Благодарим вас за посещение Nature.com.Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Кроме того, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно.Используйте кнопки «Назад» и «Далее», чтобы перемещаться по трем слайдам за раз, или используйте кнопки ползунка в конце, чтобы перемещаться по трем слайдам за раз.
Гематоэнцефалический барьер и гематоэнцефалический барьер не позволяют биотерапевтическим агентам достигать своих целей в центральной нервной системе, тем самым препятствуя эффективному лечению неврологических заболеваний.Чтобы обнаружить новые мозговые транспортеры in vivo, мы представили библиотеку пептидов фага T7 и серийно собирали кровь и спинномозговую жидкость (CSF), используя канюлированную модель большого пула крыс в сознании.Конкретные фаговые клоны были высоко обогащены CSF после четырех раундов селекции.Тестирование отдельных пептидов-кандидатов выявило более чем 1000-кратное обогащение ЦСЖ.Биоактивность пептид-опосредованной доставки в мозг была подтверждена 40% снижением уровня амилоида-β в спинномозговой жидкости с использованием пептидного ингибитора BACE1, связанного с идентифицированным новым транзитным пептидом.Эти результаты предполагают, что пептиды, идентифицированные методами селекции фагов in vivo, могут быть полезными носителями для системной доставки макромолекул в мозг с терапевтическим эффектом.
Исследования таргетной терапии центральной нервной системы (ЦНС) в основном сосредоточены на выявлении оптимизированных лекарств и агентов, обладающих свойствами, направленными на ЦНС, с меньшими усилиями на обнаружении механизмов, которые управляют активной доставкой лекарств в мозг.Это начинает меняться сейчас, поскольку доставка лекарств, особенно больших молекул, является неотъемлемой частью современной нейробиологической разработки лекарств.Окружающая среда центральной нервной системы хорошо защищена системой цереброваскулярного барьера, состоящей из гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)1, что затрудняет доставку лекарств в мозг1,2.Подсчитано, что почти все крупномолекулярные препараты и более 98% низкомолекулярных препаратов выводятся из мозга3.Вот почему очень важно выявить новые транспортные системы головного мозга, обеспечивающие эффективную и специфическую доставку терапевтических препаратов в ЦНС 4,5.Тем не менее, ГЭБ и BCSFB также представляют прекрасную возможность для доставки лекарств, поскольку они проникают во все структуры головного мозга через его обширную сосудистую сеть.Таким образом, современные попытки использования неинвазивных методов доставки в мозг во многом основаны на механизме рецептор-опосредованного транспорта (РМТ) с использованием эндогенного рецептора BBB6.Несмотря на недавние ключевые достижения с использованием пути рецептора трансферрина7,8, требуется дальнейшая разработка новых систем доставки с улучшенными свойствами.С этой целью наша цель состояла в том, чтобы идентифицировать пептиды, способные опосредовать транспорт CSF, поскольку они в принципе могут быть использованы для доставки макромолекул в ЦНС или для открытия новых рецепторных путей.В частности, потенциальными мишенями для активной и специфической доставки биотерапевтических препаратов могут служить специфические рецепторы и транспортеры цереброваскулярной системы (ГЭБ и БЦФБ).Цереброспинальная жидкость (ЦСЖ) является секреторным продуктом сосудистых сплетений (КС) и находится в непосредственном контакте с интерстициальной жидкостью головного мозга через субарахноидальное пространство и желудочковое пространство4.Недавно было показано, что субарахноидальная спинномозговая жидкость чрезмерно диффундирует в интерстиций головного мозга.Мы надеемся получить доступ к паренхиматозному пространству, используя этот субарахноидальный тракт притока или непосредственно через ГЭБ.Чтобы достичь этого, мы внедрили надежную стратегию селекции фагов in vivo, которая идеально идентифицирует пептиды, транспортируемые любым из этих двух различных путей.
Теперь мы опишем последовательный метод скрининга фагового дисплея in vivo с отбором образцов CSF в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (HTS) для мониторинга начальных раундов отбора с самым высоким разнообразием библиотек.Скрининг проводили на находящихся в сознании крысах с постоянно имплантированной большой цистерной (CM) канюлей, чтобы избежать заражения крови.Важно отметить, что этот подход выбирает как пептиды, нацеленные на мозг, так и пептиды с транспортной активностью через цереброваскулярный барьер.Мы использовали фаги T7 из-за их небольшого размера (~ 60 нм)10 и предположили, что они подходят для транспорта везикул, которые позволяют трансцеллюлярно пересекать эндотелиальный и/или эпителиально-мозговой барьер.После четырех раундов пэннинга были выделены популяции фагов, демонстрирующие сильное обогащение спинномозговой жидкости in vivo и ассоциацию с церебральными микрососудами.Важно отметить, что мы смогли подтвердить наши выводы, продемонстрировав, что предпочтительные и химически синтезированные лучшие пептиды-кандидаты способны транспортировать белковый груз в спинномозговую жидкость.Во-первых, фармакодинамические эффекты ЦНС были установлены путем объединения ведущего транзитного пептида с ингибитором пептида BACE1.В дополнение к демонстрации того, что стратегии функционального скрининга in vivo могут идентифицировать новые транспортные пептиды головного мозга в качестве эффективных переносчиков белковых грузов, мы ожидаем, что аналогичные подходы к функциональной селекции также станут важными для выявления новых путей транспорта головного мозга.
