Благодарим вас за посещение Nature.com. Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для получения наилучших результатов мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Морфогенез кишечника человека устанавливает крипто-ворсинчатые особенности трехмерной эпителиальной микроархитектуры и пространственной организации. Эта уникальная структура необходима для поддержания гомеостаза кишечника путем защиты ниши стволовых клеток в базальной крипте от экзогенных микробных антигенов и их метаболитов. Кроме того, кишечные ворсинки и секретирующая слизь представляют собой функционально дифференцированные эпителиальные клетки с защитным барьером на поверхности слизистой оболочки кишечника. имеет решающее значение для построения моделей кишечника in vitro. Примечательно, что органический миметик «кишка на чипе» может вызывать спонтанный трехмерный морфогенез кишечного эпителия с улучшенными физиологическими функциями и биомеханикой. Здесь мы предоставляем воспроизводимый протокол для надежной индукции морфогенеза кишечника в кишечнике на микрожидкостном чипе, а также во встроенном гибридном чипе Transwell. Мы подробно описываем методы изготовления устройств, культивирования Caco-2 или кишечных органоидных эпителиальных клеток в обычных условиях, а также на микрожидкостной платформе, индукция 3D-морфогенеза и характеристика установленного 3D-эпителия с использованием нескольких методов визуализации. Этот протокол обеспечивает регенерацию функциональной микроархитектоники кишечника путем контроля базолатерального потока жидкости в течение 5 дней. для биомедицинского исследовательского сообщества, предоставляя метод регенерации трехмерных эпителиальных слоев кишечника in vitro для биомедицинских, клинических и фармацевтических применений.
Эксперименты демонстрируют, что эпителиальные клетки кишечника Caco-2, культивируемые в микрофлюидных устройствах типа «кишка на чипе»1,2,3,4,5 или двухслойных микрожидкостных устройствах6,7, могут подвергаться спонтанному трехмерному морфогенезу in vitro без четкого понимания лежащего в основе механизма. co-2 и кишечные органоиды пациента.Были подтверждены эпителиальные клетки. В этом исследовании мы специально сосредоточились на продукции клеток и распределении концентрации мощного антагониста Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), в «кишечнике-на-чипе» и модифицированных микрожидкостных устройствах, содержащих вставки Transwell, называемых «гибридными чипами». , или Soggy-1) в кишечнике на чипе ингибирует морфогенез или разрушает предварительно структурированный трехмерный эпителиальный слой, предполагая, что антагонистический стресс во время культивирования отвечает за морфогенез кишечника in vitro. a-чиповые платформы) или диффузионные. Базолатеральные среды (например, из вставок Transwell в большие базолатеральные резервуары в скважинах).
В этом протоколе мы предоставляем подробный метод изготовления микроустройств «кишка на чипе» и гибридных чипов, вставляемых в Transwell (шаги 1–5), для культивирования эпителиальных клеток кишечника на пористых мембранах на основе полидиметилсилоксана (PDMS) (шаги 6A, 7A, 8, 9) или полиэфирных мембран вставок Transwell (шаги 6B, 7B, 8, 9) и индуцированного 3D морфогенеза in vi tro (шаг 10). Мы также определили клеточные и молекулярные особенности, свидетельствующие о тканеспецифическом гистогенезе и зависимой от линии клеточной дифференцировке, применяя несколько методов визуализации (шаги 11-24). Мы индуцируем морфогенез с использованием эпителиальных клеток кишечника человека, таких как Caco-2 или кишечные органоиды, в двух культуральных форматах с техническими деталями, включая поверхностную модификацию пористых мембран, создание 2D-монослоев, а также кишечные биохимические и биомеханические микроокружения. in vitro. Чтобы индуцировать 3D-морфогенез из 2D-эпителиальных монослоев, мы удалили антагонисты морфогена в обеих культивируемых формах путем подачи среды в базолатеральный компартмент культуры. барьерная дисфункция и терапия на основе пробиотиков Пример.
