Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Fertilitatea păsărilor depinde de capacitatea lor de a stoca suficient spermă viabilă pentru o perioadă lungă de timp în tubii de stocare a spermei (SST).Mecanismul exact prin care spermatozoizii intră, locuiesc și părăsesc SST rămâne controversat.Spermatozoizii găinilor sharkasi au prezentat o tendință mare de aglutinare, formând mănunchiuri filamentoase mobile care conțin multe celule.Din cauza dificultății de a observa motilitatea și comportamentul spermatozoizilor într-o trompe uterină opacă, am folosit un dispozitiv microfluidic cu o secțiune transversală microcanal similară cu cea a spermatozoizilor pentru a studia aglutinarea și motilitatea spermatozoizilor.Acest studiu discută cum se formează fasciculele de spermatozoizi, cum se mișcă și rolul lor posibil în extinderea rezidenței spermatozoizilor în SST.Am investigat viteza spermei și comportamentul reologic atunci când fluxul de fluid a fost generat într-un canal microfluidic prin presiune hidrostatică (debit = 33 µm/s).Spermatozoizii au tendința de a înota împotriva curentului (reologie pozitivă), iar viteza mănunchiului de spermatozoizi este semnificativ redusă în comparație cu spermatozoizii singuri.S-a observat că fasciculele de spermatozoizi se mișcă în spirală și cresc în lungime și grosime pe măsură ce sunt recrutați mai mulți spermatozoizi unici. S-au observat mănunchiuri de spermă apropiindu-se și aderând de pereții laterali ai canalelor microfluidice pentru a evita să fie măturați cu viteza de curgere a fluidului > 33 µm/s. S-au observat mănunchiuri de spermă apropiindu-se și aderând de pereții laterali ai canalelor microfluidice pentru a evita să fie măturați cu viteza de curgere a fluidului > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенюнкам стенюкам стенкам чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. S-a observat că fasciculele de spermă se apropie și aderă de pereții laterali ai canalelor microfluidice pentru a evita să fie îndepărtate la debite de fluid > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 怫m/s 怫m/s33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стендокам стендокам замечено чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. S-a observat că fasciculele de spermă se apropie și aderă de pereții laterali ai canalului microfluidic pentru a evita să fie îndepărtate de fluxul de fluid la >33 µm/s.Microscopia electronică de scanare și transmisie a arătat că fasciculele de spermatozoizi erau susținute de material dens abundent.Datele obținute demonstrează mobilitatea unică a spermatozoizilor de pui Sharkazi, precum și capacitatea spermatozoizilor de a aglutina și de a forma mănunchiuri mobile, ceea ce contribuie la o mai bună înțelegere a stocării pe termen lung a spermatozoizilor în SMT.
Pentru a obține fecundarea la oameni și la majoritatea animalelor, spermatozoizii și ovulele trebuie să ajungă la locul de fertilizare la momentul potrivit.Prin urmare, împerecherea trebuie să aibă loc înainte sau în momentul ovulației.Pe de altă parte, unele mamifere, cum ar fi câinii, precum și speciile non-mamifere, cum ar fi insectele, peștii, reptilele și păsările, stochează spermatozoizi în organele lor reproducătoare pentru o perioadă lungă de timp până când ouăle lor sunt gata pentru fertilizare (fertilizare asincronă 1 ).Păsările sunt capabile să mențină viabilitatea spermatozoizilor capabili să fertilizeze ouăle timp de 2-10 săptămâni2.
Aceasta este o caracteristică unică care distinge păsările de alte animale, deoarece oferă o probabilitate mare de fertilizare după o singură însămânțare timp de câteva săptămâni fără împerechere și ovulație simultană.Principalul organ de stocare a spermei, numit tubul de stocare a spermei (SST), este situat în pliurile mucoase interne de la joncțiunea uterovaginală.Până în prezent, mecanismele prin care spermatozoizii intră, locuiesc și ies din banca de spermă nu sunt pe deplin înțelese.Pe baza unor studii anterioare, au fost avansate multe ipoteze, dar niciuna nu a fost confirmată.
Forman4 a emis ipoteza că spermatozoizii își mențin reședința în cavitatea SST printr-o mișcare oscilatorie continuă împotriva direcției fluxului de fluid prin canalele proteice situate pe celulele epiteliale SST (reologie).ATP este epuizat din cauza activității flagelare constante necesare pentru a menține spermatozoizii în lumenul SST și motilitatea scade în cele din urmă până când spermatozoizii sunt scoși din banca de spermă prin fluxul de lichid și încep o nouă călătorie în josul trompei uterine ascendente pentru a fertiliza spermatozoizii.Ou (Forman4).Acest model de stocare a spermei este susținut de detectarea prin imunocitochimie a acvaporinelor 2, 3 și 9 prezente în celulele epiteliale SST.Până în prezent, studiile privind reologia spermei de pui și rolul său în stocarea SST, selecția spermatozoizilor vaginali și competiția spermatozoizilor lipsesc.La pui, spermatozoizii intră în vagin după împerecherea naturală, dar mai mult de 80% din spermatozoizi sunt ejectați din vagin la scurt timp după împerechere.Acest lucru sugerează că vaginul este locul principal pentru selecția spermatozoizilor la păsări.În plus, s-a raportat că mai puțin de 1% din spermatozoizii fertilizați în vagin ajung în SST2.În inseminarea artificială a puilor în vagin, numărul de spermatozoizi care ajung la SST tinde să crească la 24 de ore după inseminare.Până în prezent, mecanismul de selecție a spermei în timpul acestui proces este neclar, iar motilitatea spermatozoizilor poate juca un rol important în absorbția spermatozoizilor SST.Datorită pereților groși și opaci ai trompelor uterine, este dificil să monitorizați direct motilitatea spermatozoizilor în trompele uterine ale păsărilor.Prin urmare, ne lipsesc cunoștințele de bază despre cum trece spermatozoizii la SST după fertilizare.
