 ore.Clonele selectate individual și secvențiate manual au fost propagate în mediu TB.După extracția fagilor, purificarea și îndepărtarea endotoxinei (așa cum este descris mai sus), 2 x 1010 fagi/animal în 300 μl au fost injectați intravenos într-o venă a cozii.
Preprocesarea și filtrarea calitativă a datelor secvențe.Datele brute 454/Roche au fost convertite dintr-un format binar de hartă de flux standard (sff) într-un format Pearson care poate fi citit de om (fasta) folosind software-ul furnizorului.Prelucrarea ulterioară a secvenței de nucleotide a fost efectuată folosind programe și scripturi C proprietare (pachet software nelansat), așa cum este descris mai jos.Analiza datelor primare include proceduri stricte de filtrare în mai multe etape.Pentru a filtra citirile care nu conțineau o secvență validă de ADN de inserție de 12meri, citirile au fost aliniate secvenţial la eticheta de pornire (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), eticheta de oprire (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) și insertul de fundal (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizând testul global Needleman-Wunsch.aliniere permițând până la 2 inconsecvențe per aliniere31.Prin urmare, citirile fără etichete de pornire și oprire și citirile care conțineau inserții de fundal, adică aliniamentele care depășesc numărul permis de nepotriviri, au fost eliminate din bibliotecă.În ceea ce privește citirile rămase, secvența de ADN N-mer care se extinde de la marcajul de început și se termină înainte de semnul de oprire a fost excizată din secvența de citire originală și procesată în continuare (denumită în continuare „inserție”).După translația insertului, porțiunea de după primul codon de oprire la capătul 5′ al primerului este îndepărtată din insert.În plus, nucleotidele care conduc la codoni incompleti la capătul 3′ al primerului au fost, de asemenea, îndepărtate.Pentru a exclude inserțiile care conțin numai secvențe de fundal, inserțiile traduse care încep cu modelul de aminoacizi „PAG” au fost de asemenea eliminate.Peptidele cu o lungime post-translațională mai mică de 3 aminoacizi au fost îndepărtate din bibliotecă.În cele din urmă, eliminați redundanța din grupul de inserții și determinați frecvența fiecărei inserții unice.Rezultatele acestei analize au inclus o listă de secvențe de nucleotide (inserții) și frecvențele lor (de citire) (Figurile suplimentare 1c și 2).
Grupați inserțiile de ADN N-mer după asemănarea secvenței: pentru a elimina erorile de secvențiere specifice 454/Roche (cum ar fi problemele cu secvențierea extensiilor de homopolimeri) și pentru a elimina redundanțe mai puțin importante, inserțiile (inserțiile) de secvențe de ADN N-mer filtrate anterior sunt sortate după similitudine.inserții (permise până la 2 baze care nu se potrivesc) folosind un algoritm iterativ definit după cum urmează: inserțiile sunt sortate mai întâi după frecvența lor (de la cea mai mare la cea mai mică), iar dacă sunt aceleași, după sortarea lor secundară după lungime (de la cea mai lungă la cea mai scurtă) ).Astfel, cele mai frecvente și mai lungi inserții definesc primul „grup”.Frecvența grupului este setată la frecvența cheie.Apoi, fiecare inserție rămasă în lista sortată a fost încercată să fie adăugată la grup prin aliniere Needleman-Wunsch în perechi.Dacă numărul de nepotriviri, inserții sau ștergeri dintr-o aliniere nu depășește un prag de 2, o inserție este adăugată la grup și frecvența totală a grupului este crescută cu cât de des a fost adăugată inserția.Inserțiile adăugate la un grup sunt marcate ca utilizate și excluse de la procesarea ulterioară.Dacă secvența de inserare nu poate fi adăugată la un grup deja existent, secvența de inserare este utilizată pentru a crea un grup nou cu frecvența de inserare corespunzătoare și marcat ca utilizat.Iterația se termină atunci când fiecare secvență de inserție fie a fost folosită pentru a forma un grup nou, fie poate fi inclusă într-un grup deja existent.La urma urmei, inserțiile grupate constând din nucleotide sunt în cele din urmă traduse în secvențe de peptide (biblioteci de peptide).Rezultatul acestei analize este un set de inserții și frecvențele corespunzătoare care alcătuiesc numărul de citiri consecutive (Fig. 2 suplimentară).
