Unele subiecte de depanare LC nu sunt niciodată depășite, deoarece există probleme în practica LC, chiar dacă tehnologia instrumentelor se îmbunătățește în timp. Există multe moduri în care problemele pot apărea într-un sistem LC și pot ajunge într-o formă slabă a vârfului. Când apar probleme legate de forma vârfului, o listă scurtă de cauze posibile pentru aceste rezultate ajută la simplificarea experienței noastre de depanare.
A fost distractiv să scriu această rubrică „LC Troubleshooting” și să mă gândesc la subiecte în fiecare lună, pentru că unele subiecte nu se demodează niciodată. În timp ce în domeniul cercetării cromatografiei anumite subiecte sau idei devin învechite deoarece sunt înlocuite cu idei mai noi și mai bune, în domeniul depanării, de când primul articol de depanare a apărut în acest jurnal (LC) încă din ultimii ani (193) sunt încă relevante. Am concentrat mai multe secțiuni de depanare LC pe tendințele contemporane care afectează cromatografia lichidă (LC) (de exemplu, comparația relativă a înțelegerii noastre a efectului presiunii asupra retenției [2] Noi progrese) Interpretarea rezultatelor LC și modul de depanare cu instrumentele LC moderne. depanare — elementele care sunt grozave pentru orice instrument de depanare sunt esențiale, indiferent de vârsta sistemului pe care îl folosim. Subiectul principal al acestei serii este foarte relevant pentru faimoasa diagramă de perete „LC Troubleshooting Guide” a LCGC (4) agățată în multe laboratoare. Pentru a treia parte a acestei serii, am ales să mă concentrez asupra problemelor legate de forma vârfului sau caracteristicile vârfurilor. toate aceste probleme în detaliu într-un singur articol, așa că în această primă tranșă pe acest subiect, mă voi concentra asupra unora dintre cele pe care le văd cel mai des. Sper că utilizatorii tineri și bătrâni LC vor găsi câteva sfaturi utile și mementouri pe acest subiect important.
Răspund din ce în ce mai mult la întrebările de depanare cu „orice este posibil”. Acest răspuns poate părea ușor atunci când iau în considerare observații greu de interpretat, dar mi se pare adesea adecvat. Având multe posibile cauze ale formei slabe a vârfului, este important să păstrăm o minte deschisă atunci când luăm în considerare care ar putea fi problema și să putem prioritiza cauzele potențiale pentru a începe să ne concentrăm asupra celor mai importante eforturi.
Un pas cheie în orice exercițiu de depanare – dar unul care cred că este subestimat – este recunoașterea faptului că există o problemă care trebuie rezolvată. Recunoașterea faptului că există o problemă înseamnă adesea să recunoaștem că ceea ce se întâmplă cu instrumentul este diferit de așteptările noastre, care sunt modelate de teorie, cunoștințe empirice și experiență (5). , pufos, marginea anterioară, coadă etc.), dar și la lățime. Așteptările noastre pentru forma reală a vârfului sunt simple. Teoria (6) susține bine așteptarea manualului conform căreia, în cele mai multe cazuri, vârfurile cromatografice ar trebui să fie simetrice și să se conformeze formei unei distribuții gaussiene, așa cum se arată în Figura 1a. în Figura 1, arată câteva dintre celelalte posibilități care ar putea fi observate – cu alte cuvinte, unele dintre modurile în care lucrurile ar putea merge prost. În restul acestei tranșe, vom petrece timp discutând câteva exemple specifice de situații care pot duce la aceste tipuri de forme.
Uneori, vârfurile nu sunt observate deloc în cromatogramă unde se așteaptă să fie eluate. Diagrama de perete de mai sus indică faptul că absența unui vârf (presupunând că proba conține de fapt analitul țintă la o concentrație care ar trebui să facă răspunsul detectorului suficient pentru a-l vedea deasupra zgomotului) este de obicei legată de unele probleme ale instrumentului sau de condiții incorecte de fază mobilă (dacă este observată deloc).vârfuri, de obicei prea „slabe”). O listă scurtă de probleme potențiale și soluții din această categorie poate fi găsită în Tabelul I.