Reologia a fost recent recunoscută ca un factor important care controlează transportul spermatozoizilor în organele genitale ale mamiferelor.Pe baza capacității spermatozoizilor mobili de a migra în contracurent, Zaferani și colab.8 au folosit un sistem microfluidic corra pentru a izola pasiv spermatozoizii mobili din probele de material seminal.Acest tip de sortare a materialului seminal este esențial pentru tratamentul medical al infertilității și cercetarea clinică și este preferat în detrimentul metodelor tradiționale care necesită mult timp și muncă și pot compromite morfologia și integritatea structurală a spermei.Cu toate acestea, până în prezent, nu au fost efectuate studii cu privire la efectul secrețiilor din organele genitale ale găinilor asupra motilității spermatozoizilor.
Indiferent de mecanismul care menține sperma stocată în SST, mulți cercetători au observat că spermatozoizii rezidenți aglutinează cap la cap în SST la puii 9, 10, prepelițe 2 și curcani 11 pentru a forma mănunchiuri de spermatozoizi aglutinați.Autorii sugerează că există o legătură între această aglutinare și depozitarea pe termen lung a spermatozoizilor în SST.
Tingari și Lake12 au raportat o asociere puternică între spermatozoizii din glanda de primire a spermatozoizilor a puiului și s-au întrebat dacă spermatozoizii aviari aglutinează în același mod ca spermatozoizii de mamifere.Ei cred că conexiunile profunde dintre spermatozoizi în canalul deferent se pot datora stresului cauzat de prezența unui număr mare de spermatozoizi într-un spațiu mic.
La evaluarea comportamentului spermatozoizilor pe lamele de sticlă suspendate proaspete, pot fi observate semne tranzitorii de aglutinare, în special la marginile picăturilor de sperma.Cu toate acestea, aglutinarea a fost adesea perturbată de acțiunea de rotație asociată cu mișcarea continuă, ceea ce explică natura tranzitorie a acestui fenomen.Cercetătorii au observat, de asemenea, că atunci când diluantul a fost adăugat în material seminal, au apărut agregate celulare alungite, „asemănătoare unui fir”.
Primele încercări de a imita un spermatozoid au fost făcute prin îndepărtarea unui fir subțire dintr-o picătură atârnată, ceea ce a dus la o veziculă alungită asemănătoare spermatozoizilor care iese din picătura de material seminal.Spermatozoizii s-au aliniat imediat în mod paralel în interiorul veziculei, dar întreaga unitate a dispărut rapid din cauza limitării 3D.Prin urmare, pentru a studia aglutinarea spermatozoizilor, este necesar să se observe motilitatea și comportamentul spermatozoizilor direct în tubii izolați de stocare a spermatozoizilor, ceea ce este dificil de realizat.Prin urmare, este necesar să se dezvolte un instrument care să imite spermatozoizii pentru a sprijini studiile asupra motilității și comportamentului de aglutinare a spermatozoizilor.Brillard și colab.13 au raportat că lungimea medie a tubilor de depozitare a spermei la puii adulți este de 400-600 µm, dar unele SST pot fi chiar și 2000 µm.Mero și Ogasawara14 au împărțit glandele seminifere în tubuli de stocare a spermatozoizilor măriți și nemariți, ambele având aceeași lungime (~500 µm) și lățimea gâtului (~38 µm), dar diametrul mediu al lumenului tubulilor a fost de 56,6 și 56,6 µm.., respectiv 11,2 μm.În studiul actual, am folosit un dispozitiv microfluidic cu o dimensiune a canalului de 200 µm × 20 µm (L × H), a cărui secțiune transversală este oarecum apropiată de cea a SST amplificat.În plus, am examinat motilitatea spermatozoizilor și comportamentul de aglutinare în fluidul care curge, ceea ce este în concordanță cu ipoteza lui Foreman că fluidul produs de celulele epiteliale SST menține spermatozoizii în lumen într-o direcție contracurent (reologică).
Scopul acestui studiu a fost de a depăși problemele de observare a motilității spermatozoizilor în trompele uterine și de a evita dificultățile de a studia reologia și comportamentul spermatozoizilor într-un mediu dinamic.A fost folosit un dispozitiv microfluidic care creează presiune hidrostatică pentru a simula motilitatea spermatozoizilor în organele genitale ale unui pui.
Atunci când o picătură dintr-o probă de spermă diluată (1:40) a fost încărcată în dispozitivul cu microcanal, au putut fi identificate două tipuri de motilitate a spermatozoizilor (sperma izolată și spermatozoizii legați).În plus, spermatozoizii au avut tendința de a înota împotriva curentului (reologie pozitivă; video 1, 2). Deși fasciculele de spermatozoizi au avut o viteză mai mică decât cea a spermatozoizilor singuri (p < 0,001), au crescut procentul de spermatozoizi care prezintă reotaxie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2). Deși fasciculele de spermatozoizi au avut o viteză mai mică decât cea a spermatozoizilor singuri (p < 0,001), au crescut procentul de spermatozoizi care prezintă reotaxie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоих сперматозох ви доле 01 (), ли процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Deși fasciculele de spermatozoizi au avut o viteză mai mică decât cea a spermatozoizilor unici (p < 0,001), au crescut procentul de spermatozoizi care prezintă reotaxie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示浾显示阁显示阁显的速度（p < 0,001），分比（p <0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显瀾 昳怏 昳怏 昳怏 昳怏分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001 руела ниже), нт сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Deși viteza fasciculelor de spermatozoizi a fost mai mică decât cea a spermatozoizilor singuri (p < 0,001), acestea au crescut procentul de spermatozoizi cu reologie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2).Reologia pozitivă pentru un singur spermatozoizi și smocuri este estimată la aproximativ 53% și, respectiv, 85%.
