Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Эволюция микробных паразитов связана с противодействием естественного отбора, который заставляет паразитов совершенствоваться, и дрейфа генов, который заставляет паразитов терять гены и накапливать вредные мутации.Здесь, чтобы понять, как это противодействие происходит в масштабе одной макромолекулы, мы опишем крио-ЭМ структуру рибосомы Encephalitozoon cuniculi, эукариотического организма с одним из самых маленьких геномов в природе.Крайняя редукция рРНК в рибосомах E. cuniculi сопровождается беспрецедентными структурными изменениями, такими как появление неизвестных ранее слитых линкеров рРНК и рРНК без утолщений.Кроме того, рибосома E. cuniculi пережила потерю фрагментов и белков рРНК, развивая способность использовать небольшие молекулы в качестве структурных имитаторов деградировавших фрагментов и белков рРНК.В целом, мы показываем, что молекулярные структуры, которые долгое время считались редуцированными, дегенеративными и подверженными изнурительным мутациям, имеют ряд компенсаторных механизмов, поддерживающих их активность, несмотря на экстремальные молекулярные сокращения.
Поскольку большинство групп микробных паразитов имеют уникальные молекулярные инструменты для эксплуатации своих хозяев, нам часто приходится разрабатывать разные терапевтические средства для разных групп паразитов1,2.Однако новые данные свидетельствуют о том, что некоторые аспекты эволюции паразитов конвергентны и в значительной степени предсказуемы, что указывает на потенциальную основу для широких терапевтических вмешательств в отношении микробных паразитов3,4,5,6,7,8,9.
Предыдущая работа выявила общую эволюционную тенденцию микробных паразитов, называемую редукцией генома или распадом генома10,11,12,13.Текущие исследования показывают, что когда микроорганизмы отказываются от своего свободного образа жизни и становятся внутриклеточными паразитами (или эндосимбионтами), их геномы претерпевают медленные, но удивительные метаморфозы на протяжении миллионов лет9,11.В процессе, известном как распад генома, микробные паразиты накапливают вредные мутации, которые превращают многие ранее важные гены в псевдогены, что приводит к постепенной потере генов и мутационному коллапсу14,15.Этот коллапс может разрушить до 95% генов у древнейших внутриклеточных организмов по сравнению с близкородственными свободноживущими видами.Таким образом, эволюция внутриклеточных паразитов представляет собой перетягивание каната двух противоборствующих сил: дарвиновского естественного отбора, приводящего к совершенствованию паразитов, и коллапса генома, отбрасывающего паразитов в небытие.Как паразиту удалось выйти из этого перетягивания каната и сохранить активность своей молекулярной структуры, остается неясным.
Хотя механизм распада генома до конца не изучен, похоже, что он происходит в основном из-за частого генетического дрейфа.Поскольку паразиты живут небольшими, бесполыми и генетически ограниченными популяциями, они не могут эффективно устранять вредные мутации, которые иногда возникают во время репликации ДНК.Это приводит к необратимому накоплению вредных мутаций и редукции генома паразита.В результате паразит не только теряет гены, которые больше не нужны ему для выживания во внутриклеточной среде.Именно неспособность популяций паразитов эффективно устранять спорадические вредные мутации приводит к тому, что эти мутации накапливаются по всему геному, включая их наиболее важные гены.
Большая часть нашего нынешнего понимания редукции генома основана исключительно на сравнении последовательностей генома с меньшим вниманием к изменениям в реальных молекулах, которые выполняют функции домашнего хозяйства и служат потенциальными мишенями для лекарств.Сравнительные исследования показали, что бремя вредных внутриклеточных микробных мутаций, по-видимому, предрасполагает белки и нуклеиновые кислоты к неправильной укладке и агрегации, делая их более зависимыми от шаперонов и гиперчувствительными к теплу19,20,21,22,23.Кроме того, различные паразиты — независимая эволюция иногда разделяла целых 2,5 миллиарда лет — испытали аналогичную потерю центров контроля качества в своих механизмах синтеза белка5,6 и репарации ДНК24.Однако мало что известно о влиянии внутриклеточного образа жизни на все другие свойства клеточных макромолекул, включая молекулярную адаптацию к увеличивающемуся бремени вредоносных мутаций.
В данной работе для лучшего понимания эволюции белков и нуклеиновых кислот внутриклеточных микроорганизмов мы определили структуру рибосом внутриклеточного паразита Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi представляет собой грибоподобный организм, принадлежащий к группе паразитических микроспоридий, которые имеют необычно маленькие эукариотические геномы и поэтому используются в качестве модельных организмов для изучения распада генома25,26,27,28,29,30.Недавно структура крио-ЭМ рибосом была определена для умеренно редуцированных геномов Microsporidia, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix31,32 (геном ~3,2 Мб).Эти структуры указывают на то, что некоторая потеря амплификации рРНК компенсируется развитием новых контактов между соседними рибосомными белками или приобретением новых msL131,32 рибосомных белков.Виды Encephalitozoon (геном ~2,5 млн п.н.) наряду со своим ближайшим родственником Ordospora демонстрируют предельную степень редукции генома у эукариот – у них менее 2000 белок-кодирующих генов, и ожидается, что их рибосомы не только лишены фрагментов экспансии рРНК (фрагментов рРНК, отличающих эукариотические рибосомы от бактериальных рибосом), но и имеют четыре рибосомных белка из-за отсутствия у них гомо логи в геноме E. cuniculi26,27,28.Таким образом, мы пришли к выводу, что рибосома E. cuniculi может выявить неизвестные ранее стратегии молекулярной адаптации к распаду генома.