Наш протокол может быть полезен широкому кругу ученых в области фундаментальных (например, биологии слизистой оболочки кишечника, биологии стволовых клеток и биологии развития) и прикладных исследований (например, доклинические испытания лекарств, моделирование заболеваний, тканевая инженерия и гастроэнтерология). Благодаря воспроизводимости и надежности нашего протокола для индукции трехмерного морфогенеза кишечного эпителия in vitro мы предполагаем, что наша техническая стратегия может быть распространена среди аудитории, изучающей динамику клеточного сигнала. ing во время развития, регенерации или гомеостаза кишечника. Кроме того, наш протокол полезен для изучения инфекции, вызванной различными инфекционными агентами, такими как Norovirus 8, тяжелый острый респираторный синдром Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 или Vibrio cholerae.Аудитории патологии и патогенеза заболеваний также полезны. Использование системы микрофизиологии кишечника на чипе может позволить продольное совместное культивирование 10 и последующую оценку защиты хозяина, иммунных реакций и восстановления, связанного с патогенами в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) 11. Другие расстройства желудочно-кишечного тракта, связанные с синдромом повышенной кишечной проницаемости, глютеновой болезнью, болезнью Крона, язвенным колитом, резервуарным илеитом или синдромом раздраженного кишечника могут быть смоделированы, когда 3D кишечный эпителий может быть смоделирован слои подготовлены с использованием трехмерных эпителиальных слоев кишечника пациента. Эти заболевания включают атрофию ворсинок, укорочение крипт, повреждение слизистой оболочки или нарушение эпителиального барьера. Биопсия или кишечные органоиды, полученные из стволовых клеток12,13. очертания.тканеспецифические иммунные клетки, 5.
Поскольку трехмерная микроструктура эпителия может быть зафиксирована и визуализирована без процесса секционирования, зрители, работающие с пространственной транскриптомикой и визуализацией с высоким или сверхвысоким разрешением, могут быть заинтересованы в нашем картировании пространственно-временной динамики генов и белков в эпителиальных нишах.Заинтересован в технологии. Реакция на микробные или иммунные стимулы. Кроме того, продольные перекрестные помехи между хозяином и микробиомом 10, 14, которые координируют гомеостаз кишечника, могут быть установлены в трехмерном слое слизистой оболочки кишечника путем совместного культивирования различных микробных видов, микробных сообществ или фекальной микробиоты, особенно в кишечнике на чипе.на платформе. Этот подход особенно привлекателен для аудитории, изучающей иммунологию слизистых оболочек, гастроэнтерологию, микробиом человека, культуромику и клиническую микробиологию, стремящихся культивировать ранее некультивируемую кишечную микробиоту в лаборатории. , биомедицинские или высокопроизводительные платформы для скрининга или валидации для пищевой промышленности. В качестве подтверждения принципа мы недавно продемонстрировали осуществимость мультиплексной высокопроизводительной системы морфогенеза, масштабируемой до формата 24-луночных планшетов. правительственные и регулирующие органы для понимания клеточного перепрограммирования морфогенеза кишечника in vitro на транскриптомном уровне для тестирования лекарств или биотерапевтических средств. Поглощение и транспорт кандидатов в лекарства оценивали с использованием 3D-суррогатов кишечника или с использованием нестандартных или коммерческих моделей органов на чипе для оценки воспроизводимости процесса морфогенеза кишечника.
Для изучения морфогенеза кишечного эпителия использовалось ограниченное количество экспериментальных моделей, относящихся к человеку, в основном из-за отсутствия реализуемых протоколов для индукции 3D-морфогенеза in vitro. Фактически, большая часть современных знаний о морфогенезе кишечника основана на исследованиях на животных (например, рыбках данио20, мышах21 или цыплятах22). .Эти модели также очень ограничены в своих возможностях для тестирования в многостороннем масштабируемом режиме. Таким образом, наш протокол для регенерации 3D-структур тканей in vitro превосходит модели животных in vivo, а также другие традиционные статические 2D-модели клеточных культур. может предоставить пространство для изучения того, как микробные клетки конкурируют за формирование пространственных ниш и экологическую эволюцию в ответ на факторы хозяина (например, внутренние и внешние слои слизи, секрецию IgA и противомикробных пептидов). особенности могут быть продемонстрированы только тогда, когда 3D эпителиальные слои установлены in vitro.
В дополнение к нашему методу создания 3D-структур кишечного эпителия, существует несколько методов in vitro. Культура кишечных органоидов — это современный метод тканевой инженерии, основанный на культивировании кишечных стволовых клеток в определенных условиях морфогена [23, 24, 25]. микробных клеток или экзогенных антигенов ограничено.Доступ к просветам органоидов можно улучшить с помощью микроинъектора,26,27 но этот метод является инвазивным и трудоемким и требует специальных знаний для выполнения.