S-a observat că spermatozoizii puilor sharkasi imediat după ejaculare formează mănunchiuri liniare, formate din zeci de indivizi.Aceste smocuri cresc în lungime și grosime în timp și pot rămâne in vitro câteva ore înainte de a se disipa (video 3).Aceste mănunchiuri filamentoase sunt în formă de spermatozoizi de echidna care se formează la capătul epididimului.S-a descoperit că materialul seminal de găină Sharkashi are o tendință mare de a se aglutina și de a forma un mănunchi reticulat în mai puțin de un minut după colectare.Aceste grinzi sunt dinamice și capabile să se lipească de orice pereți din apropiere sau obiecte statice.Deși fasciculele de spermatozoizi reduc viteza celulelor spermatozoizilor, este clar că macroscopic își măresc liniaritatea.Lungimea fasciculelor variază în funcție de numărul de spermatozoizi colectați în fascicule.Au fost izolate două părți ale fasciculului: partea inițială, incluzând capul liber al spermatozoizilor aglutinați, și partea terminală, incluzând coada și întregul capăt distal al spermatozoizilor.Folosind o cameră de mare viteză (950 fps), s-au observat capete libere de spermatozoizi aglutinați în partea inițială a fasciculului, responsabile de mișcarea fasciculului datorită mișcării lor oscilatorii, trăgându-le pe cele rămase în fascicul cu o mișcare elicoidală (Video 4).Cu toate acestea, în smocuri lungi, s-a observat că unele capete de spermatozoizi libere au aderat de corp, iar porțiunea terminală a smocului acționează ca palete pentru a ajuta la propulsarea smocului.
În timp ce într-un flux lent de lichid, fasciculele de spermatozoizi se deplasează paralel unul cu celălalt, cu toate acestea, ele încep să se suprapună și să se lipească de tot ce este nemișcat, pentru a nu fi spălate de fluxul de curent pe măsură ce viteza de curgere crește.Mănunchiurile se formează atunci când o mână de spermatozoizi se apropie unul de celălalt, încep să se miște în sincron și se înfășoară unul în jurul celuilalt, apoi se lipesc de o substanță lipicioasă.Figurile 1 și 2 arată modul în care spermatozoizii se apropie unul de celălalt, formând o joncțiune pe măsură ce cozile se înfășoară unul în jurul celuilalt.
Cercetătorii au aplicat presiune hidrostatică pentru a crea un flux de fluid într-un microcanal pentru a studia reologia spermatozoizilor.A fost utilizat un microcanal cu o dimensiune de 200 µm × 20 µm (L × H) și o lungime de 3,6 µm.Utilizați microcanale între recipiente cu seringi montate la capete.Colorantul alimentar a fost folosit pentru a face canalele mai vizibile.
Legați cablurile de interconectare și accesoriile de perete.Videoclipul a fost realizat cu un microscop cu contrast de fază.Cu fiecare imagine, sunt prezentate microscopia cu contrast de fază și imagini de cartografiere.(A) Legătura dintre două fluxuri rezistă curgerii datorită mișcării elicoidale (săgeată roșie).(B) Legătura dintre fascicul de tuburi și peretele canalului (săgeți roșii), în același timp sunt conectate la alte două fascicule (săgeți galbene).(C) Mănunchiurile de spermă din canalul microfluidic încep să se conecteze între ele (săgeți roșii), formând o plasă de fascicule de spermatozoizi.(D) Formarea unei rețele de fascicule de spermatozoizi.
Când o picătură de spermă diluată a fost încărcată în dispozitivul microfluidic și s-a creat un flux, s-a observat că fasciculul de spermă se mișcă împotriva direcției fluxului.Legăturile se potrivesc perfect pe pereții microcanalelor, iar capetele libere din partea inițială a fasciculelor se potrivesc perfect pe ele (video 5).De asemenea, se lipesc de orice particule staționare în calea lor, cum ar fi resturile, pentru a rezista la a fi luate de curent.În timp, aceste smocuri devin filamente lungi care captează alți spermatozoizi unici și smocuri mai scurte (Video 6).Pe măsură ce fluxul începe să încetinească, liniile lungi de spermatozoizi încep să formeze o rețea de linii de spermă (Video 7; Figura 2).
La viteză mare de curgere (V > 33 µm/s), mișcările spiralate ale firelor sunt crescute ca o încercare de a prinde mai multe mănunchiuri individuale de spermatozoizi, care rezistă mai bine forței de deriva a fluxului. La viteză mare de curgere (V > 33 µm/s), mișcările spiralate ale firelor sunt crescute ca o încercare de a prinde mai multe mănunchiuri individuale de spermatozoizi, care rezistă mai bine forței de deriva a fluxului. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постонь мкопы ножество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дротивостоят дротивостоят дрелщих пучки. La debite mari (V > 33 µm/s), mișcările elicoidale ale toroanelor cresc pe măsură ce încearcă să prindă mulți spermatozoizi individuali formând mănunchiuri care sunt mai capabile să reziste forței de deriva a fluxului.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成捉许多形成束纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束纹的螺束的廴成束的维束曌地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形 成 束 形 成 束 形 成 束 厪 动 增加 ，更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в постопхзме в позоких отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейтока. La debite mari (V > 33 µm/s), mișcarea elicoidală a filamentelor crește în încercarea de a captura mulți spermatozoizi individuali care formează mănunchiuri pentru a rezista mai bine forțelor de derivă ale fluxului.De asemenea, au încercat să atașeze microcanale pe pereții laterali.
Fasciculele de spermatozoizi au fost identificate ca grupuri de capete de spermatozoizi si cozi ondulate folosind microscopie cu lumina (LM).Fasciculele de spermatozoizi cu diverse agregate au fost, de asemenea, identificate ca capete răsucite și agregate flagelare, cozi multiple de spermatozoizi fuzionate, capete de spermatozoizi atașate de o coadă și capete de spermatozoizi cu nuclei îndoiți ca nuclee fuzionate multiple.microscopia electronică cu transmisie (TEM).Microscopia electronică cu scanare (SEM) a arătat că fasciculele de spermatozoizi erau agregate învelite de capete de spermatozoizi, iar agregatele de spermatozoizi au arătat o rețea atașată de cozi înfășurate.
Morfologia și ultrastructura spermatozoizilor, formarea fasciculelor de spermatozoizi au fost studiate prin microscopie cu lumină (jumătate de secțiune), microscopie electronică cu scanare (SEM) și microscopie electronică cu transmisie (TEM), frotiurile de spermatozoizi au fost colorate cu portocaliu de acridină și examinate cu ajutorul microscopiei cu epifluorescență.