Наша крио-ЭМ-структура представляет собой наименьшую эукариотическую цитоплазматическую рибосому, которую предстоит охарактеризовать, и дает представление о том, как окончательная степень сокращения генома влияет на структуру, сборку и эволюцию молекулярного механизма, который является неотъемлемой частью клетки.Мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi нарушает многие из широко консервативных принципов укладки РНК и сборки рибосом, и открыли новый, ранее неизвестный рибосомный белок.Совершенно неожиданно мы показываем, что рибосомы микроспоридий развили способность связывать небольшие молекулы, и выдвигаем гипотезу о том, что укорочения в рРНК и белках запускают эволюционные инновации, которые в конечном итоге могут придать полезные качества рибосомам.
Чтобы улучшить наше понимание эволюции белков и нуклеиновых кислот во внутриклеточных организмах, мы решили выделить споры E. cuniculi из культур инфицированных клеток млекопитающих, чтобы очистить их рибосомы и определить структуру этих рибосом.Получить большое количество паразитарных микроспоридий затруднительно, поскольку микроспоридии нельзя культивировать на питательной среде.Вместо этого они растут и размножаются только внутри клетки-хозяина.Поэтому, чтобы получить биомассу E. cuniculi для очистки рибосом, мы заразили линию клеток почек млекопитающих RK13 спорами E. cuniculi и культивировали эти инфицированные клетки в течение нескольких недель, чтобы позволить E. cuniculi расти и размножаться.Используя инфицированный клеточный монослой площадью около половины квадратного метра, мы смогли очистить около 300 мг спор Microsporidia и использовать их для выделения рибосом.Затем мы разрушили очищенные споры стеклянными шариками и выделили сырые рибосомы, используя поэтапное фракционирование лизатов полиэтиленгликолем.Это позволило нам получить примерно 300 мкг сырых рибосом E. cuniculi для структурного анализа.
Затем мы собрали крио-ЭМ изображения, используя полученные образцы рибосом, и обработали эти изображения, используя маски, соответствующие большой рибосомной субъединице, малой головке субъединицы и малой субъединице.В ходе этого процесса мы собрали изображения около 108 000 рибосомных частиц и вычислили крио-ЭМ-изображения с разрешением 2,7 Å (дополнительные рисунки 1-3).Затем мы использовали криоЭМ-изображения для моделирования рРНК, рибосомного белка и фактора гибернации Mdf1, ассоциированного с рибосомами E. cuniculi (рис. 1а, б).
а Структура рибосомы E. cuniculi в комплексе с фактором гибернации Mdf1 (pdb id 7QEP).б Карта фактора гибернации Mdf1, ассоциированного с рибосомой E. cuniculi.c Карта вторичной структуры, сравнивающая восстановленную рРНК у видов Microsporidian с известными рибосомными структурами.На панелях показано расположение амплифицированных фрагментов рРНК (ES) и активных сайтов рибосом, включая сайт декодирования (DC), сарцинициновую петлю (SRL) и пептидилтрансферазный центр (PTC).d Электронная плотность, соответствующая пептидилтрансферазному центру рибосомы E. cuniculi, позволяет предположить, что этот каталитический центр имеет одинаковую структуру у паразита E. cuniculi и его хозяев, включая H. sapiens.д, е Соответствующая электронная плотность центра декодирования (д) и схематическая структура центра декодирования (е) указывают на то, что E. cuniculi имеет остатки U1491 вместо A1491 (нумерация E. coli) у многих других эукариот.Это изменение предполагает, что E. cuniculi может быть чувствительна к антибиотикам, нацеленным на этот активный центр.
В отличие от установленных ранее структур рибосом V. necatrix и P. locustae (обе структуры представляют одно и то же семейство микроспоридий Nosematidae и очень похожи друг на друга), 31,32 рибосомы E. cuniculi претерпевают многочисленные процессы фрагментации рРНК и белков.Дальнейшая денатурация (дополнительные рисунки 4-6).В рРНК наиболее поразительные изменения включали полную потерю амплифицированного фрагмента 25S рРНК ES12L и частичную дегенерацию спиралей h39, h41 и H18 (рис. 1с, дополнительная рис. 4).Среди рибосомных белков наиболее поразительные изменения включали полную потерю белка eS30 и укорочение белков eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (дополнительные рисунки 4, 5).
Таким образом, крайняя редукция геномов видов Encephalotozoon/Ordospora отражается в их рибосомной структуре: рибосомы E. cuniculi испытывают наиболее резкую потерю белкового содержания в эукариотических цитоплазматических рибосомах, подлежащих структурной характеристике, и у них нет даже тех фрагментов рРНК и белков, которые широко консервативны не только у эукариот, но и во всех трех доменах жизни.Структура рибосомы E. cuniculi обеспечивает первую молекулярную модель этих изменений и раскрывает эволюционные события, которые не учитывались как сравнительной геномикой, так и исследованиями внутриклеточной биомолекулярной структуры (дополнительная рис. 7).Ниже мы описываем каждое из этих событий вместе с их вероятным эволюционным происхождением и их потенциальным влиянием на функцию рибосом.
