Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Folosiți o versiune de browser cu suport CSS limitat. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). În plus, pentru a asigura suport continuu, afișăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Afișează un carusel cu trei diapozitive simultan. Folosește butoanele Anterior și Următor pentru a parcurge trei diapozitive simultan sau folosește butoanele cursorului de la final pentru a parcurge trei diapozitive simultan.
Particulele poroase de silice au fost preparate prin metoda sol-gel cu unele modificări pentru a obține particule cu pori largi. Aceste particule au fost derivatizate cu N-fenilmaleimidă-metilvinil izocianat (PMI) și stiren prin polimerizare cu transfer invers de lanț-fragmentare (RAFT) pentru a produce poliamide intercalate cu N-fenilmaleimidă. Fază staționară de stiren (PMP). Coloanele din oțel inoxidabil cu diametru îngust (100 × 1,8 mm diametru interior) au fost umplute cu o suspensie. Performanța cromatografică a coloanei PMP a fost evaluată pentru a separa un amestec de peptide sintetice constând din cinci peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoacid enkefalină) și hidrolizat triptic de albumină serică umană (HAS). În condiții optime de eluție, numărul teoretic de plăci cu un amestec de peptide a atins 280.000 de plăci/mp. Comparând performanța de separare a coloanei dezvoltate cu coloana comercială Ascentis Express RP-Amide, s-a observat că eficiența de separare a coloanei PMP a fost superioară coloanei comerciale în ceea ce privește eficiența de separare și rezoluția.
Industria biofarmaceutică a devenit o piață globală în expansiune, cu o creștere semnificativă a cotei de piață în ultimii ani. Odată cu creșterea explozivă a industriei biofarmaceutice1,2,3, există o mare nevoie de analiza peptidelor și proteinelor. Pe lângă peptida țintă, în timpul sintezei peptidelor se formează diverse impurități, astfel încât purificarea cromatografică este necesară pentru a obține puritatea dorită a peptidei. Analiza și caracterizarea proteinelor din fluidele corporale, țesuturi și celule reprezintă o sarcină extrem de dificilă datorită numărului mare de specii potențial detectabile prezente într-o singură probă. Deși spectrometria de masă este un instrument eficient pentru secvențierea peptidelor și proteinelor, dacă astfel de probe sunt introduse direct în spectrometrul de masă, separarea va fi nesatisfăcătoare. Această problemă poate fi rezolvată prin efectuarea cromatografiei lichide (LC) înainte de analiza MS, ceea ce va reduce cantitatea de analiți care intră în spectrometrul de masă la un moment dat4,5,6. În plus, analiții se pot concentra într-o regiune îngustă în timpul separării fazei lichide, concentrând astfel acești analiți și crescând sensibilitatea detectării MS. Cromatografia lichidă (LC) a avansat semnificativ în ultimul deceniu și a devenit o metodă utilizată pe scară largă pentru analiza proteomică7,8,9,10.
Cromatografia lichidă în fază inversă (RP-LC) este utilizată pe scară largă pentru purificarea și separarea amestecurilor de peptide folosind silice modificată cu octadecil (ODS) ca fază staționară11,12,13. Cu toate acestea, datorită structurii lor complexe și naturii amfotere,14,15 fazele staționare RP nu pot oferi o separare satisfăcătoare a peptidelor și proteinelor. Prin urmare, analiza peptidelor și proteinelor cu fragmente polare și nepolare necesită faze staționare special concepute pentru a interacționa și a reține acești analiți16. Cromatografia mixtă, care oferă interacțiuni multimodale, poate fi o alternativă la RP-LC pentru separarea peptidelor, proteinelor și a altor amestecuri complexe. Au fost preparate mai multe faze staționare de tip mixt, iar coloanele umplute cu aceste faze staționare au fost utilizate pentru a separa peptidele și proteinele17,18,19,20,21. Datorită prezenței grupărilor polare și nepolare, fazele staționare în mod mixt (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalare polară/RPLC) sunt potrivite pentru separarea peptidelor și proteinelor22,23,24,25,26,27,28. Fazele staționare intercalate polare cu grupări polare legate covalent prezintă capacități bune de separare și o selectivitate unică pentru analiții polari și nepolari, deoarece separarea depinde de interacțiunea dintre analit și faza staționară. Interacțiuni multimodale 29,30,31,32. Recent, Zhang și colab.30 au obținut faze staționare terminate cu behenil ale poliaminelor și au separat cu succes hidrocarburi, antidepresive, flavonoide, nucleozide, estrogeni și alți analiți. Materialul staționar încorporat polar are atât grupări polare, cât și nepolare, astfel încât poate fi utilizat pentru a separa peptidele și proteinele în părți hidrofobe și hidrofile. Coloanele polare inline (de exemplu, coloanele C18 cu amidă inline) sunt disponibile sub denumirea comercială de coloane Ascentis Express RP-Amide, dar aceste coloane au fost utilizate doar pentru analiza aminei 33.
