Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Lupinul Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) este o plantă leguminoasă utilizată pentru producția alimentară și îmbunătățirea solului. Expansiunea globală a NLL ca cultură a atras numeroase ciuperci patogene, inclusiv antracnoza lupinului, care provoacă boala devastatoare a antracnozei. Două alele, Lanr1 și AnMan, care conferă o rezistență crescută, au fost utilizate în ameliorarea NLL, dar mecanismele moleculare care stau la baza acesteia rămân necunoscute. În acest studiu, markerii Lanr1 și AnMan au fost utilizați pentru a analiza probele europene de NLL. Testarea vaccinului într-un mediu controlat a confirmat eficacitatea ambilor donori rezistenți. Profilarea diferențială a expresiei genelor a fost efectuată pe linii reprezentative, rezistente și sensibile. Rezistența la antracnoză a fost asociată cu supraexprimarea termenilor ontologiei genetice „GO:0006952 Defense Response”, „GO:0055114 Redox Process” și „GO:0015979 Photosynthesis”. În plus, linia Lanr1(83A:476) a prezentat o reprogramare transcriptomică semnificativă și rapidă după inoculare, în timp ce celelalte linii au prezentat o întârziere a acestui răspuns cu aproximativ 42 de ore. Răspunsurile de apărare sunt asociate cu genele TIR-NBS, CC-NBS-LRR și NBS-LRR, 10 proteine ​​implicate în patogeneză, proteine ​​de transfer lipidic, endoglucan-1,3-β-glucozidază, proteine ​​ale peretelui celular bogate în glicină și gene din calea reactivă a oxigenului. Primele răspunsuri la 83A:476, inclusiv suprimarea atentă a genelor asociate cu fotosinteza, au coincis cu o protecție reușită în timpul fazei de creștere vegetativă a biologiei fungice, sugerând că un efector declanșează imunitatea. Reacția Mandeloop este încetinită, la fel ca și rezistența orizontală generală.
Lupinul cu frunze înguste (NLL, Lupinus angustifolius L.) este o cereală bogată în proteine, originară din regiunea vest-mediteraneană1,2. În prezent, este cultivată ca plantă alimentară pentru animale și oameni. De asemenea, este considerată îngrășământ verde în sistemele de rotație a culturilor datorită fixării azotului de către bacteriile simbiotice fixatoare de azot și îmbunătățirii generale a structurii solului. NLL a suferit un proces rapid de domesticire în ultimul secol și este încă supusă unei presiuni ridicate de reproducere3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Odată cu cultivarea pe scară largă a NLL, succesiunea de ciuperci patogene a dezvoltat noi nișe agricole și a cauzat noi boli care distrug culturile. Cel mai remarcabil lucru pentru cultivatorii și crescătorii de lupin a fost apariția antracnozei, cauzată de ciuperca patogenă Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Cel mai remarcabil lucru pentru cultivatorii și crescătorii de lupin a fost apariția antracnozei, cauzată de ciuperca patogenă Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав, патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Cea mai notabilă pentru cultivatorii și crescătorii de lupini a fost apariția antracnozei cauzate de ciuperca patogenă Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由真hum) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是玟真Colletohum 茟真hum (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракнозозакнозозонеров патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Cea mai frapantă problemă pentru cultivatorii și crescătorii de lupini este apariția antracnozei cauzate de ciuperca patogenă Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Primele raportări ale bolii au provenit din Brazilia și Statele Unite, simptomele tipice apărând în 1912 și, respectiv, 1929. Cu toate acestea, după aproximativ 30 de ani, agentul patogen a fost desemnat ca Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfă Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfă Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf al genei Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld în Morfologie țintită. și H. Schrenk. și H. Schrenk.și H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。și H. Schlenk.Fenotiparea preliminară a bolii, efectuată la mijlocul secolului al XX-lea, a arătat o oarecare rezistență la accesiunile de NLL și lupin galben (L. luteus L.), dar toate accesiunile de lupin alb (L. albus L.) testate au fost foarte susceptibile15,16. Studiile au arătat că dezvoltarea antracnozei este asociată cu creșterea precipitațiilor (umidității aerului) și a temperaturii (în intervalul 12-28°C), ceea ce duce la o încălcare a rezistenței la temperaturi mai ridicate17, 18. De fapt, timpul necesar germinarii conidiilor și începerii bolii a fost de patru ori mai scurt la 24°C (4 ore) decât la 12°C (16 ore) în condiții de umiditate ridicată19. Astfel, încălzirea globală continuă a dus la răspândirea antracnozei. Cu toate acestea, boala a fost observată în Franța (1982) și Ucraina (1983) ca un prevestitor al unei amenințări iminente, dar a fost aparent ignorată de industria lupinului la acea vreme20,21. Câțiva ani mai târziu, această boală devastatoare s-a răspândit în întreaga lume și a afectat, de asemenea, țări importante producătoare de lupin, cum ar fi Australia, Polonia și Germania22,23,24. În urma unui focar de antracnoză la mijlocul anilor 1990, screening-ul extins a dus la identificarea mai multor donori rezistenți în probele NLL19. Rezistența NLL la antracnoză este controlată de două alele dominante separate, găsite în diferite surse de germoplasmă: Lanr1 la cultivarul Tanjil și Wonga și AnMan la cultivarul Mandalay25, 26. Aceste alele completează markerii moleculari care susțin selecția germoplasmei rezistente în programele de ameliorare25,26,27,28,29,30. Linia de reproducere rezistentă 83A:476, purtătoare a alelei Lanr1, a fost încrucișată cu linia sălbatică susceptibilă P27255 pentru a obține o populație RIL segregată pentru rezistența la antracnoză, ceea ce a făcut posibilă atribuirea locusului Lanr1 cromozomului NLL-1131, 32, 33. Alinierea markerilor hărții de linkage de la locusurile de rezistență flancante la antracnoză cu un cadru genomic, NLL a relevat locația tuturor celor trei alele pe același cromozom (NLL-11), dar în poziții diferite29,34,35. Cu toate acestea, din cauza numărului mic de RIL-uri și a distanței genetice mari dintre markeri și alelele corespunzătoare, nu se pot trage concluzii fiabile despre genele lor subiacente. Pe de altă parte, utilizarea geneticii inverse la lupini este dificilă din cauza potențialului lor de regenerare foarte scăzut, ceea ce face ca manipularea genetică să fie greoaie37.
Dezvoltarea germoplasmei domestice care poartă alela dorită în stare homozigotă, cum ar fi 83A:476 (Lanr1) și Mandelup (AnMan), a deschis calea studierii rezistenței la antracnoză în fața prezenței unor combinații opuse de alele în populațiile sălbatice. Posibilitățile mecanismelor moleculare. Compararea răspunsurilor de apărare generate de genotipuri specifice. Acest studiu a evaluat răspunsul transcriptom timpuriu al NLL la vaccinarea cu C. lupini. Mai întâi, un panel european de germoplasmă NLL care conține 215 linii a fost analizat folosind markeri moleculari care marchează alelele Lanr1 și AnMan. Fenotiparea antracnozei a fost apoi efectuată pe 50 de linii NLL, selectate anterior pentru markerii moleculari, în condiții controlate. Pe baza acestor experimente, patru linii care diferă în ceea ce privește rezistența la antracnoză și compoziția alelică Lanr1/AnMan au fost selectate pentru profilarea expresiei genelor de apărare diferențială folosind două abordări complementare: secvențierea ARN cu randament ridicat și cuantificarea PCR în timp real.