Затем мы обнаружили, что в дополнение к большим укорочениям рРНК рибосомы E. cuniculi имеют вариации рРНК в одном из своих активных центров.Хотя пептидилтрансферазный центр рибосомы E. cuniculi имеет ту же структуру, что и другие эукариотические рибосомы (рис. 1г), центр декодирования отличается из-за вариации последовательности на нуклеотиде 1491 (нумерация E. coli, рис. 1д, е).Это наблюдение важно, потому что сайт декодирования эукариотических рибосом обычно содержит остатки G1408 и A1491 по сравнению с остатками бактериального типа A1408 и G1491.Эта вариация лежит в основе разной чувствительности бактериальных и эукариотических рибосом к семейству аминогликозидов рибосомных антибиотиков и другим малым молекулам, нацеленным на сайт декодирования.В сайте декодирования рибосомы E. cuniculi остаток A1491 был заменен на U1491, потенциально создавая уникальный интерфейс связывания для небольших молекул, нацеленных на этот активный сайт.Тот же вариант A14901 также присутствует в других микроспоридиях, таких как P. locustae и V. necatrix, что позволяет предположить, что он широко распространен среди видов микроспоридий (рис. 1f).
Поскольку наши образцы рибосом E. cuniculi были выделены из метаболически неактивных спор, мы протестировали крио-ЭМ-карту E. cuniculi на ранее описанное связывание рибосом в условиях стресса или голодания.Факторы гибернации 31,32,36,37, 38. Мы сопоставили ранее установленную структуру гибернирующей рибосомы с крио-ЭМ картой рибосомы E. cuniculi.Для докинга использовали рибосомы S. cerevisiae в комплексе с фактором гибернации Stm138, рибосомы саранчи в комплексе с фактором Lso232 и рибосомы V. necatrix в комплексе с факторами Mdf1 и Mdf231.В то же время мы нашли плотность крио-ЭМ, соответствующую фактору покоя Mdf1.Подобно связыванию Mdf1 с рибосомой V. necatrix, Mdf1 также связывается с рибосомой E. cuniculi, где он блокирует сайт E рибосомы, возможно, помогая сделать рибосомы доступными, когда споры паразита становятся метаболически неактивными при инактивации организма (рис. 2).).
Mdf1 блокирует сайт E рибосомы, что, по-видимому, помогает инактивировать рибосому, когда споры паразита становятся метаболически неактивными.В структуре рибосомы E. cuniculi мы обнаружили, что Mdf1 образует неизвестный ранее контакт со стеблем рибосомы L1, той частью рибосомы, которая способствует высвобождению деацилированной тРНК из рибосомы в процессе синтеза белка.Эти контакты позволяют предположить, что Mdf1 диссоциирует от рибосомы с использованием того же механизма, что и деацетилированная тРНК, обеспечивая возможное объяснение того, как рибосома удаляет Mdf1 для реактивации синтеза белка.
Однако наша структура выявила неизвестный контакт между Mdf1 и ветвью рибосомы L1 (частью рибосомы, которая помогает высвобождать деацилированную тРНК из рибосомы во время синтеза белка).В частности, Mdf1 использует те же контакты, что и локтевой сегмент деацилированной молекулы тРНК (рис. 2).Это ранее неизвестное молекулярное моделирование показало, что Mdf1 диссоциирует от рибосомы, используя тот же механизм, что и деацетилированная тРНК, что объясняет, как рибосома удаляет этот фактор гибернации для реактивации синтеза белка.
При построении модели рРНК мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi имеет аномально свернутые фрагменты рРНК, которые мы назвали слитыми рРНК (рис. 3).В рибосомах, которые охватывают три домена жизни, рРНК сворачивается в структуры, в которых большинство оснований рРНК либо спариваются и укладываются друг с другом, либо взаимодействуют с рибосомными белками38,39,40.Однако в рибосомах E. cuniculi рРНК, по-видимому, нарушают этот принцип укладки, превращая некоторые из своих спиралей в развернутые области рРНК.
Структура спирали 25S рРНК H18 у S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi.Обычно в рибосомах, охватывающих три домена жизни, этот линкер закручивается в спираль РНК, содержащую от 24 до 34 остатков.У Microsporidia, напротив, этот линкер рРНК постепенно редуцируется до двух одноцепочечных богатых уридином линкеров, содержащих только 12 остатков.Большинство этих остатков подвергается воздействию растворителей.Рисунок показывает, что паразитические микроспоридии, по-видимому, нарушают общие принципы укладки рРНК, где основания рРНК обычно связаны с другими основаниями или участвуют во взаимодействиях рРНК-белок.В микроспоридиях некоторые фрагменты рРНК принимают неблагоприятную складчатость, при которой бывшая спираль рРНК становится одноцепочечным фрагментом, вытянутым почти по прямой линии.Наличие этих необычных участков позволяет рРНК микроспоридий связывать отдаленные фрагменты рРНК, используя минимальное количество оснований РНК.