În studiul actual, a fost preparată o fază staționară polară încorporată (N-fenilmaleimidă, polistiren încorporat) și evaluată pentru separarea peptidelor și scindarea HSA triptică. Următoarea strategie a fost utilizată pentru prepararea fazei staționare. Particulele poroase de silice au fost preparate conform procedurilor descrise în publicațiile noastre anterioare, cu unele modificări ale schemelor de preparare 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Raporturile de uree, polietilen glicol (PEG), TMOS și acid apos-acetic au fost ajustate pentru a obține particule de silice cu dimensiuni mari ale porilor. În al doilea rând, a fost sintetizat un nou ligand fenilmaleimidă-metilvinil izocianat, iar particulele sale de silice derivatizate au fost utilizate pentru a prepara faze staționare polare încorporate. Faza staționară obținută a fost umplută într-o coloană de oțel inoxidabil (diametru interior 100 × 1,8 mm) conform unei scheme de umplutură optimizate. Umplerea coloanei este ajutată de vibrații mecanice pentru a asigura un strat uniform în coloană. Coloana umplută a fost evaluată pentru separarea unui amestec de peptide constând din cinci peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptida leucină-encefalină) și hidrolizate triptice ale albuminei serice umane (HSA). S-a observat că amestecul de peptide și digestul triptic HSA s-au separat cu o rezoluție și o eficiență bune. Eficiența de separare a coloanei PMP a fost comparată cu cea a coloanei Ascentis Express RP-Amide. S-a observat că peptidele și proteinele au o rezoluție bună și o eficiență de separare ridicată pe coloana PMP, iar eficiența de separare a coloanei PMP este mai mare decât cea a coloanei Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glicol), uree, acid acetic, trimetoxiortosilicat (TMOS), trimetilclorosilan (TMCS), tripsină, albumină serică umană (HSA), clorură de amoniu, uree, hexametilmetacriloildisilazan (HMDS), clorură de metacriloil (MC), stiren, 4-hidroxi-TEMPO, peroxid de benzoil (BPO), acetonitril (ACN) pentru HPLC, metanol, 2-propanol și acetonă. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, SUA).
Un amestec de uree (8 g), polietilen glicol (8 g) și 8 ml de acid acetic 0,01 N a fost agitat timp de 10 minute, iar la acesta s-au adăugat 24 ml de TMOS sub răcire cu gheață. Amestecul de reacție a fost încălzit la 40°C timp de 6 ore și apoi la 120°C timp de 8 ore într-o autoclavă din oțel inoxidabil. Apa a fost decantată, iar reziduul a fost uscat la 70°C timp de 12 ore. Blocurile moi uscate au fost măcinate neted și calcinate într-un cuptor la 550°C timp de 12 ore. Au fost preparate și caracterizate trei loturi pentru a testa reproductibilitatea dimensiunilor particulelor, a dimensiunii porilor și a suprafeței.
Grup polară și fază staționară pentru lanțurile de polistiren. Procedura de preparare este descrisă mai jos.
N-fenilmaleimidă (200 mg) și izocianat de metilvinil (100 mg) au fost dizolvate în toluen anhidru, apoi s-au adăugat 0,1 ml de 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) în balonul de reacție pentru a obține un copolimer de fenilmaleimidă și izocianat de metilvinil (PMCP). Amestecul a fost încălzit la 60°C timp de 3 ore, filtrat și uscat într-o etuvă la 40°C timp de 3 ore.