Screening-ul unui set de germoplasmă NLL (N = 215) cu markeri Lanr1 (Anseq3 și Anseq4) și AnMan (Anseq4) și AnMan (AnManM1) a arătat că doar o linie (95726, lângă Salamanca-b) amplifică alela de „rezistență” pentru toți markerii, în timp ce „Prezența alelelor «sensibile»” a constatat proporția tuturor markerilor în 158 (~73,5%) linii. Treisprezece linii au produs două alele „rezistente” ale markerului Lanr1, iar 8 linii au produs alele „rezistente” ale markerului Lanr1. Alela de „rezistență” a markerului AnMan (Tabelul suplimentar S1). Două linii au fost heterozigote pentru markerul Anseq3 și una heterozigotă pentru markerul AnManM1. 42 de linii (19,5%) au purtat faze opuse ale alelelor Anseq3 și Anseq4, indicând o frecvență ridicată de recombinare între aceste două loci. Fenotipurile de antracnoză în condiții controlate (Tabelul suplimentar S2) au evidențiat variabilitate în rezistența genotipurilor testate, ceea ce s-a reflectat în severitatea antracnozei. Diferențele în scorurile medii au variat de la 1,8 (moderat rezistent) la 6,9 (susceptibil), iar diferențele de greutate a plantelor au variat de la 0,62 (susceptibil) la 4,45 g (rezistent). A existat o corelație semnificativă între valorile observate în două replicări ale experimentului (0,51 pentru scorurile de severitate a bolii, P = 0,00017 și 0,61 pentru greutatea plantei, P < 0,0001), precum și între acești doi parametri (−0,59 și −0,77, P < 0,0001). A existat o corelație semnificativă între valorile observate în două replicări ale experimentului (0,51 pentru scorurile de severitate a bolii, P = 0,00017 și 0,61 pentru greutatea plantei, P < 0,0001), precum și între acești doi parametri (−0,59 și −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция э0, кслентер баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между между эвтами эрамди (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). O corelație semnificativă a fost constatată între valorile observate în două repetiții ale experimentului (0,51 pentru scorurile de severitate a bolii, P = 0,00017 și 0,61 pentru greutatea plantei, P < 0,0001), precum și între acești doi parametri (-0,59 și -0,77, P < 0,0001) (0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺0. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77）P < 0,0001)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸为度 诸分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之（ （ 9.– （ （ （ 9. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух постенканк тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 și масса растения 0,61, P <0,0001), și между этими двуми пара9миме-0,5рами -0,0001) 0,77, P <0,0001. A existat o corelație semnificativă între valorile observate în duplicat (scorul de severitate al bolii 0,51, P = 0,00017 și greutatea plantei 0,61, P < 0,0001) și între acești doi parametri (-0,59 și -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Simptomele tipice observate la plantele sensibile includ îndoirea și răsucirea tulpinii, asemănătoare unei structuri de „arc ciobanesc”, urmate de leziuni ovale cu sporozoiți portocalii/roz (Fig. suplimentară 1). Genele australiene care poartă genele Lanr1 (83A:476 și Tanjil) și AnMan (Mandelup) sunt moderat rezistente, 0,0331 și 0,0036). Unele linii care poartă și alele „rezistente” Lanr1 și/sau AnMan prezintă simptome ale bolii.
Interesant este că câteva linii NLL cărora le lipsește orice alelă marker „rezistentă” au relevat un nivel ridicat de rezistență la antracnoză (comparabil sau mai mare decât pentru genotipurile Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoare P < 0,0001 pentru ambii parametri), Bojar (valoare P < 0,0001 pentru scor și 0,001 pentru greutatea plantei) și Populația B-549/79b (valoare P < 0,0001 pentru scor și nesemnificativă pentru greutate). Interesant este că câteva linii NLL cărora le lipsește orice alelă marker „rezistentă” au relevat un nivel ridicat de rezistență la antracnoză (comparabil sau mai mare decât pentru genotipurile Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoare P < 0,0001 pentru ambii parametri), Bojar (valoare P < 0,0001 pentru scor și 0,001 pentru greutatea plantei) și Populația B-549/79b (valoare P < 0,0001 pentru scor și nesemnificativă pentru greutate). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллелеля,солокавы уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи An BoManхь), илаи An Boкий (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы массы). Interesant este că mai multe linii NLL cărora le lipsesc orice alelă marker „rezistentă” au prezentat un nivel ridicat de rezistență la antracnoză (comparabil cu sau mai mare decât în ​​cazul genotipurilor Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoare P < 0,0001 pentru ambii parametri), Bojar (valoare P < 0,0001 pentru evaluare și 0,001 pentru greutatea plantei) și populația B-549/79b (valoare P < 0,0001 pentru evaluare și nesemnificativă pentru greutate).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭疽的炭等位基因的NLL或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重显睂怍量一量 Este interesant faptul că unele sisteme NLL care nu au markeri „antigenici” prezintă o rezistență orizontală ridicată (echivalentă cu genele Lanr1 sau AnMan sau mai mare), cum ar fi Boregine (ambii parametri P < 0,0001), Bojar (valoare P < 0,0001, greutatea plantei 0,001) și tulpina B-549/79b (valoare P < 0,0001, greutate nesemnificativă). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентноста», споликва уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие кание или выше (Сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan) обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) și популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Interesant este că unele linii NLL cărora le lipsesc alelele marker de „rezistență” au prezentat niveluri ridicate de rezistență la antracnoză (comparabile cu sau mai mari decât genotipurile Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoare P pentru ambii parametri <0,0001), Bojar (valoare P < 0,0001, greutatea plantei 0,001) și populația B-549/79b (valoare P < 0,0001, greutate nesemnificativă).Acest fenomen sugerează posibilitatea unei noi surse genetice de rezistență, explicând lipsa observată de corelație între genotipurile markerilor și fenotipurile bolii (valori P de la ~0,42 la ~0,98). Astfel, testul Kolmogorov-Smirnov a arătat că datele privind rezistența la antracnoză au fost distribuite aproximativ normal pentru scoruri (valori P 0,25 și 0,11) și masa plantei (valori P 0,47 și 0,55), sugerând că emit ipoteza că sunt implicate mai multe alele decât Lanr1 și AnMan.
Pe baza rezultatelor screening-ului pentru rezistența la antracnoză, au fost selectate 4 linii pentru analiza transcriptomului: 83A:476, Boregine, Mandelup și Populația 22660. Aceste linii au fost retestate pentru rezistența la antrax în experimente de inoculare prin secvențiere ARN, cu condiția să fie aceleași ca în testul anterior. Valorile scorurilor au fost următoarele: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) și populația 22660 (6,11 ± 1,29).
Protocolul Illumina NovaSeq 6000 a obținut o medie de 40,5 perechi de citiri M per probă (29,7 până la 54,4 citiri M) (Tabelul suplimentar S3). Scorurile de aliniere în secvența de referință au variat de la 75,5% la 88,6%. Corelația medie a datelor privind numărul de citiri între variantele experimentale și replicile biologice a variat de la 0,812 la 0,997 (medie 0,959). Din cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au prezentat nicio expresie, iar celelalte 4785 de gene au fost exprimate la un nivel neglijabil (media de bază < 5). Din cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au prezentat nicio expresie, iar celelalte 4785 de gene au fost exprimate la un nivel neglijabil (media de bază < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов сисров экспрессии незначительном уровне (базовое среднее <5). Dintre cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au prezentat nicio expresie, iar restul de 4785 de gene au fost exprimate la un nivel neglijabil (media de bază <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имеленов имелись экспрессию (базовое среднее значение <5). Dintre cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au fost exprimate, iar restul de 4785 de gene au avut o expresie neglijabilă (media de bază <5).Astfel, numărul de gene considerate exprimate (media de bază ≥ 5) în timpul experimentului a fost de 27.468 (78,1%) (Tabelul suplimentar S4).