Frotiul de spermatozoizi cu portocaliu de acridină (Fig. 3B) a arătat că capetele spermatozoizilor au fost lipite împreună și acoperite cu material secretor, ceea ce a dus la formarea de smocuri mari (Fig. 3D).Fasciculele de spermatozoizi constau din agregate de spermatozoizi cu o retea de cozi atasate (Fig. 4A-C).Fasciculele de spermatozoizi sunt compuse din cozile multor spermatozoizi lipiti impreuna (Fig. 4D).Secretele (Fig. 4E,F) acopereau capetele fasciculelor de spermatozoizi.
Formarea mănunchiului de spermatozoizi Folosind microscopia cu contrast de fază și frotiuri de spermatozoizi colorate cu portocaliu de acridină, a arătat că capetele spermatozoizilor se lipesc împreună.(A) Formarea timpurie a smocului de spermatozoizi începe cu un spermatozoid (cerc alb) și trei spermatozoizi (cerc galben), cu spirala începând de la coadă și terminând la cap.(B) Fotomicrografie a unui frotiu de spermă colorat cu portocaliu de acridină care arată capete de spermatozoizi aderente (săgeți).Descărcarea acoperă capul (capele).Mărire × 1000. (C) Dezvoltarea unui fascicul mare transportat prin flux într-un canal microfluidic (folosind o cameră de mare viteză la 950 fps).(D) Micrografie a unui frotiu de spermă colorat cu portocaliu de acridină care arată smocuri mari (săgeți).Mărire: ×200.
Micrografie electronică cu scanare a unui fascicul de spermă și a unui frotiu de spermă colorate cu portocaliu de acridină.(A, B, D, E) sunt micrografii electronice digitale cu scanare color ale spermatozoizilor, iar C și F sunt micrografii ale frotiurilor de spermă colorate cu acridină portocalie care arată atașarea mai multor spermatozoizi care înfășoară rețeaua caudală.(AC) Agregatele de spermatozoizi sunt prezentate ca o rețea de cozi atașate (săgeți).(D) Aderența mai multor spermatozoizi (cu substanță adezivă, contur roz, săgeată) care se înfășoară în jurul cozii.(E și F) Agregatele capului de spermatozoizi (indicatoare) acoperite cu material adeziv (indicatoare).Spermatozoizii au format mănunchiuri cu mai multe structuri asemănătoare vortexului (F).(C) ×400 și (F) ×200 măriri.
Folosind microscopia electronică de transmisie, am descoperit că fasciculele de spermatozoizi aveau cozi atașate (Fig. 6A, C), capete atașate la cozi (Fig. 6B) sau capete atașate la cozi (Fig. 6D).Capetele spermatozoizilor din fascicul sunt curbate, prezentând în secțiune două regiuni nucleare (Fig. 6D).În fasciculul de incizie, spermatozoizii aveau un cap răsucit cu două regiuni nucleare și mai multe regiuni flagelare (Fig. 5A).
Micrografie digitală electronică color care arată cozile de legătură din fasciculul de spermatozoizi și materialul aglutinant care conectează capetele spermatozoizilor.(A) Coada atașată a unui număr mare de spermatozoizi.Observați cum arată coada atât în ​​proiecția portret (săgeată) cât și în cea peisaj (săgeată).(B) Capul (săgeata) spermatozoizilor este conectat la coadă (săgeata).(C) Mai multe cozi de spermatozoizi (săgeți) sunt atașate.(D) Materialul de aglutinare (AS, albastru) conectează patru capete de spermatozoizi (violet).
Microscopia electronică cu scanare a fost utilizată pentru a detecta capete de spermatozoizi în fasciculele de spermatozoizi acoperite cu secreții sau membrane (Figura 6B), indicând faptul că fasciculele de spermă au fost ancorate de material extracelular.Materialul aglutinat a fost concentrat în capul spermei (ansamblu asemănător capului de meduză; Fig. 5B) și sa extins distal, dând un aspect galben strălucitor la microscopie cu fluorescență atunci când este colorat cu portocaliu de acridină (Fig. 6C).Această substanță este clar vizibilă la microscopul de scanare și este considerată un liant.Secțiunile semi-subțiri (Fig. 5C) și frotiurile de spermă colorate cu portocaliu de acridină au arătat fascicule de spermatozoizi care conțineau capete dens împachetate și cozi ondulate (Fig. 5D).
Diverse microfotografii care arată agregarea capetelor de spermatozoizi și a cozilor pliate folosind diferite metode.(A) Micrografie electronică cu transmisie de culoare digitală în secțiune transversală a unui pachet de spermatozoizi care arată un cap de spermă încolăcit cu un nucleu din două părți (albastru) și mai multe părți flagelare (verde).(B) Micrografie electronică digitală cu scanare color care arată un grup de capete de spermă asemănătoare meduzei (săgeți) care par a fi acoperite.(C) Secțiune semi-subțire care arată capete de spermatozoizi agregate (săgeți) și cozi ondulate (săgeți).(D) Micrografie a unui frotiu de spermă colorat cu portocaliu de acridină care arată agregate de capete de spermatozoizi (săgeți) și cozi aderente ondulate (săgeți).Rețineți că o substanță lipicioasă (S) acoperă capul spermatozoidului.(D) × 1000 mărire.
Folosind microscopia electronică cu transmisie (Fig. 7A), s-a remarcat, de asemenea, că capetele spermatozoizilor erau răsucite și nucleii aveau o formă de spirală, așa cum este confirmat de frotiurile de spermatozoizi colorate cu portocaliu de acridină și examinate cu ajutorul microscopiei cu fluorescență (Fig. 7B).
(A) Micrografie electronică cu transmisie de culoare digitală și (B) Frotiu de spermă colorat cu acridină portocalie care arată capete încolăciți și atașarea capetelor și cozilor spermatozoizilor (săgeți).(B) × 1000 mărire.