Particulele de silice uscate (2 g) au fost dispersate în toluen uscat (100 ml), agitate și sonicate timp de 10 minute într-un balon cu fund rotund de 500 ml. PMCP (10 mg) a fost dizolvat în toluen și adăugat picătură cu picătură în balonul de reacție printr-o pâlnie de adăugare. Amestecul a fost refluxat la 100°C timp de 8 ore, filtrat, spălat cu acetonă și uscat la 60°C timp de 3 ore. Apoi, particulele de silice asociate cu PMCP (100 g) au fost dizolvate în toluen (200 ml), iar la acesta s-a adăugat 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) în prezența a 100 μl de dilaurat de dibutilstaniu ca și catalizator. Amestecul a fost agitat la 50°C timp de 8 ore, filtrat și uscat la 50°C timp de 3 ore.
Stirenul (1 ml), peroxidul de benzoil BPO (0,5 ml) și particulele de silice atașate la TEMPO-PMCP (1,5 g) au fost dispersate în toluen și purjate cu azot. Polimerizarea stirenului a fost efectuată la 100°C timp de 12 ore. Produsul rezultat a fost spălat cu metanol și uscat peste noapte la 60°C. Schema generală a reacției este prezentată în figura 1.
Probele au fost degazate la 393 K timp de 1 oră până când s-a obținut o presiune reziduală mai mică de 10–3 Torr. Cantitatea de N2 adsorbită la presiunea relativă P/P0 = 0,99 a fost utilizată pentru a determina volumul total al porilor. Morfologia particulelor de silice pure și legate de ligand a fost examinată utilizând un microscop electronic cu scanare (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonia). Probele uscate (silice pură și particule de silice legate de ligand) au fost plasate pe tije de aluminiu folosind o bandă de carbon. Aurul a fost depus pe probă utilizând un dispozitiv de pulverizare catodică Q150T, iar pe probă a fost depus un strat de Au cu grosimea de 5 nm. Acest lucru îmbunătățește eficiența procesului de joasă tensiune și asigură o pulverizare fină la rece. Analiza elementară a fost efectuată utilizând un analizor de compoziție elementară Thermo Electron (Waltham, MA, SUA) Flash EA1112. Un analizor de dimensiune a particulelor Malvern (Worcestershire, Marea Britanie) Mastersizer 2000 a fost utilizat pentru a obține distribuția dimensiunii particulelor. Particulele de silice neacoperite și particulele de silice legate de ligand (câte 5 mg fiecare) au fost dispersate în 5 ml de izopropanol, sonicate timp de 10 minute, agitate timp de 5 minute și plasate pe o bancă optică Mastersizer. Analiza termogravimetrică se efectuează cu o viteză de 5 °C pe minut, în intervalul de temperatură de la 30 la 800 °C.
Coloane din oțel inoxidabil cu diametru îngust, căptușite cu fibră de sticlă, cu dimensiuni (ID 100 × 1,8 mm), au fost umplete prin metoda de umplere cu suspensie, urmând aceeași procedură ca în referința 31. O coloană din oțel inoxidabil (căptușită cu sticlă, ID 100 × 1,8 mm) și o ieșire conținând o frită de 1 µm au fost conectate la o mașină de ambalat suspensie (Alltech Deerfield, IL, SUA). Se prepară o suspensie a fazei staționare prin suspendarea a 150 mg de fază staționară în 1,2 ml de metanol și alimentarea acesteia într-o coloană rezervor. Metanolul a fost utilizat ca solvent pentru suspensie și solvent de control. Umpleți coloana aplicând o secvență de presiune de 100 MP timp de 10 min, 80 MP timp de 15 min și 60 MP timp de 30 min. Procesul de umplere a utilizat două vibratoare pentru coloană de cromatografie în fază gazoasă (Alltech, Deerfield, IL, SUA) pentru vibrații mecanice, pentru a asigura o umplere uniformă a coloanei. Închideți packerul de suspensie și eliberați presiunea încet pentru a preveni deteriorarea coloanei. Coloana a fost deconectată de la duza de suspensie și un alt racord a fost atașat la intrare și conectat la sistemul LC pentru a-i testa funcționarea.
