Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Sângerarea necontrolată este una dintre principalele cauze de deces.Realizarea hemostazei rapide asigură supraviețuirea subiectului ca prim ajutor în timpul luptei, accidentelor rutiere și operațiunilor de reducere a morții.Schela compozită ranforsată cu fibre nanoporoase (NFRCS) derivată dintr-o compoziție hemostatică simplă care formează film (HFFC), deoarece o fază continuă poate declanșa și îmbunătăți hemostaza.Dezvoltarea NFRCS se bazează pe proiectarea aripii libelulei.Structura aripilor de libelulă constă din aripi transversale și longitudinale, iar membranele aripilor sunt conectate între ele pentru a menține integritatea microstructurii.HFFC acoperă uniform suprafața fibrei cu o peliculă de grosime nanometrică și conectează grosimea bumbacului distribuită aleatoriu (Ct) (fază dispersată) pentru a forma o structură nanoporoasă.Combinația de faze continue și dispersate reduce costul produsului de zece ori comparativ cu produsele disponibile comercial.NFRCS modificat (tampoane sau brățări) poate fi utilizat într-o varietate de aplicații biomedicale.Studiile in vivo au concluzionat că Cp NFRCS dezvoltat declanșează și îmbunătățește procesul de coagulare la locul aplicării.NFRCS poate modula micromediul și poate acționa la nivel celular datorită structurii sale nanoporoase, rezultând o vindecare mai bună a rănilor în modelul plăgii de excizie.
Sângerările necontrolate în timpul luptei, situațiile intraoperatorii și de urgență pot reprezenta o amenințare gravă la adresa vieții răniților1.Aceste afecțiuni conduc în continuare la o creștere generală a rezistenței vasculare periferice, ducând la șoc hemoragic.Măsurile adecvate pentru controlul sângerării în timpul și după intervenția chirurgicală sunt considerate potențial amenințătoare de viață2,3.Deteriorarea vaselor mari duce la pierderi masive de sânge, rezultând o rată a mortalității ≤ 50% în luptă și 31% în timpul intervenției chirurgicale1.Pierderea masivă de sânge duce la o scădere a volumului corpului, ceea ce reduce debitul cardiac.O creștere a rezistenței vasculare periferice totale și o afectare progresivă a microcirculației duc la hipoxie în organele de susținere a vieții.Şocul hemoragic poate apărea dacă starea continuă fără o intervenţie eficientă1,4,5.Alte complicații includ progresia hipotermiei și acidozei metabolice, precum și o tulburare de coagulare care împiedică procesul de coagulare.Șocul hemoragic sever este asociat cu un risc mai mare de deces6,7,8.În șocul de gradul III (progresiv), transfuzia de sânge este esențială pentru supraviețuirea pacientului în timpul morbidității și mortalității intraoperatorii și postoperatorii.Pentru a depăși toate situațiile de mai sus care pun viața în pericol, am dezvoltat o schelă compozită ranforsată cu fibre nanoporoase (NFRCS) care utilizează o concentrație minimă de polimer (0,5%) folosind o combinație de polimeri hemostatici solubili în apă.
Cu ajutorul armăturii cu fibre, pot fi dezvoltate produse rentabile.Fibrele dispuse aleatoriu seamănă cu structura aripii unei libelule, echilibrate de dungile orizontale și verticale de pe aripi.Venele transversale și longitudinale ale aripii comunică cu membrana aripii (Fig. 1).NFRCS constă din Ct armat ca sistem de schelă cu rezistență fizică și mecanică mai bună (Figura 1).Datorită accesibilității și măiestriei, chirurgii preferă să folosească dispozitive de măsurare a firului de bumbac (Ct) în timpul operațiilor și pansamentelor. Prin urmare, având în vedere beneficiile sale multiple, inclusiv > 90% celuloză cristalină (impărtășește creșterea activității hemostatice), Ct a fost utilizat ca sistem osos al NFRCS9,10. Prin urmare, având în vedere beneficiile sale multiple, inclusiv > 90% celuloză cristalină (impărtășește creșterea activității hemostatice), Ct a fost utilizat ca sistem osos al NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристалличесталы ленные преимущества в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Prin urmare, având în vedere numeroasele sale beneficii, inclusiv >90% celuloză cristalină (implicata în creșterea activității hemostatice), Ct a fost folosit ca sistem osos NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血滢止血滢止血滴 NF ，，，，，） ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Prin urmare, având în vedere numeroasele sale beneficii, inclusiv peste 90% celuloză cristalină (ajută la îmbunătățirea activității hemostatice), Ct a fost folosit ca schelă pentru NFRCS9,10.Ct a fost acoperit superficial (s-a observat formarea de peliculă nano-groasă) și interconectat cu o compoziție hemostatică formatoare de film (HFFC).HFFC acționează ca un matrigel, ținând împreună Ct plasat aleatoriu.Designul dezvoltat transmite stresul în cadrul fazei dispersate (fibre de armare).Este dificil să se obțină structuri nanoporoase cu rezistență mecanică bună folosind concentrații minime de polimer.În plus, nu este ușor să personalizați diferite matrițe pentru diferite aplicații biomedicale.
Figura prezintă o diagramă a designului NFRCS bazat pe structura aripii de libelulă (A).Această imagine prezintă o analogie comparativă a structurii aripii unei libelule (venele care se intersectează și longitudinale ale aripii sunt interconectate) și o microfotografie în secțiune transversală a Cp NFRCS (B).Reprezentarea schematică a NFRCS.