După cum am menționat mai sus, întrebarea cu privire la cât de multă lărgire a vârfului trebuie tolerată înainte de a acorda atenție și de a încerca să o rezolv este un subiect complex pe care îl voi discuta într-un articol viitor. Experiența mea este că lărgirea semnificativă a vârfului este adesea însoțită de o schimbare semnificativă a formei vârfului, iar coada vârfului este mai frecventă decât pre-vârf sau divizare.
Fiecare dintre aceste probleme a fost discutată în detaliu în numerele anterioare ale Troubleshooting LC, iar cititorii interesați de aceste subiecte se pot referi la aceste articole anterioare pentru informații despre cauzele principale și potențialele soluții la aceste probleme.Mai multe detalii.
Peak tailing, vârful frontal și divizarea pot fi toate cauzate de fenomene chimice sau fizice, iar lista de soluții potențiale la aceste probleme variază foarte mult, în funcție de faptul că avem de-a face cu o problemă chimică sau fizică. Adesea, comparând diferitele vârfuri dintr-o cromatogramă, puteți găsi indicii importante despre care este vinovat. doar unul sau câteva vârfuri sunt afectate, dar restul arată bine, cauza este cel mai probabil chimică.
Cauzele chimice ale vârfurilor sunt prea complexe pentru a fi discutate pe scurt aici. Cititorul interesat este referit la numărul recent al „LC Troubleshooting” pentru o discuție mai aprofundată (10). Cu toate acestea, un lucru ușor de încercat este să reduceți masa analitului injectat și să vedeți dacă forma vârfului se îmbunătățește. mase mici de analit sau condițiile cromatografice trebuie modificate astfel încât să se poată obține forme bune de vârf chiar și cu mase mai mari injectate.
Există, de asemenea, multe motive fizice potențiale pentru apariția vârfurilor. Cititorii interesați într-o discuție detaliată a posibilităților sunt referiți la o altă ediție recentă a „LC Troubleshooting” (11). Una dintre cele mai frecvente cauze fizice ale vârfurilor este o conexiune slabă la un punct între injector și detector (12). nu am folosit înainte și am instalat o buclă de injecție de volum mic cu o virolă care a fost turnată pe un capilar din oțel inoxidabil. După câteva experimente inițiale de depanare, ne-am dat seama că adâncimea portului din statorul supapei de injecție era mult mai adâncă decât eram obișnuiți, rezultând un volum mort mare în partea de jos a portului. volumul mort din partea de jos a portului.
Fronturile de vârf, precum cele prezentate în Figura 1e, pot fi cauzate și de probleme fizice sau chimice. O cauză fizică comună a marginii de avans este că patul de particule al coloanei nu este bine împachetat sau că particulele s-au reorganizat în timp. Ca ​​și în cazul coziului de vârf cauzat de acest fenomen fizic, cel mai bun mod de a rezolva acest lucru este înlocuirea coloanei și menținerea deseori în formă. „liniare” condiții de retenție. În condiții ideale (liniare), cantitatea de analit reținută de faza staționară (deci, factorul de retenție) este liniar legată de concentrația analitului în coloană. Din punct de vedere cromatografic, aceasta înseamnă că, pe măsură ce masa de analit injectată în coloană crește, vârful devine mai înalt, dar nu și mai mare. r pe măsură ce se injectează mai multă masă. În plus, formele neliniare determină forma vârfurilor cromatografice, rezultând margini de avans sau de fugă. Ca și în cazul supraîncărcării de masă care provoacă un pic de coadă (10), vârful de avans cauzat de retenția neliniară poate fi diagnosticat și prin reducerea masei analitului injectat. trebuie schimbat pentru a minimiza acest comportament.
Uneori observăm ceea ce pare a fi un vârf „divizat”, așa cum se arată în Figura 1f. Primul pas în rezolvarea acestei probleme este de a determina dacă forma vârfului se datorează co-eluției parțiale (adică, prezența a doi compuși diferiți, dar aproape eluați). Vârfurile t” sunt legate de fizic Performanța nu are nimic de-a face cu coloana în sine. Adesea, cel mai important indiciu pentru această decizie este dacă toate vârfurile din cromatogramă prezintă forme divizate, sau doar una sau două. Dacă este doar una sau două, probabil că este o problemă de co-eluție;dacă toate vârfurile sunt împărțite, probabil că este o problemă fizică, cel mai probabil legată de coloana în sine.