Un MLC personalizat a fost construit folosind o pompă LC (10AD Shimadzu, Japonia), un eșantionator cu o buclă de injecție de 50 nL (Valco (SUA) C14 W.05), un degazor cu membrană (Shimadzu DGU-14A) și o fereastră capilară UV-VIS. Dispozitiv detector (UV-2075) și microcoloană emailată. Se utilizează tuburi de conectare foarte înguste și scurte pentru a minimiza efectul expansiunii suplimentare a coloanei. După umplerea coloanei, se instalează un capilar (50 µm id 365) la ieșirea joncțiunii reducătoare de 1/16″ și se instalează un capilar (50 µm) al joncțiunii reducătoare. Colectarea datelor și procesarea cromatogramei se efectuează folosind software-ul Multichro 2000. La 254 nm, absorbanța UV a analiților subiecți a fost monitorizată la 0. Datele cromatografice au fost analizate folosind OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumină serică umană, pulbere liofilizată, ≥ 96% (electroforeză pe gel de agaroză) 3 mg amestecată cu tripsină (1,5 mg), uree 4,0 M (1 ml) și bicarbonat de amoniu 0,2 M (1 ml). Soluția a fost agitată timp de 10 minute și menținută într-o baie de apă la 37°C timp de 6 ore, apoi stinsă cu 1 ml de TFA 0,1%. Soluția a fost filtrată și depozitată sub 4°C.
Separarea unui amestec de peptide și HSA digerată triptic pe o coloană PMP a fost evaluată separat. Verificați hidroliza triptică a unui amestec de peptide și HSA separate printr-o coloană PMP și comparați rezultatele cu o coloană Ascentis Express RP-Amide. Numărul de talere teoretice este calculat folosind următoarea ecuație:
Imaginile SEM ale particulelor de silice pură și ale particulelor de silice legate de ligand sunt prezentate în Figura 2. Imaginile SEM ale particulelor de silice pură (A, B) prezintă o formă sferică în care particulele sunt alungite sau au simetrie neregulată în comparație cu studiile noastre anterioare. Suprafața particulelor de silice legate de ligand (C, D) este mai netedă decât cea a particulelor de silice pură, ceea ce se poate datora lanțurilor de polistiren care acoperă suprafața particulelor de silice.
Micrografii electronice cu scanare ale particulelor de silice pură (A, B) și ale particulelor de silice legate de ligand (C, D).
Distribuția dimensiunii particulelor particulelor de silice pură și a particulelor de silice legate de ligand este prezentată în Fig. 2.3(A). Curbele de distribuție a dimensiunii particulelor volumetrice au arătat că dimensiunea particulelor de silice a crescut după modificarea chimică (Fig. 3A). Datele privind distribuția dimensiunii particulelor de silice din studiul actual și din studiul anterior sunt comparate în Tabelul 1(A). Dimensiunea volumetrică a particulelor d(0,5) a PMP a fost de 3,36 µm, comparativ cu valoarea ad(0,5) de 3,05 µm din studiul nostru anterior (particule de silice legate de polistiren)34. Datorită modificării raportului dintre PEG, uree, TMOS și acid acetic în amestecul de reacție, distribuția dimensiunii particulelor pentru acest lot a fost mai restrânsă în comparație cu studiul nostru anterior. Dimensiunea particulelor fazei PMP este puțin mai mare decât cea a fazei de particule de silice legate de polistiren pe care am studiat-o anterior. Aceasta înseamnă că funcționalizarea de suprafață a particulelor de silice cu stiren a depus doar un strat de polistiren (0,97 µm) pe suprafața de silice, în timp ce în faza PMP grosimea stratului a fost de 1,38 µm.
Distribuția dimensiunii particulelor (A) și distribuția dimensiunii porilor (B) ale particulelor de silice pură și ale particulelor de silice legate de ligand.
Dimensiunea porilor, volumul porilor și aria suprafeței particulelor de silice utilizate în acest studiu sunt prezentate în Tabelul 1 (B). Profilurile PSD ale particulelor de silice pure și ale particulelor de silice legate de ligand sunt prezentate în Fig. 3 (B). Rezultatele au fost comparabile cu studiul nostru anterior34. Dimensiunile porilor particulelor de silice pure și legate de ligand au fost de 310 Å și respectiv 241 Å, indicând faptul că, după modificarea chimică, dimensiunea porilor a scăzut cu 69 Å, așa cum se arată în Tabelul 1 (B), iar curba de deplasare este prezentată în Fig. Suprafața specifică a particulelor de silice în studiul actual este de 116 m2/g, ceea ce este comparabil cu studiul nostru anterior (124 m2/g). După cum se arată în Tabelul 1 (B), aria suprafeței (m2/g) a particulelor de silice după modificarea chimică a scăzut, de asemenea, de la 116 m2/g la 105 m2/g.