Generarea de motive: Pe baza unei liste de peptide unice, a fost creată o bibliotecă care conține toate modelele posibile de aminoacizi (aa), așa cum se arată mai jos.Fiecare model posibil de lungime 3 a fost extras din peptidă și modelul său invers a fost adăugat împreună cu o bibliotecă de motive comună care conține toate modelele (tripeptide).Bibliotecile de motive foarte repetitive au fost secvențiate și redundanța eliminată.Apoi, pentru fiecare tripeptidă din biblioteca de motive, am verificat prezența acesteia în bibliotecă folosind instrumente de calcul.În acest caz, frecvența peptidei care conține tripeptidul motiv găsit este adăugată și atribuită motivului din biblioteca de motive („număr de motive”).Rezultatul generării motivelor este o matrice bidimensională care conține toate aparițiile tripeptidelor (motivelor) și valorile lor respective, care sunt numărul de citiri de secvențiere care au ca rezultat motivul corespunzător atunci când citirile sunt filtrate, grupate și traduse.Metrici așa cum este descris în detaliu mai sus.
Normalizarea numărului de motive și a graficelor de dispersie corespunzătoare: numărul de motive pentru fiecare probă a fost normalizat folosind
unde ni este numărul de citiri care conțin subiectul i.Astfel, vi reprezintă frecvența procentuală a citirilor (sau peptidelor) care conțin motivul i în probă.Valorile P pentru numărul nenormalizat de motive au fost calculate folosind testul exact al lui Fisher.În ceea ce privește corelogramele numărului de motive, corelațiile lui Spearman au fost calculate folosind numărul normalizat de motive cu R.
Pentru a vizualiza conținutul de aminoacizi la fiecare poziție din biblioteca de peptide, au fost create logogramele web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).În primul rând, conținutul de aminoacizi la fiecare poziție a peptidei 12-mer este stocat într-o matrice de 20x12.Apoi, un set de 1000 de peptide conţinând acelaşi conţinut relativ de aminoacizi la fiecare poziţie este generat în format de secvenţă fasta şi furnizat ca intrare în logo-ul web 3, care generează o reprezentare grafică a conţinutului relativ de aminoacizi la fiecare poziţie.pentru o anumită bibliotecă de peptide.Pentru a vizualiza seturi de date multidimensionale, hărțile termice au fost create folosind un instrument dezvoltat intern în R (biosHeatmap, un pachet R care nu a fost încă lansat).Dendrogramele prezentate în hărțile termice au fost calculate folosind metoda de grupare ierarhică a lui Ward cu metrica distanței euclidiene.Pentru analiza statistică a datelor de scorare a motivelor, valorile P pentru scorul nenormalizat au fost calculate utilizând testul exact al lui Fisher.Valorile P pentru alte seturi de date au fost calculate în R folosind testul t Student sau ANOVA.
Clonele de fagi selectate și fagii fără inserții au fost injectate intravenos prin vena cozii (2 x 1010 fagi/animal în 300 μl PBS).Zece minute înainte de perfuzie și fixare ulterioară, aceleași animale au fost injectate intravenos cu 100 μl de lectină marcată cu DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).La 60 de minute după injectarea cu fagi, șobolanii au fost perfuzați prin inimă cu 50 ml PBS urmat de 50 ml 4% PFA/PBS.Probele de creier au fost fixate suplimentar peste noapte în 4% PFA/PBS și înmuiate în zaharoză 30% peste noapte la 4°C.Probele sunt congelate rapid în amestecul OCT.Analiza imunohistochimică a probelor congelate a fost efectuată la temperatura camerei pe criosecțiuni de 30 µm blocate cu 1% BSA și incubate cu anticorpi marcați cu FITC policlonali împotriva fagului T7 (Novus NB 600-376A) la 4 °C.Se incubează peste noapte.În cele din urmă, secțiunile au fost spălate de 3 ori cu PBS și examinate cu un microscop laser confocal (Leica TCS SP5).
Toate peptidele cu o puritate minimă de 98% au fost sintetizate de GenScript USA, biotinilate și liofilizate.Biotina este legată printr-un distanțier suplimentar de triplu glicină la capătul N-terminal.Verificați toate peptidele folosind spectrometrie de masă.