NFRC-urile au fost dezvoltate folosind HFFC ca fază continuă pentru a aborda limitările de mai sus.HFFC este compus din diverși polimeri hemostatici filmogeni, inclusiv chitosan (ca polimer hemostatic principal) cu metilceluloză (MC), hidroxipropil metilceluloză (HPMC 50 cp) și alcool polivinilic (PVA)) (125 kDa) ca polimer suport care promovează formarea trombului.formare.Adăugarea de polivinilpirolidină K30 (PVP K30) a îmbunătățit capacitatea de absorbție a umidității a NFRCS.S-a adăugat polietilen glicol 400 (PEG 400) pentru a îmbunătăți reticularea polimerului în amestecurile de polimeri legați.Trei compoziții hemostatice HFFC diferite (Cm HFFC, Ch HFFC și Cp HFFC), și anume chitosan cu MC (Cm), chitosan cu HPMC (Ch) și chitosan cu PVA (Cp), au fost aplicate pe Ct.Diverse studii de caracterizare in vitro și in vivo au confirmat activitatea hemostatică și de vindecare a rănilor a NFRCS.Materialele compozite oferite de NFRCS pot fi folosite pentru a personaliza diverse forme de schele pentru a satisface nevoi specifice.
În plus, NFRCS poate fi modificat ca bandaj sau rolă pentru a acoperi întreaga zonă de vătămare a extremităților inferioare și a altor părți ale corpului.În special pentru leziunile membrelor de luptă, designul proiectat NFRCS poate fi schimbat la jumătate de braț sau picior complet (Figura suplimentară S11).NFRCS poate fi transformat într-o brățară cu adeziv pentru țesut, care poate fi folosită pentru a opri sângerarea de la leziuni grave sinucigașe ale încheieturii mâinii.Scopul nostru principal este să dezvoltăm un NFRCS cu cât mai puțin polimer posibil, care să poată fi livrat unei populații mari (sub pragul sărăciei) și care poate fi introdus într-o trusă de prim ajutor.Simplu, eficient și economic în design, NFRCS aduce beneficii comunităților locale și poate avea un impact global.
Chitosanul (greutate moleculară 80 kDa) și amarantul au fost achiziționate de la Merck, India.Hidroxipropil metilceluloză 50 Cp, polietilen glicol 400 și metilceluloză au fost achiziționate de la Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Alcoolul polivinilic (greutate moleculară 125 kDa) (87-90% hidrolizat) a fost achiziționat de la National Chemicals, Gujarat.Polivinilpirolidina K30 a fost achiziționată de la Molychem, Mumbai, tampoane sterile au fost achiziționate de la Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, cu apă Milli Q (sistem de purificare a apei Direct-Q3, Merck, India) ca purtător.
NFRCS a fost dezvoltat folosind o metodă de liofilizare11,12.Toate compozițiile de HFFC (Tabelul 1) au fost preparate folosind un agitator mecanic.Se prepară o soluție de chitosan 0,5% folosind acid acetic 1% în apă prin agitare continuă la 800 rpm cu un agitator mecanic.Greutatea exactă a polimerului încărcat indicată în Tabelul 1 a fost adăugată la soluţia de chitosan şi agitată până când s-a obţinut o soluţie limpede de polimer.PVP K30 şi PEG 400 au fost adăugate la amestecul rezultat în cantităţile indicate în Tabelul 1 şi agitarea a fost continuată până când s-a obţinut o soluţie limpede de polimer vâscos.Baia rezultată de soluție de polimer a fost supusă cu ultrasunete timp de 60 de minute pentru a îndepărta bulele de aer prinse din amestecul de polimeri.Așa cum se arată în Figura suplimentară S1 (b), Ct a fost distribuit uniform în fiecare godeu al unei plăci cu 6 godeuri (matriză) suplimentată cu 5 ml de HFFC.
Placa cu șase godeuri a fost sonicată timp de 60 de minute pentru a obține umezirea și distribuția uniformă a HFFC în rețeaua Ct.Apoi congelați placa cu șase godeuri la -20°C timp de 8-12 ore.Plăcile de congelare au fost liofilizate timp de 48 de ore pentru a obține diferite formulări de NFRCS.Aceeași procedură este utilizată pentru a produce diferite forme și structuri, cum ar fi tampoane sau tampoane cilindrice sau orice altă formă pentru diferite aplicații.
Chitosanul (80 kDa) (3%) cântărit cu precizie este dizolvat în acid acetic 1% folosind un agitator magnetic.La soluţia rezultată de chitosan s-a adăugat 1% PEG 400 şi s-a agitat timp de 30 de minute.Se toarnă soluția rezultată într-un recipient pătrat sau dreptunghiular și se îngheață la -80°C timp de 12 ore.Probele congelate au fost liofilizate timp de 48 de ore pentru a obține Cs13 poros.
NFRCS dezvoltat a fost supus experimentelor folosind spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japonia) pentru a confirma compatibilitatea chimică a chitosanului cu alți polimeri14,15.Spectrele FTIR (lățimea intervalului spectral de la 400 la 4000 cm-1) ale tuturor probelor testate au fost obținute prin efectuarea a 32 de scanări.
Rata de absorbție a sângelui (BAR) pentru toate formulările a fost evaluată folosind metoda descrisă de Chen și colab.16 cu mici modificari.NFRK-urile dezvoltate ale tuturor compozițiilor au fost uscate într-un cuptor cu vid la 105°C peste noapte pentru a îndepărta solventul rezidual.30 mg NFRCS (greutatea inițială a probei – W0) și 30 mg Ct (martor pozitiv) au fost plasate în vase separate care conțineau un premix de 3,8% citrat de sodiu.La intervale de timp predeterminate, adică 5, 10, 20, 30, 40 și 60 de secunde, NFRCS au fost îndepărtate și suprafețele lor au fost curățate de sânge neabsorbit prin plasarea probelor pe Ct timp de 30 de secunde.Greutatea finală a sângelui absorbită de NFRCS 16 a fost luată în considerare (W1) la fiecare punct de timp.Calculați procentul BAR folosind următoarea formulă:
Timpul de coagulare a sângelui (BCT) a fost determinat așa cum este raportat de Wang și colab.17 .Timpul necesar pentru coagularea sângelui integral (sânge de șobolan preamestecat cu 3,8% citrat de sodiu) în prezența NFRCS a fost calculat ca BCT al probei de testat.Diferitele componente NFRCS (30 mg) au fost plasate în flacoane cu capac filetat de 10 ml și incubate la 37°C.S-a adăugat sânge (0,5 ml) în flacon și s-au adăugat 0,3 ml de CaCI2 0,2 ​​M pentru a activa coagularea sângelui.În cele din urmă, răsturnați flaconul la fiecare 15 secunde (până la 180°) până când se formează un cheag ferm.BCT-ul eșantionului este estimat prin numărul de flip vails17,18.Pe baza BCT, au fost selectate două compoziții optime din NFRCS Cm, Ch și Cp pentru studii de caracterizare ulterioare.
BCT al compozițiilor Ch NFRCS și Cp NFRCS a fost determinată prin implementarea metodei descrise de Li și colab.19 .Puneți 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS și Cs (control pozitiv) în vase Petri separate (37 ° C).Sângele care conține 3,8% citrat de sodiu a fost amestecat cu 0,2 M CaCl2 într-un raport de volum de 10:1 pentru a începe procesul de coagulare a sângelui.20 ui de amestec de sânge de șobolan 0,2 M CaCl2 au fost aplicați pe suprafața probei și plasați într-o cutie Petri goală.Controlul a fost sânge turnat în vase Petri goale fără Ct.La intervale fixe de 0, 3 și 5 minute, opriți coagularea prin adăugarea a 10 ml de apă deionizată (DI) la proba care conține vasul fără a perturba cheagul.Eritrocitele necoagulate (eritrocitele) suferă hemoliză în prezența apei deionizate și eliberează hemoglobină.Hemoglobina la diferite momente de timp (HA(t)) a fost măsurată la 540 nm (λmax hemoglobină) utilizând un spectrofotometru UV-Vis.Absorbția absolută a hemoglobinei (AH(0)) în 0 min a 20 µl de sânge în 10 ml apă deionizată a fost luată ca standard de referință.Captarea relativă a hemoglobinei (RHA) a sângelui coagulat a fost calculată din raportul HA(t)/HA(0) utilizând același lot de sânge.
Folosind un analizor de textură (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, SUA), au fost determinate proprietățile adezive ale NFRK la țesutul deteriorat.Apăsați un vas cilindric cu fundul deschis pe interiorul pielii de porc (fără stratul de grăsime).Probele (Ch NFRCS și Cp NFRCS) au fost aplicate prin canule în forme cilindrice pentru a crea aderență la pielea porcului.După o incubare de 3 minute la temperatura camerei (RT) (25°C), puterea adezivă NFRCS a fost înregistrată la o viteză constantă de 0,5 mm/sec.
Principala caracteristică a etanșanților chirurgicali este de a crește coagularea sângelui, reducând în același timp pierderile de sânge.Coagularea fără pierderi în NFRCS a fost evaluată folosind o metodă publicată anterior, cu mici modificări 19 .Faceți un tub de microcentrifugă (2 ml) (diametrul interior 10 mm) cu o gaură de 8 × 5 mm2 pe o parte a tubului de centrifugă (reprezentând o rană deschisă).NFRCS este folosit pentru a închide deschiderea și banda este utilizată pentru a etanșa marginile exterioare.Se adaugă 20 µl de 0,2 M CaCl2 în tubul de microcentrifugă care conține premixul de citrat de sodiu 3,8%.După 10 minute, tuburile de microcentrifugă au fost îndepărtate din vase și a fost determinată creșterea masei vaselor din cauza fluxului de sânge din NFRK (n = 3).Pierderea de sânge Ch NFRCS și Cp NFRCS au fost comparate cu Cs.
Integritatea umedă a NFRCS a fost determinată pe baza metodei descrise de Mishra și Chaudhary21 cu modificări minore.Puneți NFRCS într-un balon Erlenmeyer de 100 ml cu 50 ml apă și agitați timp de 60 de secunde fără a forma un vârf.Inspecția vizuală și prioritizarea probelor pentru integritatea fizică pe baza recoltării.