Rezultatele analizei elementare a fazei staționare sunt prezentate în Tabelul 2. Conținutul de carbon al fazei staționare actuale este de 6,35%, ceea ce este mai mic decât în ​​studiul nostru anterior (particule de silice asociate cu polistiren, 7,93%35 și respectiv 10,21%)42. Conținutul de carbon al fazei staționare actuale este prezentat mai jos, deoarece unii liganzi polari, cum ar fi fenilmaleimidă metil vinil izocianat (PCMP) și 4-hidroxi-TEMPO, au fost utilizați pe lângă stiren în prepararea SP. Procentul de azot în greutate în faza staționară actuală este de 2,21%, comparativ cu 0,1735 și 0,85% în studiile anterioare42. Aceasta înseamnă că faza staționară actuală are un procent ridicat de azot în greutate datorită fenilmaleimidei. În mod similar, produsele (4) și (5) au un conținut de carbon de 2,7% și, respectiv, 2,9%, în timp ce produsul final (6) are un conținut de carbon de 6,35%, așa cum se arată în Tabelul 2. Analiza termogravimetrică (TGA) a fost utilizată pe faza staționară a PMP pentru a testa pierderea în greutate, iar curba TGA este prezentată în Figura 4. Curba TGA arată o pierdere în greutate de 8,6%, ceea ce este în bună concordanță cu conținutul de carbon (6,35%), deoarece liganzii conțin nu numai C, ci și N, O și H.
Ligand fenilmaleimidă-metilvinil izocianat a fost ales pentru a modifica suprafața particulelor de silice datorită grupărilor sale polare fenilmaleimidă și viniizocianat. Grupările de vinil izocianat pot reacționa în continuare cu stirenul prin polimerizare radicalică vie. Al doilea motiv este de a introduce un grup care are interacțiuni moderate cu analitul și nu există interacțiuni electrostatice puternice între analit și faza staționară, deoarece gruparea fenilmaleimidă nu are sarcină virtuală la pH normal. Polaritatea fazei staționare poate fi controlată prin cantitatea optimă de stiren și timpul de reacție al polimerizării radicalice libere. Etapa finală a reacției (polimerizarea radicalică liberă) este critică, deoarece modifică polaritatea fazei staționare. A fost efectuată o analiză elementară pentru a verifica conținutul de carbon din aceste faze staționare. S-a observat că creșterea cantității de stiren și a timpului de reacție crește conținutul de carbon al fazei staționare și invers. SP-urile preparate cu diferite concentrații de stiren au încărcături de carbon diferite. În mod similar, aceste faze staționare au fost plasate pe coloane din oțel inoxidabil și au fost verificate caracteristicile lor cromatografice (selectivitate, rezoluție, valoare N etc.). Pe baza acestor experimente, a fost aleasă o compoziție optimizată pentru prepararea fazei staționare PMP, care să asigure o polaritate controlată și o bună retenție a analitului.
Coloana PMP a fost evaluată și pentru analiza a cinci amestecuri de peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucină-encefalină) utilizând capacitatea fazei mobile 60/40 (v/v) ACN/apă (0,1% TFA) la un debit de 80 µl/min. În condiții optime de eluție (200.000 plăci/m), numărul de plăci teoretice (N) per coloană (100 × 1,8 mm) este de 20.000 ± 100. Valorile N pentru cele trei coloane PMP sunt prezentate în Tabelul 3, iar cromatogramele sunt prezentate în Figura 5A. Analiză rapidă la debit mare (700 µl/min) pe o coloană PMP, cinci peptide eluate în decurs de un minut, valoare excelentă a N de 13.500 ± 330 per coloană (100 x 1,8 mm diametru), echivalentă a 135.000 plăci/m (Fig. 5B). Trei coloane de aceeași dimensiune (diametru interior 100 x 1,8 mm) au fost umplute cu trei loturi diferite de fază staționară PMP pentru a testa reproductibilitatea. Analiții au fost înregistrați pentru fiecare coloană prin separarea aceluiași amestec de testare pe fiecare coloană, utilizând condiții optime de eluție, numărul de plăci teoretice N și timpul de retenție. Datele de reproductibilitate pentru coloanele PMP sunt prezentate în Tabelul 4. Reproductibilitatea coloanei PMP a fost bine corelată cu valori foarte scăzute ale %RSD, așa cum se arată în Tabelul 3.