O descoperire interesantă este că spermatozoizii lui Sharkazi se agregează pentru a forma mănunchiuri filamentoase mobile.Proprietățile acestor fascicule ne permit să înțelegem posibilul lor rol în absorbția și stocarea spermatozoizilor în SST.
După împerechere, spermatozoizii intră în vagin și sunt supuși unui proces intens de selecție, rezultând doar un număr limitat de spermatozoizi care intră în SST15,16.Până în prezent, mecanismele prin care spermatozoizii intră și ies din SST sunt neclare.La păsările de curte, spermatozoizii sunt depozitați în SST pentru o perioadă extinsă de 2 până la 10 săptămâni, în funcție de specie6.Controversa rămâne cu privire la starea materialului seminal în timpul depozitării în SST.Sunt în mișcare sau în repaus?Cu alte cuvinte, cum își mențin spermatozoizii poziția în SST atât de mult timp?
Forman4 a sugerat că rezidența și ejecția SST ar putea fi explicate în termeni de motilitate a spermatozoizilor.Autorii presupun că spermatozoizii își mențin poziția înotând împotriva fluxului de fluid creat de epiteliul SST și că spermatozoizii sunt ejectați din SST atunci când viteza lor scade sub punctul în care încep să se miște înapoi din cauza lipsei de energie.Zaniboni5 a confirmat prezența acvaporinelor 2, 3 și 9 în porțiunea apicală a celulelor epiteliale SST, care pot sprijini indirect modelul de stocare a spermei al lui Foreman.În studiul actual, am constatat că aproape jumătate din spermatozoizii lui Sharkashi prezintă reologie pozitivă în fluidul care curge și că fasciculele de spermatozoizi aglutinați cresc numărul de spermatozoizi care prezintă reologie pozitivă, deși aglutinarea îi încetinește.Modul în care spermatozoizii parcurg tubul uterin al păsării până la locul de fertilizare nu este pe deplin înțeles.La mamifere, lichidul folicular atrage spermatozoizii.Cu toate acestea, se crede că chimioatractanții direcționează spermatozoizii să se apropie de distanțe lungi7.Prin urmare, alte mecanisme sunt responsabile de transportul spermatozoizilor.Capacitatea spermatozoizilor de a se orienta și curge împotriva fluidului trompelor uterine eliberat după împerechere a fost raportată a fi un factor major în țintirea spermatozoizilor la șoareci.Parker 17 a sugerat că spermatozoizii traversează oviductele înotând împotriva curentului ciliar la păsări și reptile.Deși nu a fost demonstrat experimental la păsări, Adolphi18 a fost primul care a descoperit că spermatozoizii aviari dă rezultate pozitive atunci când un strat subțire de lichid între o lamă și lamă este creat cu o bandă de hârtie de filtru.Reologie.Hino și Yanagimachi [19] au plasat un complex ovar-tubar-uterin de șoarece într-un inel de perfuzie și au injectat 1 µl de cerneală în istm pentru a vizualiza fluxul de fluid în trompele uterine.Ei au observat o mișcare foarte activă de contracție și relaxare în trompa uterină, în care toate bilele de cerneală se mișcau constant spre ampula trompei uterine.Autorii subliniază importanța fluxului de lichid tubar de la trompele uterine inferioare spre cele superioare pentru ridicarea spermatozoizilor și fertilizare.Brillard20 a raportat că la găini și curcani, spermatozoizii migrează prin mișcare activă de la intrarea vaginală, unde sunt depozitați, la joncțiunea utero-vaginală, unde sunt depozitați.Totuși, această mișcare nu este necesară între joncțiunea uterovaginală și infundibul deoarece spermatozoizii sunt transportați prin deplasare pasivă.Cunoscând aceste recomandări anterioare și rezultatele obținute în studiul actual, se poate presupune că capacitatea spermatozoizilor de a se deplasa în amonte (reologia) este una dintre proprietățile pe care se bazează procesul de selecție.Aceasta determină trecerea spermatozoizilor prin vagin și intrarea lor în CCT pentru depozitare.După cum a sugerat Forman4, acest lucru poate facilita, de asemenea, procesul de intrare a spermatozoizilor în SST și în habitatul său pentru o perioadă de timp și apoi ieșirea când viteza lor începe să scadă.
Pe de altă parte, Matsuzaki și Sasanami 21 au sugerat că spermatozoizii aviari suferă modificări de motilitate de la repaus la motilitate în tractul reproducător masculin și feminin.Inhibarea motilității spermei rezidente în SST a fost propusă pentru a explica timpul lung de depozitare a spermei și apoi întinerirea după părăsirea SST.În condiții hipoxice, Matsuzaki și colab.1 a raportat o producție mare și eliberare de lactat în SST, ceea ce poate duce la inhibarea motilității spermei rezidente.În acest caz, importanța reologiei spermatozoizilor se reflectă în selecția și absorbția spermatozoizilor, și nu în depozitarea acestora.
Modelul de aglutinare a spermei este considerat o explicație plauzibilă pentru perioada lungă de depozitare a spermei în SST, deoarece acesta este un model comun de retenție a spermei la păsările de curte2,22,23.Bakst şi colab.2 a observat că majoritatea spermatozoizilor au aderat unul la altul, formând agregate fasciculare, iar spermatozoizii unici au fost rar întâlniți în CCM de prepeliță.Pe de altă parte, Wen și colab.24 au observat mai mulți spermatozoizi împrăștiați și mai puține smocuri de spermatozoizi în lumenul SST la pui.Pe baza acestor observații, se poate presupune că înclinația pentru aglutinarea spermatozoizilor diferă între păsări și între spermatozoizi din același ejaculat.În plus, Van Krey și colab.9 sugerează că disocierea aleatorie a spermatozoizilor aglutinați este responsabilă pentru pătrunderea treptată a spermatozoizilor în lumenul trompei uterine.Conform acestei ipoteze, spermatozoizii cu capacitate de aglutinare mai mică ar trebui expulzați mai întâi din SST.În acest context, capacitatea spermatozoizilor de a aglutina poate fi un factor care influențează rezultatul competiției spermatozoizilor la păsările murdare.În plus, cu cât spermatozoizii aglutinați se disociază mai mult, cu atât fertilitatea se menține mai mult timp.