Forța de legare a HFFC la Ct a fost studiată folosind metode publicate anterior cu modificări minore.Integritatea acoperirii suprafeței a fost evaluată prin expunerea NFRK la unde acustice (stimul extern) în prezența apei milliQ (Ct).NFRCS Ch NFRCS și Cp NFRCS dezvoltate au fost plasate într-un pahar umplut cu apă și sonicate timp de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 și, respectiv, 30 de minute.După uscare, diferența procentuală dintre greutatea inițială și cea finală a NFRCS a fost utilizată pentru a calcula pierderea procentuală de material (HFFC).BCT in vitro a susținut în continuare rezistența de legare sau pierderea materialelor de suprafață.Eficiența legării HFFC la Ct asigură coagularea sângelui și o acoperire elastică pe suprafața Ct22.
Omogenitatea NFRCS dezvoltat a fost determinată de BCT de probe (30 mg) prelevate din locații generale ale NFRCS selectate aleatoriu.Urmați procedura BCT menționată anterior pentru a determina conformitatea NFRCS.Proximitatea dintre toate cele cinci probe asigură acoperirea uniformă a suprafeței și depunerea de HFFC în plasa Ct.
Aria nominală de contact cu sângele (NBCA) a fost determinată așa cum a fost raportat anterior, cu unele modificări.Coagulați sângele prin prinderea a 20 µl de sânge între cele două suprafețe ale Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS și Cs.După 1 oră, cele două părți ale stentului au fost separate și măsurate manual zona cheagului.Valoarea medie a trei repetări a fost considerată NBCA NFRCS19.
Analiza Dynamic Vapor Sorption (DVS) a fost utilizată pentru a evalua eficacitatea NFRCS de a absorbi apa din mediul extern sau din locul leziunii responsabil pentru inițierea coagulării.DVS evaluează sau înregistrează absorbția și pierderea de vapori dintr-o probă gravimetric folosind o balanță ultra-sensibilă cu o rezoluție de masă de ±0,1 µg.O presiune parțială a vaporilor (umiditate relativă) este generată de un controler electronic al debitului de masă în jurul probei prin amestecarea gazelor purtătoare saturate și uscate. Conform ghidurilor Farmacopeei Europene, pe baza procentului de absorbție de umiditate de către probe, probele au fost clasificate în 4 categorii (0–0,012% g/g - nehigroscopice, 0,2–2% g/g ușor higroscopice, 2–15% moderat higroscopice) și > 1,5% foarte higroscopice Conform ghidurilor Farmacopeei Europene, pe baza procentului de absorbție de umiditate de către probe, probele au fost clasificate în 4 categorii (0–0,012% g/g - nehigroscopice, 0,2–2% g/g ușor higroscopice, 2–15% moderat higroscopice) și > 1,5% foarte higroscopiceÎn conformitate cu recomandările Farmacopeei Europene, în funcție de procentul de absorbție a umidității de către probe, probele au fost împărțite în 4 categorii (0–0,012% g/g – nehigroscopic, 0,2–2% g/g ușor higroscopic, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderat higroscopic şi > 15% foarte higroscopic)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/0,012% w/0,012% w/0,012% w/0,012% w. /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为 分为 分为 琸 （01（ 0.湿 性 、 、 、 、 0,2-2% g/g 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。În conformitate cu recomandările Farmacopeei Europene, probele sunt împărțite în 4 clase în funcție de procentul de umiditate absorbit de probă (0-0,012% în greutate – nehigroscopic, 0,2-2% în greutate ușor higroscopic, 2-15% în greutate).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderat higroscopic, > 15% foarte higroscopic) 23.Eficiența higroscopică a NFCS X NFCS și TsN NFCS a fost determinată pe un analizor DVS TA TGA Q5000 SA.În timpul acestui proces, s-au obținut timpul de rulare, umiditatea relativă (RH) și greutatea probei în timp real la 25°C24.Conținutul de umiditate este calculat prin analiza precisă a masei NFRCS folosind următoarea ecuație:
MC este umiditatea NFRCS.m1 – greutatea uscată a AINS.m2 este masa NFRCS în timp real la o anumită RH.
Suprafața totală a fost estimată utilizând un experiment de adsorbție a azotului cu azot lichid după golirea probelor la 25 ° C timp de 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). Suprafața totală a fost estimată utilizând un experiment de adsorbție a azotului cu azot lichid după golirea probelor la 25 ° C timp de 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азоток по сперимента ожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Suprafața totală a fost estimată utilizând un experiment de adsorbție a azotului cu azot lichid după ce probele au fost golite la 25 ° C timp de 10 ore (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表靡总表。总表。在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбцод и сорбцод писорбцик ле опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Suprafața totală a fost estimată utilizând experimente de adsorbție a azotului cu azot lichid după ce probele au fost golite timp de 10 ore la 25°C (< 7 x 10-3 torr).Suprafața totală, volumul porilor și dimensiunea porilor NFRCS au fost determinate cu un Quantachrome de la NOVA 1000e, Austria, folosind software-ul RS 232.
Pregătiți 5% RBC (soluție salină ca diluant) din sânge integral.Apoi transferați o parte alicotă de HFFC (0,25 ml) pe o placă cu 96 de godeuri și 5% masa RBC (0,1 ml).Se incubează amestecul la 37°C timp de 40 de minute.Un amestec de globule roșii și ser a fost considerat drept control pozitiv, iar un amestec de ser fiziologic și globule roșii ca control negativ.Hemaglutinarea a fost determinată conform scalei Stajitzky.Scalele propuse sunt următoarele: + + + + agregate granulare dense;+ + + tampoane inferioare netede cu margini curbate;+ + tampoane inferioare netede cu margini rupte;+ inele roșii înguste în jurul marginilor plăcuțelor netede;– (negativ) butonul roșu discret 12 în centrul puțului inferior.