В других подходах, используемых несколькими исследовательскими группами, используются предварительно структурированные каркасы из 3D-гидрогеля для имитации структуры эпителия кишечника путем культивирования изолированных клеток кишечника человека на поверхности геля. Изготовление каркасов из гидрогеля с использованием 3D-печатных, микрофрезерованных или литографически изготовленных форм. риальные перекрестные помехи за счет включения стромальных клеток в каркас. Однако природа предварительно структурированных каркасов может препятствовать проявлению самого спонтанного морфогенетического процесса. Эти модели также не обеспечивают динамического просветного или интерстициального потока, в них отсутствует напряжение сдвига жидкости, которое необходимо кишечным клеткам для морфогенеза и обретения физиологических функций. Следуйте вытравленным образцам для формирования кишечных трубчатых структур, а поток внутрипросветной жидкости можно воспроизвести с помощью модуля микрофлюидики. Однако эта модель не демонстрирует спонтанных морфогенетических процессов и не включает механобиологические движения кишечника. Методы 3D-печати из той же группы позволили создать миниатюрные кишечные трубки со спонтанными морфогенетическими процессами. особенно после завершения процесса биопечати, возмущающие экспериментальные условия или межклеточные взаимодействия. Вместо этого предлагаемый нами протокол обеспечивает спонтанный морфогенез кишечника, физиологически значимое напряжение сдвига, биомеханику, имитирующую подвижность кишечника, доступность независимых апикальных и базолатеральных отсеков и воссоздание сложных биологических микросред модульности. Таким образом, наш протокол морфогенеза in vitro 3D может обеспечить дополнительный подход для преодоления проблем существующих методов.
Наш протокол полностью ориентирован на трехмерный эпителиальный морфогенез, при этом в культуре находятся только эпителиальные клетки и отсутствуют другие типы окружающих клеток, таких как мезенхимальные клетки, эндотелиальные клетки и иммунные клетки. Нам предстоит воссоздать волнистый трехмерный эпителиальный слой, дополнительные биологические сложности, такие как эпителиально-мезенхимальные взаимодействия 33, 34, отложение внеклеточного матрикса (ECM) 35 и, в нашей модели, особенности крипт-ворсинок, которые передают ниши стволовых клеток в базальных криптах, еще предстоит рассмотреть. vivo35,37,38. Добавление мезенхимальных клеток к нашей модели усилило морфогенетический процесс и эффективность прикрепления клеток. Эндотелиальный слой (то есть капиллярный или лимфатический) играет важную роль в регуляции молекулярного транспорта39 и рекрутирования иммунных клеток40 в микроокружении кишечника. для моделирования более точных физиологических особенностей с разрешением на уровне органов. Иммунные клетки, полученные от пациентов, также необходимы для отображения врожденных иммунных ответов, презентации антигена, врожденных адаптивных иммунных перекрестных помех и тканеспецифического иммунитета в контексте имитации кишечного заболевания.
Использование гибридных чипов более прямолинейно, чем кишка на чипе, потому что установка устройства проще, а использование вставок Transwell позволяет масштабировать культуру эпителия кишечника. Однако имеющиеся в продаже вставки Transwell с полиэфирными мембранами неэластичны и не могут имитировать перистальтические движения. обеспечить долгосрочное совместное бактериальное культивирование в гибридных чипах. Хотя мы можем надежно индуцировать трехмерный морфогенез во вставках Transwell при использовании гибридных чипов, нехватка физиологически значимой биомеханики и апикального потока жидкости может ограничить возможность использования платформ гибридных чипов для потенциальных приложений.
Полномасштабные реконструкции оси крипта-ворсинка человека в культурах «кишка-на-чипе» и «гибрид-на-чипе» полностью не установлены. Поскольку морфогенез начинается с эпителиального монослоя, трехмерные микроархитектуры не обязательно обеспечивают морфологическое сходство с криптами in vivo. не были четко разграничены. Хотя более высокие верхние каналы на чипе приводят к увеличению высоты микроинженерного эпителия, максимальная высота все еще ограничена ~ 300–400 мкм. Фактическая глубина кишечных крипт человека в тонком и толстом кишечнике составляет ~ 135 мкм и ~ 400 мкм соответственно, а высота ворсинок тонкого кишечника составляет ~ 600 мкм41.
С точки зрения визуализации, визуализация трехмерных микроархитектур со сверхвысоким разрешением in situ может быть ограничена кишечником на чипе, поскольку требуемое рабочее расстояние от линзы объектива до эпителиального слоя составляет порядка нескольких миллиметров. Чтобы решить эту проблему, может потребоваться удаленный объектив. каждого слоя чрезвычайно сложно открыть или удалить верхний слой для изучения структуры поверхности эпителиального слоя. Например, с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).
Гидрофобность ПДМС была ограничивающим фактором в микрофлюидных исследованиях, связанных с гидрофобными малыми молекулами, поскольку ПДМС может неспецифически адсорбировать такие гидрофобные молекулы. Альтернативы ПДМС могут быть рассмотрены с другими полимерными материалами. В качестве альтернативы можно рассмотреть поверхностную модификацию ПДМС (например, покрытие липофильными материалами 42 или полиэтиленгликолем 43) для минимизации адсорбции гидрофобных молекул.