Самый яркий пример такого эволюционного перехода можно наблюдать в спирали 25S рРНК H18 (рис. 3).У видов от E. coli до человека основания этой спирали рРНК содержат 24-32 нуклеотида, образуя слегка неправильную спираль.В ранее идентифицированных рибосомных структурах V. necatrix и P. locustae 31, 32 основания спирали H18 частично развернуты, но спаривание нуклеотидных оснований сохраняется.Однако у E. cuniculi этот фрагмент рРНК становится самыми короткими линкерами 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUU307.В отличие от типичных фрагментов рРНК, эти богатые уридином линкеры не скручиваются и не вступают в экстенсивный контакт с рибосомными белками.Вместо этого они принимают открытые для растворителя и полностью развернутые структуры, в которых нити рРНК вытянуты почти прямо.Эта растянутая конформация объясняет, как E. cuniculi использует только 12 оснований РНК, чтобы заполнить промежуток в 33 Å между спиралями рРНК H16 и H18, в то время как другим видам требуется по крайней мере вдвое больше оснований рРНК, чтобы заполнить этот пробел.
Таким образом, мы можем продемонстрировать, что посредством энергетически невыгодного фолдинга паразитические микроспоридии развили стратегию сокращения даже тех сегментов рРНК, которые остаются широко консервативными у разных видов в трех доменах жизни.По-видимому, накапливая мутации, превращающие спирали рРНК в короткие поли-U линкеры, E. cuniculi может образовывать необычные фрагменты рРНК, содержащие как можно меньше нуклеотидов для лигирования дистальных фрагментов рРНК.Это помогает объяснить, как микроспоридии достигли резкого сокращения своей основной молекулярной структуры без потери своей структурной и функциональной целостности.
Другой необычной особенностью рРНК E. cuniculi является появление рРНК без утолщений (рис. 4).Выпуклости — это нуклеотиды без пар оснований, которые выкручиваются из спирали РНК, а не прячутся в ней.Большинство выступов рРНК действуют как молекулярные клеи, помогая связывать соседние рибосомные белки или другие фрагменты рРНК.Некоторые из выпуклостей действуют как шарниры, позволяя спирали рРНК изгибаться и складываться оптимально для продуктивного синтеза белка 41 .
a Выступ рРНК (нумерация S. cerevisiae) отсутствует в структуре рибосом E. cuniculi, но присутствует у большинства других эукариот b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и внутренние рибосомы E. cuniculi.у паразитов отсутствуют многие из древних высококонсервативных выпуклостей рРНК.Эти утолщения стабилизируют структуру рибосомы;следовательно, их отсутствие у микроспоридий указывает на пониженную стабильность фолдинга рРНК у паразитов микроспоридий.Сравнение с P-стеблями (стебли L7/L12 у бактерий) показывает, что потеря бугорков рРНК иногда совпадает с появлением новых бугорков рядом с потерянными бугорками.Спираль H42 в 23S/28S рРНК имеет древнюю выпуклость (U1206 у Saccharomyces cerevisiae), возраст которой оценивается как минимум в 3,5 миллиарда лет из-за ее защиты в трех доменах жизни.У микроспоридий эта выпуклость устраняется.Однако рядом с утраченной выпуклостью появилась новая выпуклость (A1306 у E. cuniculi).
Поразительно, но мы обнаружили, что рибосомы E. cuniculi лишены большей части выпуклостей рРНК, обнаруженных у других видов, включая более 30 выпуклостей, консервативных у других эукариот (Fig. 4a).Эта потеря устраняет многие контакты между рибосомными субъединицами и соседними спиралями рРНК, иногда создавая большие полые пустоты внутри рибосомы, что делает рибосому E. cuniculi более пористой по сравнению с более традиционными рибосомами (рис. 4b).Примечательно, что мы обнаружили, что большинство этих выпуклостей также были потеряны в ранее идентифицированных рибосомных структурах V. necatrix и P. locustae, которые были упущены из виду при предыдущем структурном анализе31,32.
Иногда потеря выпуклостей рРНК сопровождается развитием новых выпуклостей рядом с утраченной выпуклостью.Например, рибосомный P-стебель содержит выпуклость U1208 (у Saccharomyces cerevisiae), которая сохранилась от E. coli до человека, и поэтому ее возраст оценивается в 3,5 миллиарда лет.Во время синтеза белка эта выпуклость помогает стеблю P перемещаться между открытой и закрытой конформациями, так что рибосома может рекрутировать факторы трансляции и доставлять их в активный центр.В рибосомах E. cuniculi это утолщение отсутствует;однако новое утолщение (G883), расположенное только в трех парах оснований, может способствовать восстановлению оптимальной гибкости Р-стебля (рис. 4в).
Наши данные о рРНК без утолщений предполагают, что минимизация рРНК не ограничивается потерей элементов рРНК на поверхности рибосомы, но может также затрагивать ядро ​​рибосомы, создавая специфический для паразита молекулярный дефект, который не был описан в свободноживущих клетках.наблюдаются живые виды.