Hemocompatibilitatea NFRCS a fost studiată conform metodei Organizației Internaționale de Standardizare (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Metoda gravimetrică descrisă de Singh și colab.Au fost făcute modificări minore pentru a evalua formarea de trombi în prezența sau pe suprafața NFRCS.500 mg de Cs, Ch NFRCS și Cp NFRCS au fost incubate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 24 de ore la 37°C.După 24 de ore, PBS a fost îndepărtat și NFRCS a fost tratat cu 2 ml de sânge care conține 3,8% citrat de sodiu.Pe suprafața NFRCS, adăugați 0,04 ml de 0,1 M CaCl2 la probele incubate.După 45 de minute, s-au adăugat 5 ml apă distilată pentru a opri coagularea.Sângele coagulat de pe suprafața NFRK a fost tratat cu soluție de formaldehidă 36-38%.Cheagurile fixate cu formaldehidă au fost uscate și cântărite.Procentul de tromboză a fost estimat prin calculul greutății paharului fără sânge și probă (control negativ) și a paharului cu sânge (control pozitiv).
Ca o confirmare inițială, probele au fost vizualizate la microscop optic pentru a înțelege capacitatea acoperirii suprafeței HFFC, Ct interconectat și a rețelei Ct de a forma pori.Secțiunile subțiri de Ch și Cp din NFRCS au fost tăiate cu o lamă de bisturiu.Secțiunea rezultată a fost plasată pe o lamă de sticlă, acoperită cu o lamă, iar marginile au fost fixate cu lipici.Diapozitivele pregătite au fost vizualizate la microscop optic și fotografiile au fost făcute la diferite măriri.
Depunerea polimerului în rețelele Ct a fost vizualizată folosind microscopie cu fluorescență pe baza metodei descrise de Rice și colab.29. Compoziția de HFFC utilizată pentru formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (amarant) și NFRCS (Ch și Cp) au fost preparate conform metodei menționate anterior. Compoziția de HFFC utilizată pentru formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (amarant) și NFRCS (Ch și Cp) au fost preparate conform metodei menționate anterior.Compoziția de HFFC utilizată pentru formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (amarant) și s-a obținut NFRCS (Ch și Cp) conform metodei menționate anterior.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶到的斶ChCh将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶到的斶ChChCompoziția de HFFC utilizată în formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (Amaranth) și a primit NFRCS (Ch și Cp), așa cum s-a menționat mai devreme.Secțiuni subțiri de NFRK au fost tăiate din probele obținute, plasate pe lame de sticlă și acoperite cu lamele de acoperire.Observați lamelele preparate la microscop fluorescent folosind un filtru verde (310-380 nm).Imaginile au fost luate la o mărire de 4x pentru a înțelege relațiile Ct și depunerea în exces de polimer în rețeaua Ct.
Topografia suprafeței NFRCS Ch și Cp a fost determinată utilizând un microscop cu forță atomică (AFM) cu un cantilever TESP ultra-ascuțit în modul de atingere: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Rugozitatea suprafeței a fost determinată prin pătrat mediu (RMS) folosind software-ul (Scanning Probe Image Processor).Diferite locații NFRCS au fost redate pe imagini 3D pentru a verifica uniformitatea suprafeței.Abaterea standard a scorului pentru o anumită zonă este definită ca rugozitatea suprafeței.Ecuația RMS a fost utilizată pentru a cuantifica rugozitatea suprafeței NFRCS31.
Studiile bazate pe FESEM au fost efectuate folosind FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, pentru a înțelege morfologia de suprafață a Ch NFRCS și Cp NFRCS, care au arătat un BCT mai bun decât Cm NFRCS.Studiul FESEM a fost realizat conform metodei descrise de Zhao et al.32 cu mici modificări.NFRCS 20 până la 30 mg Ch NFRCS şi Cp NFRCS au fost preamestecate cu 20 pl de citrat de sodiu 3,8% preamestecat cu sânge de şobolan.S-au adăugat 20 μl de 0,2 M CaCl2 la probele tratate cu sânge pentru a iniția coagularea și probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 10 minute.În plus, eritrocitele în exces au fost îndepărtate de pe suprafața NFRCS prin clătire cu soluție salină.
Probele ulterioare au fost tratate cu 0,1% glutaraldehidă și apoi uscate într-un cuptor cu aer cald la 37°C pentru a îndepărta umezeala.Probele uscate au fost acoperite și analizate 32 .Alte imagini obținute în timpul analizei au fost formarea cheagurilor pe suprafața fibrelor individuale de bumbac, depunerea polimerului între Ct, morfologia (forma) eritrocitelor, integritatea cheagurilor și morfologia eritrocitelor în prezența NFRCS.Zonele NFRCS netratate și zonele NFRCS tratate cu Ch și Cp incubate cu sânge au fost scanate pentru ioni elementari (sodiu, potasiu, azot, calciu, magneziu, zinc, cupru și seleniu)33.Comparați procentele de ioni elementali dintre probele tratate și netratate pentru a înțelege acumularea de ioni elementari în timpul formării cheagurilor și omogenitatea acestuia.
Grosimea acoperirii suprafeței Cp HFFC pe suprafața Ct a fost determinată folosind FESEM.Secțiunile transversale ale Cp NFRCS au fost tăiate din cadru și acoperite prin pulverizare.Probele rezultate de acoperire prin pulverizare au fost observate de FESEM și grosimea acoperirii de suprafață a fost măsurată 34, 35, 36.
Micro-CT cu raze X oferă imagini 3D nedistructive de înaltă rezoluție și vă permite să studiați aranjamentul structural intern al NFRK.Micro-CT folosește un fascicul de raze X care trece prin eșantion pentru a înregistra coeficientul de atenuare liniar local al razelor X din probă, ceea ce ajută la obținerea informațiilor morfologice.Locația internă a Ct în Cp NFRCS și Cp NFRCS tratat cu sânge a fost examinată prin micro-CT pentru a înțelege eficiența absorbției și coagularea sângelui în prezența NFRCS37,38,39.Structurile 3D ale probelor Cp NFRCS tratate cu sânge și netratate au fost reconstruite folosind micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Germania).Folosind software-ul VG STUDIO-MAX versiunea 2.2, au fost luate mai multe imagini cu raze X din unghiuri diferite (ideal acoperire 360°) pentru a dezvolta imagini 3D pentru NFRCS.Datele de proiecție colectate au fost reconstruite în imagini volumetrice 3D utilizând software-ul 3D ScanIP Academic simplu corespunzător.
În plus, pentru a înțelege distribuția cheagului, s-au adăugat la NFRCS 20 ui de sânge citrat preamestecat și 20 ui de CaCl2 0,2 ​​M pentru a iniția coagularea sângelui.Probele pregătite se lasă să se întărească.Suprafața NFRK a fost tratată cu 0,5% glutaraldehidă și uscată într-un cuptor cu aer cald la 30-40°C timp de 30 de minute.Cheagul de sânge format pe NFRCS a fost scanat, reconstruit și a fost vizualizată o imagine 3D a cheagului de sânge.
Testele antibacteriene au fost efectuate pe Cp NFRCS (cel mai bine în comparație cu Ch NFRCS) folosind metoda descrisă anterior cu modificări minore.Activitatea antibacteriană a Cp NFRCS și Cp HFFC a fost determinată folosind trei microorganisme de testare diferite [S.aureus (bacterii gram-pozitive), E.coli (bacterii gram-negative) și Candida albă (C.albicans)] crescând pe agar în vase Petri într-un incubator.Se inoculează uniform 50 ml de suspensie de cultură bacteriană diluată la o concentrație de 105-106 CFU ml-1 pe mediul de agar.Se toarnă mediul într-un vas Petri și se lasă să se solidifice.S-au făcut godeuri pe suprafața plăcii de agar pentru a se umple cu HFFC (3 godeuri pentru HFFC și 1 pentru control negativ).Se adaugă 200 ui HFFC la 3 godeuri și 200 ui pH 7,4 PBS la al 4-lea godeu.Pe cealaltă parte a plăcii Petri, puneți un disc Cp NFRCS de 12 mm pe agar solidificat și umeziți cu PBS (pH 7,4).Ciprofloxacina, ampicilină și comprimatele de fluconazol sunt considerate standarde de referință pentru Staphylococcus aureus, Escherichia coli și Candida albicans.Măsurați manual zona de inhibiție și faceți o imagine digitală a zonei de inhibiție.
După aprobarea etică instituțională, studiul a fost realizat la Colegiul Medical de Educație și Cercetare Kasturba din Manipal, Karnataka, în sudul Indiei.Protocolul experimental TEG in vitro a fost revizuit și aprobat de Comitetul de etică instituțională al Colegiului Medical Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Subiecții au fost recrutați din rândul donatorilor de sânge voluntari (cu vârste cuprinse între 18 și 55 de ani) de la banca de sânge a spitalului.În plus, a fost obținut un formular de consimțământ informat de la voluntari pentru recoltarea de probe de sânge.TEG nativ (N-TEG) ​​a fost folosit pentru a studia efectul formulării Cp HFFC asupra sângelui integral preamestecat cu citrat de sodiu.N-TEG este recunoscut pe scară largă pentru rolul său în resuscitarea la punctul de îngrijire, care creează probleme medicilor din cauza potențialului de întârziere semnificativă clinic a rezultatelor (testele de coagulare de rutină).Analiza N-TEG a fost efectuată folosind sânge integral.Consimțământul informat și istoricul medical detaliat au fost obținute de la toți participanții.Studiul nu a inclus participanți cu complicații hemostatice sau trombotice, cum ar fi sarcina/postpartum sau boli hepatice.Subiecții care iau medicamente care afectează cascada de coagulare au fost, de asemenea, excluși din studiu.Testele de laborator de bază (hemoglobină, timp de protrombină, tromboplastină activată și număr de trombocite) au fost efectuate tuturor participanților conform procedurilor standard.N-TEG determină vâscoelasticitatea cheagului de sânge, structura inițială a cheagului, interacțiunea particulelor, întărirea cheagurilor și liza cheagurilor.Analiza N-TEG oferă date grafice și numerice despre efectele colective ale mai multor elemente celulare și plasmă.Analiza N-TEG a fost efectuată pe două volume diferite de Cp HFFC (10 pl și 50 pl).Ca rezultat, 1 ml de sânge integral cu acid citric a fost adăugat la 10 μl de Cp HFFC.Se adaugă 1 ml (Cp HFFC + sânge citrat), 340 ui sânge amestecat la 20 ui 0,2 M CaCl2 care conţine vas TEG.După aceea, vasele TEG au fost încărcate în TEG® 5000, US pentru a măsura R, K, unghi alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% din probele de sânge în prezența Cp HFFC41.
Protocolul de studiu in vivo a fost revizuit și aprobat de Comitetul Instituțional de Etică a Animalelor (IAEC), Școala de Medicină Kasturba, Institutul de Învățământ Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu recomandările Comitetului pentru Controlul și Supravegherea Experimentării Animale (CPCSEA).Toate studiile NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) au fost efectuate pe femele de șobolan Wistar (cu o greutate de 200 până la 250 g).Toate animalele au fost aclimatizate la o temperatură de 24-26°C, animalele au avut acces liber la hrană standard și apă ad libitum.Toate animalele au fost împărțite aleatoriu în diferite grupuri, fiecare grup fiind format din trei animale.Toate studiile au fost efectuate în conformitate cu Studiile pe animale: Raportul experimentelor in vivo 43 .Înainte de studiu, animalele au fost anesteziate prin administrarea intraperitoneală (ip) a unui amestec de 20-50 mg de ketamina (la 1 kg greutate corporală) și 2-10 mg de xilazină (la 1 kg greutate corporală).După studiu s-a calculat volumul de sângerare prin evaluarea diferenței dintre greutatea inițială și cea finală a probelor, s-a luat ca volum de sângerare al probei valoarea medie obținută în urma celor trei teste.
Modelul de amputare a cozii de șobolan a fost implementat pentru a înțelege potențialul NFRCS de a modula sângerarea în traumatisme, lupte sau accidente de circulație (model de rănire).Tăiați 50% din coadă cu o lamă de bisturiu și puneți-l în aer timp de 15 secunde pentru a asigura sângerare normală.În plus, probele de testare au fost plasate pe coada unui șobolan prin aplicarea presiunii (Ct, Cs, Ch NFRCS și Cp NFRCS).Sângerarea și PCT au fost raportate pentru probele de testat (n ​​= 3)17,45.
Eficacitatea controlului presiunii NFRCS în luptă a fost investigată pe un model al arterei femurale superficiale.Artera femurală este expusă, perforată cu un trocar 24G și sângerează în 15 secunde.După ce se observă o sângerare necontrolată, eșantionul de testat este plasat la locul de puncție cu presiune aplicată.Imediat după aplicarea probei de testat, s-a înregistrat timpul de coagulare și s-a observat eficiența hemostatică pentru următoarele 5 minute.Aceeași procedură a fost repetată cu Cs și Ct46.
Dowling şi colab.47 au propus un model de leziune hepatică pentru a evalua potențialul hemostatic al materialelor hemostatice în contextul sângerării intraoperatorii.BCT a fost înregistrat pentru probele Ct (control negativ), cadru Cs (control pozitiv), probele Ch NFRCS și probele Cp NFRCS.Vena cava suprahepatică a șobolanului a fost expusă prin efectuarea unei laparotomii mediane.După aceea, partea distală a lobului stâng a fost tăiată cu foarfece.Faceți o incizie în ficat cu o lamă de bisturiu și lăsați-l să sângereze câteva secunde.Probele de testare Ch NFRCS și Cp NFRCS cântărite cu precizie au fost plasate pe suprafața deteriorată fără nicio presiune pozitivă și a fost înregistrată BCT.Grupul de control (Ct) a aplicat apoi presiune urmată de Cs 30 s47 fără a rupe rănirea.
Testele de vindecare a rănilor in vivo au fost efectuate utilizând un model de răni excizional pentru a evalua proprietățile de vindecare a rănilor ale NFRCS-urilor pe bază de polimeri dezvoltate.Modele de răni exciziale au fost selectate și efectuate conform metodelor publicate anterior, cu modificări minore19,32,48.Toate animalele au fost anesteziate așa cum s-a descris anterior.Utilizați un pumn pentru biopsie (12 mm) pentru a face o incizie circulară adâncă în pielea spatelui.Locurile rănilor pregătite au fost îmbrăcate cu Cs (control pozitiv), Ct (recunoscând că tampoanele de bumbac interferează cu vindecarea), Ch NFRCS și Cp NFRCS (grup experimental) și un control negativ fără niciun tratament.În fiecare zi a studiului, aria rănii a fost măsurată la toți șobolanii.Utilizați o cameră digitală pentru a face o fotografie a zonei rănii și puneți-vă un nou pansament.Procentul de închidere a plăgii a fost măsurat prin următoarea formulă:
Pe baza procentului de închidere a plăgii în a 12-a zi a studiului, pielea de șobolan din cel mai bun grup a fost excizată ((Cp NFRCS) și grupul de control) și studiată prin colorare H&E și colorare tricrom Masson. Pe baza procentului de închidere a plăgii în a 12-a zi a studiului, pielea de șobolan din cel mai bun grup a fost excizată ((Cp NFRCS) și grupul de control) și studiată prin colorare H&E și colorare tricrom Masson.Pe baza procentului de închidere a plăgii în a 12-a zi a studiului, pielea șobolanilor din cel mai bun grup ((Cp NFRCS) și grupul martor) a fost excizată și examinată prin colorare cu hematoxilină-eozină și tricrom Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠的大鼠皌H&Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠百分比切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠百分比根据进鼠皌按进最佳组眳组）Șobolanii din cel mai bun grup ((Cp NFRCS) și grupurile de control) au fost excizati pentru colorarea cu hematoxilină-eozină și colorarea tricrom Masson pe baza procentului de închidere a plăgii în ziua 12 a studiului.Procedura de colorare implementată a fost efectuată conform metodelor descrise anterior49,50.Pe scurt, după fixarea în formol 10%, probele au fost deshidratate folosind o serie de alcooli gradați.Utilizați un microtom pentru a obține secțiuni subțiri (5 µm grosime) ale țesutului excizat.Secțiunile în serie subțiri ale controalelor și Cp NFRCS au fost tratate cu hematoxilină și eozină pentru a studia modificările histopatologice.Colorația tricromă a lui Masson a fost folosită pentru a detecta formarea fibrilelor de colagen.Rezultatele obţinute au fost studiate orbeşte de către patologi.