Наконец, наш метод не был хорошо охарактеризован с точки зрения обеспечения высокопроизводительного скрининга или удобной для пользователя экспериментальной платформы «один размер подходит всем». Текущий протокол требует наличия шприцевого насоса на каждое микроустройство, что занимает место в инкубаторе CO2 и препятствует проведению крупномасштабных экспериментов. латеральные медии).
Чтобы вызвать трехмерный морфогенез эпителия кишечника человека in vitro, мы использовали кишечное устройство с микрофлюидным чипом, содержащее два параллельных микроканала и эластичную пористую мембрану между ними для создания просветно-капиллярного интерфейса. Мы также демонстрируем использование одноканального микрожидкостного устройства (гибридного чипа), которое обеспечивает непрерывный базолатеральный поток под поляризованными слоями эпителия, выращенными на вставках Transwell. На обеих платформах можно продемонстрировать морфогенез различных клеток эпителия кишечника человека. путем применения направленного манипулирования потоком для удаления антагонистов морфогена из базолатерального компартмента. Вся экспериментальная процедура (рис. 1) состоит из пяти частей: (i) микроизготовление кишечного чипа или вставляемого гибридного чипа Transwell (шаги 1-5; вставка 1), (ii) подготовка клеток кишечного эпителия (клетки Caco-2) или кишечных органоидов человека;вставки 2–5), (iii) культивирование эпителиальных клеток кишечника на кишечных чипах или гибридных чипах (этапы 6–9), (iv) индукция 3D-морфогенеза in vitro (этап 10) и (v)) для характеристики микроструктуры 3D-эпителия (этапы 11–24). генезиса к пространственному, временному, условному или процедурному контролю.
Мы использовали две разные культуральные платформы: кишечник на чипе с прямыми каналами или нелинейными извилистыми каналами или гибридные чипы, содержащие вставки Transwell (TW) в микрофлюидном устройстве, изготовленном, как описано в вставке 1, и шаг 1-5. «Изготовление устройства» показывает основные этапы изготовления одного чипа или гибридного чипа. vitro morphogenesis» показаны общие этапы, на которых Caco-2 или эпителиальные клетки органоидного происхождения культивируются на кишечном чипе или на вставках Transwell гибридного чипа с последующей индукцией трехмерного морфогенеза и формированием охарактеризованной эпителиальной структуры. Номер шага программы или номер поля отображается под каждой стрелкой. Иммунофлуоресцентные изображения в разделе «Дифференциация клеток», показывающие ядра, F-актин и MUC2, экспрессированные в трехмерном эпителиальном слое Caco-2, созданном на чипе кишечника. Передача сигналов MUC2 присутствует в бокаловидных клетках и слизи, выделяемой с поверхности слизистой оболочки. зародышевый агглютинин. На двух перекрывающихся изображениях в «совместных культурах микробов-хозяев» показаны репрезентативные совместные культуры микробиомов-хозяев в кишечнике на чипе. флуоресцентное окрашивание F-актином (красный) и ядрами (синий). Моделирование заболевания иллюстрирует здоровую и протекающую кишку в чипах воспаления кишечника при физиологической нагрузке бактериальными антигенами (например, липополисахаридом, LPS) и иммунными клетками (например, PBMC;зеленый). Клетки Caco-2 культивировали для создания трехмерного эпителиального слоя. Масштабная линейка, 50 мкм. Изображения в нижнем ряду: «Дифференциация клеток» адаптирована с разрешения из ссылки. 2.Издательство Оксфордского университета;Воспроизведено с разрешения из Ref.5.NAS;«Совместная культура хозяина и микроба» адаптирована с разрешения ссылки 3.NAS;«Моделирование болезни» адаптировано с разрешения ссылки.5.НАС.
Как «внутренняя оболочка на кристалле», так и гибридные чипы были изготовлены с использованием реплик PDMS, которые были извлечены из кремниевых форм с помощью мягкой литографии1,44 и сформированы с помощью SU-8. Конструкция микроканалов в каждом чипе определяется с учетом гидродинамики, такой как напряжение сдвига и гидродинамическое давление1,4,12. сложная кишка на чипе (расширенные данные, рис. 1b), которая включает пару изогнутых микроканалов, вызывающих увеличение времени пребывания жидкости, нелинейный характер потока и многоосную деформацию культивируемых клеток (рис. 2a–f). 12. Когда необходимо воссоздать более сложную биомеханику кишечника, можно выбрать сложную кишку на чипе. аналогичная степень эпителиального роста по сравнению с исходным Gut-Chip, независимо от типа культивируемых клеток. Следовательно, для индукции трехмерного морфогенеза линейные и сложные конструкции кишечника на чипе взаимозаменяемы. Реплики PDMS, отвержденные на силиконовых формах с узорами SU-8, давали отрицательные черты после извлечения из формы (рис.2a). Для изготовления кишки на чипе подготовленный верхний слой PDMS был последовательно соединен с пористой пленкой PDMS, а затем совмещен с нижним слоем PDMS путем необратимого связывания с использованием устройства для обработки коронным разрядом (рис. 2b–f). процесс выполняется путем обработки поверхностей реплики PDMS и стекла с помощью кислородной плазмы или обработки коронным разрядом. После стерилизации микроизготовленного устройства, прикрепленного к силиконовой трубке, установка устройства была готова для выполнения трехмерного морфогенеза кишечного эпителия (рис. 2g).