Picurile divizate legate de proprietățile fizice ale coloanei în sine se datorează de obicei fritului parțial blocat de intrare sau ieșire sau reorganizării particulelor în coloană, permițând fazei mobile să curgă mai repede decât faza mobilă în anumite zone ale formării canalului coloanei. în alte regiuni (11). Fritul parțial înfundat poate fi uneori curățat prin inversarea fluxului prin coloană;cu toate acestea, din experiența mea, aceasta este de obicei o soluție pe termen scurt, mai degrabă decât o soluție pe termen lung. Aceasta este adesea fatală cu coloanele moderne dacă particulele se recombină în interiorul coloanei. În acest moment, cel mai bine este să înlocuiți coloana și să continuați.
Vârful din Figura 1g, de asemenea dintr-un exemplu recent din propriul meu laborator, indică de obicei că semnalul este atât de mare încât a atins limita înaltă a intervalului de răspuns. Pentru detectoarele optice de absorbție (UV-vis în acest caz), când concentrația analitului este foarte mare, analitul absoarbe cea mai mare parte a luminii care trece prin celula de flux a detectorului, lăsând foarte puțină lumină să fie detectată de diferite surse electrice, influențate de diferite surse electrice. de zgomot, cum ar fi lumina parazită și „curent întunecat”, făcând semnalul foarte „neclar” ca aspect și independent de concentrația analitului.Când se întâmplă acest lucru, problema poate fi adesea rezolvată cu ușurință prin reducerea volumului de injectare al analitului - reducerea volumului de injectare, diluarea probei sau ambele.
În școala de cromatografie, folosim semnalul detectorului (adică, axa y din cromatogramă) ca indicator al concentrației de analit din probă. Așa că pare ciudat să vezi o cromatogramă cu un semnal sub zero, deoarece interpretarea simplă este că aceasta indică o concentrație negativă a analitului - ceea ce, desigur, nu este posibil fizic. În experiența mea, vârfurile negative sunt observate de cele mai multe ori când se folosesc detectoare optice, de absorbție UV.
În acest caz, un vârf negativ înseamnă pur și simplu că moleculele care eluează din coloană absorb mai puțină lumină decât faza mobilă însăși imediat înainte și după vârf. Acest lucru poate apărea, de exemplu, atunci când se utilizează lungimi de undă de detecție relativ scăzute (<230 nm) și aditivi de fază mobilă care absorb cea mai mare parte a luminii la aceste lungimi de undă. vârfuri pentru a pregăti o curbă de calibrare și a obține informații cantitative precise, deci nu există un motiv fundamental pentru a le evita în sine (această metodă este uneori denumită „detecție UV indirectă”) (13). Cu toate acestea, dacă vrem cu adevărat să evităm vârfurile negative, în cazul detectării absorbanței, cea mai bună soluție este să folosim o altă lungime de undă de detecție, astfel încât să absoarbă mai puțin faza mobilă decât faza mobilă, astfel încât să absoarbă mai puțin faza mobilă decât faza analitică. decât analiții.
Picurile negative pot apărea și atunci când se utilizează detecția indicelui de refracție (RI) atunci când indicele de refracție al altor componente decât analitul din probă, cum ar fi matricea solventului, este diferit de indicele de refracție al fazei mobile. Acest lucru se întâmplă și cu detecția UV-vis, dar acest efect tinde să fie atenuat în raport cu detecția RI. faza mobilă.
În partea a treia, despre subiectul de bază al depanării LC, am discutat situații în care forma vârfului observată diferă de forma maximă așteptată sau normală. Depanarea eficientă a unor astfel de probleme începe cu cunoașterea formelor vârfurilor așteptate (pe baza teoriei sau a experienței anterioare cu metodele existente), astfel încât abaterile de la aceste așteptări sunt evidente. motivele pe care le văd cel mai des. Cunoașterea acestor detalii oferă un loc bun pentru a începe depanarea, dar nu surprinde toate posibilitățile. Cititorii interesați de o listă mai detaliată de cauze și soluții pot consulta diagrama de perete LCGC „Ghid de depanare LC”.
(4) Diagramă de perete „LC Troubleshooting Guide” LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF și Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.