На основе бляшкообразующих единиц (БОЕ) после этапа упаковки фага была спроектирована и создана библиотека случайных 12-мерных линейных пептидов фага Т7 с разнообразием примерно 109 (см. Материалы и методы).Важно отметить, что мы тщательно проанализировали эту библиотеку перед панорамированием in vivo.ПЦР-амплификация образцов фаговой библиотеки с использованием модифицированных праймеров генерировала ампликоны, которые были непосредственно применимы к HTS (дополнительная рис. 1a).Из-за а) ошибок секвенирования HTS11, б) влияния на качество праймеров (NNK) 1-12 и в) наличия фага дикого типа (wt) (скелетные вставки) в резервной библиотеке была реализована процедура фильтрации последовательности для извлечения только проверенной информации о последовательности (дополнительная рис. 1b).Эти шаги фильтра применяются ко всем библиотекам секвенирования HTS.Для стандартной библиотеки было получено в общей сложности 233 868 прочтений, из которых 39% прошли критерии фильтрации и были использованы для анализа библиотеки и отбора для последующих раундов (дополнительный рисунок 1c – e).Прочтения были преимущественно кратны 3 парам оснований в длину с пиком в 36 нуклеотидов (дополнительная рис. 1c), что подтверждает дизайн библиотеки (NNK) 1-12.Примечательно, что примерно 11% членов библиотеки содержали 12-мерную вставку PAGISRELVDKL остова дикого типа (wt), и почти половина последовательностей (49%) содержала вставки или делеции.HTS библиотечной библиотеки подтвердил высокое разнообразие пептидов в библиотеке: более 81% пептидных последовательностей были обнаружены только один раз и только 1,5% встречались в ≥4 копиях (дополнительная рис. 2a).Частоты аминокислот (аа) во всех 12 позициях в репертуаре хорошо коррелировали с частотами, ожидаемыми для количества кодонов, генерируемых вырожденным репертуаром NKK (дополнительная рис. 2b).Наблюдаемая частота остатков аа, кодируемых этими вставками, хорошо коррелировала с расчетной частотой (r = 0,893) (дополнительная рис. 2c).Подготовка фаговых библиотек для инъекции включает этапы амплификации и удаления эндотоксина.Ранее было показано, что это потенциально снижает разнообразие фаговых библиотек12,13.Поэтому мы секвенировали фаговую библиотеку, амплифицированную на чашках, которая подверглась удалению эндотоксина, и сравнили ее с исходной библиотекой, чтобы оценить частоту АА.Между исходным пулом и амплифицированным и очищенным пулом (дополнительная рис. 2d) наблюдалась сильная корреляция (r = 0,995), что указывает на то, что конкуренция между клонами, амплифицированными на чашках с использованием фага T7, не вызывала серьезной систематической ошибки.Это сравнение основано на частоте трипептидных мотивов в каждой библиотеке, поскольку разнообразие библиотек (~ 109) не может быть полностью захвачено даже с помощью HTS.Частотный анализ aa в каждой позиции выявил небольшое смещение, зависящее от позиции, в последних трех позициях введенного репертуара (дополнительный рис. 2e).В заключение мы пришли к выводу, что качество и разнообразие библиотеки были приемлемыми, и наблюдались лишь незначительные изменения в разнообразии из-за амплификации и подготовки фаговых библиотек между несколькими раундами селекции.
Серийные пробы спинномозговой жидкости могут быть выполнены путем хирургической имплантации канюли в CM крыс в сознании, чтобы облегчить идентификацию фага T7, введенного внутривенно (iv) через BBB и/или BCSFB (Fig. 1a-b).Мы использовали две независимые группы селекции (группы A и B) в первых трех раундах селекции in vivo (рис. 1c).Мы постепенно увеличивали строгость отбора, уменьшая общее количество фага, вводимого в первые три раунда отбора.Для четвертого раунда панорамирования мы объединили выборки из ветвей A и B и выполнили три дополнительных независимых выборки.Для изучения in vivo свойств частиц фага Т7 в этой модели фаг дикого типа (мастер-вставка PAGISRELVDKL) вводили крысам через хвостовую вену.Восстановление фагов из спинномозговой жидкости и крови в разные моменты времени показало, что относительно небольшие икосаэдрические фаги T7 имели быструю начальную фазу клиренса из кровяного отсека (дополнительная рис. 3).Основываясь на введенных титрах и объеме крови крыс, мы подсчитали, что только приблизительно 1% мас.Фаг из введенной дозы определялся в крови через 10 минут после внутривенного введения.После этого первоначального быстрого снижения был измерен более медленный первичный клиренс с периодом полувыведения 27,7 минут.Важно отметить, что из компартмента CSF было извлечено очень мало фагов, что указывает на низкий фон для миграции фагов дикого типа в компартмент CSF (дополнительная рис. 3).В среднем за весь период отбора проб (0-250 мин) в спинномозговой жидкости было обнаружено лишь около 1 х 10-3% титров фага Т7 в крови и 4 х 10-8% первоначально введенных фагов.Примечательно, что время полужизни (25,7 мин) фага дикого типа в спинномозговой жидкости было сходно с наблюдаемым в крови.Эти данные демонстрируют, что барьер, отделяющий компартмент CSF от крови, не поврежден у крыс с канюлированными CM, что позволяет проводить отбор фаговых библиотек in vivo для идентификации клонов, которые легко переносятся из крови в компартмент CSF.