а, Схематическая иллюстрация подготовки деталей из ПДМС из силиконовых форм с рисунком СУ-8. Неотвержденный раствор ПДМС заливали в силиконовую форму (слева), отверждали при 60 °C (в центре) и извлекали из формы (справа). Извлеченный из формы ПДМС разрезали на части и очищали для дальнейшего использования. б, Фотография силиконовой формы, использованной для подготовки верхнего слоя ПДМС. фотографии верхнего и нижнего компонентов PDMS и собранного внутричипового кишечного устройства.e, Схема выравнивания верхнего, мембранного и нижнего компонентов PDMS. Каждый слой необратимо связан с помощью плазмы или коронного разряда.f, Схема изготовленного устройства «кишка-на-чипе» с наложенными извилистыми микроканалами и вакуумными камерами.g, Установка кишки-на-чипе для микрофлюидной клеточной культуры. и шприц был помещен на покровное стекло. Устройство с чипом было помещено на крышку чашки Петри диаметром 150 мм для обработки. Связующее вещество используется для закрытия силиконовой трубки. h, Визуальные снимки изготовления гибридных чипов и трехмерного морфогенеза с использованием гибридных чипов. Вставки Transwell, приготовленные независимо для культивирования 2D-монослоев эпителиальных клеток кишечника, были вставлены в гибридный чип для индукции 3D-морфогенеза кишечника. Среда перфузируется через микроканалы под слоем клеток, установленным на вставке Transwell. .Шкала, 1 см.ч Перепечатано с разрешения из ссылки.4.Эльзевир.
В этом протоколе в качестве источников эпителия использовали клеточную линию Caco-2 и кишечные органоиды (рис. 3a). Оба типа клеток культивировали независимо (бокс 2 и бокс 5) и использовали для посева микроканалов, покрытых ECM, микроканалов кишечника на чипе или вставок Transwell. собирали для приготовления диссоциированных клеточных суспензий с помощью жидкости для трипсинизации (бокс 2). Кишечные органоиды человека из биопсий кишечника или хирургических резекций культивировали в матригельных каркасных куполах в 24-луночных планшетах для поддержания структурного микроокружения. мкм в диаметре. Полностью выращенные органоиды собирают и диссоциируют на отдельные клетки для посева в кишечник или вставки Transwell на чипе (вставка 5). Как мы сообщали ранее, их можно дифференцировать в зависимости от типа заболевания12,13 (например, язвенный колит, болезнь Крона, колоректальный рак или нормальный донор), места поражения (например, поражение или неповрежденная область) и расположения в желудочно-кишечном тракте (например, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, слепая кишка, толстая кишка или прямая кишка). Мы предоставляем оптимизированный протокол во вставке 5 для культивирования органоидов толстой кишки (колоидов), которые обычно требуют более высоких концентраций морфогенов, чем органоиды тонкой кишки.