После моделирования канонических рибосомных белков и рРНК мы обнаружили, что обычные рибосомные компоненты не могут объяснить три части крио-ЭМ-изображения.Два из этих фрагментов представляют собой небольшие молекулы (рис. 5, дополнительная рис. 8).Первый сегмент зажат между рибосомными белками uL15 и eL18 в положении, которое обычно занимает С-конец eL18, укороченный у E. cuniculi.Хотя мы не можем определить идентичность этой молекулы, размер и форма этого островка плотности хорошо объясняются присутствием молекул спермидина.Его связывание с рибосомой стабилизируется специфическими для микроспоридий мутациями в белках uL15 (Asp51 и Arg56), которые, по-видимому, увеличивают сродство рибосомы к этой небольшой молекуле, поскольку они позволяют uL15 заворачивать малую молекулу в рибосомную структуру.Дополнительный рисунок 2).8, дополнительные данные 1, 2).
Крио-ЭМ-изображение, показывающее присутствие нуклеотидов вне рибозы, связанной с рибосомой E. cuniculi.В рибосоме E. cuniculi этот нуклеотид занимает то же место, что и нуклеотид 25S рРНК A3186 (нумерация Saccharomyces cerevisiae) в большинстве других эукариотических рибосом.б В структуре рибосомы E. cuniculi этот нуклеотид расположен между рибосомными белками uL9 и eL20, тем самым стабилизируя контакт между двумя белками.Анализ сохранения последовательности cd eL20 среди видов микроспоридий.Филогенетическое дерево видов Microsporidia (c) и множественное выравнивание последовательностей белка eL20 (d) показывают, что нуклеотидсвязывающие остатки F170 и K172 консервативны у большинства типичных Microsporidia, за исключением S. lophii, за исключением ранних ветвящихся Microsporidia, которые сохранили удлинение рРНК ES39L.e На этом рисунке показано, что нуклеотид-связывающие остатки F170 и K172 присутствуют только в eL20 сильно редуцированного генома микроспоридий, но не в других эукариотах.В целом, эти данные свидетельствуют о том, что рибосомы Microsporidian развили сайт связывания нуклеотидов, который, по-видимому, связывает молекулы AMP и использует их для стабилизации белок-белковых взаимодействий в рибосомной структуре.Высокая консервативность этого сайта связывания у Microsporidia и его отсутствие у других эукариот позволяет предположить, что этот сайт может обеспечить избирательное преимущество для выживания Microsporidia.Таким образом, карман для связывания нуклеотидов в рибосоме микроспоридий, по-видимому, не является вырожденным признаком или конечной формой деградации рРНК, как описано ранее, а скорее полезной эволюционной инновацией, которая позволяет рибосомам микроспоридий напрямую связывать небольшие молекулы, используя их в качестве молекулярных строительных блоков.строительные блоки для рибосом.Это открытие делает рибосому микроспоридий единственной известной рибосомой, использующей один нуклеотид в качестве структурного строительного блока.f Гипотетический эволюционный путь, основанный на связывании нуклеотидов.
Вторая низкомолекулярная плотность расположена на границе между рибосомными белками uL9 и eL30 (рис. 5а).Этот интерфейс был ранее описан в структуре рибосомы Saccharomyces cerevisiae как сайт связывания 25S нуклеотида рРНК A3186 (часть расширения рРНК ES39L)38.Показано, что в вырожденных рибосомах P. locustae ES39L этот интерфейс связывает неизвестный одиночный нуклеотид 31, и предполагается, что этот нуклеотид представляет собой редуцированную конечную форму рРНК, в которой длина рРНК составляет ~130-230 оснований.ES39L уменьшен до одного нуклеотида 32,43.Наши крио-ЭМ изображения подтверждают идею о том, что плотность можно объяснить нуклеотидами.Однако более высокое разрешение нашей структуры показало, что этот нуклеотид является внерибосомной молекулой, возможно, АМП (рис. 5а, б).
Затем мы спросили, появился ли сайт связывания нуклеотидов в рибосоме E. cuniculi или он существовал ранее.Поскольку связывание нуклеотидов в основном опосредовано остатками Phe170 и Lys172 в рибосомном белке eL30, мы оценили консервативность этих остатков у 4396 репрезентативных эукариот.Как и в случае uL15 выше, мы обнаружили, что остатки Phe170 и Lys172 высококонсервативны только у типичных Microsporidia, но отсутствуют у других эукариот, включая атипичные Microsporidia Mitosporidium и Amphiamblys, у которых фрагмент рРНК ES39L не редуцирован 44, 45, 46 (рис. 5c).-е).
Взятые вместе, эти данные подтверждают идею о том, что E. cuniculi и, возможно, другие канонические микроспоридии развили способность эффективно захватывать большое количество малых метаболитов в структуру рибосомы, чтобы компенсировать снижение уровней рРНК и белка.При этом они развили уникальную способность связывать нуклеотиды вне рибосомы, показывая, что паразитические молекулярные структуры компенсируют это за счет захвата обильных малых метаболитов и использования их в качестве структурных имитаторов деградировавших фрагментов РНК и белков..