Deși agregarea spermatozoizilor și agregarea în mănunchiuri au fost observate în mai multe studii2,22,24, aceștia nu au fost descriși în detaliu din cauza complexității observării lor cinematice în cadrul SST.Au fost făcute mai multe încercări de a studia aglutinarea spermatozoizilor in vitro.A fost observată o agregare extinsă, dar tranzitorie, atunci când firul subțire a fost îndepărtat din picătura de semințe atârnând.Acest lucru duce la faptul că o bulă alungită iese din picătură, imitând glanda seminal.Din cauza limitărilor 3D și a timpilor scurti de uscare prin picurare, întregul bloc a căzut rapid în paragină9.În studiul actual, folosind găini Sharkashi și chipsuri microfluidice, am putut descrie modul în care se formează aceste smocuri și cum se mișcă.fasciculele de spermă s-au format imediat după colectarea materialului seminal și s-au descoperit că se mișcă în spirală, prezentând reologie pozitivă atunci când sunt prezente în flux.În plus, atunci când sunt privite macroscopic, s-a observat că fasciculele de spermă cresc liniaritatea motilității în comparație cu spermatozoizii izolați.Acest lucru sugerează că aglutinarea spermatozoizilor poate avea loc înainte de penetrarea SST și că producția de spermă nu este limitată la o zonă mică din cauza stresului, așa cum sa sugerat anterior (Tingari și Lake12).În timpul formării smocurilor, spermatozoizii înoată sincron până când formează o joncțiune, apoi cozile lor se înfășoară una în jurul celeilalte, iar capul spermatozoidului rămâne liber, dar coada și partea distală a spermatozoidului se lipesc împreună cu o substanță lipicioasă.Prin urmare, capul liber al ligamentului este responsabil de mișcare, trăgând restul ligamentului.Microscopia electronică de scanare a fasciculelor de spermatozoizi a arătat capete de spermatozoizi atașate acoperite cu o mulțime de material lipicios, sugerând că capetele de spermatozoizi au fost atașate în fascicule de repaus, ceea ce poate să fi avut loc după ce au ajuns la locul de depozitare (SST).
Când un frotiu de spermatozoizi este colorat cu portocaliu de acridină, materialul adeziv extracelular din jurul celulelor spermatozoizilor poate fi văzut la microscop fluorescent.Această substanță permite fasciculelor de spermatozoizi să adere și să se agațe de orice suprafețe sau particule din jur, astfel încât acestea să nu se deplaseze cu fluxul înconjurător.Astfel, observațiile noastre arată rolul aderenței spermatozoizilor sub formă de fascicule mobile.Capacitatea lor de a înota împotriva curentului și de a se lipi de suprafețele din apropiere permite spermatozoizilor să rămână mai mult timp în SST.
Rothschild25 a folosit o cameră de hemocitometrie pentru a studia distribuția plutitoare a materialului seminal de bovine într-o picătură de suspensie, făcând microfotografii printr-o cameră cu axa optică atât verticală, cât și orizontală a microscopului.Rezultatele au arătat că spermatozoizii au fost atrași de suprafața camerei.Autorii sugerează că pot exista interacțiuni hidrodinamice între spermatozoizi și suprafață.Luând în considerare acest lucru, împreună cu capacitatea materialului seminal de pui Sharkashi de a forma smocuri lipicioase, poate crește probabilitatea ca materialul seminal să adere la peretele SST și să fie depozitat pentru perioade lungi de timp.
Bccetti și Afzeliu26 au raportat că glicocalixul spermatozoizilor este necesar pentru recunoașterea gameților și aglutinarea.Forman10 a observat că hidroliza legăturilor α-glicozidice din straturile de glicoproteină-glicolipide prin tratarea spermei aviare cu neuraminidază a dus la o fertilitate redusă, fără a afecta motilitatea spermatozoizilor.Autorii sugerează că efectul neuraminidazei asupra glicocalixului afectează sechestrarea spermei la joncțiunea utero-vaginală, reducând astfel fertilitatea.Observațiile lor nu pot ignora posibilitatea ca tratamentul cu neuraminidază să reducă recunoașterea spermatozoizilor și a ovocitelor.Forman și Engel10 au descoperit că fertilitatea a fost redusă atunci când găinile au fost inseminare intravaginal cu material seminal tratat cu neuraminidază.Cu toate acestea, FIV cu spermatozoizi tratați cu neuraminidază nu a afectat fertilitatea în comparație cu puii de control.Autorii au concluzionat că modificările învelișului de glicoproteină-glicolipid din jurul membranei spermatozoizilor au redus capacitatea spermatozoizilor de a fertiliza prin afectarea sechestrului spermatozoizilor la joncțiunea utero-vaginală, care la rândul său a crescut pierderea spermatozoizilor datorită vitezei joncțiunii utero-vaginale, dar nu afectează recunoașterea spermatozoizilor și a ovulelor.
La curcani, Bakst și Bauchan 11 au găsit vezicule mici și fragmente de membrană în lumenul SST și au observat că unele dintre aceste granule s-au fuzionat cu membrana spermatozoizilor.Autorii sugerează că aceste relații pot contribui la depozitarea pe termen lung a spermatozoizilor în SST.Cu toate acestea, cercetătorii nu au precizat sursa acestor particule, dacă sunt secretate de celulele epiteliale CCT, produse și secretate de sistemul reproducător masculin sau produse de spermatozoizi însuși.De asemenea, aceste particule sunt responsabile de aglutinare.Grützner și colab.27 au raportat că celulele epiteliale epididimale produc și secretă o proteină specifică care este necesară pentru formarea tracturilor seminale cu un singur por.Autorii raportează, de asemenea, că dispersia acestor fascicule depinde de interacțiunea proteinelor epididimale.Nixon et al28 au descoperit că anexele secretă o proteină, osteonectina acidă bogată în cisteină;SPARC este implicat în formarea de smocuri de spermă la echidna cu cioc scurt și ornitorinci.Imprăștirea acestor fascicule este asociată cu pierderea acestei proteine.