а, Рабочий процесс для индукции морфогенеза кишечника в чипе кишечника. Эпителий кишечника человека Caco-2 и кишечные органоиды используются в этом протоколе для демонстрации трехмерного морфогенеза. Изолированные эпителиальные клетки были высеяны в подготовленное устройство «кишка на чипе» (подготовка чипа). в течение первых 2 дней (поток, AP, D0-D2). Базолатеральный (BL) поток также инициируется наряду с циклическими движениями растяжения (растяжение, поток, AP и BL), когда формируется полный 2D-монослой. Кишечный 3D-морфогенез происходил спонтанно после 5 дней микрофлюидной культуры (морфогенез, D5). Фазово-контрастные изображения показывают репрезентативную морфологию клеток Caco-2 на каждом экспериментальном этапе или в каждый момент времени (гистограмма, 100). мкм). Четыре схематические диаграммы, иллюстрирующие соответствующие каскады морфогенеза кишечника (вверху справа). Пунктирные стрелки на схеме представляют направление потока жидкости. b, СЭМ-изображение, показывающее топологию поверхности сформированного 3D-эпителия Caco-2 (слева). D, клаудин (ZO-1, красный) и непрерывные мембраны щеточной каймы, помеченные F-актином (зеленый) и ядрами (синий). Иммунофлуоресцентная конфокальная визуализация эпителиальных клеток на кишечных чипах. Стрелки, указывающие на среднюю схему, указывают расположение фокальной плоскости для каждого конфокального изображения. 3. На вставке (вверху справа) показано изображение с большим увеличением. e, ДИК-микрофотография органоидного эпителия в 3D, установленном в кишечнике на срезе, сделанном на 7-й день. f, Наложенные иммунофлуоресцентные изображения, показывающие маркеры стволовых клеток (LGR5;пурпурный), бокаловидные клетки (MUC2; зеленый), F-актин (серый) и ядра (голубой), выращенные на чипах кишечника в течение 3 дней, соответственно (слева) и 13-дневных (в центре) органоидов на эпителиальном слое. чип путем окрашивания плазматической мембраны красителем CellMask (справа) на 13-й день культивирования. Масштабная шкала составляет 50 мкм, если не указано иное.b Перепечатано с разрешения из ссылки.2.Издательство Оксфордского университета;c Адаптировано с разрешения Reference.2.Издательство Оксфордского университета;e и f адаптированы с разрешения по ссылке.12 В соответствии с лицензией Creative Commons CC BY 4.0.
В кишечнике на чипе необходимо изменить гидрофобную поверхность пористой мембраны PDMS для успешного покрытия ECM. В этом протоколе мы применяем два разных метода для изменения гидрофобности мембран PDMS. ium требует химической функционализации поверхности для достижения эффективного отложения белков ECM путем последовательного нанесения полиэтиленимина (PEI) и глутарового альдегида на микроканалы PDMS. После модификации поверхности белки ECM откладывались, чтобы покрыть функционализированную поверхность PDMS, а затем вводились в изолированный органоидный эпителий. Этот оптимизированный метод активации поверхности и покрытия ECM позволяет прикреплять органоидный эпителий, чтобы вызвать трехмерный морфогенез на поверхности PDMS.
Культуры Transwell также требуют покрытия ECM перед посевом клеток;однако культуры Transwell не требуют сложных этапов предварительной обработки для активации поверхности пористых вставок. При выращивании клеток Caco-2 на вставках Transwell покрытие ECM на пористых вставках ускоряет прикрепление диссоциированных клеток Caco-2 (<1 часа) и формирование барьера плотных соединений (<1-2 дней). органоиды образуют полный монослой с барьерной целостностью. Культуры Transwell проводят в 24-луночных планшетах без использования гибридных чипов.
Трехмерный морфогенез in vitro можно инициировать путем приложения потока жидкости к базолатеральной части установленного эпителиального слоя. В кишечнике на чипе эпителиальный морфогенез начался, когда среда была перфузирована в верхние и нижние микроканалы (рис. 3а). напряжение сдвига просвета, мы обычно применяем двойной поток в кишечнике на чипе. В гибридных чипах вставки Transwell, содержащие эпителиальные монослои, были вставлены в гибридные чипы. Затем среда была нанесена под базолатеральную сторону пористой вставки Transwell через микроканал. Морфогенез кишечника происходил через 3-5 дней после начала базолатерального потока в обеих культуральных платформах.