Третья несмоделированная часть нашей крио-ЭМ-карты, обнаруженная в большой рибосомной субъединице.Относительно высокое разрешение (2,6 Å) нашей карты предполагает, что эта плотность принадлежит белкам с уникальными комбинациями больших остатков боковой цепи, что позволило нам идентифицировать эту плотность как ранее неизвестный рибосомный белок, который мы идентифицировали как Он был назван msL2 (Microsporidia-специфический белок L2) (методы, рис. 6).Наш поиск гомологии показал, что msL2 консервативен в кладе Microsporidia рода Encephaliter и Orosporidium, но отсутствует у других видов, включая другие Microsporidia.В структуре рибосомы msL2 занимает брешь, образованную потерей удлиненной рРНК ES31L.В этой пустоте msL2 помогает стабилизировать укладку рРНК и может компенсировать потерю ES31L (Рис. 6).
a Электронная плотность и модель специфичного для Microsporidia рибосомного белка msL2, обнаруженного в рибосомах E. cuniculi.b Большинство эукариотических рибосом, включая рибосому 80S Saccharomyces cerevisiae, имеют амплификацию рРНК ES19L, утраченную у большинства видов Microsporidian.Ранее установленная структура рибосом микроспоридий V. necatrix предполагает, что потеря ES19L у этих паразитов компенсируется эволюцией нового рибосомного белка msL1.В этом исследовании мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi также выработала дополнительный белок-миметик рибосомальной РНК в качестве очевидной компенсации потери ES19L.Однако msL2 (в настоящее время аннотированный как гипотетический белок ECU06_1135) и msL1 имеют различное структурное и эволюционное происхождение.c Это открытие генерации эволюционно неродственных рибосомных белков msL1 и msL2 предполагает, что если рибосомы накапливают вредные мутации в своих рРНК, они могут достигать беспрецедентного уровня композиционного разнообразия даже у небольшого подмножества близкородственных видов.Это открытие может помочь прояснить происхождение и эволюцию митохондриальной рибосомы, которая известна своей сильно редуцированной рРНК и аномальной изменчивостью белкового состава у разных видов.
Затем мы сравнили белок msL2 с ранее описанным белком msL1, единственным известным специфичным для микроспоридий рибосомным белком, обнаруженным в рибосоме V. necatrix.Мы хотели проверить, связаны ли эволюционно msL1 и msL2.Наш анализ показал, что msL1 и msL2 занимают одну и ту же полость в структуре рибосомы, но имеют разные первичную и третичную структуры, что свидетельствует об их независимом эволюционном происхождении (рис. 6).Таким образом, наше открытие msL2 предоставляет доказательства того, что группы компактных эукариотических видов могут независимо эволюционировать структурно различающиеся рибосомные белки, чтобы компенсировать потерю фрагментов рРНК.Это открытие примечательно тем, что большинство цитоплазматических эукариотических рибосом содержат инвариантный белок, в том числе одно и то же семейство из 81 рибосомного белка.Появление msL1 и msL2 в различных кладах микроспоридий в ответ на потерю расширенных сегментов рРНК позволяет предположить, что деградация молекулярной архитектуры паразита заставляет паразитов искать компенсаторные мутации, которые в конечном итоге могут привести к их приобретению в разных популяциях паразита.структуры.
Наконец, когда наша модель была завершена, мы сравнили состав рибосомы E. cuniculi с предсказанным на основе последовательности генома.Ранее считалось, что несколько рибосомных белков, включая eL14, eL38, eL41 и eS30, отсутствуют в геноме E. cuniculi из-за очевидного отсутствия их гомологов в геноме E. cuniculi.Потеря многих рибосомных белков также предсказывается у большинства других сильно редуцированных внутриклеточных паразитов и эндосимбионтов.Например, хотя большинство свободноживущих бактерий содержат одно и то же семейство из 54 рибосомных белков, только 11 из этих белковых семейств имеют обнаруживаемые гомологи в каждом проанализированном геноме ограниченных хозяином бактерий.В поддержку этого представления экспериментально наблюдалась потеря рибосомных белков у микроспоридий V. necatrix и P. locustae, у которых отсутствуют белки eL38 и eL4131,32.
Однако наши структуры показывают, что только eL38, eL41 и eS30 фактически теряются в рибосоме E. cuniculi.Белок eL14 был консервативен, и наша структура показала, почему этот белок не мог быть найден при поиске по гомологии (рис. 7).В рибосомах E. cuniculi большая часть сайта связывания eL14 теряется из-за деградации ES39L, амплифицированного рРНК.В отсутствие ES39L eL14 потерял большую часть своей вторичной структуры, и только 18% последовательности eL14 были идентичны у E. cuniculi и S. cerevisiae.Эта плохая сохранность последовательности примечательна тем, что даже Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens — организмы, которые эволюционировали с разницей в 1,5 миллиарда лет — имеют более 51% одних и тех же остатков в eL14.Эта аномальная потеря сохранения объясняет, почему E. cuniculi eL14 в настоящее время аннотируется как предполагаемый белок M970_061160, а не как рибосомный белок eL1427.