Separarea amestecurilor de peptide pe o coloană PMP (B) și o coloană Ascentis Express RP-Amide (A), fază mobilă 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensiunile coloanei PMP (100 x 1,8 mm id), analiză Ordinea de eluție a compușilor: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) și 5 (encefalină acid leucic).
O coloană PMP (diametru interior 100 x 1,8 mm) a fost evaluată pentru separarea hidrolizatului triptic al albuminei serice umane prin HPLC. Cromatograma din Figura 6 arată că probele sunt bine separate, cu o rezoluție foarte bună. Soluțiile de HSA au fost analizate utilizând un debit de 100 μl/min, o fază mobilă de 70/30 acetonitril/apă și 0,1% TFA. Clivajul HSA a fost împărțit în 17 vârfuri, așa cum se arată în cromatograma (Fig. 6), corespunzătoare a 17 peptide. Eficiențele de separare ale vârfurilor individuale din hidrolizatul de HSA au fost calculate, iar valorile sunt prezentate în Tabelul 5.
Hidrolizatele triptice HSA au fost separate pe o coloană PMP (diametru interior 100 x 1,8 mm), cu debit (100 μl/min), fază mobilă 60/40 acetonitril/apă și 0,1% TFA.
unde L este lungimea coloanei, η este vâscozitatea fazei mobile, ΔP este contrapresiunea coloanei, iar u este viteza liniară a fazei mobile. Permeabilitatea coloanei PMP a fost de 2,5 × 10–14 m2, debitul a fost de 25 µl/min, s-a utilizat ACN/apă 60/40 v/v. Permeabilitatea coloanei PMP (ID 100 × 1,8 mm) a fost similară cu cea din studiul nostru anterior Ref.34. Permeabilitatea unei coloane umplute cu particule superficial poroase este de 1,7×10,6 µm, 2,5×10-14 m2 pentru particule de 5 µm43. Prin urmare, permeabilitatea fazei PMP este similară cu permeabilitatea particulelor miez-înveliș cu o dimensiune de 5 μm.
Unde Wx este masa coloanei umplute cu cloroform, Wy este masa coloanei umplute cu metanol, iar ρ este densitatea solventului. Densitatea metanolului (ρ = 0,7866) și a cloroformului (ρ = 1,484). Porozitatea totală a coloanei cu particule de silice C18 (100 × 1,8 mm ID)34 și a coloanei C18-uree31 studiate anterior a fost de 0,63 și, respectiv, 0,55. Aceasta înseamnă că prezența liganzilor uree reduce permeabilitatea fazei staționare. Pe de altă parte, porozitatea totală a coloanei PMP (diametru interior 100 × 1,8 mm) este de 0,60. Coloanele PMP sunt mai puțin permeabile decât coloanele umplute cu particule de silice legate de C18, deoarece în fazele staționare de tip C18 liganzii C18 sunt atașați de particulele de silice în lanțuri liniare, în timp ce în fazele staționare de tip polistiren se formează un polimer relativ gros în jurul particulelor. stratul A. Într-un experiment tipic, porozitatea coloanei se calculează după cum urmează:
În fig. 7A și B sunt prezentate graficele Van Deemter pentru o coloană PMP (id 100 x 1,8 mm) și o coloană Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) în aceleași condiții de eluție, 60/40 ACN/H2O și 0,1% TFA de la 20 µl/min la 800 µl/min pe ambele coloane. Valorile minime HETP la debitul optim (80 µl/min) au fost de 2,6 µm și 3,9 µm pentru coloana PMP și respectiv pentru coloana Ascentis Express RP-Amide. Valorile HETP arată că eficiența de separare a coloanei PMP (100 x 1,8 mm id) este mult mai mare decât cea a coloanei Ascentis Express RP-Amide disponibilă comercial (100 x 1,8 mm id). Graficul van Deemter din Fig. 7(A) arată că scăderea valorii N nu este semnificativ mai mare odată cu creșterea debitului în comparație cu studiul nostru anterior. Eficiența de separare mai mare a coloanei PMP (id 100 × 1,8 mm) comparativ cu coloana Ascentis Express RP-Amide se bazează pe forma și dimensiunea îmbunătățite a particulelor și pe procedura sofisticată de umplure a coloanei utilizată în lucrarea actuală34.