Морфологические особенности микроинженерных трехмерных эпителиальных слоев можно анализировать с помощью различных методов визуализации, включая фазово-контрастную микроскопию, дифференциально-интерференционно-контрастную (ДИК) микроскопию, СЭМ или иммунофлуоресцентную конфокальную микроскопию (рис. 3 и 4). Фазово-контрастную или ДИК-визуализацию можно легко проводить в любое время во время культивирования для контроля формы и выступания трехмерных эпителиальных слоев. Благодаря оптической прозрачности ПДМС и полиэфирных пленок, Платформы «кишка на чипе» и «гибридный чип» могут обеспечивать визуализацию in situ в режиме реального времени без необходимости разделения или разборки устройства. При проведении иммунофлуоресцентной визуализации (рис. 1, 3c, f и 4b, c) клетки обычно фиксируют 4% (вес/объем) параформальдегида (PFA), затем Triton X-100 и 2% (вес/объем) бычьего сывороточного альбумина (BSA) по порядку. можно использовать различные фиксаторы, пермеабилизаторы и блокирующие агенты. Для выделения клеток, иммобилизованных in situ на чипе, используются первичные антитела, нацеленные на маркеры клеток или областей, зависящих от линии дифференцировки, а затем вторичные антитела вместе с контрастным красителем, нацеленным либо на ядро ​​(например, 4',6-диамидино-2-фенилен), индол, DAPI), либо на F-актин (например, флуоресцентно меченный фаллоидин). также может быть выполнено in situ для обнаружения продукции слизи (рис.1, «Дифференцировка клеток» и «Физиология кишечника»), случайная колонизация микробных клеток (рис. 1, «Совместное культивирование микробов-хозяев»), рекрутирование иммунных клеток (рис. 1, «Моделирование заболевания») или контуры трехмерной морфологии эпителия (рис. 3c,f и 4b,c). При модификации кишечника на чипе отделить верхний слой от нижнего слоя микроканалов, как описано в ссылке. На рис. 2 трехмерная морфология эпителия, а также микроворсинки на апикальной щеточной кайме могут быть визуализированы с помощью SEM (рис. 3b). Экспрессию маркеров дифференцировки можно оценить с помощью количественной ПЦР5 или секвенирования одноклеточной РНК. В этом случае трехмерные слои эпителиальных клеток, выращенные в кишечных чипах или гибридных чипах, собирают путем трипсинизации, а затем используют для молекулярного или генетического анализа.
a, рабочий процесс для индукции кишечного морфогенеза в гибридном чипе. Caco-2 и кишечные органоиды используются в этом протоколе для демонстрации трехмерного морфогенеза в платформе гибридного чипа. Диссоциированные эпителиальные клетки высевали в подготовленные вставки Transwell (подготовка TW; см. рисунок ниже). содержащий 2D-монослой эпителиальных клеток, был интегрирован в гибридный чип для введения базолатерального потока (Flow, BL), что в конечном итоге привело к созданию 3D-эпителиального слоя (морфогенез). Фазово-контрастные микрофотографии, показывающие морфологические особенности эпителиальных клеток органов человека, полученных от нормального донора (линия C103) восходящей ободочной кишки на каждом экспериментальном этапе или в каждый момент времени. Схемы в верхних слоях иллюстрируют экспериментальную конфигурацию для каждого этапа. привести к трехмерному морфогенезу органоидных эпителиальных клеток с конфокальной микроскопией сверху вниз, полученной в разных положениях Z (верхнем, среднем и нижнем);см. правую схему и соответствующие пунктирные линии).показали очевидные морфологические характеристики. F-актин (голубой), ядро ​​(серый). c, Флуоресцентные конфокальные микрофотографии (трехмерное изображение под углом) эпителиальных клеток органоидного происхождения, культивированных в статическом трансвелле (TW; вставка в белой пунктирной рамке) по сравнению с гибридным чипом (самый большой полный снимок), сравнивающие 2D и 3D морфологию соответственно. и 3D-функции. Масштабная линейка, 100 мкм. c Перепечатано с разрешения из ссылки. 4.Эльзевир.
Контроли могут быть приготовлены путем культивирования тех же клеток (Caco-2 или кишечных органоидных эпителиальных клеток) в двумерных монослоях в обычных условиях статического культивирования. Примечательно, что истощение питательных веществ может произойти из-за ограниченной емкости микроканалов (т.е. ~ 4 мкл в верхнем канале в исходном дизайне кишечного чипа). Таким образом, можно также сравнить морфологию эпителия до и после применения базолатерального потока.
Процесс мягкой литографии должен выполняться в чистой комнате. Для каждого слоя на чипе (верхний и нижний слои и мембраны) и гибридных чипов использовались разные фотошаблоны, которые изготавливались на отдельных кремниевых пластинах, поскольку высота микроканалов была разной. Целевая высота верхнего и нижнего микроканалов кишки на чипе составляет 500 мкм и 200 мкм соответственно. Целевая высота канала гибридного чипа составляет 200 мкм.
Поместите 3-дюймовую кремниевую пластину в блюдо с ацетоном. Аккуратно вращайте пластину в течение 30 секунд, затем высушите пластину на воздухе. Перенесите пластину на пластину с IPA, затем вращайте пластину в течение 30 с, чтобы очистить.
Раствор пираньи (смесь перекиси водорода и концентрированной серной кислоты, 1:3 (об./об.)) можно дополнительно использовать для максимального удаления органических остатков с поверхности кремниевой пластины.
Раствор Piranha чрезвычайно агрессивен и выделяет тепло. Необходимы дополнительные меры предосторожности. Для удаления отходов дайте раствору остыть и перенесите его в чистый, сухой контейнер для отходов.
Обезвоживают пластины, помещая их на горячую плиту при 200°С на 10 мин. После обезвоживания пластину пять раз встряхивают на воздухе для охлаждения.