Încă de la primul moment, toate liniile NLL au răspuns la inocularea C. lupini (tulpina Col-08) prin reprogramarea transcriptomului (Tabelul 1), cu toate acestea, s-au observat diferențe semnificative între linii. Astfel, linia de rezistență 83A:476 (purtătoare a genei Lanr1) a prezentat o reprogramare transcriptomică semnificativă la primul moment (6 hpi), cu o creștere de 31-69 de ori a numărului de gene ascendente și descendente izolate, comparativ cu alte momente la acest moment. În plus, acest vârf a fost de scurtă durată, deoarece expresia doar a câtorva gene a rămas semnificativ modificată la al doilea moment (12 hpi). Interesant este că Boregine, care a prezentat, de asemenea, un nivel ridicat de rezistență în testul de grefă, nu a suferit o reprogramare transcripțională atât de masivă în timpul experimentului. Cu toate acestea, numărul de gene exprimate diferențial (DEG) a fost același pentru Boregine și 83A:476 la 12 HPI. Atât Mandelup, cât și populația 22660 au prezentat vârfuri DEG la ultimul moment (48 l/s), indicând o întârziere relativă a răspunsurilor de apărare.
Deoarece 83A:476 a suferit o reprogramare transcriptomică masivă ca răspuns la C. lupini la 6 HPI în comparație cu toate celelalte linii, ~91% dintre DEG-urile observate în acest moment au fost specifice liniei celulare (Fig. 1). Cu toate acestea, a existat o oarecare suprapunere în răspunsurile timpurii între liniile de studiu, deoarece 68,5%, 50,9% și, respectiv, 52,6% DEG în Boregine, Mandelup și populația 22660 s-au suprapus cu cele găsite în 83A:476 în anumite momente. Cu toate acestea, aceste DEG-uri au reprezentat doar o mică fracțiune (0,97–1,70%) din toate DEG-urile detectate în prezent folosind 83A:476. În plus, 11 degree de gene (DEG) din toate liniile au fost coerente în acest moment (Tabelele suplimentare S4-S6), incluzând componente comune ale răspunsurilor de apărare ale plantelor: proteina de transfer lipidic (TanjilG_32225), enzima endoglucan-1,3-β-glucozidă (TanjilG_23384), două proteine ​​inductibile de stres, cum ar fi SAM22 (TanjilG_31528 și TanjilG_31531), proteina latex bazică (TanjilG_32352) și două proteine ​​structurale ale peretelui celular bogate în glicină (TanjilG_19701 și TanjilG_19702). De asemenea, a existat o suprapunere relativ mare a răspunsurilor transcriptomice între 83A:476 și Boregine la 24 HPI (total 16-38% DEG) și între Mandelup și Populația 22660 la 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagramă Venn care arată numărul de gene exprimate diferențial (DEG) în liniile de lupin cu frunze înguste (NLL) inoculate cu Colletotrichum lupini (tulpina Col-08 obținută din câmpurile de lupin din Wierzhenice, Polonia, 1999). Liniile NLL analizate au fost: 83A:476 (rezistent, purtător al alelei Lanr1), Boregine (rezistent, fond genetic necunoscut), Mandelup (moderat rezistent, purtător al alelei AnMan) și populația 22660 (foarte sensibil). Prescurtarea hpi reprezintă orele după vaccinare. Valorile zero au fost eliminate pentru a simplifica graficul.
Setul de gene supraexprimate la 6 hpi a fost analizat pentru prezența domeniilor canonice ale genei R (Tabelul suplimentar S7). Acest studiu a relevat inducerea transcriptomului genelor clasice de rezistență la boli cu domenii NBS-LRR doar la 83A:476. Acest set a constat dintr-o genă TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinci gene CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 și tanjilg_16162) și patru NBS-LR, Tanjilg_16162) și patru NBS-LRRE (tanjilg_16162), precum și patru NBS-Lrr (tanjilg_16162) și patru NBS-LRR (TANJILG_16162). Toate aceste gene au domenii canonice aranjate în secvențe conservate. Pe lângă genele domeniului NBS-LRR, mai multe kinaze RLL au fost activate la 6 hpi, și anume una în Boregine (TanjilG_19877), două în Mandelup (TanjilG_07141 și TanjilG_19877) și în populația 22660 (TanjilG_09014 și TanjilG_10361) și două în 83A 27:476.
Genele cu expresie semnificativ modificată ca răspuns la inocularea cu C. lupini (tulpina Col-08) au fost supuse analizei de îmbogățire Gene Ontology (GO) (Tabelul suplimentar S8). Termenul de proces biologic cel mai frecvent suprareprezentat a fost „GO:0006952 răspuns de apărare”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × linie) cu semnificație ridicată (valoare P < 0,001) (Fig. 2). Termenul de proces biologic cel mai frecvent suprareprezentat a fost „GO:0006952 răspuns de apărare”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × linie) cu semnificație ridicată (valoare P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 тетнащой который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значимостью (значение P) (0.001) <0). Termenul de proces biologic cel mai frecvent suprareprezentat a fost „GO:0006952 defense response”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × linie) cu semnificație ridicată (valoare P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Cel mai reprezentativ termen al procesului biologic este „GO:0006952 defense response”, care apare în 6 din cele 16 combinații (时间×线), cu semnificație ridicată (valoare P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Сохологического" появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис.2). Termenul de proces biologic cel mai frecvent suprareprezentat a fost „GO:0006952 Defense Response”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × linie) cu semnificație ridicată (valoare P < 0,001) (Fig. 2).Acest termen a fost suprareprezentat în două momente în 83A: 476 și Boregine (6 și 24 hpi) și la un moment dat în Mandelup și Populația 22660 (12 și respectiv 6 hpi). Acesta este un rezultat așteptat, evidențiind răspunsul antifungic al liniilor rezistente. În plus, 83A:476 a răspuns la C. lupini prin inducerea rapidă a genelor legate de explozia oxidativă reprezentată de termenul „proces redox GO:0055114”, indicând un răspuns specific de apărare, în timp ce Boregine a relevat răspunsuri specifice de apărare, legate de termenul „GO”. :0006950 Răspuns la stres”. Populația 22660 a activat răspunsul de rezistență orizontală care implică metaboliți secundari, evidențiind numărul excesiv de termeni „GO:0016104 Procesul de biosinteză a triterpenelor” și „GO:0006722 Procesul de metabolism al triterpenelor” (ambii termeni aparțin aceluiași set de gene), ținând cont de rezultatele analizei de îmbogățire a termenilor GO, stabilitatea reacției Mandelup a fost între Boregine și Populația 22660. În plus, reacția timpurie 83A:476 (6 hpi) și reacția întârziată Mandelup și Populația 22660 includ termenul GO:0015979 „fotosinteză” și alte procese biologice conexe.
Termenii ontologici ai genelor bioproceselor selectați în adnotarea genelor exprimate diferențial în timpul răspunsurilor transcriptomice ale lupinului cu frunze înguste (NLL) inoculat cu lupin antrax (tulpina Col-08 obținută din câmpurile de lupin din Wierzhenice, Polonia, în 1999) sunt mult exagerați. Liniile NLL analizate au fost: 83A:476 (rezistent, purtător al alelei homozigote Lanr1), Boregine (rezistent, fond genetic necunoscut), Mandelup (moderat rezistent, purtător al alelei homozigote AnMan) și populația 22660 (susceptibil).
Deoarece acest studiu a avut ca scop identificarea genelor care contribuie la rezistența la antracnoză, genele atribuite termenilor GO „GO: 0006952 Defensive responses” și „GO: 0055114 Redox processes” au fost analizate cu valori limită, deoarece mediile inițiale au fost ≥ 30 cu cel puțin o linie × punct în timp, combinând valori semnificative statistic ale log2 (modificarea de ori). Numărul de gene care au îndeplinit aceste criterii a fost de 65 pentru GO:0006952 și 524 pentru GO:0055114.
83A:476 a relevat două vârfuri DEG adnotate cu termenul GO:0006952, primul la 6 gene pe inch (64 de gene, reglare ascendentă și descendentă) și al doilea la 24 de gene pe inch (15 gene, doar reglare ascendentă). Boregine a arătat, de asemenea, că GO:0006952 a atins vârful în același moment, dar cu mai puțin DEG (11 și 8) și activare preferențială. Mandeloop a arătat două vârfuri de GO:0006952 la 12 și 48 HPI, ambele purtând 12 gene (primul cu gene activatoare, iar al doilea doar cu gene supresoare), în timp ce populația 22660 la 6 HPI (13 gene) a avut o predominanță mai mare a reglării vârfului de creștere. Trebuie remarcat faptul că 96,4% din DEG-urile GO:0006952 din aceste vârfuri au avut același tip de răspuns (ascensor sau descendent), indicând o suprapunere semnificativă a răspunsurilor de apărare, în ciuda diferențelor în numărul de gene implicate. Cel mai mare grup de secvențe legate de termenul GO:0006952 codifică Proteina 22 de mesaj asociată stresului de înfometare (SAM22-like), care aparține cladei proteice PR-10 (proteină asociată patogenezei din clasa 10) și proteinei centrale latex. proteina similară (MLP-like) (Fig. 3). Cele două grupuri au diferit prin natura expresiei și direcția răspunsului. Genele care codifică proteinele de tip SAM22 au prezentat o inducție consistentă și semnificativă la momente timpurii (6 sau 12 hpi) și au fost în general neresponsive la sfârșitul experimentului (48 hpi), în timp ce proteinele de tip MLP au prezentat coordonare la 6 hpi. 83A:476 și Mandelup la 48 hp/in, aproape toate celelalte puncte de date au fost neresponsive. În plus, diferențele în profilurile de expresie ale genelor proteice de tip SAM22 au urmat variabilitatea observată în rezistența la antracnoză, deoarece liniile mai rezistente au avut mai multe momente timpuri care au indus semnificativ aceste gene decât genele mai susceptibile. O altă genă PR-10 de tip LlR18A/B a prezentat un model de expresie foarte similar cu gena proteică de tip SAM22.
Au fost identificate componentele principale ale termenului de proces biologic „GO:0006952 Defense Response” și modelele de expresie ale genelor candidate ale alelelor Lanr1 și AnMan. Scara Log2 reprezintă valorile log2 (modificarea orii de modificare) între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin, Wizhenica, Polonia, 1999) și cele de control (inoculate fictiv) în același moment. Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunză îngustă: 83A:476 (rezistent, purtător al alelei homozigote Lanr1), Boregine (rezistent, fond genetic necunoscut), Mandelup (moderat rezistent, purtător al alelei homozigote AnMan) și Populația 22660 (susceptibilă).
În plus, au fost evaluate profilurile de expresie ale genelor candidate RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) și AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). Gena TanjilG_05042 a prezentat un răspuns semnificativ (activare) la 83A:476 doar la primul moment de timp (6 hpi), în timp ce TanjilG_12861 a fost semnificativă în Mandeloop doar la două momente de timp: 6 hpi (reglare negativă) și 24 hpi (6 hpi). Cu.). reglabil).
Cele mai supraexprimate gene în termenul GO:0055114 „proces redox” au fost genele care codifică proteinele citocromului P450 și peroxidaza (Fig. 4). Pentru probele izolate din 83A:476 la 6 HPI, valorile maxime sau minime ale log2 (modificare de modificare) (pentru 86,6% din gene) au fost observate în general între plantele inoculate și cele de control, evidențiind răspunsul ridicat al acestui genotip la sexul inoculat. 83A:476 a prezentat cel mai semnificativ DEG GO:0055114 la 6 hpi (503 gene), în timp ce restul liniilor la 48 hpi (Boregine, 31 de gene; Mandelup, 85 de gene; și Populația 22660, 78 de gene)). În majoritatea genelor din familia GO:0055114, s-au observat două tipuri de răspunsuri la vaccinare (activare și inhibare). Interesant este că până la 97,6% din DEG-urile identificate pentru termenul GO: 0055114 în Mandelupe la 48 hp. Aceste observații sugerează că, în ciuda scării semnificativ mai mici (adică numărul de gene redox mutate, 85 față de 503), modelul răspunsurilor transcriptomice întârziate ale mandeloup la antracnoză este similar cu răspunsul timpuriu al 83A:476. În Boregine și Populația 22660, această convergență este mai mică, la 51,6% și, respectiv, 75,6%.
Au fost evidențiate modelele de expresie ale principalelor componente ale termenului procesului biologic „GO:0055114 Proces redox”. Scara Log2 reprezintă valorile log2 (modificarea orii de modificare) între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin, Wizhenica, Polonia, 1999) și cele de control (inoculate cu cip) în același moment. Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunză îngustă: 83A:476 (rezistent, purtător al alelei homozigote Lanr1), Boregine (rezistent, fond genetic necunoscut), Mandelup (moderat rezistent, purtător al alelei homozigote AnMan) și Populația 22660 (susceptibilă).
Răspunsurile transcriptomice 83A:476 la inocularea cu C. lupini (tulpina Col-08) au inclus, de asemenea, reducerea coordonată a tăcerii genelor atribuite termenului GO:0015979 „fotosinteză” și altor procese biologice conexe (FIG. 5). Acest set DEG GO:0015979 conținea 105 gene care au fost reprimate semnificativ la 6 hpi la 83A:476. În acest subset, 37 de gene au fost, de asemenea, reglate negativ în Mandelup la 48 HPI și 35 în același moment în populația 22660, inclusiv 19 DEG comune ambelor genotipuri. Niciun DEG legat de termenul GO:0015979 nu a fost activat semnificativ în nicio combinație (linie x timp).
Au fost evidențiate modelele de expresie ale principalelor componente ale termenului procesului biologic „GO:0015979 Fotosinteză”. Scara Log2 reprezintă valorile log2 (modificarea orii de modificare) între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin, Wizhenica, Polonia, 1999) și cele de control (inoculate fictiv) în același moment. Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunză îngustă: 83A:476 (rezistent, purtător al alelei homozigote Lanr1), Boregine (rezistent, fond genetic necunoscut), Mandelup (moderat rezistent, purtător al alelei homozigote AnMan) și Populația 22660 (susceptibilă).
Pe baza rezultatelor analizei expresiei diferențiale și probabil implicate în răspunsurile de apărare împotriva ciupercilor patogene, acest set de șapte gene a fost selectat pentru cuantificarea profilurilor de expresie prin PCR în timp real (Tabelul suplimentar S9).
Gena proteică presupusă TanjilG_10657 a fost indusă semnificativ în toate liniile și momentele de timp studiate, comparativ cu plantele de control (mimetice) (Tabelele suplimentare S10, S11). În plus, profilul de expresie al TanjilG_10657 a arătat o tendință crescătoare pe parcursul experimentului pentru toate liniile. Populația 22660 a prezentat cea mai mare sensibilitate a TanjilG_10657 la inoculare, cu o activare de 114 ori și cel mai ridicat nivel de expresie relativă (4,4 ± 0,4) la 24 HPI (Fig. 6a). Gena proteică PR10 LlR18A TanjilG_27015 a prezentat, de asemenea, activare pe toate liniile și momentele de timp, cu semnificație statistică la majoritatea punctelor de date (Fig. 6b). Similar cu TanjilG_10657, cel mai ridicat nivel de expresie relativă a TanjilG_27015 a fost observat în populația inoculată cu 22660 la 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gena endochitinazei acide TanjilG_04706 a fost semnificativ suprareglată în toate liniile și în toate momentele de timp, cu excepția Boreginei cu 6 hpi (Fig. 6c). Aceasta a fost puternic indusă la primul moment de timp (6 HPI) la 83A:476 (de 10,5 ori) și a crescut moderat în celelalte linii (de 6,6-7,5 ori). În timpul experimentului, expresia TanjilG_04706 a rămas la niveluri similare în 83A:476 și Boregine, în timp ce în Mandelup și Populația 22660 a crescut semnificativ, atingând valori relativ ridicate (5,9 ± 1,5 și, respectiv, 6,2 ± 1,5). Gena de tip endoglucan-1,3-β-glucozidază TanjilG_23384 a prezentat o activare ridicată în primele două momente de timp (6 și 12 hpi) în toate liniile, cu excepția populației 22660 (Fig. 6d). Cele mai ridicate niveluri relative de expresie a genei TanjilG_23384 au fost observate la al doilea moment (12 hpi) în Mandelup (2,7 ± 0,3) și 83A:476 (1,5 ± 0,1). La 24 HPI, expresia genei TanjilG_23384 a fost relativ scăzută în toate liniile studiate (de la 0,04 ± 0,009 la 0,44 ± 0,12).
Profilurile de expresie ale genelor selectate (ag) au fost evidențiate prin PCR cantitativ. Numerele 6, 12 și 24 reprezintă orele după vaccinare. Genele LanDExH7 și LanTUB6 au fost utilizate pentru normalizare, iar LanTUB6 a fost utilizată pentru calibrarea inter-serie. Barele de eroare reprezintă deviația standard bazată pe trei replici biologice, fiecare dintre acestea fiind media a trei replici tehnice. Semnificația statistică a diferențelor în nivelurile de expresie dintre plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută în 1999 din câmpul de lupin din Wierzenica, Polonia) și plantele de control (inoculate simulat) este marcată deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0,01, ***valoare P ≤ 0,001). Semnificația statistică a diferențelor în nivelurile de expresie dintre plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută în 1999 din câmpul de lupin din Wierzenica, Polonia) și plantele de control (inoculate simulat) este marcată deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0,01, ***valoare P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м шшта8, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулиров) отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Diferențe semnificative statistic în nivelurile de expresie între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută în 1999 dintr-un câmp de lupini din Wierzhenice, Polonia) și plantele de control (inoculate cu metodă simulată) sunt observate deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0,01, ***valoare P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数渍在数渍在数水平差异的统计学显着性标记在数渍在敹乼水平差0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 (colletotrichum lupini), color-08 株, 1999水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м ш08та полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно ино инокаулиро инокаули) отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Diferențe statistic semnificative în nivelurile de expresie între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin din Verzhenice, Polonia, în 1999) și plantele de control (inoculate cu metodă simulată) sunt observate deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0,01, ***valoare P ≤ 0,001).Liniile NLL analizate au fost: 83A:476 (rezistente, purtătoare a alelei homozigote Lanr1), Mandelup (moderat rezistente, purtătoare a alelei homozigote AnMan), Boregine (rezistente, fond genetic necunoscut) și populația 22660 (susceptibile).
Gena candidată TanjilG_05042 la locusul Lanr1 a prezentat un model de expresie semnificativ diferit față de profilurile obținute din studiile RNA-seq (Fig. 6e). Activarea semnificativă a acestei gene a fost observată la Mandelup și populația 22660 (de până la 39,7 și respectiv 11,7 ori), rezultând niveluri de expresie relativ ridicate (de până la 1,4 ± 0,14 și respectiv 7,2 ± 1,3). 83A:476 a relevat, de asemenea, o oarecare creștere a expresiei genei TanjilG_05042 (de până la 3,8 ori), cu toate acestea, nivelurile relative de expresie atinse (0,044 ± 0,002) au fost de peste 30 de ori mai mici decât cele observate la Mandelup și populația 22660. Analizele prin qPCR au arătat diferențe semnificative în nivelurile de expresie între genotipuri în variantele vaccinate fals (de control), atingând o diferență de 58 de ori între populațiile 22660 și 83A:476, precum și între populațiile 22660 și 22660. O diferență de dublă valoare a fost obținută între Boregine și Mandalup.
Gena candidată la locusul AnMan, TanjilG_12861, a fost activată ca răspuns la vaccinare în 83A:476 și Mandelup, a fost neutră în populația 22660 și a fost reglată negativ în Boregine (Fig. 6f). Expresia relativă a genei TanjilG_12861 a fost cea mai mare în 83A:476 inoculată (0,14±0,01). Gena proteinei de șoc termic clasa I de 17,4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, a prezentat niveluri relative de expresie mai scăzute în toate tulpinile și momentele de timp studiate (Fig. 6g). Cea mai mare valoare a fost observată la 24 HPI în populația 22660 (0,14 ± 0,02, o creștere de opt ori a răspunsului la vaccinare).
Compararea profilurilor de expresie genică (Fig. 7) a relevat o corelație ridicată între TanjilG_10657 și alte patru gene: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) și TanjilG_04706 (r = 0,79). Astfel de rezultate pot indica corelarea acestor gene în timpul răspunsurilor de apărare. Genele TanjilG_12861 și TanjilG_23384 au prezentat profiluri de expresie diferite, cu valori mai mici ale coeficientului de corelație Pearson (de la 0,08 la 0,43 și, respectiv, -0,19 la 0,28) în comparație cu alte gene.
Corelațiile dintre profilurile de expresie genică au fost detectate folosind PCR cantitativ. Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunze înguste: 83A:476 (rezistent, purtător al alelei homozigote Lanr1), Mandelup (moderat rezistent, purtător al alelei homozigote AnMan), Boregine (rezistent, fond genetic necunoscut) și Populația 22660 (susceptibil). Au fost calculate trei momente de timp (6, 12 și 24 de ore după inoculare), incluzând plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin din Wierzhenice, Polonia, în 1999) și plantele de control (inoculate fictiv). Scara arată valoarea coeficientului de corelație Pearson.
Pe baza datelor obținute la o putere de 6 cai putere pe inch, WGCNA a fost efectuat pe 9981 DEG identificate prin compararea plantelor inoculate cu cele de control pentru a se concentra pe răspunsurile de apărare timpurii (Tabelul suplimentar S12). Au fost găsite douăzeci și două de module (clustere) genetice cu profiluri de expresie corelate (pozitive sau negative) între genotipuri și variante experimentale. În medie, nivelurile de expresie genică au fost descrescătoare în ordinea 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 (în ambele variante, însă, această tendință a fost mai puternică la plantele de control). În medie, nivelurile de expresie genică au fost descrescătoare în ordinea 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 (în ambele variante, însă, această tendință a fost mai puternică la plantele de control). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 эта тенденция была сильнее у контрольных растений). În medie, nivelurile de expresie genică au scăzut în ordinea 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populație 22660 (în ambele variante, însă, această tendință a fost mai puternică la plantele de control).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populație 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 翭 ， 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 тенденция была сильнее у контрольных растений). În medie, nivelurile de expresie genică au scăzut în seria 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 (cu toate acestea, în ambele variante, această tendință a fost mai puternică la plantele de control).Vaccinarea a dus la o creștere a expresiei genelor, în special în modulele 18, 19, 14, 6 și 1 (în ordinea descrescătoare a efectului), reglare negativă (de exemplu, modulele 9 și 20) sau cu efecte neutre (de exemplu, modulele 11, 22, 8 și 13). Analiza îmbogățirii termenilor GO (Tabelul suplimentar S13) a relevat „GO: 0006952 Răspunsuri protectoare” pentru modulul inoculat (18) cu activare maximă, incluzând genele analizate prin qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 și TanjilG_27015), precum și multe module cu fotosinteză suprimată (9). Concentratorul modulului 18 (Fig. 8) a fost identificat ca gena TanjilG_26536, care codifică proteina LlR18B de tip PR-10, iar concentratorul modulului 9 a fost identificat ca gena TanjilG_28955, care codifică proteina PsbQ din fotosistemul II. O genă candidată de rezistență la antracnoză, Lanr1, TanjilG_05042, a fost găsită în modulul 22 (Fig. 9) și este asociată cu termenii „GO:0044260 Procese metabolice macromoleculare celulare” și „GO:0006355 Reglarea transcripțională, modelarea ADN-ului”, care poartă hub-ul TanjilG_01212. Gena codifică factorul de transcripție al stresului termic A-4a (HSFA4a).
Analiza rețelei ponderate a coexpresiei genice a modulelor cu termeni de proces biologic suprareprezentați „GO: 0006952 Răspunsuri de apărare”. Ligatura a fost simplificată pentru a evidenția cele patru gene analizate prin qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 și TanjilG_27015).
Analiza rețelei ponderate a coexpresiei genice a unui modul cu un termen de proces biologic suprareprezentat „GO: 0006355: Reglare transcripțională, șablonare ADN” și purtător al unei gene candidate de rezistență la antracnoză, Lanr1 TanjilG_05042. Ligatura a fost simplificată pentru a izola gena TanjilG_05042 și gena centrală TanjilG_01212.
Screening-ul pentru rezistența la antracnoză colectat în Australia a arătat că majoritatea soiurilor lansate timpuriu au fost sensibile; Kalya, Coromup și Mandelup au fost descrise ca fiind moderat rezistente, în timp ce Wonga, Tanjil și 83A:476 au fost descrise ca fiind extrem de rezistente26,27,31. au avut aceeași alelă de rezistență, desemnată Lanr1, iar Coromup și Mandelup au avut o alelă diferită, desemnată AnMan10, 26, 39, în timp ce Kalya a transmis o alelă diferită, Lanr2. Screening-ul pentru rezistența la antracnoză în Germania a dus la identificarea unei linii rezistente Bo7212 cu o alelă candidată alta decât Lanr1, desemnată LanrBo36.
Studiul nostru a relevat o frecvență foarte scăzută (aproximativ 6%) a alelei Lanr1 în germoplasma testată. Această observație este în concordanță cu rezultatele screening-ului germoplasmei est-europene utilizând markerii Anseq3 și Anseq4, care au arătat că alela Lanr1 este prezentă doar în două linii belaruse. Acest lucru sugerează că alela Lanr1 nu este încă utilizată pe scară largă de programele locale de ameliorare, spre deosebire de Australia, unde este una dintre alelele cheie pentru ameliorarea asistată de markeri. Acest lucru se poate datora nivelului mai scăzut de rezistență oferit de alela Lanr1 în condiții de câmp europene, comparativ cu raportul australian. În plus, studiile privind antracnoza în zonele cu precipitații ridicate din Australia au arătat că răspunsurile de rezistență mediate de alela Lanr1 pot să nu fie eficiente în condiții meteorologice care favorizează creșterea și dezvoltarea rapidă a agentului patogen19,42. De fapt, în prezentul studiu, unele simptome de antracnoză au fost observate și la genotipurile care poartă alela Lanr1, sugerând că rezistența poate dispărea în condiții optime pentru dezvoltarea C. lupini. În plus, sunt posibile interpretări fals pozitive ale prezenței markerilor Anseq3 și Anseq4, care se află la aproximativ 1 cM de locusul Lanr1 28,30,43.
Studiul nostru a arătat că 83A:476, purtător al alelei Lanr1, a răspuns la inocularea cu C. lupini cu o reprogramare transcriptomică la scară largă la primul moment analizat (6 hpi), în timp ce la Mandelup, purtător al alelei AnMan, răspunsurile transcriptomice au fost observate mult mai târziu (de la 24 la 48 hpi). Aceste variații temporale ale răspunsurilor de apărare sunt asociate cu diferențe în simptomele bolii, subliniind importanța recunoașterii timpurii a agenților patogeni pentru un răspuns de succes la rezistență. Pentru a infecta țesutul vegetal, sporii de antrax trebuie să treacă prin mai multe etape de dezvoltare pe suprafața gazdei, inclusiv germinarea, diviziunea celulară și formarea unui apresor. Un apendice este o structură infecțioasă care se atașează de suprafața gazdei și facilitează penetrarea în țesuturile gazdei. Astfel, sporii de C. gloeosporioides din extractul de mazăre au prezentat prima diviziune a nucleului după 75-90 de minute de incubare, formarea unui tub germinativ după 90-120 de minute și supresia după 4 ore. Mango-ul C. gloeosporioides a prezentat o germinare a conidiilor de peste 40% după 3 ore de incubare și o formare de apresori de aproximativ 20% după 4 ore. Gena CAP20 asociată cu virulența de la C. gloeosporioides a prezentat activitate transcripțională în conidiile formatoare de epifite după 3,5 ore de incubare în ceară de suprafață de avocado cu concentrații mari de proteină CAP20 după 4 ore și 46 de minute. În mod similar, activitatea genelor de biosinteză a melaninei la C. trifolii a fost indusă în timpul unei incubări de 2 ore, urmată de formarea unui apresor după 1 oră. Studiile țesuturilor frunzelor au arătat că căpșunile inoculate cu C. acutatum au o primă supresie la 8 hpi, în timp ce roșiile inoculate cu C. coccodes au o primă supresie la 4 hpi48,49. În mare măsură consistent cu scara de timp a procesului infecțios cu Colletotrichum spp. Răspunsurile rapide de apărare la 83A:476 sugerează implicarea genelor de rezistență a plantelor și a imunității declanșate de efectori (ETI) în această linie, în timp ce răspunsurile întârziate ale lui Mandelup susțin ipoteza imunității declanșate de modele moleculare microasociate (MTI) 50. Răspunsuri timpurii la 83A: 476 și Mandelup. Suprapunerea parțială dintre genele reglate în sus sau în jos în răspunsul întârziat susține, de asemenea, acest concept, deoarece ETI este adesea considerat a fi un răspuns MTI accelerat și amplificat care culminează cu moartea celulară programată la locul infecției, cunoscut sub numele de șoc anafilactic 51,52.
Majoritatea genelor atribuite termenului suprareprezentat Gene Ontology GO:0006952 „Răspuns de apărare” sunt cei 11 omologi ai proteinei 22 a mesajului de post indus de stres (similară cu SAM22) și ai celor șapte proteine ​​majore de tip latex (MLP). Proteinele 31, 34, 43 și 423 de tip MLP au prezentat similaritate de secvență. Genele de tip SAM22 au prezentat o activare semnificativă care a durat mai mult, indicând niveluri crescute de rezistență la antracnoză (83A:476 și Boregine). Cu toate acestea, genele de tip MLP au fost reglate negativ doar în liniile care poartă alela de rezistență candidată (83A:476/Lanr1 la 6 hpi și Mandelup/AnMan la 24 hpi). Trebuie menționat că toți omologii de tip SAM22 identificați provin dintr-un grup de gene care se întinde pe aproximativ 105 kb, în ​​timp ce genele de tip MLP provin din regiuni separate ale genomului. Activarea coordonată a unor astfel de gene de tip SAM22 a fost descoperită și în studiul nostru anterior privind rezistența NLL la inocularea cu Diaporthetoxica, sugerând că acestea sunt implicate în componentele orizontale ale răspunsului de apărare. Această concluzie este susținută și de rapoartele privind un răspuns pozitiv al genelor de tip SAM22 la leziuni sau tratament cu acid salicilic, inductori fungici sau peroxid de hidrogen.
S-a demonstrat că genele de tip MLP răspund la diverse stresuri abiotice și biotice, inclusiv infecții fungice bacteriene, virale și patogene la multe specii de plante55. Direcțiile de răspuns la anumite interacțiuni dintre plante și agenți patogeni au variat de la o creștere puternică (de exemplu, în timpul infestării bumbacului cu Verticillium dahliae) la o scădere semnificativă (de exemplu, după infectarea mărului cu Alternaria spp.)56,57. O reglare semnificativă a genei 423 de tip MLP a fost observată în timpul apărării avocadoului împotriva infecției cu F. niger și în timpul infecției mărului Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola și Alternaria alternata sunt patotipuri de măr58,59. În plus, calulul mărului care supraexprimă gena 423 de tip MLP a avut o expresie mai scăzută a genelor asociate rezistenței și a fost mai susceptibil la infecții fungice59. În urma infecției cu Fusarium oxysporum f, gena 423 de tip MLP a fost, de asemenea, suprimată în germoplasma rezistentă a fasolei comune. cn. Infecția cu fasole 60.
Alți membri ai familiei PR-10 identificați în studiul nostru RNA-seq au fost genele LlR18A și LlR18B ca răspuns la suprareglare, precum și gena suprareglată (1 genă) sau subreglată (3 gene) pentru proteina de transfer lipidic DIR1. În plus, WGCNA evidențiază gena LlR18B ca un hub în acest modul, care este foarte susceptibilă la vaccinare și poartă mai multe gene de răspuns protector. Genele LlR18A și LlR18B au fost induse în frunze de lupin galben ca răspuns la bacteriile patogene, precum și în tulpinile NLL după inocularea cu D. toxica, în timp ce omologul de orez al acestor gene, RSOsPR10, a fost indus rapid de o infecție fungică implicată probabil în calea de semnalizare a acidului jasmonic53,61,62. Gena DIR1 codifică proteine ​​nespecifice de transport lipidic care sunt necesare pentru apariția rezistenței sistemice dobândite (SAR). Odată cu dezvoltarea reacțiilor protectoare, proteina DIR1 este transportată de la focarul infecției prin floem pentru a induce SAR în organele îndepărtate. Interesant este că gena TanjilG_02313 DIR1 a fost indusă semnificativ la primul moment în liniile 84A:476 și Populația 22660, dar rezistența la antracnoză s-a dezvoltat cu succes doar în linia 84A:476. Acest lucru poate indica o oarecare subfuncționalizare a genei DIR1 în NLL, deoarece ceilalți trei omologi au răspuns la inoculare doar în linia 83A:476 la 6 hpi, iar acest răspuns a fost direcționat în jos.
În studiul nostru, cele mai comune componente corespunzătoare procesului biologic numit „GO:0055114 Procesul redox” au fost proteina citocromului P450, peroxidaza, acidul linoleic 9S-/13S-lipoxigenaza și acidul 1-aminociclopropan-1-carboxilic oxidaza. În plus, WGCNA-ul nostru definește omologul HSFA4a ca un hub care transportă module, cum ar fi gena candidată de rezistență Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a este o componentă a reglării dependente de redox a transcripției nucleare la plante.
Proteinele citocromului P450 sunt oxidoreductaze care catalizează reacțiile de hidroxilare dependente de NADPH și/sau O2 în metabolismul primar și secundar, inclusiv metabolismul xenobioticelor, precum și al hormonilor, acizilor grași, sterolilor, componentelor peretelui celular, biopolimerilor și biosinteza compușilor protectori 69. În studiul nostru, variabilitatea funcției citocromului P450 la plante a fost redusă de la -10,6 log2 (modificare de ori) la 5,7 datorită numărului mare de omologi modificați (37) și diferențelor în modelele de răspuns între gene specifice, reflectând o revizuire ascendentă. Utilizarea doar a datelor RNA-seq pentru a elucida funcția biologică presupusă a genelor NLL într-o superfamilie de proteine ​​atât de mare ar fi extrem de speculativă. Cu toate acestea, este demn de remarcat faptul că unele gene ale citocromului P450 sunt asociate cu o rezistență crescută la ciuperci sau bacterii patogene, inclusiv o contribuție la reacții alergice 69,70,71.
Peroxidazele de clasa III sunt enzime vegetale multifuncționale implicate într-o gamă largă de procese metabolice în timpul creșterii și dezvoltării plantelor, precum și ca răspuns la stresurile de mediu, cum ar fi salinitatea, seceta, intensitatea luminoasă ridicată și atacul agenților patogeni72. Peroxidazele sunt implicate în interacțiunea mai multor specii de plante cu Anthracis, inclusiv Stylosanthes humilis și C. gloeosporioides, Lens culinaris și C. truncatum, Phaseolus vulgaris și C. lindemuthianum, Cucumis sativus și C. lagenarium73,74,75,76. Răspunsul este foarte rapid, uneori chiar la 4 HPI, înainte ca ciuperca să pătrundă în țesutul plantei73. Gena peroxidazei a răspuns, de asemenea, la inocularea cu D. toxica NLL. Pe lângă funcțiile lor tipice de reglare a exploziei oxidative sau de eliminare a stresului oxidativ, peroxidazele pot interfera cu creșterea agenților patogeni prin crearea de bariere fizice bazate pe întărirea peretelui celular în timpul lignificării, subunităților sau reticulării compușilor specifici. Această funcție poate fi atribuită in silico genei TanjilG_03329 care codifică o presupusă peroxidază anionică formatoare de lignină, care a fost semnificativ suprareglată în studiul nostru în linia rezistentă 83A:476 la 6 HPI, dar nu și în alte tulpini și momente de timp care nu au răspuns.
9S-/13S-lipoxigenaza acidului linoleic este prima etapă în calea oxidativă a biosintezei lipidelor78. Produșii acestei căi au multiple funcții în apărarea plantelor, inclusiv întărirea peretelui celular prin formarea depozitelor de caloză și pectină și reglarea stresului oxidativ prin producerea de specii reactive de oxigen79,80,81,82,83. În prezentul studiu, expresia acidului linoleic 9S-/13S-lipoxigenazei a fost modificată în toate tulpinile, dar în populația susceptibilă 22660, suprareglarea a prevalat în momente diferite, în timp ce în tulpinile purtătoare de Lanr1 rezistent și alela AnMan, aceasta accentuează diversificarea stratului de oxilipină în reacțiile protectoare la antrax între aceste genotipuri.
Omologul 1-aminociclopropan-1-carboxilat oxidazei (ACO) a fost semnificativ suprareglat (9 gene) sau subreglat (2 gene) atunci când a fost inoculat cu lupin. Cu două excepții, toate aceste răspunsuri au avut loc la 6 hp. la 83A:476. Reacția enzimatică mediată de proteinele ACO este etapa limitatoare de viteză în producerea de etilenă și, prin urmare, este puternic reglată84. Etilena este un hormon vegetal care joacă o varietate de roluri în reglarea dezvoltării plantelor și a răspunsului la condițiile de stres abiotic și biotic. Inducerea transcripției ACO și activarea căii de semnalizare a etilenei sunt implicate în creșterea rezistenței orezului la ciuperca hemibiotrofă oryzae oryzae prin reglarea producției de specii reactive de oxigen și fitoalexine. Un proces foarte similar de infecție a frunzelor, descoperit între M. oryzae și C. lupini88,89, pe fondul unei suprareglări semnificative a omologilor ACO în linia 83A:476 raportată în acest studiu, schimbă posibilitatea conferirii rezistenței la antracnoza NLL (etilenă), o etapă centrală de semnalizare în căile moleculare.
În prezentul studiu, s-a observat o suprimare la scară largă a multor gene asociate cu fotosinteza la 6 hpi în 83A:476 și la 48 hpi în Mandeloop și populația 22660. Amploarea și progresia acestor modificări sunt proporționale cu nivel. În acest experiment s-a observat rezistență la antracnoză. Recent, a fost raportată o represie puternică și timpurie a transcrierilor legate de fotosinteză în mai multe modele de interacțiuni plantă-agent patogen, inclusiv bacterii și fungi patogeni. Graba (de la 2 HPI în unele interacțiuni) și suprimarea globală a genelor asociate cu fotosinteza ca răspuns la infecție pot declanșa imunitatea plantelor pe baza utilizării speciilor reactive de oxigen și a interacțiunii acestora cu calea acidului salicilic pentru a media reacțiile alergice 90,94.
În concluzie, mecanismele de răspuns de apărare propuse pentru linia cea mai rezistentă (83A:476) includ recunoașterea rapidă a agenților patogeni de către gena R (probabil TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) și semnalizarea acidului salicilic și etilenei mediată de răspunsul alergic, urmată de stabilirea unei acțiuni SAR pe termen lung. Acțiunea este susținută de proteina DIR-1. Trebuie menționat că perioada biotrofică pentru infecția cu C. lupini este foarte scurtă (aproximativ 2 zile), urmată de creștere necrotică95. Tranziția dintre aceste etape poate fi asociată cu necroza și exprimarea proteinelor inductibile de etilenă care acționează ca declanșatori ai reacțiilor de hipersensibilitate la plantele gazdă. Prin urmare, fereastra de timp pentru capturarea cu succes a C. lupini în stadiul biotrofic este foarte îngustă. Reprogramarea genelor asociate cu redox și fotosinteza observată în 83A:476 la 6 hpi este în concordanță cu progresia hifelor fungice și anunță dezvoltarea unui răspuns protector de succes în stadiul biotrofic. Răspunsurile transcriptomice ale Mandelup și ale populației 22660 pot fi prea întârziate pentru a capta ciuperca înainte de a trece la creștere necrotică; cu toate acestea, Mandelup poate fi mai eficient decât populația 22660, deoarece reglarea relativ rapidă a proteinei PR-10 promovează rezistența orizontală.
ETI, condusă de gena canonică R, pare a fi un mecanism comun pentru rezistența fasolei la antracnoză. Astfel, la leguminoasa model Medicago truncatula, rezistența la antracnoză este conferită de gena RCT1, un membru al clasei de gene R ale plantei TIR-NBS-LRR97. Această genă conferă, de asemenea, rezistență la antracnoză cu spectru larg la lucernă atunci când este transferată la plante sensibile. La fasolea comună (P. vulgaris), până în prezent au fost identificate peste două duzini de gene de rezistență la antracnoză. Unele dintre aceste gene se găsesc în regiuni cărora le lipsesc genele R canonice, însă multe altele sunt situate la marginile cromozomilor care poartă clusterul de gene NBS-LRR, inclusiv TIR-NBS-LRRs99. Studiul SSR la nivelul întregului genom a confirmat, de asemenea, asocierea genei NBS-LRR cu rezistența la antracnoză la fasolea comună. Gena canonică R a fost găsită și în regiunea genomică care poartă locusul major de rezistență la antracnoză la lupinul alb 101.
Studiul nostru arată că o reacție de rezistență imediată, activată într-un stadiu incipient al infecției plantelor (de preferință nu mai târziu de 12 hpi), protejează eficient lupinul cu frunze înguste de antracnoza cauzată de ciuperca patogenă Collelotrichum lupini. Folosind secvențierea cu randament ridicat, am demonstrat profiluri de expresie diferențială ale genelor de rezistență la antracnoză la plantele NLL, mediate de genele de rezistență Lanr1 și AnMan. Apărarea cu succes implică proiectarea atentă a genelor pentru proteinele implicate în redox, fotosinteză și patogeneză, în câteva ore de la primul contact al plantei cu un agent patogen. Reacții de protecție similare, dar întârziate în timp, sunt mult mai puțin eficiente în protejarea plantelor de boli. Rezistența la antrax mediată de gena Lanr1 seamănă cu răspunsul rapid tipic al genei R (imunitate declanșată de efector), în timp ce gena AnMan oferă cel mai probabil un răspuns orizontal (imunitate declanșată de un model molecular asociat cu microbii), oferind un nivel moderat de sustenabilitate.
Cele 215 linii NLL utilizate pentru screening-ul markerilor de antracnoză au constat din 74 de soiuri, 60 de linii obținute prin încrucișare sau ameliorare, 5 mutanți și 76 de germeni sălbatici sau originali. Liniile provin din 17 țări, în principal din Polonia (58), Spania (47), Germania (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Italia (5) și alte linii din 10 țări. Setul include, de asemenea, linii rezistente de referință: 83A:476, Tanjil, Wonga care poartă alela Lanr1 și Mandelup care poartă alela AnMan. Liniile au fost obținute din Baza de Date Europeană de Resurse Genetice de Lupin, administrată de Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Tabelul suplimentar S1).
Plantele au fost cultivate în condiții controlate (fotoperioadă 16 ore, temperatură 25°C ziua și 18°C ​​noaptea). Au fost analizate două replici biologice. ADN-ul a fost izolat din frunze cu vârsta de trei săptămâni utilizând kitul DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Germania) conform protocolului. Calitatea și concentrația ADN-ului izolat au fost evaluate prin metode spectrofotometrice (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Au fost analizați markerul AnManM1 care marchează gena de rezistență la antracnoză AnMan (derivată din cv. Mandelup) și markerii Anseq3 și Anseq4 care flanchează gena Lanr1 (derivată din cv. Tanjil) 11, 26, 28. Homozigoții pentru alela rezistentă au fost evaluați cu „1”, sensibili – cu „0”, iar heterozigoții – cu 0,5.
Pe baza rezultatelor screening-ului pentru markerii AnManM1, AnSeq3 și AnSeq4 și a disponibilității semințelor pentru experimentele finale ulterioare, au fost selectate 50 de linii NLL pentru fenotiparea rezistenței la antracnoză. Analiza a fost efectuată în duplicat într-o seră controlată de computer, cu o fotoperioadă de 14 ore, cu un interval de temperatură de 22°C ziua și 19°C noaptea. Semințele sunt zgâriate (tăind coaja semințelor pe partea opusă a embrionului cu o lamă ascuțită) înainte de semănat pentru a preveni repausul semințelor din cauza coajei prea tari și pentru a asigura o germinare uniformă. Plantele au fost cultivate în ghivece (11 × 11 × 21 cm) cu sol steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varșovia, Polonia). Inocularea a fost efectuată cu tulpina Colletotrichum lupini Col-08, cultivată în 1999 din tulpinile unor plante de lupin cu frunze înguste, cultivate pe un câmp din Verzhenitsa, Polonia Mare (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Obțineți o zonă. Izolatele au fost cultivate în mediu SNA la 20° C, sub lumină neagră, timp de 21 de zile pentru a induce sporularea. La patru săptămâni după semănat, când plantele au ajuns în stadiul de 4-6 frunze, inocularea a fost efectuată prin pulverizarea cu o suspensie de conidii la o concentrație de 0,5 x 106 conidii per ml. După inoculare, plantele au fost ținute la întuneric timp de 24 de ore, la o umiditate de aproximativ 98% și o temperatură de 25°C, pentru a facilita germinarea conidiilor și procesul de infecție. Plantele au fost apoi cultivate sub o fotoperioadă de 14 ore, la 22°C zi/19°C noapte și 70% umiditate. Scorul bolii a fost calculat la 22 de zile după inoculare și a variat de la 0 (imun) la 9 (foarte susceptibil), în funcție de prezența sau absența leziunilor necrotice pe tulpini și frunze. În plus, după punctare, a fost măsurată greutatea plantelor. Relațiile dintre genotipurile markerilor și fenotipurile bolii au fost calculate ca corelații punctuale de două secvențe (absența markerilor heterozigoți în setul de linii pentru analiza fenotipului de rezistență la antracnoză).