и рибосома Microsporidia потеряла удлинение рРНК ES39L, что частично устранило сайт связывания рибосомного белка eL14.В отсутствие ES39L белок микроспоры eL14 претерпевает потерю вторичной структуры, при которой бывшая рРНК-связывающая α-спираль вырождается в петлю минимальной длины.b Множественное выравнивание последовательностей показывает, что белок eL14 высококонсервативен у эукариотических видов (57% идентичности последовательностей между гомологами дрожжей и человека), но плохо консервативен и дивергентен в микроспоридиях (у которых не более 24% остатков идентичны гомологу eL14).из S. cerevisiae или H. sapiens).Эта плохая консервативность последовательности и изменчивость вторичной структуры объясняет, почему гомолог eL14 никогда не был обнаружен в E. cuniculi и почему считается, что этот белок был потерян в E. cuniculi.Напротив, E. cuniculi eL14 ранее был аннотирован как предполагаемый белок M970_061160.Это наблюдение предполагает, что разнообразие генома микроспоридий в настоящее время переоценено: некоторые гены, которые в настоящее время считаются потерянными в микроспоридиях, на самом деле сохранились, хотя и в высокодифференцированных формах;вместо этого считается, что некоторые из них кодируют гены микроспоридий для белков, специфичных для червей (например, гипотетический белок M970_061160), который на самом деле кодирует очень разнообразные белки, обнаруженные у других эукариот.
Это открытие предполагает, что денатурация рРНК может привести к резкой потере сохранения последовательности в соседних рибосомных белках, делая эти белки необнаружимыми для поиска гомологии.Таким образом, мы можем переоценить фактическую степень молекулярной деградации у организмов с малым геномом, поскольку некоторые белки, считавшиеся утраченными, на самом деле сохраняются, хотя и в сильно измененных формах.
Как могут паразиты сохранять функции своих молекулярных машин в условиях экстремальной редукции генома?Наше исследование отвечает на этот вопрос, описывая сложную молекулярную структуру (рибосому) E. cuniculi, организма с одним из самых маленьких эукариотических геномов.
Уже почти два десятилетия известно, что молекулы белков и РНК у микробных паразитов часто отличаются от своих гомологичных молекул у свободноживущих видов из-за отсутствия у них центров контроля качества, уменьшения их размеров до 50% от их размера у свободноживущих микробов и т. д.множество изнурительных мутаций, которые нарушают складывание и функционирование.Например, ожидается, что в рибосомах организмов с небольшим геномом, включая многих внутриклеточных паразитов и эндосимбионтов, отсутствует несколько рибосомных белков и до одной трети нуклеотидов рРНК по сравнению со свободноживущими видами 27, 29, 30, 49. Однако то, как эти молекулы функционируют в паразитах, остается в значительной степени загадкой, изучаемой в основном с помощью сравнительной геномики.
Наше исследование показывает, что структура макромолекул может раскрыть многие аспекты эволюции, которые трудно извлечь из традиционных сравнительных геномных исследований внутриклеточных паразитов и других организмов, ограниченных хозяином (дополнительная рис. 7).Например, на примере белка eL14 показано, что мы можем переоценивать реальную степень деградации молекулярного аппарата у паразитических видов.В настоящее время считается, что энцефалитные паразиты имеют сотни генов, специфичных для микроспоридий.Однако наши результаты показывают, что некоторые из этих, казалось бы, специфических генов на самом деле являются просто очень разными вариантами генов, которые распространены у других эукариот.Более того, пример белка msL2 показывает, как мы упускаем из виду новые рибосомные белки и недооцениваем содержание паразитических молекулярных машин.Пример малых молекул показывает, как мы можем упускать из виду самые изобретательные инновации в паразитарных молекулярных структурах, которые могут придать им новую биологическую активность.
В совокупности эти результаты улучшают наше понимание различий между молекулярными структурами организмов, ограниченных хозяином, и их аналогами в свободноживущих организмах.Мы показываем, что молекулярные машины, которые долгое время считались редуцированными, дегенеративными и подверженными различным изнурительным мутациям, вместо этого имеют набор систематически упускаемых из виду необычных структурных особенностей.
С другой стороны, необъемные фрагменты рРНК и слитые фрагменты, которые мы обнаружили в рибосомах E. cuniculi, позволяют предположить, что редукция генома может изменить даже те части основного молекулярного механизма, которые сохранились в трех доменах жизни — спустя почти 3,5 миллиарда лет.самостоятельная эволюция видов.
Свободные от утолщений и слитые фрагменты рРНК в рибосомах E. cuniculi представляют особый интерес в свете предыдущих исследований молекул РНК у эндосимбиотических бактерий.Например, было показано, что у эндосимбионта тли Buchnera aphidicola молекулы рРНК и тРНК имеют чувствительные к температуре структуры из-за смещения состава А+Т и высокой доли неканонических пар оснований20,50.Эти изменения в РНК, а также изменения в белковых молекулах теперь считаются ответственными за сверхзависимость эндосимбионтов от партнеров и неспособность эндосимбионтов передавать тепло 21, 23 .Хотя рРНК паразитарных микроспоридий имеет структурно отчетливые изменения, природа этих изменений позволяет предположить, что сниженная термостабильность и более высокая зависимость от белков-шаперонов могут быть общими чертами молекул РНК в организмах с редуцированными геномами.