Streptavidina (Sigma S0677) a fost amestecată cu un exces echimolar de 5 ori de peptidă biotinilată, peptidă inhibitoare BACE1 biotinilată sau o combinație (raport 3:1) de peptidă inhibitoare BACE1 biotinilată și peptidă inhibitoare BACE1 în 5-10% DMSO/incubat în PBS.1 oră la temperatura camerei înainte de injectare.Peptidele conjugate cu streptavidină au fost injectate intravenos într-o doză de 10 mg/kg într-una dintre venele cozii ale șobolanilor cu cavitate cerebrală.
Concentrația de complexe streptavidină-peptidă a fost evaluată prin ELISA.Plăcile de microtitrare Nunc Maxisorp (Sigma) au fost acoperite peste noapte la 4°C cu 1,5 μg/ml anticorp anti-streptavidină de șoarece (Thermo, MA1-20011).După blocare (tampon de blocare: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatină, 1% BSA) la temperatura camerei timp de 2 ore, se spală placa cu 0,05% Tween-20/PBS (tampon de spălare) timp de 3 secunde, s-au adăugat CSF și probele de plasmă de blocare: 0000000000000 CSF 1:115).Placa a fost apoi incubată peste noapte la 4°C cu anticorp de detectare (1 μg/ml, anti-streptavidină-HRP, Novus NB120-7239).După trei etape de spălare, streptavidina a fost detectată prin incubare în soluție de substrat TMB (Roche) timp de până la 20 de minute.După oprirea dezvoltării culorii cu H2SO4 1M, măsurați absorbanța la 450 nm.
Funcția complexului inhibitor streptavidină-peptidă-BACE1 a fost evaluată prin ELISA Ap(1-40) conform protocolului producătorului (Wako, 294-64701).Pe scurt, probele de LCR au fost diluate în diluant standard (1:23) și incubate peste noapte la 4°C în plăci cu 96 de godeuri acoperite cu anticorp de captură BNT77.După cinci etape de spălare, anticorpul BA27 conjugat cu HRP a fost adăugat şi incubat timp de 2 ore la 4°C, urmat de cinci etape de spălare.Ap (1-40) a fost detectat prin incubare în soluție de TMB timp de 30 de minute la temperatura camerei.După ce dezvoltarea culorii a fost oprită cu soluția stop, măsurați absorbanța la 450 nm.Probele de plasmă au fost supuse extracției în fază solidă înainte de ELISA Aβ(1-40).Plasma a fost adăugată la 0,2% DEA (Sigma) în plăci cu 96 de godeuri și incubată la temperatura camerei timp de 30 de minute.După spălarea succesivă a plăcilor SPE (Oasis, 186000679) cu apă și 100% metanol, probele de plasmă au fost adăugate pe plăcile SPE și tot lichidul a fost îndepărtat.Probele au fost spălate (mai întâi cu 5% metanol apoi 30% metanol) și eluate cu 2% NH4OH/90% metanol.După uscarea eluatului la 55°C timp de 99 de minute la curent constant de N2, probele au fost reduse în diluanți standard și Aβ(1-40) a fost măsurat așa cum este descris mai sus.
Cum să citez acest articol: Urich, E. et al.Livrarea mărfurilor către creier folosind peptide de tranzit identificate in vivo.știința.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB și Moos T. Livrarea de medicamente macromoleculare la creier folosind terapie țintită.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. și Martinez-Martinez, P. Livrarea medicamentelor cu peptide și proteine ​​peste bariera hematoencefalică.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Bariera hematoencefalică: un blocaj în dezvoltarea medicamentelor pentru creier.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, și Byrd, A. Perspective pentru livrarea de medicamente îmbunătățite și direcționarea către creier prin calea plexului coroid-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizarea produselor biofarmaceutice cu cai troieni moleculari pentru livrarea creierului.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10,1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transportul peptidei mediat de receptorul WM prin bariera hemato-encefalică.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. şi colab.Creșteți penetrarea creierului și eficacitatea anticorpilor terapeutici folosind navete moleculare monovalente.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. şi colab.Transportul receptorului de transferină (TfR) determină absorbția cerebrală a variantelor de afinitate ale anticorpilor TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).