Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Biopsia lichidă (LB) este un concept care câștigă rapid popularitate în domeniul biomedical.Conceptul se bazează în principal pe detectarea fragmentelor de ADN extracelular circulant (ccfDNA), care sunt eliberate în principal sub formă de fragmente mici după moartea celulelor în diferite țesuturi.O mică parte din aceste fragmente provin din țesuturi sau organisme străine (străine).În lucrările curente, am aplicat acest concept la midii, o specie santinelă cunoscută pentru capacitatea mare de filtrare a apei de mare.Folosim capacitatea midii de a acționa ca filtre naturale pentru a captura fragmente de ADN din mediu dintr-o varietate de surse pentru a oferi informații despre biodiversitatea ecosistemelor marine de coastă.Rezultatele noastre arată că hemolimfa de midii conține fragmente de ADN care variază foarte mult ca mărime, de la 1 la 5 kb.Secvențierea cu pușcă a arătat că un număr mare de fragmente de ADN sunt de origine microbiană străină.Printre acestea, am găsit fragmente de ADN de la bacterii, arhee și viruși, inclusiv viruși despre care se știe că infectează o varietate de gazde întâlnite în mod obișnuit în ecosistemele marine de coastă.În concluzie, studiul nostru demonstrează că conceptul de LB aplicat midii reprezintă o sursă bogată, dar încă neexplorată de cunoștințe despre diversitatea microbiană în ecosistemele marine de coastă.
Impactul schimbărilor climatice (CC) asupra biodiversității ecosistemelor marine este un domeniu de cercetare în creștere rapidă.Încălzirea globală nu numai că provoacă stresuri fiziologice importante, ci și împinge limitele evolutive ale stabilității termice a organismelor marine, afectând habitatul unui număr de specii, determinându-le să caute condiții mai favorabile [1, 2].Pe lângă faptul că afectează biodiversitatea metazoarelor, CC perturbă echilibrul delicat al interacțiunilor gazdă-microbiene.Această disbacterioză microbiană reprezintă o amenințare serioasă pentru ecosistemele marine, deoarece face organismele marine mai susceptibile la agenții patogeni infecțioși [3, 4].Se crede că SS joacă un rol important în decesele în masă, ceea ce reprezintă o problemă serioasă pentru gestionarea ecosistemelor marine globale [5, 6].Aceasta este o problemă importantă, având în vedere impactul economic, ecologic și nutrițional al multor specii marine.Acest lucru este valabil mai ales pentru bivalvele care trăiesc în regiunile polare, unde efectele CK sunt mai imediate și mai severe [6, 7].De fapt, bivalvele precum Mytilus spp.sunt utilizate pe scară largă pentru a monitoriza efectele CC asupra ecosistemelor marine.Nu este surprinzător că un număr relativ mare de biomarkeri au fost dezvoltați pentru a le monitoriza sănătatea, adesea folosind o abordare pe două niveluri care implică biomarkeri funcționali bazați pe activitatea enzimatică sau pe funcții celulare, cum ar fi viabilitatea celulară și activitatea fagocitară [8].Aceste metode includ și măsurarea concentrației indicatorilor specifici de presiune care se acumulează în țesuturile moi după absorbția unor cantități mari de apă de mare.Cu toate acestea, capacitatea mare de filtrare și sistemul circulator semi-deschis al bivalvelor oferă o oportunitate de a dezvolta noi biomarkeri hemolimfei folosind conceptul de biopsie lichidă (LB), o abordare simplă și minim invazivă a managementului pacientului.probe de sânge [9, 10].Deși mai multe tipuri de molecule circulante pot fi găsite în LB uman, acest concept se bazează în primul rând pe analiza secvențierii ADN a fragmentelor circulante de ADN extracelular (ccfDNA) din plasmă.De fapt, prezența ADN-ului circulant în plasma umană este cunoscută încă de la mijlocul secolului al XX-lea [11], dar abia în ultimii ani apariția metodelor de secvențiere cu randament ridicat a condus la un diagnostic clinic bazat pe ccfDNA.Prezența acestor fragmente de ADN circulant se datorează în parte eliberării pasive a ADN-ului genomic (nuclear și mitocondrial) după moartea celulei. La indivizii sănătoși, concentrația de ccfDNA este în mod normal scăzută (<10 ng/mL), dar poate fi crescută de 5-10 ori la pacienții care suferă de diverse patologii sau supuși la stres, rezultând leziuni tisulare. La indivizii sănătoși, concentrația de ccfDNA este în mod normal scăzută (<10 ng/mL), dar poate fi crescută de 5-10 ori la pacienții care suferă de diverse patologii sau supuși la stres, rezultând leziuni tisulare. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. La persoanele sănătoase, concentrația de cccDNA este în mod normal scăzută (<10 ng/mL), dar poate crește de 5-10 ori la pacienții cu diverse patologii sau sub stres care duce la afectarea țesuturilor.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或病理或承常较低（<10 ng/mL）加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 傯忣 或 扏 手 戏 扏增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелить увелича ны по 10 у здоровых людей с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Concentrațiile de ccfDNA sunt de obicei scăzute (<10 ng/ml) la indivizii sănătoși, dar pot fi crescute de 5-10 ori la pacienții cu diverse patologii sau stres, ducând la leziuni tisulare.Mărimea fragmentelor ccfADN variază foarte mult, dar de obicei variază de la 150 la 200 bp.[12].Analiza ccfDNA auto-derivată, adică ccfDNA din celule gazdă normale sau transformate, poate fi utilizată pentru a detecta modificări genetice și epigenetice prezente în genomul nuclear și/sau mitocondrial, ajutând astfel clinicienii să selecteze terapii specifice moleculare țintite [13] .Cu toate acestea, ccfDNA poate fi obținut din surse străine, cum ar fi ccfDNA din celulele fetale în timpul sarcinii sau din organe transplantate [14,15,16,17].ccfDNA este, de asemenea, o sursă importantă de informații pentru detectarea prezenței acizilor nucleici ai unui agent infecțios (străin), care permite detectarea neinvazivă a infecțiilor răspândite neidentificate prin hemoculturi, evitând biopsia invazivă a țesutului infectat [18].Studii recente au arătat într-adevăr că sângele uman conține o sursă bogată de informații care poate fi folosită pentru a identifica agenții patogeni virali și bacterieni și că aproximativ 1% din ADNccc găsit în plasma umană este de origine străină [19].Aceste studii demonstrează că biodiversitatea microbiomului circulant al unui organism poate fi evaluată folosind analiza ccfDNA.Cu toate acestea, până de curând, acest concept a fost folosit exclusiv la oameni și, într-o măsură mai mică, la alte vertebrate [20, 21].
În lucrarea de față, folosim potențialul LB pentru a analiza ccfADN-ul Aulacomya atra, o specie sudică întâlnită în mod obișnuit în Insulele Kerguelen subantarctice, un grup de insule aflate în vârful unui platou mare care s-a format acum 35 de milioane de ani.erupție vulcanică.Folosind un sistem experimental in vitro, am constatat că fragmentele de ADN din apa de mare sunt preluate rapid de midii și intră în compartimentul hemolimfei.Secvențierea cu pușcă a arătat că ADN-ul hemolimfei de midii conține fragmente de ADN de origine proprie și non-auto, inclusiv bacterii simbiotice și fragmente de ADN din biomi tipici ecosistemelor marine de coastă vulcanice reci.Hemolimfa ccfDNA conține, de asemenea, secvențe virale derivate din viruși cu diferite game de gazdă.De asemenea, am găsit fragmente de ADN de la animale multicelulare, cum ar fi pești osoși, anemone de mare, alge și insecte.În concluzie, studiul nostru demonstrează că conceptul LB poate fi aplicat cu succes nevertebratelor marine pentru a genera un repertoriu genomic bogat în ecosistemele marine.
Adulti (55-70 mm lungime) Mytilus platensis (M. platensis) si Aulacomya atra (A. atra) au fost colectati de pe tarmurile stancoase intertidale din Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Insulele Kerguelen în decembrie 2018. Alte midii albastre adulte (Mytilus spp.) au fost obținute de la un furnizor comercial (PEI Mussel King Inc., Insula Prince Edward, Canada) și plasate într-un rezervor aerat cu temperatură controlată (4°C) care conține 10–20 L de saramură artificială 32‰.(sare de mare artificială Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SUA).Pentru fiecare experiment, au fost măsurate lungimea și greutatea cochiliilor individuale.
Un protocol gratuit de acces deschis pentru acest program este disponibil online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Pe scurt, hemolimfa LB a fost colectată din mușchii abductori așa cum este descris [22].Hemolimfa a fost clarificată prin centrifugare la 1200 x g timp de 3 minute, supernatantul a fost congelat (-20°C) până la utilizare.Pentru izolarea și purificarea cfDNA, probele (1,5-2,0 ml) au fost dezghețate și procesate folosind trusa NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) conform instrucțiunilor producătorului.ccfDNA a fost păstrat la -80°C până la o analiză ulterioară.În unele experimente, ccfDNA a fost izolat și purificat folosind kit-ul QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).ADN-ul purificat a fost cuantificat utilizând un test PicoGreen standard.Distribuția fragmentelor de ccfADN izolat a fost analizată prin electroforeză capilară utilizând un bioanalizator Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) utilizând un kit ADN de înaltă sensibilitate.Analiza a fost efectuată utilizând 1 pl de probă de ccfADN conform instrucțiunilor producătorului.
Pentru secvențierea fragmentelor de hemolimf ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) a pregătit biblioteci de puști folosind kitul Illumina DNA Mix al kit-ului Illumina MiSeq PE75.A fost folosit un adaptor standard (BioO).Fișierele de date brute sunt disponibile din Arhiva de citire a secvenței NCBI (SRR8924808 și SRR8924809).Calitatea de bază a lecturii a fost evaluată folosind FastQC [23].Trimmomatic [24] a fost folosit pentru adaptoare de tăiere și citiri de proastă calitate.Citirile de puști cu capete împerecheate au fost îmbinate FLASH în citiri unice mai lungi, cu o suprapunere minimă de 20 bp pentru a evita nepotrivirile [25]. Citirile îmbinate au fost adnotate cu BLASTN utilizând o bază de date de taxonomie NCBI de bivalve (valoarea e < 1e-3 și omologie de 90%), iar mascarea secvențelor de complexitate scăzută a fost efectuată folosind DUST [26]. Citirile îmbinate au fost adnotate cu BLASTN utilizând o bază de date de taxonomie NCBI de bivalve (valoarea e < 1e-3 și omologie de 90%), iar mascarea secvențelor de complexitate scăzută a fost efectuată folosind DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннтированы оллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой низкой сло ножной слологии пользованием PRAF [26]. Citirile grupate au fost adnotate cu BLASTN utilizând baza de date de taxonomie bivalve NCBI (valoarea e < 1e-3 și omologie de 90%) și mascarea secvenței de complexitate scăzută a fost efectuată folosind DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数并的诌数诌数＿， 同源性）用BLASTN低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 Ａ 迻数 Ｈ ， 源）复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичесанкой сономичесанкой сономичеснкой сованием тых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей нислокобы низологии с использованием PRAF [26]. Citirile grupate au fost adnotate cu BLASTN utilizând baza de date taxonomică de bivalve NCBI (valoarea e <1e-3 și omologie de 90%), iar mascarea secvenței de complexitate scăzută a fost efectuată folosind DUST [26].Citirile au fost împărțite în două grupe: legate de secvențe de bivalve (numite aici auto-citește) și fără legătură (non-self-citit).Două grupuri au fost asamblate separat folosind MEGAHIT pentru a genera contigs [27].Între timp, distribuția taxonomică a citirilor microbiomului extraterestră a fost clasificată folosind Kraken2 [28] și reprezentată grafic printr-o diagramă circulară Krona pe Galaxy [29, 30].Din experimentele noastre preliminare, s-a determinat kmeri optimi a fi kmeri-59. Auto-contigii au fost apoi identificați prin alinierea cu BLASTN (bază de date NCBI bivalve, valoarea e < 1e-10 și 60% omologie) pentru o adnotare finală. Auto-contigii au fost apoi identificați prin alinierea cu BLASTN (bază de date NCBI bivalve, valoarea e < 1e-10 și 60% omologie) pentru o adnotare finală. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN BI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Auto-contigii au fost apoi identificați prin potrivirea cu BLASTN (baza de date de bivalve NCBI, valoare e <1e-10 și omologie de 60%) pentru adnotarea finală.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识对齐来识堫褛臍西褛与最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтвенные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Auto-contigii au fost apoi identificați pentru adnotarea finală prin potrivirea cu BLASTN (baza de date de bivalve NCBI, valoarea e <1e-10 și 60% omologie). În paralel, conturile de grup nonself au fost adnotate cu BLASTN (baza de date nt NCBI, valoarea e < 1e-10 și 60% omologie). În paralel, conturile de grup nonself au fost adnotate cu BLASTN (baza de date nt NCBI, valoarea e < 1e-10 și 60% omologie). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN гомология 60%). În paralel, conturile grupurilor străine au fost adnotate cu BLASTN (baza de date NT NCBI, valoarea e <1e-10 și 60% omologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组釤。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤」叠组釤。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощьд ачение e <1e-10 и гомология 60%). În paralel, contigs non-self-grup au fost adnotați cu BLASTN (baza de date nt NCBI, valoarea e <1e-10 și 60% omologie). BLASTX a fost, de asemenea, efectuat pe contig nonself folosind bazele de date NCBI de proteine ​​nr și RefSeq (valoarea e < 1e-10 și omologie de 60%). BLASTX a fost, de asemenea, efectuat pe contig nonself folosind bazele de date NCBI de proteine ​​nr și RefSeq (valoarea e < 1e-10 și omologie de 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка беле на 10 și гомология 60%). BLASTX a fost, de asemenea, efectuat pe contigi non-self folosind bazele de date de proteine ​​nr și RefSeq NCBI (valoarea e < 1e-10 și 60% omologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性怼 性 60%。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性怼 性 60%。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безных белка NC 10 e 10 гомология 60%). BLASTX a fost, de asemenea, efectuat pe contigi non-self folosind bazele de date de proteine ​​nr și RefSeq NCBI (valoarea e <1e-10 și omologie de 60%).Pool-urile BLASTN și BLASTX de non-contig-uri reprezintă contig-urile finale (a se vedea fișierul suplimentar).
Primerii utilizați pentru PCR sunt enumerați în Tabelul S1.Taq ADN polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) a fost utilizată pentru a amplifica genele țintă ccfDNA.Au fost utilizate următoarele condiții de reacție: denaturare la 95°C timp de 3 minute, 95°C timp de 1 minut, temperatura de recoacere stabilită pentru 1 minut, alungire la 72°C timp de 1 minut, 35 de cicluri și în final 72°C în 10 minute..Produsele PCR au fost separate prin electroforeză în geluri de agaroză (1,5%) care conțineau SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) la 95 V.
Midiile (Mytilus spp.) au fost aclimatizate în 500 ml apă de mare oxigenată (32 PSU) timp de 24 de ore la 4°C.ADN-ul plasmidic care conține o inserție care codifică secvența de ADNc galectin-7 uman (număr de acces NCBI L07769) a fost adăugat în flacon la o concentrație finală de 190 μg/μl.Midiile incubate în aceleași condiții fără adăugare de ADN au fost martor.Al treilea rezervor de control conținea ADN fără scoici.Pentru a monitoriza calitatea ADN-ului din apa de mare, din fiecare rezervor au fost prelevate probe de apă de mare (20 μl; trei repetări) la ora indicată.Pentru trasabilitatea ADN-ului plasmid, midiile LB au fost recoltate la momentele indicate și analizate prin qPCR și ddPCR.Datorită conținutului ridicat de sare al apei de mare, alicotele au fost diluate în apă de calitate PCR (1:10) înainte de toate testele PCR.
PCR cu picături digitale (ddPCR) a fost efectuată utilizând protocolul BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Utilizați profilul de temperatură pentru a determina temperatura optimă (Tabelul S1).Picăturile au fost generate folosind un generator de picături QX200 (BioRad).ddPCR a fost efectuat după cum urmează: 95°C timp de 5 minute, 50 de cicluri de 95°C timp de 30 s și o temperatură dată de recoacere timp de 1 min și 72°C timp de 30 s, 4°C timp de 5 minute și 90°C în 5 minute.Numărul de picături și reacțiile pozitive (număr de copii/pl) au fost măsurate utilizând un cititor de picături QX200 (BioRad).Probele cu mai puțin de 10.000 de picături au fost respinse.Controlul modelului nu a fost efectuat de fiecare dată când a fost executat ddPCR.
qPCR a fost efectuată utilizând primeri specifici Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) și LGALS7.Toate PCR-urile cantitative au fost efectuate în 20 pl utilizând Kit-ul QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).qPCR a fost începută cu o incubare de 15 minute la 95°C urmată de 40 de cicluri la 95°C timp de 10 secunde și la 60°C timp de 60 de secunde cu o colectare de date.Curbele de topire au fost generate utilizând măsurători succesive la 95°C timp de 5 s, 65°C timp de 60 s și 97°C la sfârșitul qPCR.Fiecare qPCR a fost efectuat în trei exemplare, cu excepția probelor de control.
Deoarece midiile sunt cunoscute pentru rata lor mare de filtrare, am investigat mai întâi dacă ar putea filtra și reține fragmentele de ADN prezente în apa de mare.De asemenea, ne-a interesat dacă aceste fragmente se acumulează în sistemul lor limfatic semideschis.Am rezolvat această problemă experimental, urmărind soarta fragmentelor de ADN solubile adăugate în rezervoarele de midii albastre.Pentru a facilita urmărirea fragmentelor de ADN, am folosit ADN plasmidic străin (nu auto) care conține gena galectin-7 umană.ddPCR urmărește fragmente de ADN plasmidic în apa de mare și scoici.Rezultatele noastre arată că, dacă cantitatea de fragmente de ADN din apa de mare a rămas relativ constantă în timp (până la 7 zile) în absența midii, atunci în prezența midii acest nivel a dispărut aproape complet în 8 ore (Fig. 1a,b).Fragmente de ADN exogen au fost detectate cu ușurință în 15 minute în lichidul intravalvular și hemolimfă (Fig. 1c).Aceste fragmente pot fi detectate în continuare până la 4 ore după expunere.Această activitate de filtrare în ceea ce privește fragmentele de ADN este comparabilă cu activitatea de filtrare a bacteriilor și algelor [31].Aceste rezultate sugerează că midiile pot filtra și acumula ADN străin în compartimentele lor fluide.
Concentrații relative de ADN plasmidic în apa de mare în prezența (A) sau absența (B) de midii, măsurate prin ddPCR.În A, rezultatele sunt exprimate în procente, marginile casetelor reprezentând percentilele 75 și 25.Curba logaritmică ajustată este afișată în roșu, iar zona umbrită în gri reprezintă intervalul de încredere de 95%.În B, linia roșie reprezintă media, iar linia albastră reprezintă intervalul de încredere de 95% pentru concentrație.C Acumularea de ADN plasmidic în hemolimfă și lichidul valvular al midii la momente diferite după adăugarea ADN-ului plasmid.Rezultatele sunt prezentate ca copii absolute detectate/ml (±SE).
Apoi, am investigat originea ccfDNA în midii colectate din paturile de midii de pe Insulele Kerguelen, un grup îndepărtat de insule cu influență antropică limitată.În acest scop, cccDNA din hemolimfe de midii a fost izolat și purificat prin metode utilizate în mod obișnuit pentru a purifica cccDNA uman [32, 33].Am constatat că concentrațiile medii ale hemolimfei ccfDNA la midii sunt în intervalul mic de micrograme per ml hemolimfă (a se vedea Tabelul S2, Informații suplimentare).Acest interval de concentrații este mult mai mare decât la persoanele sănătoase (nanograme mici pe mililitru), dar în cazuri rare, la pacienții cu cancer, nivelul ccfDNA poate ajunge la câteva micrograme pe mililitru [34, 35].O analiză a distribuției mărimii hemolimfei ccfDNA a arătat că aceste fragmente variază foarte mult ca mărime, variind de la 1000 bp la 1000 bp.până la 5000 bp (Fig. 2).Rezultate similare au fost obținute folosind kit-ul QIAamp Investigator pe bază de silice, o metodă utilizată în mod obișnuit în știința criminalistică pentru a izola și purifica rapid ADN-ul genomic din probe de ADN cu concentrație scăzută, inclusiv ccfDNA [36].
Electroforegrama ccfDNA reprezentativă a hemolimfei midii.Extras cu NucleoSnap Plasma Kit (sus) și QIAamp DNA Investigator Kit.B Diagrama de vioară care arată distribuția concentrațiilor de ccfDNA hemolimfei (±SE) la midii.Liniile negre și roșii reprezintă mediana și, respectiv, primul și al treilea quartile.
Aproximativ 1% din ccfDNA la oameni și primate are o sursă străină [21, 37].Având în vedere sistemul circulator semi-deschis al bivalvelor, apa de mare bogată în microbi și distribuția dimensiunii ccfADN-ului de midii, am emis ipoteza că hemolimfa ccfDNA de midii poate conține un bazin bogat și divers de ADN microbian.Pentru a testa această ipoteză, am secvențiat hemolimfa ccfDNA din probele de Aulacomya atra colectate din Insulele Kerguelen, producând peste 10 milioane de citiri, dintre care 97,6% au trecut controlul de calitate.Citirile au fost apoi clasificate în funcție de sursele proprii și non-self folosind bazele de date de bivalve BLASTN și NCBI (Fig. S1, Informații suplimentare).
La om, atât ADN-ul nuclear, cât și cel mitocondrial pot fi eliberați în fluxul sanguin [38].Cu toate acestea, în studiul de față, nu a fost posibil să se descrie în detaliu ADN-ul genomic nuclear al midii, având în vedere că genomul A. atra nu a fost secvențiat sau descris.Cu toate acestea, am reușit să identificăm o serie de fragmente ccfADN de origine proprie folosind biblioteca de bivalve (Fig. S2, informații suplimentare).De asemenea, am confirmat prezența fragmentelor de ADN de origine proprie prin amplificarea PCR direcționată a acelor gene A. atra care au fost secvențiate (Fig. 3).În mod similar, având în vedere că genomul mitocondrial al A. atra este disponibil în bazele de date publice, se pot găsi dovezi pentru prezența fragmentelor mitocondriale ccfDNA în hemolimfa A. atra.Prezența fragmentelor de ADN mitocondrial a fost confirmată prin amplificare PCR (Fig. 3).
Diverse gene mitocondriale au fost prezente în hemolimfa A. atra (puncte roșii – număr stoc: SRX5705969) și M. platensis (puncte albastre – număr stoc: SRX5705968) amplificate prin PCR.Figura adaptată după Breton și colab., 2011 B Amplificarea supernatantului hemolimfei din A. atra Stocat pe hârtie FTA.Utilizați un perforator de 3 mm pentru a adăuga direct la tubul PCR care conține amestecul PCR.
Având în vedere conținutul abundent de microbi din apa de mare, ne-am concentrat inițial pe caracterizarea secvențelor de ADN microbian din hemolimfă.Pentru a face acest lucru, folosim două strategii diferite.Prima strategie a folosit Kraken2, un program de clasificare a secvențelor bazat pe algoritm care poate identifica secvențele microbiene cu o acuratețe comparabilă cu BLAST și alte instrumente [28].Mai mult de 6719 citiri au fost determinate a fi de origine bacteriană, în timp ce 124 și 64 au fost de la arhee și, respectiv, viruși (Fig. 4).Cele mai abundente fragmente de ADN bacterian au fost Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) și Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Această distribuție este în concordanță cu studiile anterioare ale microbiomului midii albastre marine [39, 40].Gammaproteobacterii au fost clasa principală de Proteobacterii (44%), inclusiv multe Vibronales (Fig. 4b).Metoda ddPCR a confirmat prezența fragmentelor de ADN Vibrio în ccfDNA al hemolimfei A. atra (Fig. 4c) [41].Pentru a obține mai multe informații despre originea bacteriană a ccfDNA, a fost luată o abordare suplimentară (Fig. S2, Informații suplimentare). În acest caz, citirile suprapuse au fost asamblate ca citiri de sfârșit pereche și au fost clasificate ca de origine proprie (bivalve) sau nonself folosind BLASTN și o valoare e de 1e-3 și o limită cu omologie > 90%. În acest caz, citirile suprapuse au fost asamblate ca citiri de sfârșit pereche și au fost clasificate ca de origine proprie (bivalve) sau nonself folosind BLASTN și o valoare e de 1e-3 și o limită cu omologie > 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны обственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и 1e-3сен и 1-3сея с гомологией> 90%. În acest caz, citirile suprapuse au fost colectate ca citiri cu capete perechi și au fost clasificate ca native (bivalve) sau non-originale folosind BLASTN și valoarea e de 1e-3 și cutoff cu > 90% omologie.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倢 倢 倢 倢 末 端读数，并使用BLASTN值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 用 用 3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и концами и классонка собраны енные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием зованием зованием зованием зернач знач происхождению мологии> 90%. În acest caz, citirile suprapuse au fost colectate ca citiri cu sfârșit de pereche și clasificate ca proprii (bivalve) sau neoriginale folosind valorile e BLASTN și 1e-3 și un prag de omologie > 90%.Deoarece genomul A. atra nu a fost încă secvențiat, am folosit strategia de asamblare de novo a asamblatorului MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Un total de 147.188 de contigs au fost identificați ca dependenți (bivalve) de origine.Aceste contigs au fost apoi explodate cu valori e de 1e-10 folosind BLASTN și BLASTX.Această strategie ne-a permis să identificăm 482 de fragmente non-bivalve prezente în A. atra ccfDNA.Mai mult de jumătate (57%) din aceste fragmente de ADN au fost obținute din bacterii, în principal din simbioți branhiali, inclusiv simbioți sulfotrofici, și din simbioți branhiali Solemya velum (Fig. 5).
Abundență relativă la nivel de tip.B Diversitatea microbiană a două phyla principale (Firmicute și Proteobacterii).Amplificarea reprezentativă a ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmente ale genei ARNr 16S (albastru) în trei hemolimfe atra.
Au fost analizate un total de 482 de conturi colectate.Profilul general al distribuției taxonomice a adnotărilor contig metagenomice (procariote și eucariote).B Distribuția detaliată a fragmentelor de ADN bacterian identificate prin BLASTN și BLASTX.
Analiza Kraken2 a arătat, de asemenea, că ccfDNA de midii conține fragmente de ADN arheal, inclusiv fragmente de ADN de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) și Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Prezența fragmentelor de ADN derivate din Euryarchaeota și Crenarchaeota, găsite anterior în comunitatea microbiană a midii din California, nu ar trebui să surprindă [42].Deși Euryarchaeota este adesea asociată cu condiții extreme, acum este recunoscut că atât Euryarchaeota, cât și Crenarcheota sunt printre cele mai comune procariote din mediul criogenic marin [43, 44].Prezența microorganismelor metanogene în midii nu este surprinzătoare, având în vedere rapoarte recente despre scurgeri extinse de metan din scurgerile de fund de pe platoul Kerguelen [45] și posibila producție microbiană de metan observată în largul coastei Insulelor Kerguelen [46].
Atenția noastră s-a îndreptat apoi către citirile de la virușii ADN.Din câte cunoștințele noastre, acesta este primul studiu în afara țintei privind conținutul de virus al midii.După cum era de așteptat, am găsit fragmente de ADN ale bacteriofagelor (Caudovirales) (Fig. 6b).Cu toate acestea, cel mai comun ADN viral provine dintr-un filum de nucleocitovirusuri, cunoscut și sub numele de virusul ADN-ului mare citoplasmatic nuclear (NCLDV), care are cel mai mare genom dintre orice virus.În cadrul acestui filum, cele mai multe secvențe ADN aparțin familiilor Mimimidoviridae (58%) și Poxviridae (21%), ale căror gazde naturale includ vertebrate și artropode, în timp ce o mică parte din aceste secvențe ADN aparțin algelor virologice cunoscute.Infectează algele eucariote marine.Secvențele au fost, de asemenea, obținute din virusul Pandora, virusul gigant cu cea mai mare dimensiune a genomului dintre toate genurile virale cunoscute.Interesant este că gama de gazde cunoscute a fi infectate cu virusul, determinată de secvențierea hemolimfei ccfDNA, a fost relativ mare (Figura S3, Informații suplimentare).Include viruși care infectează insecte precum Baculoviridae și Iridoviridae, precum și viruși care infectează ameba, algele și vertebratele.Am găsit, de asemenea, secvențe care se potrivesc cu genomul Pithovirus sibericum.Pitovirusurile (cunoscute și ca „virusuri zombi”) au fost izolate pentru prima dată din permafrostul vechi de 30.000 de ani din Siberia [47].Astfel, rezultatele noastre sunt în concordanță cu rapoartele anterioare care arată că nu toate speciile moderne ale acestor viruși sunt dispărute [48] și că acești virusuri pot fi prezenți în ecosistemele marine subarctice îndepărtate.
În cele din urmă, am testat pentru a vedea dacă am putea găsi fragmente de ADN de la alte animale multicelulare.Un total de 482 de contig străini au fost identificați de BLASTN și BLASTX cu bibliotecile nt, nr și RefSeq (genomice și proteine).Rezultatele noastre arată că printre fragmentele străine de ccfDNA ale animalelor multicelulare predomină ADN-ul oaselor osoase (Fig. 5).Au fost găsite și fragmente de ADN de la insecte și alte specii.O parte relativ mare a fragmentelor de ADN nu a fost identificată, posibil din cauza subreprezentării unui număr mare de specii marine în bazele de date genomice în comparație cu speciile terestre [49].
În lucrarea de față, aplicăm conceptul LB la midii, argumentând că secvențierea hemolimfei ccfDNA poate oferi o perspectivă asupra compoziției ecosistemelor marine de coastă.În special, am constatat că 1) hemolimfa de midii conține concentrații relativ mari (nivele de micrograme) de fragmente de ADN circulante relativ mari (~1-5 kb);2) aceste fragmente de ADN sunt atât independente, cât și neindependente. 3) Printre sursele străine ale acestor fragmente de ADN, am găsit ADN bacterian, arheal și viral, precum și ADN-ul altor animale multicelulare;4) Acumularea acestor fragmente străine de ccfADN în hemolimfă are loc rapid și contribuie la activitatea de filtrare internă a midii.În concluzie, studiul nostru demonstrează că conceptul de LB, care a fost aplicat până acum în principal în domeniul biomedicinei, codifică o sursă bogată, dar neexploratată de cunoștințe, care poate fi folosită pentru a înțelege mai bine interacțiunea dintre speciile santinelă și mediul lor.
În plus față de primate, izolarea ccfDNA a fost raportată la mamifere, inclusiv la șoareci, câini, pisici și cai [50, 51, 52].Cu toate acestea, din cunoștințele noastre, studiul nostru este primul care raportează detectarea și secvențierea ccfDNA la speciile marine cu un sistem de circulație deschis.Această caracteristică anatomică și capacitatea de filtrare a midii pot explica, cel puțin parțial, caracteristicile de dimensiune diferite ale fragmentelor de ADN circulante în comparație cu alte specii.La om, majoritatea fragmentelor de ADN care circulă în sânge sunt fragmente mici, cu dimensiuni cuprinse între 150 și 200 bp.cu un vârf maxim de 167 bp [34, 53].O porțiune mică, dar semnificativă, a fragmentelor de ADN are o dimensiune între 300 și 500 bp și aproximativ 5% sunt mai lungi de 900 bp.[54].Motivul pentru această distribuție a mărimii este că principala sursă de ccfDNA din plasmă apare ca urmare a morții celulare, fie din cauza morții celulare, fie din cauza necrozei celulelor hematopoietice circulante la indivizii sănătoși sau din cauza apoptozei celulelor tumorale la pacienții cu cancer (cunoscută sub numele de ADN tumoral circulant)., ADNc).Distribuția de mărime a hemolimfei ccfDNA pe care am găsit-o la midii a variat între 1000 și 5000 bp, sugerând că ccfDNA-ul de midii are o origine diferită.Aceasta este o ipoteză logică, deoarece midiile au un sistem vascular semideschis și trăiesc în medii acvatice marine care conțin concentrații mari de ADN genomic microbian.De fapt, experimentele noastre de laborator folosind ADN exogen au arătat că midiile acumulează fragmente de ADN în apa de mare, cel puțin după câteva ore sunt degradate după absorbția celulară și/sau eliberate și/sau depozitate în diferite organizații.Având în vedere raritatea celulelor (atât procariote, cât și eucariote), utilizarea compartimentelor intravalvulare va reduce cantitatea de ccfADN din surse proprii, precum și din surse străine.Având în vedere importanța imunității înnăscute a bivalvelor și numărul mare de fagocite circulante, am emis în continuare ipoteza că chiar și ADN-ul străin străin este îmbogățit în fagocite circulante care acumulează ADN străin la ingestia de microorganisme și/sau resturi celulare.Luate împreună, rezultatele noastre arată că ADN-ul hemolimfei bivalve este un depozit unic de informații moleculare și le consolidează statutul de specie santinelă.
Datele noastre indică faptul că secvențierea și analiza fragmentelor hemolimfei ccfDNA derivate din bacterii pot oferi informații cheie despre flora bacteriană gazdă și bacteriile prezente în ecosistemul marin din jur.Tehnicile de secvențiere au scos la iveală secvențe ale bacteriei comensale A. atra gill care ar fi fost omise dacă ar fi fost folosite metode convenționale de identificare a ARNr 16S, datorită parțial unei părtiniri bibliotecii de referință.De fapt, utilizarea noastră a datelor LB colectate de la M. platensis în același strat de midii de la Kerguelen a arătat că compoziția simbioților bacterieni asociați branhiilor a fost aceeași pentru ambele specii de midii (Fig. S4, Informații suplimentare).Această asemănare a două midii diferite genetic poate reflecta compoziția comunităților bacteriene din depozitele reci, sulfuroase și vulcanice din Kerguelen [55, 56, 57, 58].Niveluri mai ridicate de microorganisme reducătoare de sulf au fost bine descrise la recoltarea midii din zonele de coastă bioturbate [59], cum ar fi coasta Port-au-France.O altă posibilitate este ca flora midii comensale să fie afectată de transmiterea orizontală [60, 61].Sunt necesare mai multe cercetări pentru a determina corelația dintre mediul marin, suprafața fundului mării și compoziția bacteriilor simbiotice din midii.Aceste studii sunt în curs de desfășurare.