С другой стороны, наши структуры показывают, что паразитарные микроспоридии развили уникальную способность сопротивляться широко консервативным фрагментам рРНК и белков, развивая способность использовать обильные и легкодоступные небольшие метаболиты в качестве структурных имитаторов вырожденных фрагментов рРНК и белков.Деградация молекулярной структуры..В пользу этого мнения говорит тот факт, что малые молекулы, компенсирующие потерю белковых фрагментов в рРНК и рибосомах E. cuniculi, связываются со специфическими для микроспоридий остатками в белках uL15 и eL30.Это говорит о том, что связывание малых молекул с рибосомами может быть результатом положительного отбора, при котором специфичные для Microsporidia мутации в рибосомных белках были отобраны по их способности повышать сродство рибосом к малым молекулам, что может привести к более эффективным рибосомным организмам.Открытие раскрывает умную инновацию в молекулярной структуре микробных паразитов и дает нам лучшее понимание того, как молекулярные структуры паразитов сохраняют свою функцию, несмотря на редуктивную эволюцию.
В настоящее время идентификация этих малых молекул остается неясной.Неясно, почему внешний вид этих небольших молекул в рибосомной структуре различается у разных видов микроспоридий.В частности, неясно, почему связывание нуклеотидов наблюдается в рибосомах E. cuniculi и P. locustae, а не в рибосомах V. necatrix, несмотря на наличие остатка F170 в белках eL20 и K172 V. necatrix.Эта делеция может быть вызвана остатком 43 uL6 (расположенным рядом с карманом для связывания нуклеотидов), который представляет собой тирозин в V. necatrix, а не треонин в E. cuniculi и P. locustae.Объемная ароматическая боковая цепь Tyr43 может мешать связыванию нуклеотидов из-за стерического перекрывания.В качестве альтернативы очевидная делеция нуклеотидов может быть связана с низким разрешением крио-ЭМ изображений, что затрудняет моделирование рибосомных фрагментов V. necatrix.
С другой стороны, наша работа предполагает, что процесс распада генома может быть изобретательской силой.В частности, структура рибосомы E. cuniculi предполагает, что потеря рРНК и белковых фрагментов в рибосоме микроспоридий создает эволюционное давление, которое способствует изменениям в структуре рибосомы.Эти варианты встречаются далеко от активного центра рибосомы и, по-видимому, помогают поддерживать (или восстанавливать) оптимальную сборку рибосомы, которая в противном случае была бы нарушена редуцированной рРНК.Это говорит о том, что основная инновация рибосомы микроспоридий, по-видимому, превратилась в необходимость буферировать дрейф генов.
Возможно, это лучше всего иллюстрируется связыванием нуклеотидов, которое до сих пор никогда не наблюдалось у других организмов.Тот факт, что остатки, связывающие нуклеотиды, присутствуют у типичных микроспоридий, но не у других эукариот, позволяет предположить, что сайты связывания нуклеотидов — это не просто реликвии, ожидающие своего исчезновения, или конечные сайты для восстановления рРНК до формы отдельных нуклеотидов.Вместо этого этот сайт кажется полезной функцией, которая могла бы развиваться в течение нескольких раундов положительного отбора.Сайты связывания нуклеотидов могут быть побочным продуктом естественного отбора: как только ES39L деградирует, микроспоридии вынуждены искать компенсацию для восстановления оптимального биогенеза рибосом в отсутствие ES39L.Поскольку этот нуклеотид может имитировать молекулярные контакты нуклеотида A3186 в ES39L, молекула нуклеотида становится строительным блоком рибосомы, связывание которой дополнительно улучшается за счет мутации последовательности eL30.
Что касается молекулярной эволюции внутриклеточных паразитов, наше исследование показывает, что силы дарвиновского естественного отбора и генетического дрейфа распада генома действуют не параллельно, а колеблются.Во-первых, генетический дрейф устраняет важные особенности биомолекул, делая крайне необходимой компенсацию.Только когда паразиты удовлетворят эту потребность посредством дарвиновского естественного отбора, их макромолекулы получат шанс развить свои самые впечатляющие и инновационные черты.Важно отметить, что эволюция сайтов связывания нуклеотидов в рибосоме E. cuniculi предполагает, что эта схема молекулярной эволюции от потери к получению не только амортизирует вредные мутации, но иногда придает совершенно новые функции паразитическим макромолекулам.
Эта идея согласуется с теорией движущегося равновесия Сьюэлла Райта, которая утверждает, что строгая система естественного отбора ограничивает способность организмов к инновациям51,52,53.Однако если генетический дрейф нарушает естественный отбор, эти дрейфы могут вызывать изменения, которые сами по себе не являются адаптивными (или даже пагубными), но приводят к дальнейшим изменениям, обеспечивающим более высокую приспособленность или новую биологическую активность.Наша структура поддерживает эту идею, иллюстрируя, что тот же тип мутации, который уменьшает складку и функцию биомолекулы, по-видимому, является основным триггером для ее улучшения.В соответствии с беспроигрышной эволюционной моделью наше исследование показывает, что распад генома, традиционно рассматриваемый как дегенеративный процесс, также является основным двигателем инноваций, иногда и, возможно, даже часто позволяя макромолекулам приобретать новые паразитарные активности.может их использовать.