(A) Diagrama Van Deemter (HETP vs. viteza liniară a fazei mobile) obținută pe o coloană PMP (id 100 x 1,8 mm) în 60/40 ACN/H2O cu 0,1% TFA. (B) Diagrama Van Deemter (HETP vs. viteza liniară a fazei mobile) obținută pe o coloană Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) în 60/40 ACN/H2O cu 0,1% TFA.
O fază staționară polară de polistiren intercalar a fost preparată și evaluată pentru separarea unui amestec de peptide sintetice și hidrolizat triptic de albumină serică umană (HSA) în cromatografie lichidă de înaltă performanță. Performanța cromatografică a coloanelor PMP pentru amestecuri de peptide este excelentă în ceea ce privește eficiența și rezoluția separării. Eficiența îmbunătățită de separare a coloanelor PMP se datorează mai multor motive, cum ar fi dimensiunea particulelor de silice și dimensiunea porilor, sinteza controlată a fazelor staționare și materialele complexe de umplutură a coloanei. Pe lângă eficiența ridicată de separare, un alt avantaj al acestei faze staționare este contrapresiunea scăzută a coloanei la debite mari. Coloanele PMP sunt foarte reproductibile și pot fi utilizate pentru a analiza amestecuri de peptide și digestia triptică a diferitelor proteine. Intenționăm să folosim această coloană pentru separarea compușilor bioactivi din produse naturale, extracte de plante medicinale și ciuperci în cromatografie lichidă. În viitor, coloanele PMP vor fi evaluate și pentru separarea proteinelor și a anticorpilor monoclonali.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. și Petersson, P. Investigație privind sistemele de separare a peptidelor prin cromatografie în fază inversă, partea I: Dezvoltarea unui protocol pentru caracterizarea coloanei. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. și Petersson, P. Investigație privind sistemele de separare a peptidelor prin cromatografie în fază inversă, partea I: Dezvoltarea unui protocol pentru caracterizarea coloanei.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. și Petersson, P. Investigarea sistemelor de separare a peptidelor prin cromatografie în fază inversă, Partea I: Dezvoltarea unui protocol pentru caracterizarea coloanei. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. și Petersson, P. Investigație privind sistemele de separare a peptidelor prin cromatografie în fază inversă, partea I: Dezvoltarea unui protocol pentru caracteristicile coloanei. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. și Petersson, P. Investigație privind sistemele de separare a peptidelor prin cromatografie în fază inversă, partea I: Dezvoltarea unui protocol pentru caracteristicile coloanei.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. și Petersson, P. Investigarea sistemelor de separare a peptidelor prin cromatografie în fază inversă, Partea I: Dezvoltarea unui protocol pentru caracterizarea coloanei.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. și colab. Metode pentru crearea de peptide active îmbunătățite pentru tratamentul bolilor infecțioase. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. și Khrestchatisky, M. Peptide terapeutice sintetice: știință și piață. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. și Khrestchatisky, M. Peptide terapeutice sintetice: știință și piață.Vliege P, Lisowski V, Martinez J și Chreschatyski M. Peptide terapeutice sintetice: știință și piață.Vliege P, Lisowski V, Martinez J și Khreschatsky M. Peptide terapeutice sintetice: știință și piață. Descoperirea de medicamente. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD și Shen, Y. Cromatografie lichidă proteomică avansată. Xie, F., Smith, RD și Shen, Y. Cromatografie lichidă proteomică avansată.Vezi F., Smith RD și Shen Yu. Cromatografie lichidă proteomică avansată. Xie, F., Smith, RD și Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Compoziție avansată de proteine ​​液相色谱。Vezi F., Smith RD și Shen Yu. Cromatografie lichidă proteomică avansată.J. Cromatografie. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. și colab. Cromatografia lichidă avansată cu spectrometrie de masă este capabilă să combine metabolomica și proteomica pe scară largă. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM și Salisbury, JJ Rolul UHPLC în dezvoltarea farmaceutică. Chesnut, SM și Salisbury, JJ Rolul UHPLC în dezvoltarea farmaceutică.Chesnut, SM și Salisbury, JJ Rolul UHPLC în dezvoltarea farmaceutică.Chesnut, SM și Salisbury, JJ Rolul UHPLC în dezvoltarea medicamentelor. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. și Clausen, AM Aspecte fundamentale și practice ale cromatografiei lichide la presiune ultra-înaltă pentru separări rapide. Wu, N. și Clausen, AM Aspecte fundamentale și practice ale cromatografiei lichide la presiune ultra-înaltă pentru separări rapide.Wu, N. și Clausen, AM Aspecte fundamentale și practice ale cromatografiei lichide de înaltă presiune pentru separare rapidă. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. și Clausen, AM Aspecte de bază și practice ale cromatografiei lichide la presiune ultra-înaltă pentru separare rapidă.Wu, N. și Clausen, AM Aspecte fundamentale și practice ale cromatografiei lichide de înaltă presiune pentru separare rapidă.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA și Tchelitcheff, P. Utilizarea cromatografiei lichide ultraperformante în dezvoltarea farmaceutică. Wren, SA și Tchelitcheff, P. Utilizarea cromatografiei lichide ultraperformante în dezvoltarea farmaceutică.Ren, SA și Chelischeff, P. Utilizarea cromatografiei lichide de ultra-înaltă performanță în dezvoltarea farmaceutică. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA și Tchelitcheff, P.Ren, SA și Chelischeff, P. Aplicarea cromatografiei lichide ultraperformante în dezvoltarea medicamentelor.J. Cromatografie. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. și colab. Un hidrogel macroporos monolitic derivat dintr-o emulsie ulei-în-apă cu o fază internă ridicată pentru purificarea eficientă a enterovirusului 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. și Wilkins, JA Rolul cromatografiei lichide în proteomică. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. și Wilkins, JA Rolul cromatografiei lichide în proteomică.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. și Wilkins, JA Rolul cromatografiei lichide în proteomică. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. și Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. și Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. și Wilkins, JA Rolul cromatografiei lichide în proteomică.J. Cromatografie. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Noi tendințe în separările cromatografice lichide în fază inversă ale peptidelor și proteinelor terapeutice: teorie și aplicații. & Guillarme, D. Noi tendințe în separările cromatografice lichide în fază inversă ale peptidelor și proteinelor terapeutice: teorie și aplicații. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жимодкосгосю жромай ческих с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Noi tendințe în separarea peptidelor și proteinelor terapeutice prin cromatografie lichidă în fază inversă: teorie și aplicații. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.și Guillarmé, D. Noi tendințe în separarea peptidelor și proteinelor terapeutice prin cromatografie lichidă în fază inversă: teorie și aplicații.J. Pharm. Științe Biomedicale. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE și Gebler, JC Separarea bidimensională a peptidelor utilizând sistemul RP-RP-HPLC cu pH diferit în prima și a doua dimensiune de separare. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE și Gebler, JC Separarea bidimensională a peptidelor utilizând sistemul RP-RP-HPLC cu pH diferit în prima și a doua dimensiune de separare.Gilar M., Olivova P., Dali AE și Gebler JK Separarea bidimensională a peptidelor utilizând sistemul RP-RP-HPLC cu pH diferit în prima și a doua dimensiune de separare.Gilar M., Olivova P., Dali AE și Gebler JK Separarea bidimensională a peptidelor folosind diferite valori ale pH-ului în prima și a doua dimensiune de separare folosind sistemul RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. și colab. Investigarea transferului de masă și a caracteristicilor cinetice ale coloanelor de cromatografie de înaltă performanță umplute cu particule C18 complet poroase și superficial poroase, mai mici de 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. și colab. Tendințe recente și provocări analitice în izolarea, identificarea și validarea peptidelor bioactive din plante. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB și colab. Peisajul proteomic al regnului vieții. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. și colab. Post-tratamentul peptidelor terapeutice prin cromatografie lichidă preparativă. Molecules (Basel, Elveția) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. și Geng, X. Cromatografia în mod mixt și aplicațiile sale la biopolimeri. Yang, Y. și Geng, X. Cromatografia în mod mixt și aplicațiile sale la biopolimeri.Yang, Yu. și Geng, X. Cromatografia în mod mixt și aplicarea sa la biopolimeri. Yang, Y. și Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. și Geng, X. Cromatografia în mod mixt și aplicarea sa în biopolimeri.Yang, Yu. și Gene, X. Cromatografia în mod mixt și aplicarea sa la biopolimeri.J. Cromatografie. A 1218(49), 8813–8825 (2011).