În studiul actual, analiza ultrastructurală folosind microscopia electronică a arătat că spermatozoizii au aderat la o cantitate mare de material dens.Se crede că aceste substanțe sunt responsabile pentru aglutinarea care se condensează între și în jurul capetelor aderente, dar la concentrații mai mici în regiunea cozii.Presupunem că această substanță aglutinantă este excretată din sistemul reproducător masculin (epididimul sau canalul deferent) împreună cu materialul seminal, deoarece observăm adesea că materialul seminal se separă de limfă și plasma seminală în timpul ejaculării.S-a raportat că, pe măsură ce spermatozoizii aviari trec prin epididim și canalul deferent, ei suferă modificări legate de maturare care susțin capacitatea lor de a lega proteinele și de a dobândi glicoproteine ​​asociate lemei plasmatice.Persistența acestor proteine ​​pe membranele spermatozoizilor rezidente în SST sugerează că aceste proteine ​​pot influența dobândirea stabilității membranei spermatozoizilor 30 și pot determina fertilitatea lor 31 .Ahammad și colab.32 au raportat că spermatozoizii obținuți din diferite părți ale sistemului reproducător masculin (de la testicule la canalul deferent distal) au prezentat o creștere progresivă a viabilității în condiții de depozitare lichidă, indiferent de temperatura de depozitare, iar viabilitatea la pui crește și în trompele uterine după inseminare artificială.
Ciucurile de spermă de pui Sharkashi au caracteristici și funcții diferite față de alte specii, cum ar fi echidne, ornitorinci, șoareci de lemn, șobolani de căprioară și cobai.La puii sharkasi, formarea mănunchiurilor de spermatozoizi le-a redus viteza de înot în comparație cu spermatozoizii singuri.Cu toate acestea, aceste fascicule au crescut procentul de spermatozoizi reologic pozitivi și au crescut capacitatea spermatozoizilor de a se stabiliza într-un mediu dinamic.Astfel, rezultatele noastre confirmă sugestia anterioară că aglutinarea spermatozoizilor în SST este asociată cu stocarea pe termen lung a spermei.De asemenea, emitem ipoteza că înclinația spermatozoizilor de a forma smocuri poate controla rata pierderii spermatozoizilor în SST, ceea ce poate modifica rezultatul competiției spermatozoizilor.Conform acestei ipoteze, spermatozoizii cu capacitate de aglutinare scăzută eliberează mai întâi SST, în timp ce spermatozoizii cu capacitate mare de aglutinare produc majoritatea descendenților.Formarea fasciculelor de spermatozoizi cu un singur por este benefică și afectează raportul părinte-copil, dar folosește un mecanism diferit.La echidna și ornitorinci, spermatozoizii sunt aranjați paralel unul cu celălalt pentru a crește viteza de înaintare a fasciculului.Legăturile de echidne se mișcă de aproximativ trei ori mai repede decât un singur spermatozoizi.Se crede că formarea unor astfel de smocuri de spermă în echidna este o adaptare evolutivă pentru a menține dominația, deoarece femelele sunt promiscue și de obicei se împerechează cu mai mulți masculi.Prin urmare, spermatozoizii din diferite ejaculate concurează înverșunat pentru fertilizarea ovulului.
Spermatozoizii aglutinați de pui sharkasi sunt ușor de vizualizat folosind microscopia cu contrast de fază, ceea ce este considerat avantajos deoarece permite studiul ușor al comportamentului spermatozoizilor in vitro.Mecanismul prin care formarea smocurilor de spermă promovează reproducerea la puii sharkasi este, de asemenea, diferit de cel observat la unele mamifere placentare, reprezentând un comportament cooperant al spermatozoizilor, cum ar fi șoarecii de lemn, unde unii spermatozoizi ajung la ouă, ajutând alți indivizi înrudiți să ajungă și să-și deterioreze ouăle.pentru a te dovedi.comportament altruist.Autofertilizarea 34. Un alt exemplu de comportament cooperant la spermatozoizi a fost găsit la șoarecii de cerb, unde spermatozoizii au fost capabili să identifice și să se combine cu spermatozoizii cei mai înrudiți genetic și să formeze grupuri cooperante pentru a le crește viteza în comparație cu spermatozoizii neînrudiți35.
Rezultatele obținute în acest studiu nu contrazic teoria lui Foman privind depozitarea pe termen lung a spermatozoizilor în SWS.Cercetătorii raportează că spermatozoizii continuă să se miște în fluxul celulelor epiteliale care căptușesc SST pentru o perioadă îndelungată de timp, iar după o anumită perioadă de timp, depozitele de energie ale spermatozoizilor sunt epuizate, rezultând o scădere a vitezei, ceea ce permite expulzarea substanțelor cu greutate moleculară mică.energia spermatozoizilor cu fluxul de lichid din lumenul SST Cavitatea trompei uterine.În studiul actual, am observat că jumătate din spermatozoizii unici au arătat capacitatea de a înota împotriva fluidelor care curg, iar aderența lor în mănunchi le-a crescut capacitatea de a prezenta reologie pozitivă.În plus, datele noastre sunt în concordanță cu cele ale lui Matsuzaki și colab.1 care a raportat că secreția crescută de lactat în SST poate inhiba motilitatea spermatozoizilor rezidenți.Cu toate acestea, rezultatele noastre descriu formarea ligamentelor mobile ale spermatozoizilor și comportamentul lor reologic în prezența unui mediu dinamic într-un microcanal, în încercarea de a elucida comportamentul lor în SST.Cercetările viitoare se pot concentra pe determinarea compoziției chimice și a originii agentului de aglutinare, ceea ce, fără îndoială, va ajuta cercetătorii să dezvolte noi modalități de stocare a materialului seminal lichid și de a crește durata fertilității.