Налейте ~ 10 г фоторезиста SU-8 2100 в центр очищенной кремниевой пластины. Используйте пинцет, чтобы равномерно распределить фоторезист по пластине. Время от времени кладите пластину на горячую пластину с температурой 65 ° C, чтобы фоторезист был менее липким и легче распространялся. Не кладите пластину непосредственно на горячую пластину.
SU-8 равномерно распределяли по пластине методом центрифугирования. Запрограммируйте входящее вращение SU-8 в течение 5–10 с для распространения со скоростью 500 об/мин с ускорением 100 об/с. Установите основной спин для формирования рисунка толщиной 200 мкм при 1500 об/мин или добейтесь толщины 250 мкм (создав высоту 500 мкм для верхнего слоя кишки на чипе; см. «Критические шагов» ниже) устанавливается при ускорении 300 об/мин в течение 30 секунд при 1200 об/мин.
Скорость основного вращения можно регулировать в соответствии с целевой толщиной рисунка SU-8 на кремниевой пластине.
Чтобы изготовить узоры SU-8 высотой 500 мкм для верхнего слоя кишки на чипе, этапы центрифугирования и мягкого запекания этой коробки (этапы 7 и 8) были последовательно повторены (см. Шаг 9) для получения двух слоев толщиной 250 мкм. Слой SU-8, который можно наслаивать и соединять с помощью УФ-облучения на этапе 12 этой коробки, создавая слой высотой 500 мкм.
Мягко испеките вафли с покрытием SU-8, аккуратно поместив пластины на горячую плиту при 65 ° C в течение 5 минут, затем переключите настройку на 95 ° C и инкубируйте еще 40 мин.
Чтобы достичь высоты 500 мкм рисунка SU-8 в верхнем микроканале, повторите шаги 7 и 8, чтобы создать два слоя SU-8 толщиной 250 мкм.
Используя UV Mask Aligner, выполните испытание лампы в соответствии с инструкциями производителя, чтобы рассчитать время воздействия на пластину (время воздействия, мс) = (доза воздействия, мДж/см2)/(мощность лампы, мВт/см2).
После определения времени экспозиции поместите фотомаску на держатель маски выравнивателя УФ-маски и поместите фотомаску на пластину с покрытием SU-8.
Поместите печатную поверхность фотомаски непосредственно на сторону кремниевой пластины с покрытием SU-8, чтобы свести к минимуму рассеивание УФ-излучения.
Экспонируйте пластину с покрытием SU-8 и фотомаску вертикально до 260 мДж/см2 УФ-излучения в течение заданного времени экспозиции (см. шаг 10 в этой рамке).
После УФ-облучения кремниевые пластины с покрытием SU-8 запекали при 65 ° C в течение 5 минут и 95 ° C в течение 15 минут на каждой горячей пластине для изготовления узоров высотой 200 мкм. Увеличьте время пост-обжига при 95 ° C до 30 минут для изготовления узоров высотой 500 мкм.
Проявитель наливают в стеклянную посуду, а запеченную пластину помещают в посуду. Объем проявителя SU-8 может варьироваться в зависимости от размера стеклянной пластины. Убедитесь, что используется достаточное количество проявителя SU-8, чтобы полностью удалить неэкспонированный SU-8. Например, при использовании стеклянной посуды диаметром 150 мм емкостью 1 л используйте ~300 мл проявителя SU-8.
Промойте разработанную форму ~ 10 мл свежего разработчика, а затем IPA, распылив раствор с помощью пипетки.
Поместите пластину в плазменный очиститель и подвергайте воздействию кислородной плазмы (атмосферный газ, целевое давление 1 × 10–5 торр, мощность 125 Вт) в течение 1,5 мин.
Поместите пластину в вакуумный эксикатор с предметным стеклом внутри. Вафли и предметные стекла можно разместить рядом друг с другом. Если вакуумный эксикатор разделен пластиной на несколько слоев, поместите предметные стекла в нижнюю камеру, а пластины в верхнюю камеру. Капните 100 мкл раствора трихлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) силана на предметное стекло и примените вакуум для силанизации.
Разморозьте флакон с замороженными клетками Caco-2 на водяной бане при 37 ° C, затем перенесите размороженные клетки в колбу T75, содержащую 15 мл предварительно нагретой до 37 ° C среды Caco-2.
Чтобы передать клетки Caco-2 при слиянии ~ 90%, сначала нагрейте среду Caco-2, PBS и 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА на водяной бане при 37 ° C.
Аспирируйте среду вакуумной аспирацией. Промойте клетки дважды 5 мл теплого PBS, повторив вакуумную аспирацию и добавив свежий PBS.