Lungimea și concentrația hemolimfei ccfDNA, ușurința sa de purificare și calitatea înaltă pentru a permite secvențierea rapidă a puștilor sunt câteva dintre numeroasele avantaje ale utilizării ccfDNA de midii pentru a evalua biodiversitatea în ecosistemele marine de coastă.Această abordare este eficientă în special pentru caracterizarea comunităților virale (virome) dintr-un ecosistem dat [62, 63].Spre deosebire de bacterii, arhee și eucariote, genomul viral nu conține gene conservate filogenetic, cum ar fi secvențele 16S.Rezultatele noastre indică faptul că biopsiile lichide de la specii indicator, cum ar fi midiile, pot fi utilizate pentru a identifica un număr relativ mare de fragmente de virus ccfDNA cunoscute pentru a infecta gazdele care locuiesc de obicei în ecosistemele marine de coastă.Acestea includ viruși despre care se știe că infectează protozoare, artropode, insecte, plante și viruși bacterieni (de exemplu, bacteriofagi).O distribuție similară a fost găsită atunci când am examinat viromul hemolimfei ccfDNA al midii albastre (M. platensis) colectate în același strat de midii la Kerguelen (Tabelul S2, Informații suplimentare).Secvențierea ccfDNA cu pușcă este într-adevăr o nouă abordare care câștigă amploare în studiul viromului uman sau al altor specii [21, 37, 64].Această abordare este deosebit de utilă pentru studierea virusurilor ADN dublu catenar, deoarece nicio genă nu este conservată între toți virusurile ADN dublu catenar, reprezentând cea mai diversă și mai largă clasă de viruși din Baltimore [65].Deși majoritatea acestor virusuri rămân neclasificate și pot include viruși dintr-o parte complet necunoscută a lumii virale [66], am descoperit că viromii și gamele de gazdă ale midii A. atra și M. platensis se încadrează între cele două specii.în mod similar (a se vedea figura S3, informații suplimentare).Această asemănare nu este surprinzătoare, deoarece poate reflecta o lipsă de selectivitate în absorbția ADN-ului prezent în mediu.Studiile viitoare care utilizează ARN purificat sunt în prezent necesare pentru a caracteriza viromul ARN.
În studiul nostru, am folosit o conductă foarte riguroasă adaptată din lucrările lui Kowarski și colegii [37], care au folosit o ștergere în doi pași a citirilor și contig-urilor reunite înainte și după asamblarea ccfDNA-ului nativ, rezultând o proporție mare de citiri nemapate.Prin urmare, nu putem exclude că unele dintre aceste citiri necartografiate ar putea avea în continuare propria lor origine, în primul rând pentru că nu avem un genom de referință pentru această specie de midii.Am folosit, de asemenea, această conductă pentru că eram îngrijorați de himerele dintre citirile personale și non-self și de lungimile de citire generate de Illumina MiSeq PE75.Un alt motiv pentru majoritatea citirilor neexplorate este că o mare parte dintre microbii marini, în special din zonele îndepărtate, cum ar fi Kerguelen, nu au fost adnotați.Am folosit Illumina MiSeq PE75, presupunând lungimi ale fragmentelor ccfDNA similare cu ccfDNA uman.Pentru studiile viitoare, având în vedere rezultatele noastre care arată că hemolimfa ccfDNA are citiri mai lungi decât oamenii și/sau mamiferele, vă recomandăm să folosiți o platformă de secvențiere mai potrivită pentru fragmente mai lungi de ccfDNA.Această practică va face mult mai ușor să identifici mai multe indicații pentru o analiză mai profundă.Obținerea secvenței complete a genomului nuclear A. atra, indisponibilă în prezent, ar facilita foarte mult discriminarea ccfADN-ului din surse proprii și non-sine.Având în vedere că cercetările noastre s-au concentrat pe posibilitatea aplicării conceptului de biopsie lichidă la midii, sperăm că, pe măsură ce acest concept este utilizat în cercetările viitoare, vor fi dezvoltate noi instrumente și conducte pentru a crește potențialul acestei metode de a studia diversitatea microbiană a midii.ecosistem marin.
Ca biomarker clinic neinvaziv, nivelurile plasmatice crescute ale ccfADN-ului uman sunt asociate cu diferite boli, leziuni tisulare și condiții de stres [67,68,69].Această creștere este asociată cu eliberarea de fragmente de ADN de origine proprie după lezarea țesuturilor.Am abordat această problemă folosind stresul termic acut, în care midiile au fost expuse pentru scurt timp la o temperatură de 30 ° C.Am efectuat această analiză pe trei tipuri diferite de midii în trei experimente independente.Cu toate acestea, nu am găsit nicio modificare a nivelurilor ccfDNA după stres termic acut (a se vedea Figura S5, informații suplimentare).Această descoperire poate explica, cel puțin parțial, faptul că midiile au un sistem circulator semideschis și acumulează cantități mari de ADN străin datorită activității lor mari de filtrare.Pe de altă parte, midiile, ca multe nevertebrate, pot fi mai rezistente la leziunile tisulare induse de stres, limitând astfel eliberarea ccfDNA în hemolimfa lor [70, 71].
Până în prezent, analiza ADN-ului biodiversității în ecosistemele acvatice s-a concentrat în principal pe metabarcoding ADN-ul de mediu (eDNA).Cu toate acestea, această metodă este de obicei limitată în analiza biodiversității atunci când sunt utilizați primeri.Utilizarea secvențierii puștilor eludează limitările PCR și selecția părtinitoare a seturi de primeri.Astfel, într-un fel, metoda noastră este mai aproape de metoda de secvențiere eDNA Shotgun de mare performanță utilizată recent, care este capabilă să secvențeze direct ADN-ul fragmentat și să analizeze aproape toate organismele [72, 73].Cu toate acestea, există o serie de probleme fundamentale care disting LB de metodele standard eDNA.Desigur, principala diferență dintre eDNA și LB este utilizarea gazdelor filtru naturale.A fost raportată utilizarea unor specii marine precum bureții și bivalvele (Dresseina spp.) ca filtru natural pentru studierea eDNA [74, 75].Cu toate acestea, studiul lui Dreissena a folosit biopsii tisulare din care a fost extras ADN-ul.Analiza ccfDNA din LB nu necesită biopsie tisulară, echipamente specializate și uneori costisitoare și logistică asociate cu eDNA sau biopsie tisulară.De fapt, am raportat recent că ccfDNA din LB poate fi stocat și analizat cu suport FTA fără a menține un lanț de frig, ceea ce reprezintă o provocare majoră pentru cercetarea în zonele îndepărtate [76].Extracția ccfDNA din biopsiile lichide este, de asemenea, simplă și oferă ADN de înaltă calitate pentru secvențierea puștilor și analiza PCR.Acesta este un mare avantaj având în vedere unele dintre limitările tehnice asociate cu analiza eDNA [77].Simplitatea și costul scăzut al metodei de eșantionare sunt, de asemenea, potrivite în special pentru programele de monitorizare pe termen lung.Pe lângă capacitatea lor ridicată de filtrare, o altă caracteristică binecunoscută a bivalvelor este compoziția chimică a mucopolizaharidelor a mucusului lor, care promovează absorbția virusurilor [78, 79].Acest lucru face din bivalve un filtru natural ideal pentru caracterizarea biodiversității și a impactului schimbărilor climatice într-un anumit ecosistem acvatic.Deși prezența fragmentelor de ADN derivate de la gazdă poate fi văzută ca o limitare a metodei în comparație cu eDNA, costul asociat cu un astfel de ccfDNA nativ în comparație cu eDNA este simultan de înțeles pentru cantitatea mare de informații disponibile pentru studiile de sănătate.gazdă offset.Aceasta include prezența secvențelor virale integrate în genomul gazdei gazdă.Acest lucru este deosebit de important pentru midii, având în vedere prezența retrovirusurilor leucemice transmise orizontal la bivalve [80, 81].Un alt avantaj al LB față de eDNA este că exploatează activitatea fagocitară a celulelor sanguine circulante în hemolimfă, care înghiți microorganismele (și genomul acestora).Fagocitoza este funcția principală a celulelor sanguine la bivalve [82].În final, metoda profită de capacitatea mare de filtrare a midii (în medie 1,5 l/h de apă de mare) și de circulația de două zile, care măresc amestecarea diferitelor straturi de apă de mare, permițând captarea eADN-ului heterolog.[83, 84].Astfel, analiza ccfDNA pentru midii este o cale interesantă, având în vedere impactul nutrițional, economic și de mediu al midii.Similar cu analiza LB colectată de la oameni, această metodă deschide, de asemenea, posibilitatea de a măsura modificările genetice și epigenetice ale ADN-ului gazdei ca răspuns la substanțele exogene.De exemplu, tehnologiile de secvențiere de a treia generație pot fi avute în vedere pentru a efectua analize de metilare la nivelul întregului genom în ccfDNA nativ folosind secvențierea nanoporilor.Acest proces ar trebui să fie facilitat de faptul că lungimea fragmentelor de ccfADN de midii este compatibilă în mod ideal cu platformele de secvențiere cu citire lungă care permit analiza de metilare a ADN-ului la nivelul întregului genom dintr-o singură serie de secvențiere, fără a fi nevoie de transformări chimice.85,86] Aceasta este o posibilitate interesantă, deoarece s-a demonstrat că modelele de metilare ADN reflectă un răspuns la stresul multor generații de mediu și persistă.Prin urmare, poate oferi o perspectivă valoroasă asupra mecanismelor de bază care guvernează răspunsul după expunerea la schimbările climatice sau la poluanți [87].Cu toate acestea, utilizarea LB nu este lipsită de limitări.Inutil să spun că acest lucru necesită prezența speciilor indicator în ecosistem.După cum sa menționat mai sus, utilizarea LB pentru a evalua biodiversitatea unui ecosistem dat necesită, de asemenea, o conductă bioinformatică riguroasă care ține cont de prezența fragmentelor de ADN din sursă.O altă problemă majoră este disponibilitatea genomilor de referință pentru speciile marine.Se speră că inițiative precum Proiectul genomilor mamiferelor marine și proiectul Fish10k recent înființat [88] vor facilita o astfel de analiză în viitor.Aplicarea conceptului LB la organismele marine care se hrănesc prin filtrare este, de asemenea, compatibilă cu cele mai recente progrese în tehnologia de secvențiere, făcându-l bine potrivit pentru dezvoltarea biomarkerilor multi-ohmi pentru a oferi informații importante despre sănătatea habitatelor marine ca răspuns la stresul mediului.
Datele de secvențiere a genomului au fost depuse în Arhiva NCBI Sequence Read https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sub Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impactul schimbărilor climatice asupra vieții și ecosistemelor marine.Cole Biologie.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Luați în considerare impactul combinat al schimbărilor climatice și al altor factori de stres locali asupra mediului marin.mediul științific general.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Știința de la 1 martie.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleranța redusă la căldură în condiții de stres termic repetitiv explică mortalitatea ridicată de vară a midii albastre.Raport științific 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER și colab.Modificări recente în frecvența, cauzele și amploarea morților animalelor.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Mai mulți agenți patogeni care nu sunt specifici speciilor ar putea fi cauzat mortalitatea în masă a Pinna nobilis.Viaţă.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Impactul potențial al schimbărilor climatice asupra bolilor zoonotice arctice.Int J Sănătate circumpolară.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Midiile albastre (Mytilus edulis spp.) ca organisme semnal în monitorizarea poluării de coastă: o revizuire.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrarea biopsiei lichide în tratamentul cancerului.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C și colab.Maturarea biopsiei lichide: Permite circulația ADN-ului tumoral.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Acizi nucleici în plasma umană.Procesul verbal de ședință al filialelor Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nou rol pentru ADN-ul fără celule ca marker molecular pentru tratamentul cancerului.Cuantificarea analizei biomolare.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsia lichidă intră în clinică - probleme de implementare și provocări viitoare.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW și alții.ADN-ul fetal este prezent în plasma și serul matern.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studiu despre cursul sarcinii și complicațiile acesteia folosind ARN extracelular circulant în sângele femeilor în timpul sarcinii.Dopediatrie.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J și colab.Biopsie lichidă: ADN-ul fără celule donatorului este utilizat pentru a detecta leziunile alogene la o grefă de rinichi.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovații în diagnosticul prenatal: secvențierea genomului plasmatic matern.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D și colab.Detectarea rapidă a agenților patogeni cu secvențierea metagenomică de ultimă generație a fluidelor corporale infectate.Nat Medicină.2021;27:115-24.