Cincisprezece sharkasi masculi cu gâtul gol în vârstă de 30 de săptămâni (dominent homozigot; Na Na) au fost selectați ca donatori de spermă în studiu.Păsările au fost crescute la Ferma de Păsări de Cercetare a Facultății de Agricultură, Universitatea Ashit, Guvernoratul Ashit, Egipt.Păsările au fost adăpostite în cuști individuale (30 x 40 x 40 cm), supuse unui program de lumină (16 ore de lumină și 8 ore de întuneric) și au fost hrănite cu o dietă care conținea 160 g de proteină brută, 2800 kcal de energie metabolizabilă, câte 35 g de calciu.5 grame de fosfor disponibil pe kilogram de dietă.
Conform datelor 36, ​​37, materialul seminal a fost colectat de la bărbați prin masaj abdominal.Un total de 45 de probe de sperma au fost colectate de la 15 bărbați pe parcursul a 3 zile.Sperma (n = 15/zi) a fost diluată imediat 1:1 (v:v) cu Belsville Poultry Semen Diluent, care conține difosfat de potasiu (1,27 g), glutamat monosodic monohidrat (0,867 g), fructoză (0,5 d) sodiu anhidru.acetat (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometan (0,195 g), citrat de potasiu monohidrat (0,064 g), monofosfat de potasiu (0,065 g), clorură de magneziu (0,034 g) și H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritate m333O8m3.Probele de material seminal diluat au fost examinate mai întâi la microscop cu lumină pentru a asigura o bună calitate a materialului seminal (umiditate) și apoi depozitate într-o baie de apă la 37°C până la utilizare în decurs de o jumătate de oră după colectare.
Cinematica și reologia spermatozoizilor sunt descrise folosind un sistem de dispozitive microfluidice.Probele de sperma au fost diluate în continuare la 1:40 în Beltsville Avian Semen Diluent, încărcate într-un dispozitiv microfluidic (vezi mai jos), iar parametrii cinetici au fost determinați utilizând un sistem de analiză computerizată a spermei (CASA) dezvoltat anterior pentru caracterizarea microfluidicei.privind mobilitatea spermatozoizilor în medii lichide (Departamentul de Inginerie Mecanică, Facultatea de Inginerie, Universitatea Assiut, Egipt).Pluginul poate fi descărcat de la: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Au fost măsurate viteza curbei (VCL, μm/s), viteza liniară (VSL, μm/s) și viteza medie a traiectoriei (VAP, μm/s).Videoclipurile cu spermatozoizi au fost realizate folosind un microscop inversat de contrast de fază Optika XDS-3 (cu obiectiv 40x) conectat la o cameră Tucson ISH1000 la 30 fps timp de 3 secunde.Utilizați software-ul CASA pentru a studia cel puțin trei zone și 500 de traiectorii de spermatozoizi per probă.Videoclipul înregistrat a fost procesat folosind un CASA de casă.Definiția motilității în plug-in-ul CASA se bazează pe viteza de înot a spermatozoizilor în comparație cu debitul și nu include alți parametri, cum ar fi mișcarea laterală, deoarece s-a constatat că aceasta este mai fiabilă în fluxul fluidului.Mișcarea reologică este descrisă ca mișcarea spermatozoizilor împotriva direcției fluxului de fluid.Spermatozoizii cu proprietăți reologice au fost împărțiți la numărul de spermatozoizi mobili;spermatozoizii care erau în repaus și spermatozoizii în mișcare convectivă au fost excluși din numărare.
Toate substanțele chimice utilizate au fost obținute de la Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egipt), dacă nu este menționat altfel.Dispozitivul a fost fabricat așa cum este descris de El-sherry și colab.40 cu unele modificari.Materialele utilizate pentru fabricarea microcanalelor au inclus plăci de sticlă (Howard Glass, Worcester, MA), rezistență negativă SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcool diaceton (Sigma Aldrich, Steinheim, Germania) și poliacetonă.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Microcanalele sunt fabricate folosind litografie moale.Mai întâi, o mască de protecție transparentă cu designul microcanal dorit a fost imprimată pe o imprimantă de înaltă rezoluție (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON).Maestrii au fost realizati folosind placi de sticla ca substrat.Plăcile au fost curățate în acetonă, izopropanol și apă deionizată și apoi acoperite cu un strat de 20 um de SU8-25 prin acoperire prin centrifugare (3000 rpm, 1 min).Straturile SU-8 au fost apoi uscate ușor (65°C, 2 min și 95°C, 10 min) și expuse la radiații UV timp de 50 s.Coaceți după expunere la 65°C și 95°C timp de 1 min și 4 min pentru a reticula straturile SU-8 expuse, urmată de dezvoltare în alcool diaceton timp de 6,5 min.Coaceți vafele tare (200°C timp de 15 minute) pentru a solidifica și mai mult stratul SU-8.
PDMS a fost preparat prin amestecarea monomerului și întăritorului într-un raport de greutate de 10:1, apoi a fost degazat într-un esicator în vid și turnat pe cadrul principal SU-8.PDMS a fost întărit într-un cuptor (120°C, 30 min), apoi canalele au fost tăiate, separate de master și perforate pentru a permite atașarea tuburilor la intrarea și ieșirea microcanalului.În cele din urmă, microcanalele PDMS au fost atașate permanent la lamele de microscop folosind un procesor corona portabil (Electro-Technic Products, Chicago, IL), așa cum este descris în altă parte.Microcanalul utilizat în acest studiu măsoară 200 µm × 20 µm (L × H) și are 3,6 cm lungime.
Fluxul de fluid indus de presiunea hidrostatică în interiorul microcanalului se realizează prin menținerea nivelului fluidului în rezervorul de admisie peste diferența de înălțime Δh39 în rezervorul de evacuare (Fig. 1).
unde f este coeficientul de frecare, definit ca f = C/Re pentru fluxul laminar într-un canal dreptunghiular, unde C este o constantă în funcție de raportul de aspect al canalului, L este lungimea microcanalului, Vav este viteza medie în interiorul microcanalului, Dh este diametrul hidraulic al canalului, g - accelerația gravitației.Folosind această ecuație, viteza medie a canalului poate fi calculată folosind următoarea ecuație: