Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) este o plantă leguminoasă folosită pentru producția de alimente și îmbunătățirea solului.Expansiunea globală a NLL ca cultură a atras multe ciuperci patogene, inclusiv antracnoza lupină, care provoacă boala devastatoare a antracnozei.Două alele, Lanr1 și AnMan, care conferă rezistență crescută, au fost utilizate în reproducerea NLL, dar mecanismele moleculare care stau la baza rămân necunoscute.În acest studiu, markerii Lanr1 și AnMan au fost utilizați pentru a examina mostre europene NLL.Testarea vaccinului într-un mediu controlat a confirmat eficacitatea ambilor donatori rezistenți.Profilul diferențial al expresiei genelor a fost efectuat pe linii reprezentative rezistente și susceptibile.Rezistența la antracnoză a fost asociată cu supraexprimarea termenilor de ontologie genetică „GO:0006952 Defense Response”, „GO:0055114 Redox Process” și „GO:0015979 Photosynthesis”.În plus, linia Lanr1(83A:476) a arătat o reprogramare semnificativă a transcriptomului rapid după inoculare, în timp ce celelalte linii au arătat o întârziere a acestui răspuns cu aproximativ 42 de ore.Răspunsurile de apărare sunt asociate cu genele TIR-NBS, CC-NBS-LRR și NBS-LRR, 10 proteine ​​implicate în patogeneză, proteine ​​de transfer lipidic, endoglucan-1,3-β-glucozidază, proteine ​​​​de perete celular bogat în glicină și gene din calea reactivă a oxigenului.Răspunsurile timpurii la 83A:476, inclusiv suprimarea atentă a genelor asociate cu fotosinteza, au coincis cu protecția de succes în timpul fazei de creștere vegetativă a biologiei fungice, sugerând că un efector declanșează imunitatea.Reacția Mandeloop este încetinită, la fel ca rezistența generală orizontală.
Lupinul cu frunze înguste (NLL, Lupinus angustifolius L.) este o cereală bogată în proteine, originară din regiunea de vest a Mediteranei1,2.În prezent este cultivată ca cultură alimentară pentru animale și oameni.De asemenea, este considerat îngrășământ verde în sistemele de rotație a culturilor datorită fixării azotului de către bacteriile simbiotice fixatoare de azot și îmbunătățirii generale a structurii solului.NLL a suferit un proces rapid de domesticire în ultimul secol și se află încă sub presiune mare de reproducere3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Odată cu cultivarea pe scară largă a NLL, succesiunea ciupercilor patogene a dezvoltat noi nișe agricole și a provocat noi boli care distrug culturile. Cea mai remarcabilă pentru fermierii și crescătorii de lupini a fost apariția antracnozei, cauzată de ciuperca patogenă, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Cea mai remarcabilă pentru fermierii și crescătorii de lupini a fost apariția antracnozei, cauzată de ciuperca patogenă, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав, паиболее примечательным антракнозав, паиболее ибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Cea mai notabilă pentru fermierii și crescătorii de lupini a fost apariția antracnozei cauzate de ciuperca patogenă Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是由眗Borhumm, Lupini, 眀注目的是炭目的是炭疽病的出现，它是现iler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现它是现它是现它是由眵Hum) d。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракние антракнамы гозонакнозозонеров люпина является грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Cea mai frapantă pentru fermierii și crescătorii de lupini este apariția antracnozei cauzate de ciuperca patogenă Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Cele mai timpurii raportări ale bolii au venit din Brazilia și Statele Unite, simptomele tipice au apărut în 1912 și, respectiv, 1929.Cu toate acestea, după aproximativ 30 de ani, agentul patogen a fost desemnat ca Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .şi H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。și H. Schlenk, .Fenotiparea preliminară a bolii efectuată la mijlocul secolului al XX-lea a arătat o oarecare rezistență în accesările LNN și lupin galben (L. luteus L.), dar toate accesiunile de lupin alb (L. albus L.) testate au fost foarte susceptibile15,16.Studiile au arătat că dezvoltarea antracnozei este asociată cu creșterea precipitațiilor (umiditatea aerului) și a temperaturii (în intervalul 12-28°C), ceea ce duce la o încălcare a rezistenței la temperaturi mai ridicate17, 18. De fapt, timpul necesar pentru germinarea conidilor și pentru a începe boala a fost de patru ori mai scurt la 24°C (4 ore) 12°C în condiții de umiditate ridicată (16 ore) 19°C (16 ore) 19°C.Astfel, încălzirea globală continuă a dus la răspândirea antracnozei.Cu toate acestea, boala a fost observată în Franța (1982) și Ucraina (1983) ca un prevestitor al unei amenințări iminente, dar a fost aparent ignorată de industria lupinului la acea vreme20,21.Câțiva ani mai târziu, această boală devastatoare s-a răspândit în întreaga lume și a afectat, de asemenea, țări importante producătoare de lupin, precum Australia, Polonia și Germania22,23,24.În urma unui focar de antracnoză la mijlocul anilor 1990, un screening extins a dus la identificarea mai multor donatori rezistenți în probele NLL19.Rezistența NLL la antracnoză este controlată de două alele dominante separate găsite în diferite surse de germoplasmă: Lanr1 în soiul Tanjil și Wonga și AnMan în soi.Mandalay 25, 26. Aceste alele completează markerii moleculari care sprijină selecția germoplasmei rezistente în programele de reproducere25,26,27,28,29,30.Linia de reproducere rezistentă 83A:476 care poartă alela Lanr1 a fost încrucișată cu linia sălbatică sensibilă P27255 pentru a obține o populație RIL segregată pentru rezistența la antracnoză, ceea ce a făcut posibilă atribuirea locusului Lanr1 cromozomului NLL-1131, 32, 33. localizarea tuturor celor trei alele pe același cromozom (NLL-11), dar în poziții diferite29,34,35.Cu toate acestea, din cauza numărului mic de RIL și a distanței genetice mari dintre markeri și alelele corespunzătoare, nu se pot trage concluzii sigure cu privire la genele lor subiacente.Pe de altă parte, utilizarea geneticii inverse la lupini este dificilă din cauza potențialului lor de regenerare foarte scăzut, ceea ce face manipularea genetică greoaie37.
Dezvoltarea germoplasmei domestice care poartă alela dorită în stare homozigotă, cum ar fi 83A:476 (Lanr1) și Mandelup (AnMan), a deschis ușa studierii rezistenței la antracnoză în fața prezenței combinațiilor opuse de alele în populațiile sălbatice.Posibilitățile mecanismelor moleculare.Comparați răspunsurile de apărare generate de genotipuri specifice.Acest studiu a evaluat răspunsul transcriptom precoce al NLL la vaccinarea cu C. lupini.Mai întâi, un panou de germoplasmă european NLL care conține 215 linii a fost verificat folosind markeri moleculari care marchează alelele Lanr1 și AnMan.Fenotipizarea antracnozei a fost apoi efectuată pe 50 de linii NLL, selectate anterior pentru markeri moleculari, în condiții controlate.Pe baza acestor experimente, au fost selectate patru linii care diferă în rezistența la antracnoză și compoziția alelecă Lanr1/AnMan pentru profilarea exprimării genelor de apărare diferenţială folosind două abordări complementare: secvenţierea ARN de mare capacitate și cuantificarea PCR în timp real.
Screening-ul unui set de germoplasmă NLL (N = 215) cu markerii Lanr1 (Anseq3 și Anseq4) și AnMan (Anseq4) și AnMan (AnManM1) a arătat că o singură linie (95726, lângă Salamanca-b) amplifică alela de „rezistență” pentru toți markerii, în timp ce „prezența a 185 alele” a fost găsită în proporție de 18 alele. .5%) linii.Treisprezece linii au produs două alele „rezistente” ale markerului Lanr1, iar 8 linii au produs alele „rezistente” ale Lanr1.marker.Alela „rezistență” a markerului AnMan (tabelul suplimentar S1).Două linii au fost heterozigote pentru markerul Anseq3 și una heterozigotă pentru markerul AnManM1.42 de linii (19,5%) au purtat faze opuse ale alelelor Anseq3 și Anseq4, indicând o frecvență mare de recombinare între aceste două loci.Fenotipurile antracnozei în condiții controlate (Tabelul suplimentar S2) au evidențiat variabilitate în rezistența genotipurilor testate, care s-a reflectat în severitatea antracnozei.Diferențele în scorurile medii au variat de la 1,8 (moderat rezistent) la 6,9 (susceptibil), iar diferențele de greutate ale plantelor au variat de la 0,62 (susceptibil) la 4,45 g (rezistent). A existat o corelație semnificativă între valorile observate în două replicări ale experimentului (0,51 pentru scorurile de severitate a bolii, P = 0,00017 și 0,61 pentru greutatea plantei, P <0,0001), precum și între acești doi parametri (−0,59 și -0,77, P <0,0001). A existat o corelație semnificativă între valorile observate în două replicări ale experimentului (0,51 pentru scorurile de severitate a bolii, P = 0,00017 și 0,61 pentru greutatea plantei, P < 0,0001), precum și între acești doi parametri (− 0,59 și - 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями в тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими даву, 7ми пару, 7ми пару 7ми Р < 0,0001) 0,0001). S-a constatat o corelație semnificativă între valorile observate în două repetări ale experimentului (0,51 pentru scorurile de severitate a bolii, P = 0,00017 și 0,61 pentru greutatea plantei, P < 0,0001), precum și între acești doi parametri (- 0,59 și -0,77, P < 0,00001) ).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺000.51︺00.分1︺000.物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77） P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 严重 程度 评 为 度 评 之 存在 相关性1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（（及及（（（（及（（（（59.和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух потцторя (значениями) аболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметения 0,61, P <0,0001), și между этими двумя парамететрами (-1,00,50, 1,00,50,0,00,500 . A existat o corelație semnificativă între valorile observate în duplicat (scor de severitate a bolii 0,51, P = 0,00017 și greutatea plantei 0,61, P < 0,0001) și între acești doi parametri (-0,59 și -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Simptomele tipice observate la plantele susceptibile includ îndoirea și răsucirea tulpinii asemănătoare cu o structură de „arc al ciobanului”, urmate de leziuni ovale cu sporozoiți portocalii/roz (Figura 1 suplimentară).Accesiunile australiene care poartă genele Lanr1 (83A:476 și Tanjil) și AnMan (Mandelup) sunt moderat rezistente, 0,0331 și 0,0036).Unele linii care poartă și alele Lanr1 și/sau AnMan „rezistente” prezintă simptome ale bolii.
Interesant este că câteva linii NLL lipsite de orice alele marker „rezistente” au relevat un nivel ridicat de rezistență la antracnoză (comparabil sau mai mare decât pentru genotipurile Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoarea P < 0,0001 pentru ambii parametri), Bojar (valoarea P < 0,0001 pentru scor și valoarea 0,0001 pentru greutatea plantei) și POP < 0,0001 pentru greutatea plantei) 001 pentru scor și nesemnificativ pentru greutate). Interesant este că câteva linii NLL lipsite de orice alele marker „rezistente” au relevat un nivel ridicat de rezistență la antracnoză (comparabil sau mai mare decât pentru genotipurile Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoarea P < 0,0001 pentru ambii parametri), Bojar (valoarea P < 0,0001 pentru scor și valoarea 0,0001 pentru greutatea plantei) și POP < 0,0001 pentru greutatea plantei) 001 pentru scor și nesemnificativ pentru greutate). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллонкави золонкавы золесно, ь устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таки0 Boregine, такни0 1 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) și по-549ние (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) ,0001 для оценки и незначимо для массы). Interesant este că mai multe linii NLL lipsite de orice alele marker „rezistente” au arătat un nivel ridicat de rezistență la antracnoză (comparabil sau mai mare decât pentru genotipurile Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoarea P < 0,0001 pentru ambii parametri), Bojar (valoarea P < 0,0001 pentru evaluare și valoarea B-0. 0001 pentru evaluare și nesemnificativ pentru greutate).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭水平的炭疽An Lar基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<律如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分万0.0.0分万0. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Este interesant că unele sisteme NLL care nu au nici un marker „antigenic” prezintă rezistență orizontală ridicată (echivalentă cu genele Lanr1 sau AnMan sau mai mare), precum Boregine (ambele parametrii P < 0,0001), Bojar (valoarea P < 0,0001, greutatea plantei 0,001) și tulpina B-549/1, greutate nu semnificativă (greutate P < 790). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентноста", спокостива стойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (знирач делиповя 0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значенка значение 0,0001) a). Interesant, unele linii NLL lipsite de orice alele marker de „rezistență” au prezentat niveluri ridicate de rezistență la antracnoză (comparabilă sau mai mare decât genotipurile Lanr1 sau AnMan), cum ar fi Boregine (valoarea P pentru ambii parametri <0,0001), Bojar (valoare P <0,0001, greutatea plantei 0,70-549) și valoarea populației 0,70-541 01, greutatea nu este semnificativă).Acest fenomen sugerează posibilitatea unei noi surse genetice de rezistență, explicând lipsa de corelație observată între genotipurile markerului și fenotipurile bolii (valori P de la ~0,42 la ~0,98).Astfel, testul Kolmogorov-Smirnov a arătat că datele privind rezistența la antracnoză au fost distribuite aproximativ normal pentru scoruri (valori P 0,25 și 0,11) și masa plantei (valori P 0,47 și 0,55), sugerând că am ipoteza că sunt implicate mai multe alele decât Lanr1 și AnMan.
Pe baza rezultatelor screening-ului rezistenței la antracnoză, au fost selectate 4 linii pentru analiza transcriptomului: 83A:476, Boregine, Mandelup și Population 22660. Aceste linii au fost retestate pentru rezistența la antrax în experimente de inoculare prin secvențierea ARN, cu condiția ca acestea să fie aceleași ca în testul anterior.Valorile scorului au fost următoarele: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) și populație 22660 (6,11 ± 1,29).
Protocolul Illumina NovaSeq 6000 a atins o medie de 40,5 perechi Mread per probă (29,7 până la 54,4 Mreads) (Tabelul suplimentar S3).Scorurile de aliniere în secvența de referință au variat de la 75,5% la 88,6%.Corelația medie a datelor de numărare de citire între variantele experimentale între replicile biologice a variat de la 0,812 la 0,997 (media 0,959). Din cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au dezvăluit nicio expresie, iar celelalte 4785 de gene au fost exprimate la un nivel neglijabil (media de bază < 5). Din cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au dezvăluit nicio expresie, iar celelalte 4785 de gene au fost exprimate la un nivel neglijabil (media de bază < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов проявляли начительном уровне (базовое среднее <5). Din cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au prezentat nicio expresie, iar restul de 4785 de gene au fost exprimate la un nivel neglijabil (media de bază <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以帇忽可以応表达，其他4785值< 5).35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелсунч имелсунч имелись прессию (базовое среднее значение <5). Din cele 35.170 de gene analizate, 2917 nu au fost exprimate, iar restul de 4785 gene au avut o expresie neglijabilă (media de bază <5).Astfel, numărul de gene considerate exprimate (media de bază ≥ 5) în timpul experimentului a fost de 27.468 (78,1%) (Tabelul suplimentar S4).
Din primul moment, toate liniile NLL au răspuns la inocularea cu C. lupini (tulpina Col-08) prin reprogramarea transcriptomului (Tabelul 1), cu toate acestea, s-au observat diferențe semnificative între linii.Astfel, linia de rezistență 83A:476 (care poartă gena Lanr1) a arătat o reprogramare semnificativă a transcriptomului la primul punct de timp (6 hpi) cu o creștere de 31-69 de ori a numărului de gene izolate în sus și în jos în comparație cu alte momente de timp în acest moment.În plus, acest vârf a fost de scurtă durată, deoarece expresia doar a câtorva gene a rămas modificată semnificativ la al doilea punct de timp (12 hpi).Interesant, Boregine, care a arătat și un nivel ridicat de rezistență în testul de grefă, nu a suferit o astfel de reprogramare transcripțională masivă în timpul experimentului.Cu toate acestea, numărul de gene exprimate diferențial (DEG) a fost același pentru Boregine și 83A:476 la 12 HPI.Atât Mandelup, cât și populația 22660 au prezentat vârfuri de DEG la ultimul punct temporal (48 l/s), indicând o întârziere relativă a răspunsurilor de apărare.
Deoarece 83A:476 a suferit o reprogramare masivă a transcriptomului ca răspuns la C. lupini la 6 HPI în comparație cu toate celelalte linii, ~ 91% din DEG-urile observate în acest moment au fost specifice liniei (Fig. 1).Cu toate acestea, a existat o oarecare suprapunere în răspunsurile timpurii între liniile de studiu, deoarece 68,5%, 50,9% și 52,6% DEG în Boregine, Mandelup și, respectiv, populația 22660, s-au suprapus cu cele găsite în 83A:476 în anumite momente în timp.Cu toate acestea, aceste DEG au reprezentat doar o mică parte (0,97–1,70%) din toate DEG-urile detectate în prezent folosind 83A:476.În plus, 11 DEG din toate liniile au fost coerente în acest moment (Tabelele suplimentare S4-S6), inclusiv componente comune ale răspunsurilor de apărare a plantelor: proteina de transfer lipidic (TanjilG_32225), enzima endoglucan-1,3-β-glucozidă (TanjilG_23384), două proteine ​​​​inductibile de stres (TanjilG_2312315123123123132312315). 531), proteină bazică de latex (TanjilG_32352) și două proteine ​​structurale ale peretelui celular bogat în glicină (TanjilG_19701 și TanjilG_19702).A existat, de asemenea, o suprapunere relativ mare a răspunsurilor la transcriptom între 83A:476 și Boregine la 24 HPI (total 16-38% DEG) și între Mandelup și Population 22660 la 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagrama Venn care arată numărul de gene exprimate diferențial (DEG) în liniile de lupin cu frunze înguste (NLL) inoculate cu Colletotrichum lupini (tulpina Col-08 obținută din câmpurile de lupin din Wierzhenice, Polonia, 1999).Liniile NLL analizate au fost: 83A:476 (rezistente, purtând alela Lanr1), Boregine (rezistent, fundal genetic necunoscut), Mandelup (rezistent moderat, purtând alela AnMan) și populația 22660 (foarte susceptibilă).Abrevierea hpi reprezintă ore după vaccinare.Valorile zero au fost eliminate pentru a simplifica graficul.
Setul de gene supraexprimate la 6 hpi a fost analizat pentru prezența domeniilor genei R canonice (Tabelul suplimentar S7).Acest studiu a dezvăluit inducerea transcriptomului a genelor clasice de rezistență la boli cu domenii NBS-LRR numai la 83A:476.Acest set a constat dintr-o genă TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinci gene CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 și tanjilg_16162), și Four, NBS LR6 NBS-LR6 și Four NBS-LR6 jilg_16162), precum și Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) și Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Toate aceste gene au domenii canonice aranjate în secvențe conservate.În plus față de genele domeniului NBS-LRR, mai multe RLL kinaze au fost activate la 6 hpi, și anume una în Boregine (TanjilG_19877), două în Mandelup (TanjilG_07141 și TanjilG_19877) și în populația 22660 (TanjilG_09877) și două în TanjilG_09141 și 2:0614: 476.
Genele cu expresie modificată semnificativ ca răspuns la inocularea cu C. lupini (tulpina Col-08) au fost supuse analizei de îmbogățire a Ontologiei genelor (GO) (Tabelul suplimentar S8). Termenul de proces biologic suprareprezentat cel mai frecvent a fost „răspunsul de apărare GO:0006952”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × linie) cu semnificație ridicată (valoarea P < 0,001) (Fig. 2). Termenul de proces biologic suprareprezentat cel mai frecvent a fost „răspunsul de apărare GO:0006952”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × linie) cu semnificație ridicată (valoarea P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином й появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рисокой значимостью). Termenul de proces biologic suprareprezentat cel mai frecvent a fost „răspunsul de apărare GO:0006952”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × descendență) cu semnificație ridicată (valoarea P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（縿魗（时魗（时魗（时魗应”个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Cel mai reprezentativ termen de proces biologic este „GO:0006952 răspuns de apărare”, care apare în 6 din cele 16 combinații (时间×线), cu semnificație ridicată (valoarea P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response процеского в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Termenul de proces biologic suprareprezentat cel mai frecvent a fost „GO:0006952 Defense Response”, care a apărut în 6 din 16 combinații (timp × linie) cu semnificație ridicată (valoarea P < 0,001) (Fig. 2).Acest termen a fost suprareprezentat la două momente în 83A: 476 și Boregine (6 și 24 hpi) și la un moment dat în Mandelup și Populația 22660 (12 și, respectiv, 6 hpi).Acesta este un rezultat așteptat, evidențiind răspunsul antifungic al liniilor rezistente.În plus, 83A:476 a răspuns la C. lupini prin inducerea rapidă a genelor legate de explozia oxidativă reprezentată de termenul „proces redox GO:0055114”, indicând un răspuns specific de apărare, în timp ce Boregine a dezvăluit răspunsuri de apărare specifice, legate de termenul „GO”.:0006950 Răspuns la stres”.Populația 22660 a activat răspunsul de rezistență orizontal care implică metaboliți secundari, evidențiind numărul excesiv de termeni „GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis” și „GO:0006722 Process of triterpene metabolism” (ambele termeni aparțin aceluiași set de gene), ținând cont de rezultatele analizei de îmbogățire a termenului GO:0016104 și de îmbogățire a termenului de îmbogățire. 22660. În plus, reacția timpurie 83A:476 (6 hpi) și reacția întârziată Mandelup și Population 22660 includ termenul GO:0015979 „fotosinteză” și alte procese biologice înrudite.
Termenii de ontologie a genei de bioproces selectați în adnotarea genelor exprimate diferențial în timpul răspunsurilor la transcriptom ale lupinului cu frunze înguste (NLL) inoculate cu lupin antrax (tulpina Col-08 obținută din câmpurile de lupin din Wierzhenice, Polonia, în 1999) sunt foarte exagerate.Liniile NLL analizate au fost: 83A:476 (rezistente, purtând alela homozigotă Lanr1), Boregine (rezistent, fundal genetic necunoscut), Mandelup (rezistent moderat, purtând alela homozigotă AnMan) și populația 22660 (susceptibilă).
Deoarece acest studiu și-a propus să identifice genele care contribuie la rezistența la antracnoză, genele atribuite termenilor GO „GO: 0006952 Defensive responses” și „GO: 0055114 Redox processes” au fost analizate cu limite, deoarece mediile inițiale ≥ 30 cu cel puțin o linie.× moment în timp care combină valori semnificative statistic ale log2 (modificare ori).Numărul de gene care îndeplinesc aceste criterii a fost de 65 pentru GO:0006952 și 524 pentru GO:0055114.
83A:476 a dezvăluit două vârfuri DEG adnotate cu termenul GO:0006952, primul la 6 gene pe inch (64 de gene, reglare în sus și în jos) și al doilea la 24 gene pe inch (15 gene, doar reglare în sus).Boregine a arătat, de asemenea, că GO:0006952 a atins vârful în același punct de timp, dar cu mai puține DEG (11 și 8) și activare preferențială.Mandeloop a arătat două vârfuri de GO:0006952 la 12 și 48 HPI, ambele purtând 12 gene (prima cu gene activatoare, iar a doua doar cu gene supresive), în timp ce populația 22660 la 6 HPI (13 gene) a avut o predominanță mai mare a vârfului de creștere.regulament.Trebuie remarcat faptul că 96,4% din GO:0006952 DEG din aceste vârfuri au avut același tip de răspuns (în sus sau în jos), indicând o suprapunere semnificativă a răspunsurilor de apărare, în ciuda diferențelor în numărul de gene implicate.Cel mai mare grup de secvențe legate de termenul GO:0006952 codifică proteina 22 a mesajului asociată stresului de foame (SAM22-like), care aparține clasei 10 de proteine ​​asociate patogenezei (PR-10) și latexului proteic de bază.proteină similară (asemănătoare MLP) proteină (fig. 3).Cele două grupuri diferă prin natura expresiei și direcția răspunsului.Genele care codifică proteine ​​asemănătoare SAM22 au arătat o inducție consistentă și semnificativă la momentele timpurii (6 sau 12 hpi) și, în general, nu au răspuns la sfârșitul experimentului (48 hpi), în timp ce proteinele asemănătoare MLP au prezentat coordonare la 6 hpi.hpi.83A:476 și Mandelup la 48 CP/in, aproape toate celelalte puncte de date nu au răspuns.În plus, diferențele în profilurile de expresie ale genelor proteinei asemănătoare SAM22 au urmat variabilitatea observată în rezistența la antracnoză, deoarece liniile mai rezistente au avut mai multe momente de inducere semnificativă a acestor gene decât genele mai susceptibile.O altă genă PR-10 asemănătoare LlR18A/B a arătat un model de expresie foarte similar cu gena proteinei asemănătoare SAM22.
Au fost identificate principalele componente ale termenului procesului biologic „GO:0006952 Defense Response” și modelele de expresie ale genelor candidate ale alelelor Lanr1 și AnMan.Scala Log2 reprezintă valorile log2 (schimbarea orificiilor) între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin, Wizhenica, Polonia, 1999) și plantele martor (inoculate simulat) în același moment.Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunze înguste: 83A:476 (rezistent, purtând alela homozigotă Lanr1), Boregine (rezistent, fundal genetic necunoscut), Mandelup (rezistent moderat, purtând alela homozigotă AnMan) și Populația 22660 (susceptibilă).
În plus, au fost evaluate profilurile de expresie ale genelor candidate ARN-seq Lanr1 (TanjilG_05042) și AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3).Gena TanjilG_05042 a arătat un răspuns semnificativ (activare) la 83A:476 doar la primul punct de timp (6 hpi), în timp ce TanjilG_12861 a fost semnificativ în Mandeloop doar în două momente: 6 hpi (reglare în jos) și 24 hpi (6 hpi).Cu.).reglabil) ).
Cele mai supraexprimate gene în termenul GO:0055114 „proces redox” au fost genele care codifică proteinele citocromului P450 și peroxidaza (Fig. 4).Pentru probele izolate din 83A:476 la 6 HPI, valorile maxime sau minime de log2 (modificare de ori) (pentru 86,6% din gene) au fost observate în general între plantele inoculate și cele martor, evidențiind răspunsul ridicat al acestui genotip la sexul inoculat.83A:476 a arătat cel mai semnificativ GO: 0055114 DEG la 6 hpi (503 gene), în timp ce restul liniilor la 48 hpi (Boregine, 31 gene; Mandelup, 85 gene; și Populația 22660, 78 gene)).În majoritatea genelor din familia GO:0055114, au fost observate două tipuri de răspunsuri la vaccinare (activare și inhibare).Interesant este că până la 97,6% dintre DEG-urile identificate pentru termenul GO: 0055114 în Mandelupe la 48 CP. Aceste observații sugerează că, în ciuda scării semnificativ mai mici (adică, numărul de gene redox mutante, 85 față de 503), modelul de răspunsuri întârziate la transcriptom este similar cu răspunsul timpuriu al mandeloseup3.În Boregine și Populația 22660, această convergență este mai mică la 51,6% și, respectiv, 75,6%.
Au fost dezvăluite modelele de expresie ale principalelor componente ale termenului procesului biologic „GO:0055114 Proces Redox”.Scala Log2 reprezintă valorile log2 (schimbarea orificiilor) între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin, Wizhenica, Polonia, 1999) și plantele martor (inoculate simulat) în același moment.Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunze înguste: 83A:476 (rezistent, purtând alela homozigotă Lanr1), Boregine (rezistent, fundal genetic necunoscut), Mandelup (rezistent moderat, purtând alela homozigotă AnMan) și Populația 22660 (susceptibilă).
83A:476 Răspunsurile transcriptomice la inocularea cu C. lupini (tulpina Col-08) au inclus, de asemenea, tăcere coordonată a genelor atribuite termenului GO:0015979 „fotosinteză” și altor procese biologice înrudite (FIG. 5).Acest set GO:0015979 DEG conținea 105 gene care au fost reprimate semnificativ la 6 hpi la 83A:476.În acest subset, 37 de gene au fost, de asemenea, subreglate în Mandelup la 48 HPI și 35 în același moment în populația de 22660, inclusiv 19 DEG comune ambelor genotipuri.Niciun DEG legat de termenul GO: 0015979 nu a fost activat semnificativ în nicio combinație (linie x timp).
Au fost dezvăluite modelele de expresie ale principalelor componente ale termenului procesului biologic „GO:0015979 Fotosinteza”.Scala Log2 reprezintă valorile log2 (schimbarea orificiilor) între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin, Wizhenica, Polonia, 1999) și plantele martor (inoculate simulat) în același moment.Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunze înguste: 83A:476 (rezistent, purtând alela homozigotă Lanr1), Boregine (rezistent, fundal genetic necunoscut), Mandelup (rezistent moderat, purtând alela homozigotă AnMan) și Populația 22660 (susceptibilă).
Pe baza rezultatelor analizei exprimării diferențiale și probabil implicat în răspunsurile de apărare împotriva ciupercilor patogene, acest set de șapte gene a fost selectat pentru cuantificarea profilurilor de expresie prin PCR în timp real (Tabelul suplimentar S9).
Gena proteică presupusă TanjilG_10657 a fost indusă în mod semnificativ în toate liniile și punctele de timp studiate în comparație cu plantele de control (imite) (Tabelele suplimentare S10, S11).În plus, profilul de expresie al lui TanjilG_10657 a arătat o tendință de creștere pe parcursul experimentului pentru toate liniile.Populația 22660 a arătat cea mai mare sensibilitate a lui TanjilG_10657 la inoculare cu activare de 114 ori și cel mai înalt nivel de expresie relativă (4,4 ± 0,4) la 24 HPI (Fig. 6a).Gena proteinei PR10 LlR18A TanjilG_27015 a arătat, de asemenea, activare pe toate liniile și punctele de timp, cu semnificație statistică la majoritatea punctelor de date (Fig. 6b).Similar cu TanjilG_10657, cel mai înalt nivel de expresie relativă a lui TanjilG_27015 a fost observat în populația de 22660 inoculată la 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gena endochitinazei acide TanjilG_04706 a fost semnificativ suprareglată în toate liniile și în toate momentele, cu excepția Boregine 6 hpi (Fig. 6c).A fost indusă puternic la primul punct de timp (6 HPI) la 83A:476 (de 10,5 ori) și a crescut moderat în alte linii (de 6,6-7,5 ori).În timpul experimentului, expresia TanjilG_04706 a rămas la niveluri similare în 83A:476 și Boregine, în timp ce la Mandelup și Population 22660 a crescut semnificativ, atingând valori relativ mari (5,9 ± 1,5 și, respectiv, 6,2 ± 1,5).Gena asemănătoare endoglucan-1,3-β-glucozidazei TanjilG_23384 a prezentat o activare ridicată în primele două puncte de timp (6 și 12 hpi) în toate liniile, cu excepția populației 22660 (Fig. 6d).Cele mai ridicate niveluri de expresie relativă ale TanjilG_23384 au fost observate la al doilea punct de timp (12 hpi) în Mandelup (2,7 ± 0,3) și 83A: 476 (1,5 ± 0,1).La 24 HPI, expresia TanjilG_23384 a fost relativ scăzută în toate liniile studiate (de la 0,04 ± 0,009 la 0,44 ± 0,12).
Profilele de expresie ale genelor selectate (ag) relevate prin PCR cantitativă.Numerele 6, 12 și 24 reprezintă ore după vaccinare.Genele LanDExH7 și LanTUB6 au fost utilizate pentru normalizare, iar LanTUB6 a fost utilizat pentru calibrarea între serii.Barele de eroare reprezintă abaterea standard bazată pe trei replici biologice, fiecare dintre ele fiind media a trei replici tehnice. Semnificația statistică a diferențelor în nivelurile de expresie între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpină Col-08, obținută în 1999 din câmpul de lupin din Wierzenica, Polonia) și plantele martor (inoculate simulat) sunt marcate deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0.001, *** 0.0. Semnificația statistică a diferențelor în nivelurile de expresie între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpină Col-08, obținută în 1999 din câmpul de lupin din Wierzenica, Polonia) și plantele martor (inoculate simulat) sunt marcate deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0.001, *** 0.0. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, му-внях прессии между инокулированными) 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулирован ными) расод ными) расч мными и данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Diferențele semnificative statistic în nivelurile de expresie între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută în 1999 dintr-un câmp de lupin din Wierzhenice, Polonia) și cele martor (inoculate simulat) sunt notate deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0,0, ≤ 0,0, 0,0, 0,0).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟）模拟掉种拟掉的羽扇豆田获得）水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值.≤ 〼≤ 0,001)接种 (colletotrichum lupini), color-08 株, 1999平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini,м пшытунч, пшлированными олей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированы ными) расимы нымтето мо ными ми данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Diferențele semnificative statistic în nivelurile de expresie între plantele inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin din Verzhenice, Polonia, în 1999) și plantele martor (inoculate simulat) sunt notate deasupra punctelor de date (*valoare P < 0,05, **valoare P ≤ 0,001, ***0-01e, ***0-01).Liniile NLL analizate au fost: 83A:476 (rezistente, purtând alela homozigotă Lanr1), Mandelup (moderat rezistent, purtând alela homozigotă AnMan), Boregine (rezistent, fundal genetic necunoscut) și populația 22660 (susceptibilă).
Gena candidată TanjilG_05042 la locusul Lanr1 a arătat un model de expresie semnificativ diferit de profilurile obținute din studiile ARN-seq (Fig. 6e).Activarea semnificativă a acestei gene a fost observată la Mandelup și populația de 22660 (până la 39,7 și, respectiv, 11,7 ori), rezultând niveluri de expresie relativ ridicate (până la 1,4 ± 0,14 și, respectiv, 7,2 ± 1,3).83A:476 a dezvăluit, de asemenea, o anumită reglare în sus a genei TanjilG_05042 (până la 3,8 ori), cu toate acestea, nivelurile relative de expresie atinse (0,044 ± 0,002) au fost de peste 30 de ori mai mici decât cele observate la Mandelup și populația de 22660.analizate prin qPCR au arătat diferențe semnificative în nivelurile de expresie între genotipuri în variantele simulate vaccinate (de control), atingând o diferență de 58 de ori între populațiile 22660 și 83A:476, precum și între populațiile 22660 și 22660. S-a obținut o diferență de două ori între Boregine și Mandalup.
Gena candidată la locusul AnMan, TanjilG_12861, a fost activată ca răspuns la vaccinare în 83A:476 și Mandelup, a fost neutră în populația 22660 și a fost reglată în jos în Boregine (Fig. 6f).Expresia relativă a genei TanjilG_12861 a fost cea mai mare în 83A inoculat: 476 (0,14±0,01).Gena proteinei de șoc termic de 17,4 kDa clasa I TanjilG_05080 HSP17.4 a arătat niveluri de expresie relativ mai scăzute în toate tulpinile și momentele de timp studiate (Fig. 6g).Cea mai mare valoare a fost observată la 24 HPI în populația de 22660 (0,14 ± 0,02, o creștere de opt ori ca răspuns la vaccinare).
Comparația profilurilor de expresie a genelor (Fig. 7) a relevat o corelație ridicată între TanjilG_10657 și alte patru gene: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80._9) și TanjilG_05042 (r = 0,80._9).Astfel de rezultate pot indica co-reglarea acestor gene în timpul răspunsurilor de apărare.Genele TanjilG_12861 și TanjilG_23384 au prezentat profiluri de expresie diferite cu valori mai mici ale coeficientului de corelație Pearson (de la 0,08 la 0,43 și, respectiv, de la -0,19 la 0,28) în comparație cu alte gene.
Corelațiile dintre profilurile de expresie genică au fost detectate folosind PCR cantitativ.Au fost analizate următoarele linii de lupin cu frunze înguste: 83A:476 (rezistent, purtând alela homozigotă Lanr1), Mandelup (moderat rezistent, purtând alela homozigotă AnMan), Boregine (rezistent, fundal genetic necunoscut) și Populația 22660 (susceptibilă).Au fost calculate trei momente de timp (6, 12 și 24 de ore după inoculare), inclusiv plante inoculate (Colletotrichum lupini, tulpina Col-08, obținută din câmpurile de lupin din Wierzhenice, Polonia, în 1999) și plante martor (inoculate simulat).Scala arată valoarea coeficientului de corelație Pearson.
Pe baza datelor obținute la 6 cai putere pe inch, WGCNA a fost efectuat la 9981 DEG identificate prin compararea plantelor inoculate și de control pentru a se concentra asupra răspunsurilor timpurii de apărare (Tabelul suplimentar S12).Au fost găsite douăzeci și două de module de gene (clustere) cu profiluri de expresie corelate (pozitive sau negative) între genotipuri și variante experimentale. În medie, nivelurile de expresie a genelor au scăzut în ordinea 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 (în ambele variante, totuși, această tendință a fost mai puternică la plantele martor). În medie, nivelurile de expresie a genelor au scăzut în ordinea 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 (în ambele variante, totuși, această tendință a fost mai puternică la plantele martor). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 нденция была сильнее у контрольных растений). În medie, nivelurile de expresie a genelor au scăzut în ordinul 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 (în ambele variante, totuși, această tendință a fost mai puternică la plantele martor).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 的顺序下降（然而，在两缌䜨两罍两罌在势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populație 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 筌 在 筌 ， 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 ция была сильнее у контрольных растений). În medie, nivelurile de expresie a genelor au scăzut în seria 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populația 22660 (cu toate acestea, în ambele variante, această tendință a fost mai puternică la plantele martor).Vaccinarea a dus la reglarea exprimării genelor, în special în modulele 18, 19, 14, 6 și 1 (în ordinea descrescătoare a efectului), reglarea negativă (ex. modulele 9 și 20) sau cu efecte neutre (ex. modulele 11, 22, 8 și 13).Analiza de îmbogățire a termenului GO (Tabelul suplimentar S13) a dezvăluit „GO: 0006952 Răspunsuri de protecție” pentru modulul inoculat (18) cu activare maximă, inclusiv genele analizate prin qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 și cele mai multe fotografii suprimate, precum și cele mai multe, precum și cele mai suprimate în TanjilG_04706) s module (9).Concentratorul modulului 18 (Fig. 8) a fost identificat ca gena TanjilG_26536 care codifică proteina LlR18B asemănătoare PR-10, iar concentratorul modulului 9 a fost identificat ca gena TanjilG_28955 care codifică proteina PsbQ din fotosistemul II.O genă candidată a rezistenței la antracnoză Lanr1, TanjilG_05042, a fost găsită în modulul 22 (Fig. 9) și este asociată cu termenii „GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes” și „GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA Templating” purtând TanjilG_01212 hub.gena codifică factorul de transcripție al stresului termic A-4a (HSFA4a).
Analiza ponderată a rețelei a co-expresiei genetice a modulelor cu termeni de proces biologic suprareprezentați „GO: 0006952 Defense responses”.Ligarea a fost simplificată pentru a evidenția cele patru gene analizate prin qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 și TanjilG_27015).
Analiza de rețea ponderată a co-expresiei genelor a unui modul cu un termen de proces biologic suprareprezentat „GO: 0006355: Reglementare transcripțională, modelare ADN” și care poartă o genă candidată de rezistență la antracnoză Lanr1 TanjilG_05042.Ligarea a fost simplificată pentru a izola gena TanjilG_05042 și gena centrală TanjilG_01212.
Screeningul rezistenței la antracnoză colectat în Australia a arătat că majoritatea soiurilor eliberate timpuriu au fost susceptibile;Kalya, Coromup și Mandelup au fost descrise ca fiind moderat rezistente, în timp ce Wonga, Tanjil și 83A:476 au fost descrise ca fiind foarte rezistente26,27,31.au avut aceeași alelă de rezistență, denumită Lanr1, iar Coromup și Mandelup au avut o alelă diferită, denumită AnMan10, 26, 39, în timp ce Kalya a transmis o alelă diferită., Lanr2.Screeningul pentru rezistența la antracnoză în Germania a dus la identificarea unei linii rezistente Bo7212 cu o alele candidate, alta decât Lanr1, denumită LanrBo36.
Studiul nostru a relevat o frecvență foarte scăzută (aproximativ 6%) a alelei Lanr1 în germoplasma testată.Această observație este în concordanță cu rezultatele screeningului germoplasmei est-europene folosind markerii Anseq3 și Anseq4, care au arătat că alela Lanr1 este prezentă în doar două linii belaruse.Acest lucru sugerează că alela Lanr1 nu este încă utilizată pe scară largă de programele locale de reproducere, spre deosebire de Australia, unde este una dintre alelele cheie pentru reproducerea asistată de markeri.Acest lucru se poate datora nivelului mai scăzut de rezistență oferit de alela Lanr1 în condițiile de câmp european, comparativ cu raportul australian.În plus, studiile asupra antracnozei în zonele cu precipitații mari din Australia au arătat că răspunsurile de rezistență mediate de alela Lanr1 pot să nu fie eficiente în condițiile meteorologice care favorizează creșterea și dezvoltarea rapidă a agentului patogen19,42.De fapt, în studiul de față, unele simptome de antracnoză au fost observate și la genotipurile purtătoare de alela Lanr1, sugerând că rezistența poate dispărea în condiții optime pentru dezvoltarea C. lupini.În plus, sunt posibile interpretări fals pozitive ale prezenței markerilor Anseq3 și Anseq4, care sunt la aproximativ 1 cM de locusul Lanr1 28,30,43.
Studiul nostru a arătat că 83A:476, purtând alela Lanr1, a răspuns la inocularea cu C. lupini cu reprogramarea transcriptomului la scară largă la primul punct de timp analizat (6 hpi), în timp ce în Mandelup, purtând alela AnMan, răspunsurile transcriptomice au fost observate mult mai târziu.(de la 24 la 48 CP).Aceste variații temporale în răspunsurile de apărare sunt asociate cu diferențe în simptomele bolii, subliniind importanța recunoașterii timpurii a patogenului pentru un răspuns de succes la rezistență.Pentru a infecta țesutul vegetal, sporii de antrax trebuie să treacă prin mai multe etape de dezvoltare pe suprafața gazdei, inclusiv germinarea, diviziunea celulară și formarea unui appressorium.Un apendice este o structură infecțioasă care se atașează la suprafața gazdei și facilitează pătrunderea în țesuturile gazdei.Astfel, sporii de C. gloeosporioides din extractul de mazăre au prezentat prima diviziune a nucleului după 75-90 de minute de incubație, formarea unui tub germinativ după 90-120 de minute și suprimarea după 4 ore 45 .Mango C. gloeosporioides a prezentat mai mult de 40% germinare conidiană după 3 ore de incubație și aproximativ 20% formare de apresori după 4 ore.Gena CAP20 asociată virulenței a C. gloeosporioides a arătat activitate transcripțională în conidiile formatoare de epifite după 3,5 ore de incubare în ceară de suprafață de avocado cu concentrații mari de proteină CAP20 după 4 ore și 46 min.În mod similar, activitatea genelor de biosinteză a melaninei în C. trifolii a fost indusă în timpul unei incubații de 2 ore, urmată de formarea unui appressorium după 1 oră.Studiile țesuturilor frunzelor au arătat că căpșunile inoculate cu C. acutatum au prima suprimare la 8 hpi, în timp ce roșiile inoculate cu C. coccodes au prima suprimare la 4 hpi48,49.în mare măsură în concordanță cu scala de timp a Colletotrichum spp.proces infecțios.Răspunsurile rapide de apărare la 83A:476 sugerează implicarea rezistenței plantelor și a genelor de imunitate declanșată de efector (ETI) în această linie, în timp ce răspunsurile întârziate ale lui Mandelup susțin ipoteza 50 a imunității declanșate de model molecular micro-asociat (MTI). Răspunsurile timpurii la 83A: 476 și Mandelup.Suprapunerea parțială între genele reglate în sus sau în jos în răspunsul întârziat susține, de asemenea, acest concept, deoarece ETI este adesea considerat a fi un răspuns MTI accelerat și îmbunătățit care culminează cu moartea celulară programată la locul infecției, cunoscută sub numele de șoc anafilactic 51,52.
Majoritatea genelor atribuite termenului suprareprezentat Gene Ontology GO:0006952 „Răspuns de apărare” sunt cei 11 omologi ai proteinei mesajului de post indus de stres 22 (similar cu SAM22) și a celor șapte proteine ​​asemănătoare principale ale latexului (MLP).proteinele asemănătoare 31, 34, 43 și 423 au prezentat asemănări de secvență.Genele asemănătoare SAM22 au arătat o activare semnificativă care a durat mai mult, arătând niveluri crescute de rezistență la antracnoză (83A:476 și Boregine).Cu toate acestea, genele asemănătoare MLP au fost reglate în jos numai în liniile care poartă alela de rezistență candidată (83A:476/Lanr1 la 6 hpi și Mandelup/AnMan la 24 hpi).Trebuie remarcat faptul că toți omologii de tip SAM22 identificați provin dintr-un grup de gene care se întinde pe aproximativ 105 kb, în ​​timp ce genele asemănătoare MLP provin din regiuni separate ale genomului.Activarea coordonată a unor astfel de gene asemănătoare SAM22 a fost găsită și în studiul nostru anterior al rezistenței NLL la inocularea cu Diaporthetoxica, sugerând că acestea sunt implicate în componentele orizontale ale răspunsului de apărare.Această concluzie este susținută și de rapoartele unui răspuns pozitiv al genelor asemănătoare SAM22 la leziuni sau tratament cu acid salicilic, inductori fungici sau peroxid de hidrogen.
S-a demonstrat că genele asemănătoare MLP răspund la diferite stresuri abiotice și biotice, inclusiv infecții fungice bacteriene, virale și patogene la multe specii de plante55.Direcțiile de răspuns la anumite interacțiuni dintre plante și agenți patogeni au variat de la creștere puternică (adică, în timpul infestării bumbacului cu Verticillium dahliae) până la descreștere semnificativă (adică după infectarea mărului cu Alternaria spp.)56,57.S-a observat o reducere semnificativă a genei 423 asemănătoare MLP în timpul apărării avocado la infecția cu F. niger și în timpul infecției mărului Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola și Alternaria alternata sunt patotipuri ale mărului58,59.În plus, calii de măr care supraexprimă gena 423 asemănătoare MLP au avut o expresie mai scăzută a genelor asociate rezistenței și au fost mai susceptibili la infecția fungică59.După Fusarium oxysporum f, gena 423 asemănătoare MLP a fost de asemenea suprimată în germoplasma de fasole comună rezistentă.cn.Infecția fasolei 60.
Alți membri ai familiei PR-10 identificați în studiul nostru ARN-seq au fost genele LlR18A și LlR18B ca răspuns la reglarea în sus, precum și gena reglată în sus (1 genă) sau reglată în jos (3 gene) pentru proteina de transfer de lipide DIR1..În plus, WGCNA evidențiază gena LlR18B ca un hub în acest modul, care este foarte susceptibil la vaccinare și poartă mai multe gene de răspuns de protecție.Genele LlR18A și LlR18B au fost induse în frunzele de lupin galben ca răspuns la bacteriile patogene, precum și în tulpinile NLL după inocularea cu D. toxica, în timp ce omologul de orez al acestor gene, RSOsPR10, a fost indus rapid de o infecție fungică probabil implicată în calea de semnalizare a acidului iasmonic, calea nespecifică de transport al proteinei D.1623. s care sunt necesare pentru apariția rezistenței sistemice dobândite (SAR).Odată cu dezvoltarea reacțiilor de protecție, proteina DIR1 este transportată din focarul infecției prin floem pentru a induce SAR în organe îndepărtate.Interesant este că gena TanjilG_02313 DIR1 a fost indusă în mod semnificativ la primul punct de timp în liniile 84A:476 și Populația 22660, dar rezistența la antracnoză s-a dezvoltat cu succes numai în linia 84A:476.Acest lucru poate indica o oarecare subfuncționalizare a genei DIR1 în NLL, deoarece restul de trei omologi au răspuns la inoculare numai în linia 83A:476 la 6 hpi, iar acest răspuns a fost îndreptat în jos.
În studiul nostru, cele mai comune componente corespunzătoare procesului biologic numit „procesul Redox GO:0055114” au fost proteina citocromului P450, peroxidaza, acid linoleic 9S-/13S-lipoxigenaza și 1-aminociclopropan-1-carboxilic oxidaza.În plus, WGCNA nostru definește omologul HSFA4a ca un hub care transportă module precum candidatul genei de rezistență Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a este o componentă a reglării dependente de redox a transcripției nucleare în plante.
Proteinele citocromului P450 sunt oxidoreductaze care catalizează reacțiile de hidroxilare dependente de NADPH și/sau O2 în metabolismul primar și secundar, inclusiv metabolismul xenobioticelor, precum și hormoni, acizi grași, steroli, componente ale peretelui celular, biopolimeri și biosinteza de protecție a compușilor în studiul nostru a fost redusă. d de la -10,6 log2 (modificare de ori) la 5,7 datorită unui număr mare de omologi modificați (37) și diferențelor în modelele de răspuns între gene specifice, reflectând o revizuire în sus..Utilizarea numai a datelor ARN-seq pentru a elucida funcția biologică presupusă a genelor NLL într-o superfamilie de proteine ​​atât de mare ar fi foarte speculativă.Cu toate acestea, este de remarcat faptul că unele gene ale citocromului P450 sunt asociate cu rezistență crescută la ciuperci sau bacterii patogene, inclusiv o contribuție la reacțiile alergice69,70,71.
Peroxidazele de clasa III sunt enzime multifuncționale ale plantelor implicate într-o gamă largă de procese metabolice în timpul creșterii și dezvoltării plantelor, precum și ca răspuns la stresul mediului, cum ar fi salinitatea, seceta, intensitatea ridicată a luminii și atacul patogenului72.Peroxidazele sunt implicate în interacțiunea mai multor specii de plante cu Anthracis, printre care Stylosanthes humilis și C. gloeosporioides, Lens culinaris și C. truncatum, Phaseolus vulgaris și C. lindemuthianum, Cucumis sativus și C. lagenarium73,74,75,76.Răspunsul este foarte rapid, uneori chiar la 4 HPI, înainte ca ciuperca să pătrundă în țesutul plantei73.Gena peroxidazei a răspuns, de asemenea, la inocularea cu D. toxica NLL.În plus față de funcțiile lor tipice de reglare a exploziei oxidative sau de eliminare a stresului oxidativ, peroxidazele pot interfera cu creșterea patogenului prin crearea de bariere fizice bazate pe întărirea peretelui celular în timpul lignificării, subunității sau reticulare a unor compuși specifici.Această funcție poate fi atribuită in silico genei TanjilG_03329 care codifică o presupusă peroxidază anionică care formează lignină care a fost reglată semnificativ în studiul nostru în linia rezistentă 83A:476 la 6 HPI, dar nu și în alte tulpini și momente de timp care nu au răspuns.
9S-/13S-lipoxigenaza acidului linoleic este primul pas în calea oxidativă a biosintezei lipidelor78.Produsele acestei căi au funcții multiple în apărarea plantelor, inclusiv întărirea peretelui celular prin formarea depozitelor de caloză și pectină și reglarea stresului oxidativ prin producerea de specii reactive de oxigen79,80,81,82,83.În studiul de față, expresia acidului linoleic 9S-/13S-lipoxigenazei a fost modificată la toate tulpinile, dar la populația susceptibilă 22660, reglarea ascendentă a prevalat în diferite momente, în timp ce la tulpinile care poartă Lanr1 rezistentă și alela AnMan, ea subliniază diversificarea stratului de oxilipină dintre aceste reacții de genotipuri protectoare.
Omologul 1-aminociclopropan-1-carboxilat oxidază (ACO) a fost semnificativ suprareglat (9 gene) sau subreglat (2 gene) atunci când a fost inoculat cu lupin.Cu două excepții, toate aceste răspunsuri au avut loc la 6 CP.la 83A:476.Reacția enzimatică mediată de proteinele ACO este etapa de limitare a vitezei în producția de etilenă și, prin urmare, este foarte reglementată84.Etilena este un hormon vegetal care joacă o varietate de roluri în reglarea dezvoltării plantelor și a răspunsului la condițiile de stres abiotic și biotic.Inducerea transcripției ACO și activarea căii de semnalizare a etilenei sunt implicate în creșterea rezistenței orezului la ciuperca hemibiotrofă oryzae oryzae prin reglarea producției de specii reactive de oxigen și fitoalexine.Un proces de infecție a frunzelor foarte similar găsit între M. oryzae și C. lupini88,89, pe fundalul unei reglări semnificative a omologilor ACO în linia 83A:476 raportată în acest studiu, schimbă posibilitatea de a conferi rezistență la antracnoza NLL Etilena o etapă centrală de semnalizare în căile moleculare.
În studiul de față, suprimarea pe scară largă a multor gene asociate cu fotosinteza a fost observată la 6 hpi în 83A:476 și la 48 hpi în Mandeloop și populația de 22660.Amploarea și progresul acestor modificări este proporțională cu nivelul.Rezistența la antracnoză a fost observată în acest experiment.Recent, reprimarea puternică și timpurie a transcrierilor legate de fotosinteză a fost raportată în mai multe modele de interacțiuni plantă-patogen, inclusiv bacterii și ciuperci patogene.Graba (de la 2 HPI în unele interacțiuni) și suprimarea globală a genelor asociate cu fotosinteza ca răspuns la infecție pot declanșa imunitatea plantelor pe baza desfășurării speciilor reactive de oxigen și a interacțiunii lor cu calea acidului salicilic pentru a media reacțiile alergice 90,94.
În concluzie, mecanismele de răspuns de apărare propuse pentru cea mai rezistentă descendență (83A:476) includ recunoașterea rapidă a patogenului de către gena R (probabil TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) și semnalizarea acidului salicilic și etilenă mediată de răspunsul alergic, urmată de stabilirea SAR pe distanță lungă.acțiunea este susținută de proteina DIR-1.De remarcat faptul că perioada biotrofică pentru infecția cu C. lupini este foarte scurtă (aproximativ 2 zile), urmată de creșterea necrotică95.Tranziția dintre aceste etape poate fi asociată cu necroza și expresia proteinelor inductibile de etilenă care acționează ca declanșatori pentru reacțiile de hipersensibilitate la plantele gazdă.Prin urmare, fereastra de timp pentru capturarea cu succes a C. lupini în stadiul biotrofic este foarte îngustă.Reprogramarea genelor asociate cu redox și fotosinteză observată în 83A:476 la 6 hpi este în concordanță cu progresia hifelor fungice și anunță dezvoltarea unui răspuns protector de succes în stadiul biotrofic.Răspunsurile transcriptomice ale Mandelup și populația 22660 pot fi prea întârziate pentru a captura ciuperca înainte de a trece la creșterea necrotică, cu toate acestea, Mandelup poate fi mai eficient decât populația 22660, deoarece reglarea relativ rapidă a proteinei PR-10 promovează rezistența orizontală.
ETI, condusă de gena canonică R, pare a fi un mecanism comun pentru rezistența fasolei la antracnoză.Astfel, în leguminoasul model Medicago truncatula, rezistența la antracnoză este conferită de gena RCT1, membră a clasei de gene R a plantei TIR-NBS-LRR97.Această genă conferă, de asemenea, rezistență la antracnoză cu spectru larg la lucernă atunci când este transferată la plante susceptibile.La fasolea comună (P. vulgaris), au fost identificate până în prezent mai mult de două duzini de gene de rezistență la antracnoză.Unele dintre aceste gene se găsesc în regiuni fără gene R canonice, cu toate acestea multe altele sunt situate la marginile cromozomilor care poartă grupul de gene NBS-LRR, inclusiv TIR-NBS-LRRs99.Studiul SSR la nivelul genomului a confirmat, de asemenea, asocierea genei NBS-LRR cu rezistența la antracnoză la fasolea comună.Gena R canonică a fost găsită, de asemenea, în regiunea genomică care poartă locusul major de rezistență la antracnoză în lupinul alb 101.
Lucrările noastre arată că o reacție de rezistență imediată, activată într-un stadiu incipient al infecției plantei (de preferință nu mai târziu de 12 hpi), protejează eficient lupinul cu frunze înguste de antracnoza cauzată de ciuperca patogenă Collelotrichum lupini.Folosind secvențierea cu randament ridicat, am demonstrat profiluri de expresie diferențială ale genelor de rezistență la antracnoză în plante NLL mediate de genele de rezistență Lanr1 și AnMan.Apărarea de succes implică proiectarea cu atenție a genelor pentru proteinele implicate în redox, fotosinteză și patogeneză în câteva ore de la primul contact al plantei cu un agent patogen.Reacții de protecție similare, dar întârziate în timp, sunt mult mai puțin eficiente în protejarea plantelor de boli.Rezistența la antrax mediată de gena Lanr1 seamănă cu răspunsul rapid tipic al genei R (imunitate declanșată de efect), în timp ce gena AnMan oferă cel mai probabil un răspuns orizontal (imunitate declanșată de un model molecular asociat microbilor), oferind un nivel moderat de durabilitate.
Cele 215 de linii NLL utilizate pentru a depista markerii de antracnoză au constat din 74 de soiuri, 60 de linii obținute prin încrucișare sau reproducere, 5 mutanți și 76 de germoplasme sălbatice sau originale.Liniile au venit din 17 țări, în principal din Polonia (58), Spania (47), Germania (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Italia (5) și alte linii.din 10 tari.Setul include, de asemenea, linii rezistente de referință: 83A:476, Tanjil, Wonga purtând alela Lanr1 și Mandelup purtând alela AnMan.Liniile au fost obținute din Baza de date privind resursele genetice ale lupinilor europene menținută de Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Tabelul suplimentar S1).
Plantele au fost cultivate in conditii controlate (fotoperioada 16 ore, temperatura 25°C ziua si 18°C ​​noaptea).Au fost analizate două replici biologice.ADN-ul a fost izolat din frunze vechi de trei săptămâni folosind DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) conform protocolului.Calitatea și concentrația ADN-ului izolat au fost evaluate prin metode spectrofotometrice (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA).Markerul AnManM1 care marchează gena de rezistență la antracnoză AnMan (derivată din cv. Mandelup) și markerii Anseq3 și Anseq4 care flanchează gena Lanr1 (derivată din cv. Tanjil) au fost analizați 11,26,28.Homozigoții pentru alela rezistentă au fost notați ca „1″, susceptibili – ca „0” și heterozigoții – ca 0,5.
Pe baza rezultatelor screening-ului pentru markerii AnManM1, AnSeq3 și AnSeq4 și a disponibilității semințelor pentru experimentele finale de urmărire, au fost selectate 50 de linii NLL pentru fenotiparea rezistenței la antracnoză.Analiza a fost efectuată în dublu exemplar într-o seră controlată de computer cu o fotoperioadă de 14 ore cu un interval de temperatură de 22°C ziua și 19°C noaptea.Semințele sunt zgâriate (tăiând învelișul semințelor de pe partea opusă a embrionului cu o lamă ascuțită) înainte de însămânțare pentru a preveni repausul semințelor din cauza învelișului semințelor fiind prea dur și pentru a asigura o germinare uniformă.Plantele au fost cultivate în ghivece (11 × 11 × 21 cm) cu pământ steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varșovia, Polonia).Inocularea a fost efectuată cu tulpina Colletotrichum lupini Col-08, crescută în 1999 din tulpinile plantelor de lupin cu frunze înguste cultivate într-un câmp din Verjnița, Polonia Mare (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Obțineți o zonă.Izolatele au fost cultivate în mediu SNA la 20°C sub lumină neagră timp de 21 de zile pentru a induce sporularea.La patru săptămâni de la însămânțare, când plantele ajunseseră la stadiul de 4-6 frunze, inocularea s-a efectuat prin pulverizare cu o suspensie de conidii la o concentrație de 0,5 x 106 conidii per ml.După inoculare, plantele au fost ținute la întuneric timp de 24 de ore la o umiditate de aproximativ 98% și o temperatură de 25°C pentru a facilita germinarea conidiilor și procesul de infecție.Plantele au fost apoi crescute sub o fotoperioadă de 14 ore la 22°C zi/19°C noaptea și 70% umiditate.Scorul bolii a fost făcut la 22 de zile după inoculare și a variat de la 0 (imun) la 9 (foarte susceptibil) în funcție de prezența sau absența leziunilor necrotice pe tulpini și frunze.În plus, după punctare, s-a măsurat greutatea plantelor.Relațiile dintre genotipurile markerilor și fenotipurile bolii au fost calculate ca corelații punctuale cu două secvențe (absența markerilor heterozigoți în setul de linii pentru analiza fenotipului de rezistență la antracnoză).