Stabilitatea probelor de Cp NFRCS a fost studiată la temperatura camerei (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) timp de 12 luni51.Cp NFRCS (decolorarea suprafeței și creșterea microbiană) a fost inspectată vizual și testată pentru rezistența la uzură în pliere și BCT conform metodelor de mai sus prezentate în secțiunea Materiale și Metode.
Scalabilitatea și reproductibilitatea Cp NFRCS au fost examinate prin prepararea Cp NFRCS cu o dimensiune de 15×15 cm2.În plus, probe de 30 mg (n = 5) au fost excizate din diferite fracțiuni Cp NFRCS și BCT a probelor studiate a fost evaluată așa cum este descris mai devreme în secțiunea Metode.
Am încercat să dezvoltăm diverse forme și structuri folosind compoziții Cp NFRCS pentru diverse aplicații biomedicale.Astfel de forme sau configurații includ tampoane conice pentru sângerări nazale, proceduri dentare și tampoane cilindrice pentru sângerare vaginală.
Toate seturile de date sunt exprimate ca medie ± abatere standard și au fost analizate prin ANOVA utilizând Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, SUA) urmată de testul de comparații multiple al lui Bonferroni (*p<0,05).
Toate procedurile efectuate în studiile pe oameni au fost în conformitate cu standardele Institutului și ale Consiliului Național de Cercetare, precum și cu Declarația de la Helsinki 1964 și modificările ulterioare, sau cu standarde etice similare.Toți participanții au fost informați despre caracteristicile studiului și natura sa voluntară.Datele participanților rămân confidențiale odată colectate.Protocolul experimental TEG in vitro a fost revizuit și aprobat de Comitetul de etică instituțională al Colegiului Medical Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Voluntarii au semnat consimțământul informat pentru a recolta probe de sânge.
Toate procedurile efectuate în studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu Facultatea de Medicină Kastuba, Institutul de Învățământ Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Toate experimentele pe animale concepute au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului pentru Controlul și Supravegherea Experimentării Animale (CPCSEA).Toți autorii urmează regulile ARRIVE.
Spectrele FTIR ale tuturor NFRCS au fost analizate și comparate cu spectrul chitosanului prezentat în Figura 2A.Vârfuri spectrale caracteristice ale chitosanului (înregistrate) la 3437 cm-1 (întinderea OH și NH, suprapunere), 2945 și 2897 cm-1 (întindere CH), 1660 cm-1 (tulpina NH2), 1589 cm-1 (încovoiere N–H), 1157 cm-10 cm-10 (întindere secundară), C-10 (întindere secundară) yl), 993 cm-1 (întindere CO, Bo-OH) 52,53,54.Tabelul suplimentar S1 arată valorile spectrului de absorbție FTIR NFRCS pentru chitosan (reporter), chitosan pur, Cm, Ch și Cp.Spectrele FTIR ale tuturor NFRCS (Cm, Ch și Cp) au arătat aceleași benzi de absorbție caracteristice ca chitosanul pur, fără modificări semnificative (Fig. 2A).Rezultatele FTIR au confirmat absența interacțiunilor chimice sau fizice între polimerii utilizați la dezvoltarea NFRCS, indicând faptul că polimerii utilizați sunt inerți.
Caracterizarea in vitro a Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS și Cs.(A) reprezintă spectrele FTIR combinate ale compozițiilor de chitosan și Cm NFRCS, Ch NFRCS și Cp NFRCS sub compresie.(B) a) Rata de absorbție a sângelui întreg a NFRCS Cm, Ch, Cp și Cg (n = 3);Probele Ct au prezentat un BAR mai mare deoarece tamponul de bumbac are o eficiență de absorbție mai mare;b) Sânge după absorbția sângelui Ilustrație a probei absorbite.Reprezentarea grafică a BCT a probei de testare C (Cp NFRCS a avut cel mai bun BCT (15 s, n = 3)). Datele din C, D, E și G au fost afișate ca medie ± SD, iar barele de eroare reprezintă SD, ***p < 0,0001. Datele din C, D, E și G au fost afișate ca medie ± SD, iar barele de eroare reprezintă SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей прешностей прешностей прешностей онение, ***p <0,0001. Datele din C, D, E și G sunt prezentate ca medie ± abatere standard, iar barele de eroare reprezintă abaterea standard, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештносде погрештносде погрештностей е отклонение, ***p <0,0001. Datele din C, D, E și G sunt afișate ca medie ± abatere standard, barele de eroare reprezintă abaterea standard, ***p<0,0001.