(а) Создание метода повторного забора спинномозговой жидкости (ЦСЖ) из большого пула.(b) Диаграмма, показывающая клеточное расположение барьера центральной нервной системы (ЦНС) и стратегию отбора, используемую для идентификации пептидов, пересекающих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и гематоэнцефалический барьер.( c ) Блок-схема скрининга фагового дисплея in vivo.В каждом раунде отбора внутривенно вводили фаги (идентификаторы животных внутри стрелок).Две независимые альтернативные ветви (А, Б) сохраняются отдельно до 4-го тура отбора.Для раундов отбора 3 и 4 каждый клон фага, извлеченный из CSF, секвенировали вручную.(г) Кинетика фага, выделенного из крови (красные кружки) и спинномозговой жидкости (зеленые треугольники) в ходе первого раунда селекции у двух канюлированных крыс после внутривенного введения библиотеки пептидов Т7 (2 х 1012 фагов/животное).Синие квадраты обозначают среднюю начальную концентрацию фага в крови, рассчитанную по количеству введенного фага с учетом общего объема крови.Черные квадраты обозначают точку пересечения линии y, экстраполированной из концентраций фагов в крови.(e,f) Представьте относительную частоту и распределение всех возможных перекрывающихся трипептидных мотивов, обнаруженных в пептиде.Показано количество мотивов, найденных в 1000 прочтениях.Достоверно (p < 0,001) обогащенные мотивы отмечены красными точками.( e ) Диаграмма рассеяния корреляции, сравнивающая относительную частоту трипептидного мотива инъецированной библиотеки с фагом, полученным из крови животных № 1.1 и № 1.2.( f ) Диаграмма рассеяния корреляции, сравнивающая относительные частоты трипептидных мотивов животных фагов № 1.1 и № 1.2, выделенных в крови и спинномозговой жидкости.(g, h) Представление Sequence ID фага, обогащенного кровью (g) по сравнению с инъецированными библиотеками, и фага, обогащенного CSF (h) по сравнению с кровью после раунда селекции in vivo у обоих животных.Размер однобуквенного кода показывает, как часто эта аминокислота встречается в этом положении.Зеленый = полярные, фиолетовый = нейтральный, синий = основные, красный = кислые и черный = гидрофобные аминокислоты.Рисунок 1а, б был разработан и изготовлен Эдуардом Урихом.
Мы ввели фаговую пептидную библиотеку двум крысам CM (клады A и B) и выделили фаг из спинномозговой жидкости и крови (рис. 1d).Начальный быстрый клиренс библиотеки был менее выражен по сравнению с фагом дикого типа.Среднее время полужизни инъецированной библиотеки у обоих животных составляло 24,8 минуты в крови, аналогично фагу дикого типа, и 38,5 минуты в спинномозговой жидкости.Образцы фагов крови и спинномозговой жидкости от каждого животного подвергали HTS и все идентифицированные пептиды анализировали на наличие короткого трипептидного мотива.Трипептидные мотивы были выбраны потому, что они обеспечивают минимальную основу для формирования структуры и взаимодействия пептид-белок14,15.Мы обнаружили хорошую корреляцию в распределении мотивов между инъекционной фаговой библиотекой и клонами, выделенными из крови обоих животных (рис. 1д).Данные показывают, что состав библиотеки лишь незначительно обогащен в кровяном компартменте.Частоты аминокислот и консенсусные последовательности были дополнительно проанализированы в каждой позиции с использованием адаптации программного обеспечения Weblogo16.Интересно, что мы обнаружили сильное обогащение остатками глицина в крови (рис. 1g).Когда кровь сравнивали с клонами, отобранными из CSF, наблюдался сильный отбор и некоторая деселекция мотивов (рис. 1f), а определенные аминокислоты предпочтительно присутствовали в заранее определенных положениях в 12-членном (рис. 1h).Примечательно, что отдельные животные значительно различались по спинномозговой жидкости, тогда как у обоих животных наблюдалось обогащение крови глицином (дополнительная рис. 4a – j).После строгой фильтрации данных о последовательности в спинномозговой жидкости животных № 1.1 и № 1.2 было получено в общей сложности 964 и 420 уникальных 12-мерных пептидов (дополнительная рис. 1d – e).Выделенные фаговые клоны амплифицировали и подвергали второму раунду селекции in vivo.Фаг, извлеченный из второго раунда селекции, подвергали HTS у каждого животного, и все идентифицированные пептиды использовали в качестве входных данных для программы распознавания мотивов для анализа встречаемости трипептидных мотивов (фиг. 2a, b, ef).По сравнению с первым циклом фага, извлеченного из ЦСЖ, мы наблюдали дальнейшую селекцию и деселекцию многих мотивов в ЦСЖ в ветвях А и В (рис. 2).Был применен алгоритм сетевой идентификации, чтобы определить, представляют ли они разные образцы согласованной последовательности.Наблюдалось явное сходство между 12-мерными последовательностями, восстановленными CSF в альтернативной кладе A (рис. 2c, d) и кладе B (рис. 2g, h).Объединенный анализ в каждой ветви выявил разные профили отбора для 12-мерных пептидов (дополнительная рис. 5c, d) и увеличение отношения CSF/титр крови с течением времени для объединенных клонов после второго раунда отбора по сравнению с первым раундом отбора (дополнительная рис. 5e).).
Обогащение мотивов и пептидов в спинномозговой жидкости двумя последовательными раундами селекции функционального фагового дисплея in vivo.
Все фаги спинномозговой жидкости, извлеченные из первого раунда каждого животного (животные № 1.1 и № 1.2), объединяли, амплифицировали, HT-секвенировали и повторно вводили вместе (2×1010 фагов/животное) 2 канюлированным крысам SM (#1.1 → #).2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4).(a,b,e,f) Корреляционные диаграммы рассеяния, сравнивающие относительную частоту трипептидных мотивов всех фагов, происходящих из CSF, в первом и втором раундах отбора.Относительная частота и распределение мотивов, представляющих все возможные перекрывающиеся трипептиды, обнаруженные в пептидах в обеих ориентациях.Показано количество мотивов, найденных в 1000 прочтениях.Мотивы, которые были значительно (p < 0,001) отобраны или исключены в одной из сравниваемых библиотек, выделены красными точками.( c , d , g , h ) Представление логотипа последовательности всех длинных последовательностей из 12 аминокислот, богатых CSF, на основе раундов 2 и 1 селекции in vivo.Размер однобуквенного кода показывает, как часто эта аминокислота встречается в этом положении.Чтобы представить логотип, сравнивается частота последовательностей CSF, извлеченных из отдельных животных между двумя раундами отбора, и показаны обогащенные последовательности во втором раунде: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 и (h) #1.2–#2.4.Наиболее обогащенных аминокислот в данном положении на (в, г) животных нет.2.1 и нет.2.2 или (г, з) у животных №.2.3 и нет.2.4 показаны в цвете.Зеленый = полярные, фиолетовый = нейтральный, синий = основные, красный = кислые и черный = гидрофобные аминокислоты.
После третьего раунда отбора мы идентифицировали 124 уникальных пептидных последовательности (№ 3.1 и № 3.2) из ​​332 фаговых клонов, восстановленных CSF, выделенных из двух животных (дополнительная рис. 6a).Последовательность LGSVS (18,7%) имела самую высокую относительную долю, за ней следовали вставки дикого типа PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) и SARGSWREIVSLS (2,2%).В заключительном четвертом раунде мы объединили две независимо выбранные ветви от трех отдельных животных (рис. 1с).Из 925 секвенированных фаговых клонов, извлеченных из спинномозговой жидкости, в четвертом раунде мы обнаружили 64 уникальных пептидных последовательности (дополнительная рис. 6b), среди которых относительная доля фага дикого типа упала до 0,8%.Наиболее распространенными клонами CSF в четвертом раунде были LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) и RLSSVDSDLSGC (3,2%).%)).Диапазон длин выбранных пептидов обусловлен вставками/делециями нуклеотидов или преждевременными терминирующими кодонами в праймерах библиотеки при использовании вырожденных кодонов для дизайна библиотеки NNK.Преждевременные стоп-кодоны генерируют более короткие пептиды и выбираются, поскольку они содержат благоприятный мотив аа.Более длинные пептиды могут быть результатом вставок/делеций в праймерах синтетических библиотек.Это помещает разработанный стоп-кодон за пределы рамки и считывает его до тех пор, пока новый стоп-кодон не появится ниже по течению.В общем, мы рассчитали коэффициенты обогащения для всех четырех раундов отбора, сравнив входные данные с выборочными выходными данными.Для первого раунда скрининга мы использовали титры фагов дикого типа в качестве неспецифического фонового эталона.Интересно, что негативная селекция фагов была очень сильной в первом цикле ЦСЖ, но не в крови (рис. 3а), что может быть связано с низкой вероятностью пассивной диффузии большинства членов пептидной библиотеки в компартмент ЦСЖ или с тем, что родственные фаги имеют тенденцию более эффективно удерживаться или удаляться из кровотока, чем бактериофаги.Однако во втором раунде пэннинга в обеих ветвях наблюдалась сильная селекция фагов в CSF, что позволяет предположить, что предыдущий раунд был обогащен фагами, демонстрирующими пептиды, которые способствуют поглощению CSF (рис. 3a).Опять же без значительного обогащения крови.Также в третьем и четвертом раундах фаговые клоны были значительно обогащены ЦСЖ.Сравнивая относительную частоту каждой уникальной пептидной последовательности между двумя последними раундами селекции, мы обнаружили, что последовательности были еще более обогащены в четвертом раунде селекции (рис. 3б).Всего из всех 64 уникальных пептидных последовательностей был извлечен 931 трипептидный мотив с использованием обеих ориентаций пептидов.Наиболее обогащенные мотивы в четвертом раунде были более тщательно изучены на предмет их профилей обогащения во всех раундах по сравнению с введенной библиотекой (отсечение: обогащение 10%) (дополнительная рис. 6c).Общие закономерности отбора показали, что большинство изучаемых мотивов обогащались во всех предыдущих турах обеих ветвей отбора.Однако некоторые мотивы (например, SGL, VSG, LGS GSV) были преимущественно из альтернативной клады A, в то время как другие (например, FGW, RTN, WGF, NTR) были обогащены альтернативной кладой B.
Проверка транспорта CSF обогащенных CSF фагово-дисплеируемых пептидов и биотинилированных лидерных пептидов, конъюгированных с полезными нагрузками стрептавидина.
( а ) Коэффициенты обогащения, рассчитанные во всех четырех раундах (R1-R4) на основе инъецированных (вход = I) титров фага (PFU) и определенных титров фага CSF (выход = O).Коэффициенты обогащения для последних трех раундов (R2-R4) рассчитывались путем сравнения с предыдущим раундом и первым раундом (R1) с данными о весе.Незакрашенные столбцы — спинномозговая жидкость, заштрихованные столбцы — плазма.(***p<0,001, на основе критерия Стьюдента).( б ) Список наиболее распространенных фаговых пептидов, ранжированных в соответствии с их относительной долей ко всем фагам, собранным в спинномозговой жидкости после 4 раунда отбора.Шесть наиболее распространенных фаговых клонов выделены цветом, пронумерованы и их коэффициенты обогащения между 3 и 4 раундами отбора (вставки).(c, d) Шесть наиболее обогащенных фаговых клонов, библиотеки пустых фагов и исходных фаговых пептидов из раунда 4 были проанализированы индивидуально в модели выборки CSF.Образцы спинномозговой жидкости и крови собирали в указанные моменты времени.(c) Равные количества 6 фаговых клонов-кандидатов (2 x 1010 фагов/животных), пустых фагов (#1779) (2 x 1010 фагов/животных) и исходных фаговых пептидных библиотек (2 x 1012 фагов/животных). Инъекция не менее 3 см вводится канюлированному животному отдельно через хвостовую вену.Показана фармакокинетика CSF каждого инъецированного клона фага и библиотеки фаговых пептидов с течением времени.(d) показывает среднее соотношение ЦСЖ/кровь для всех извлеченных фагов/мл за время отбора проб.( e ) Четыре синтетических лидерных пептида и один скремблированный контроль были связаны биотином со стрептавидином через их N-конец (тетрамерный дисплей) с последующей инъекцией (хвостовая вена внутривенно, 10 мг стрептавидина / кг).Не менее трех интубированных крыс (N = 3).).Образцы спинномозговой жидкости собирали в указанные моменты времени, и концентрации стрептавидина измеряли с помощью ИФА против стрептавидина в спинномозговой жидкости (nd = не обнаружено).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, на основе теста ANOVA).(f) Сравнение аминокислотной последовательности наиболее обогащенного фагового пептидного клона № 2002 (фиолетовый) с другими отобранными фаговыми пептидными клонами из 4-го раунда селекции.Идентичные и похожие фрагменты аминокислот имеют цветовую кодировку.
Из всех обогащенных фагов в четвертом раунде (рис. 3b) было отобрано шесть клонов-кандидатов для дальнейшего индивидуального анализа в модели выборки CSF.Равные количества шести фаговых библиотек-кандидатов, пустых фаговых (без вставки) и профаговых пептидных библиотек вводили трем канюлированным животным CM, а фармакокинетику определяли в анализах спинномозговой жидкости (рис. 3c) и крови (дополнительная рис. 7).Все протестированные фаговые клоны нацелены на компартмент CSF на уровне, в 10-1000 раз превышающем уровень пустого контрольного фага (#1779).Например, клоны № 2020 и № 2077 имели примерно в 1000 раз более высокие титры ЦСЖ, чем контрольный фаг.Фармакокинетический профиль каждого выбранного пептида различен, но все они обладают высокой способностью самонаведения в ЦСЖ.Мы наблюдали постоянное снижение с течением времени для клонов № 1903 и № 2011, в то время как для клонов № 2077, № 2002 и № 2009 увеличение в течение первых 10 минут может указывать на активный транспорт, но это необходимо проверить.Клоны № 2020, № 2002 и № 2077 стабилизировались на высоких уровнях, в то время как концентрация ЦСЖ клона № 2009 медленно снижалась после первоначального повышения.Затем мы сравнили относительную частоту каждого кандидата CSF с его концентрацией в крови (рис. 3d).Корреляция среднего титра каждого кандидата CSF с его титром в крови во все времена отбора проб показала, что три из шести кандидатов были значительно обогащены CSF крови.Интересно, что клон № 2077 показал более высокую стабильность в крови (дополнительная фигура 7).Чтобы подтвердить, что сами пептиды способны активно транспортировать груз, отличный от фаговых частиц, в компартмент CSF, мы синтезировали четыре лидерных пептида, дериватизированных биотином на N-конце, где пептиды прикрепляются к фаговой частице.Биотинилированные пептиды (№ 2002, 2009, 2020 и 2077) конъюгировали со стрептавидином (SA) для получения мультимерных форм, несколько имитирующих геометрию фага.Этот формат также позволил нам измерить воздействие SA в крови и спинномозговой жидкости в виде белковых пептидов, транспортирующих грузы.Важно отметить, что данные о фагах часто можно было воспроизвести, когда синтетические пептиды вводили в таком формате, конъюгированном с СК (рис. 3е).Скремблированные пептиды имели меньшее начальное воздействие и более быстрый клиренс ЦСЖ с неопределяемыми уровнями в течение 48 часов.Чтобы получить представление о путях доставки этих пептидных фаговых клонов в пространство спинномозговой жидкости, мы проанализировали локализацию отдельных попаданий фаговых пептидов с помощью иммуногистохимии (ИГХ) для прямого обнаружения фаговых частиц через 1 час после внутривенной инъекции in vivo.Примечательно, что клоны № 2002, № 2077 и № 2009 можно было обнаружить по сильному окрашиванию в капиллярах головного мозга, в то время как контрольный фаг (№ 1779) и клон № 2020 не были обнаружены (дополнительная фигура 8).Это говорит о том, что эти пептиды способствуют действию на головной мозг именно за счет пересечения ГЭБ.Для проверки этой гипотезы требуется дальнейший подробный анализ, так как маршрут BSCFB также может быть задействован.При сравнении аминокислотной последовательности наиболее обогащенного клона (#2002) с другими выбранными пептидами было отмечено, что некоторые из них имеют сходные аминокислотные удлинения, что может указывать на сходный механизм транспорта (рис. 3е).
Благодаря своему уникальному профилю в плазме и значительному увеличению СМЖ с течением времени клон фагового дисплея № 2077 был дополнительно исследован в течение более длительного 48-часового периода и смог воспроизвести быстрое увеличение СМЖ, наблюдаемое в связи с устойчивыми уровнями СА (рис. 4а).Что касается других идентифицированных фаговых клонов, № 2077 сильно окрашивался в отношении капилляров головного мозга и продемонстрировал значительную колокализацию с капиллярным маркерным лектином при просмотре с более высоким разрешением и, возможно, некоторое окрашивание в паренхиматозном пространстве (рис. 4b).Чтобы исследовать, могут ли быть получены опосредованные пептидами фармакологические эффекты в ЦНС, мы провели эксперимент, в котором биотинилированные версии i) транзитного пептида #2077 и ii) пептида-ингибитора BACE1 смешивали с SA в двух различных соотношениях.Для одной комбинации мы использовали только ингибитор пептида BACE1, а для другой использовали соотношение 1:3 пептидного ингибитора BACE1 к пептиду #2077.Оба образца вводили внутривенно, и в течение времени измеряли уровни бета-амилоидного пептида 40 (Abeta40) в крови и спинномозговой жидкости.Abeta40 измеряли в спинномозговой жидкости, поскольку он отражает ингибирование BACE1 в паренхиме головного мозга.Как и ожидалось, оба комплекса значительно снижали уровень Abeta40 в крови (рис. 4в, г).Однако только образцы, содержащие смесь пептидов № 1.2077 и ингибитор пептида ВАСЕ1, конъюгированный с СК, вызывали достоверное снижение Abeta40 в спинномозговой жидкости (рис. 4в).Данные показывают, что пептид №.2077 способен транспортировать белок SA 60 кДа в ЦНС, а также индуцировать фармакологические эффекты с SA-конъюгированными ингибиторами пептида BACE1.
( а ) Клональная инъекция (2 × 10 фагов / животное) фага Т7, демонстрирующая долгосрочные фармакокинетические профили пептида ЦСЖ № 2077 (RLSSVDSDLSGC) и неинъецированного контрольного фага (№ 1779) по крайней мере у трех интубированных СМ крыс.(b) Конфокальное микроскопическое изображение репрезентативных микрососудов коры у крыс, которым вводили фаги (2 × 10 10 фагов/животное), показывающее контрастное окрашивание пептида № 2077 и сосудов (лектин).Эти фаговые клоны вводили 3 крысам и оставляли циркулировать в течение 1 часа перед перфузией.Мозг делали на срезы и окрашивали поликлональными меченными FITC антителами против капсида фага Т7.За десять минут до перфузии и последующей фиксации лектин, меченный DyLight594, вводили внутривенно.Флуоресцентные изображения, показывающие окрашивание лектинами (красный) люминальной стороны микрососудов и фагов (зеленый) в просвете капилляров и периваскулярной ткани головного мозга.Масштабная линейка соответствует 10 мкм.( c, d ) Биотинилированный ингибирующий пептид BACE1 отдельно или в комбинации с биотинилированным транзитным пептидом № 2077 был связан со стрептавидином с последующей внутривенной инъекцией по крайней мере трем канюлированным крысам CM (10 мг стрептавидина / кг).Опосредованное ингибитором пептида BACE1 снижение Aβ40 измеряли с помощью Aβ1-40 ELISA в крови (красный цвет) и спинномозговой жидкости (оранжевый цвет) в указанные моменты времени.Для большей наглядности на график нанесена пунктирная линия в масштабе 100%.( c ) Процентное снижение Aβ40 в крови (красные треугольники) и спинномозговой жидкости (оранжевые треугольники) у крыс, получавших стрептавидин, конъюгированный с транзитным пептидом № 2077, и ингибиторным пептидом BACE1 в соотношении 3: 1.( d ) Процентное снижение Aβ40 в крови (красные кружки) и спинномозговой жидкости (оранжевые кружки) у крыс, получавших стрептавидин, связанный только с пептидом, ингибирующим BACE1.Концентрация Aβ в контроле составляла 420 пг/мл (стандартное отклонение = 101 пг/мл).
Фаговый дисплей успешно применяется в нескольких областях биомедицинских исследований17.Этот метод использовался для исследований разнообразия сосудов in vivo18,19, а также для исследований сосудов головного мозга20,21,22,23,24,25,26.В этом исследовании мы распространили применение этого метода селекции не только на прямую идентификацию пептидов, нацеленных на сосуды головного мозга, но и на обнаружение кандидатов с активными транспортными свойствами для преодоления гематоэнцефалического барьера.Теперь мы описываем разработку процедуры отбора in vivo у интубированных крыс CM и демонстрируем ее потенциал для идентификации пептидов со свойствами самонаведения CSF.Используя фаг Т7, отображающий библиотеку 12-мерных случайных пептидов, мы смогли продемонстрировать, что фаг Т7 достаточно мал (примерно 60 нм в диаметре)10, чтобы адаптироваться к гематоэнцефалическому барьеру, таким образом, напрямую преодолевая гематоэнцефалический барьер или сосудистое сплетение.Мы заметили, что сбор CSF у канюлированных крыс CM был хорошо контролируемым методом функционального скрининга in vivo, и что извлеченный фаг не только связывался с сосудистой сетью, но также функционировал как переносчик через гематоэнцефалический барьер.Кроме того, одновременно собирая кровь и применяя HTS к ЦСЖ и фагам, полученным из крови, мы подтвердили, что на наш выбор ЦСЖ не повлияло обогащение крови или приспособленность к экспансии между раундами отбора.Тем не менее, компартмент крови является частью процедуры отбора, поскольку фаги, способные достичь компартмента ЦСЖ, должны выжить и циркулировать в кровотоке достаточно долго, чтобы обогатиться в головном мозге.Чтобы извлечь достоверную информацию о последовательности из необработанных данных HTS, мы внедрили фильтры, адаптированные к ошибкам секвенирования, зависящим от платформы, в рабочем процессе анализа.Путем включения кинетических параметров в метод скрининга мы подтвердили быструю фармакокинетику фагов Т7 дикого типа (t½ ~ 28 мин) в крови24, 27, 28, а также определили их период полураспада в спинномозговой жидкости (t½ ~ 26 мин) в минуту).Несмотря на схожие фармакокинетические профили в крови и ЦСЖ, только 0,001% концентрации фага в крови можно было обнаружить в ЦСЖ, что указывает на низкую фоновую подвижность фага Т7 дикого типа через гематоэнцефалический барьер.В этой работе подчеркивается важность первого раунда селекции при использовании стратегий пэннинга in vivo, особенно для фаговых систем, которые быстро удаляются из циркуляции, поскольку лишь немногие клоны способны достичь компартмента ЦНС.Таким образом, в первом раунде сокращение разнообразия библиотеки было очень большим, так как в этой очень строгой модели CSF в конечном итоге было собрано лишь ограниченное количество клонов.Эта стратегия пэннинга in vivo включала несколько этапов отбора, таких как активное накопление в компартменте CSF, выживание клона в компартменте крови и быстрое удаление клонов фага T7 из крови в течение первых 10 минут (рис. 1d и дополнительная рис. 4M).).Таким образом, после первого раунда в ЦСЖ были идентифицированы разные фаговые клоны, хотя для отдельных животных использовался один и тот же исходный пул.Это говорит о том, что несколько шагов строгого отбора для исходных библиотек с большим количеством членов библиотеки приводят к значительному снижению разнообразия.Поэтому случайные события станут неотъемлемой частью процесса первоначального отбора, сильно влияя на результат.Вполне вероятно, что многие из клонов в исходной библиотеке имели очень похожую склонность к обогащению CSF.Однако даже в одинаковых экспериментальных условиях результаты селекции могут отличаться из-за малого количества каждого конкретного клона в исходном пуле.
Мотивы, обогащенные CSF, отличаются от таковых в крови.Интересно, что мы отметили первый сдвиг в сторону богатых глицином пептидов в крови отдельных животных.(Рис. 1g, дополнительные рис. 4e, 4f).Фаг, содержащий пептиды глицина, может быть более стабильным и с меньшей вероятностью будет выведен из обращения.Однако эти богатые глицином пептиды не были обнаружены в образцах спинномозговой жидкости, что позволяет предположить, что курируемые библиотеки прошли два разных этапа отбора: один в крови, а другой позволил накопиться в спинномозговой жидкости.Обогащенные CSF клоны, полученные в результате четвертого раунда селекции, были тщательно протестированы.Было подтверждено, что почти все отдельно протестированные клоны обогащены СМЖ по сравнению с пустым контрольным фагом.Один пептидный хит (#2077) исследовали более подробно.Он показал более длительный период полувыведения из плазмы по сравнению с другими хитами (рисунок 3d и дополнительный рисунок 7), и что интересно, этот пептид содержал остаток цистеина на С-конце.Недавно было показано, что добавление цистеина к пептидам может улучшить их фармакокинетические свойства за счет связывания с альбумином 29 .В настоящее время это неизвестно для пептида № 2077 и требует дальнейшего изучения.Некоторые пептиды показали зависимость от валентности при обогащении ЦСЖ (данные не показаны), что может быть связано с отображаемой геометрией поверхности капсида Т7.Используемая нами система Т7 показала 5-15 копий каждого пептида на фаговую частицу.IHC была проведена на клонах-кандидатах свинцового фага, введенных внутривенно в кору головного мозга крыс (дополнительная рис. 8).Данные показали, что по крайней мере три клона (№ 2002, № 2009 и № 2077) взаимодействовали с ГЭБ.Остается определить, приводит ли это взаимодействие BBB к накоплению CSF или перемещению этих клонов непосредственно в BCSFB.Важно отметить, что мы показываем, что выбранные пептиды сохраняют свою транспортную способность CSF при синтезе и связывании с белковым грузом.Связывание N-концевых биотинилированных пептидов с СК практически повторяет результаты, полученные с их фаговыми клонами в крови и спинномозговой жидкости (рис. 3д).Наконец, мы показываем, что ведущий пептид № 2077 способен стимулировать действие на мозг биотинилированного пептидного ингибитора BACE1, конъюгированного с SA, вызывая выраженные фармакодинамические эффекты в ЦНС за счет значительного снижения уровней Abeta40 в ЦСЖ (рис. 4).Мы не смогли идентифицировать какие-либо гомологи в базе данных, выполнив поиск гомологии пептидной последовательности для всех попаданий.Важно отметить, что размер библиотеки T7 составляет приблизительно 109, в то время как теоретический размер библиотеки для 12-меров составляет 4 x 1015. Поэтому мы выбрали лишь небольшую часть пространства разнообразия библиотеки 12-мерных пептидов, что может означать, что более оптимизированные пептиды могут быть идентифицированы путем оценки смежного пространства последовательностей этих идентифицированных попаданий.Гипотетически одной из причин, по которой мы не нашли естественных гомологов этих пептидов, может быть деселекция в ходе эволюции для предотвращения неконтролируемого проникновения определенных пептидных мотивов в мозг.
В совокупности наши результаты обеспечивают основу для будущей работы по более подробному выявлению и характеристике транспортных систем цереброваскулярного барьера in vivo.Базовая установка этого метода основана на функциональной стратегии отбора, которая не только идентифицирует клоны со свойствами связывания с сосудами головного мозга, но также включает критический этап, на котором успешные клоны обладают внутренней активностью для преодоления биологических барьеров in vivo в компартменте ЦНС.заключается в выяснении механизма транспорта этих пептидов и их предпочтительности для связывания с микроциркуляторным руслом, специфичным для области мозга.Это может привести к открытию новых путей транспорта ГЭБ и рецепторов.Мы ожидаем, что идентифицированные пептиды могут напрямую связываться с цереброваскулярными рецепторами или с циркулирующими лигандами, транспортируемыми через ГЭБ или BCSFB.Обнаруженные в этой работе пептидные векторы с транспортной активностью СМЖ будут исследованы в дальнейшем.В настоящее время мы исследуем мозговую специфичность этих пептидов на предмет их способности пересекать ГЭБ и/или BCSFB.Эти новые пептиды будут чрезвычайно ценными инструментами для потенциального открытия новых рецепторов или путей и для разработки новых высокоэффективных платформ для доставки макромолекул, таких как биологические препараты, в мозг.
Канюлируйте большую цистерну (CM), используя модификацию ранее описанного метода.Анестезированных крыс Wistar (200-350 г) устанавливали на стереотаксический аппарат и над выбритой и асептически подготовленной кожей головы делали срединный разрез для обнажения черепа.Просверлите два отверстия в районе верхней створки и закрепите в отверстиях крепежные шурупы.В латеральном затылочном гребне просверлено дополнительное отверстие для стереотаксического ведения канюли из нержавеющей стали в КМ.Нанесите стоматологический цемент вокруг канюли и закрепите винтами.После фотоотверждения и отверждения цемента кожная рана была закрыта супрамидным швом 4/0.Правильное размещение канюли подтверждается спонтанной утечкой спинномозговой жидкости (ЦСЖ).Удалите крысу из стереотаксического аппарата, получите соответствующий послеоперационный уход и обезболивание и дайте ей восстановиться в течение как минимум одной недели, пока в спинномозговой жидкости не появятся признаки крови.Крыс Wistar (Crl:WI/Han) получали от Charles River (Франция).Все крысы содержались в специфических свободных от патогенов условиях.Все эксперименты на животных были одобрены Ветеринарным управлением города Базеля, Швейцария, и проводились в соответствии с Лицензией на животных № 2474 (Оценка активного транспорта мозга путем измерения уровней терапевтических кандидатов в спинномозговой жидкости и мозге крысы).
Аккуратно держите крысу в сознании с канюлей CM в руке.Удалите дурман из канюли и соберите 10 мкл спонтанно текущей спинномозговой жидкости.Поскольку проходимость канюли в конечном итоге была нарушена, в это исследование были включены только чистые образцы спинномозговой жидкости без признаков загрязнения кровью или обесцвечивания.Параллельно из небольшого разреза на кончике хвоста отбирали примерно 10–20 мкл крови в пробирки с гепарином (Sigma-Aldrich).СМЖ и кровь собирали в различные моменты времени после внутривенной инъекции фага Т7.Приблизительно 5–10 мкл жидкости выбрасывалось перед взятием каждой пробы ЦСЖ, что соответствует мертвому объему катетера.
Библиотеки были созданы с использованием вектора T7Select 10-3b, как описано в руководстве по системе T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Вкратце, была синтезирована случайная 12-мерная ДНК-вставка в следующем формате:
Кодон NNK использовали, чтобы избежать двойных стоп-кодонов и сверхэкспрессии аминокислот во вставке.N представляет собой смешанное вручную эквимолярное соотношение каждого нуклеотида, а K представляет собой смешанное вручную эквимолярное соотношение адениновых и цитозиновых нуклеотидов.Одноцепочечные участки превращали в двухцепочечную ДНК путем дополнительной инкубации с dNTP (Novagen) и ферментом Кленова (New England Biolabs) в буфере Кленова (New England Biolabs) в течение 3 часов при 37°C.После реакции двухцепочечную ДНК извлекали осаждением EtOH.Полученную ДНК расщепляли рестрикционными ферментами EcoRI и HindIII (оба от Roche).Затем расщепленную и очищенную (QIAquick, Qiagen) вставку (лигазу T4, New England Biolabs) лигировали в рамку считывания в предварительно расщепленный вектор T7 после аминокислоты 348 капсидного гена 10B.Реакции лигирования инкубировали при 16°С в течение 18 часов перед упаковкой in vitro.Фаговую упаковку in vitro выполняли в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для клонирования T7Select 10-3b (Novagen), и упаковочный раствор однократно амплифицировали до лизиса с использованием Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Лизаты центрифугировали, титровали и замораживали при -80°С в виде маточного раствора глицерина.
Прямая ПЦР-амплификация вариабельных областей фага, амплифицированных в бульоне или планшете, с использованием запатентованных праймеров для слияния 454/Roche-amplicon.Прямой праймер слияния содержит последовательности, фланкирующие вариабельную область (NNK) 12 (специфическую для матрицы), GS FLX Titanium Adapter A и последовательность ключей библиотеки из четырех оснований (TCAG) (дополнительная фигура 1a):
Праймер для обратного слияния также содержит биотин, присоединенный для захвата гранул, и титановый адаптер GS FLX Titanium Adapter B, необходимый для клональной амплификации во время эмульсионной ПЦР:
Затем ампликоны подвергали пиросеквенированию 454/Roche в соответствии с протоколом 454 GS-FLX Titanium.Для ручного секвенирования по Сэнгеру (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) ДНК фага T7 амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали со следующими парами праймеров:
Вставки из отдельных бляшек подвергали ПЦР-амплификации с использованием набора Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (согласно инструкциям производителя).Выполните горячий старт (10 мин при 95 ° C) и 35 циклов форсирования (50 с при 95 ° C, 1 мин при 50 ° C и 1 мин при 72 ° C).
Фаг из библиотек, фаг дикого типа, фаг, извлеченный из ЦСЖ и крови, или отдельные клоны амплифицировали в Escherichia coli BL5615 в бульоне TB (Sigma Aldrich) или в чашках объемом 500 см2 (Thermo Scientific) в течение 4 ч при 37°C.Фаг экстрагировали из планшетов путем ополаскивания планшетов буфером Трис-ЭДТА (Fluka Analytical) или путем сбора бляшек стерильными наконечниками пипеток.Фаг выделяли из культурального супернатанта или буфера для экстракции с помощью одного раунда преципитации полиэтиленгликолем (PEG 8000) (Promega) и ресуспендировали в буфере Tris-EDTA.
Амплифицированный фаг подвергали 2-3 циклам удаления эндотоксина с использованием шариков для удаления эндотоксина (Miltenyi Biotec) перед внутривенной (IV) инъекцией (500 мкл/животное).В первом раунде вводили 2×1012 фагов;во втором — 2×1010 фагов;в третьем и четвертом раундах отбора по 2×109 фагов на животное.Содержание фагов в образцах спинномозговой жидкости и крови, собранных в указанные моменты времени, определяли путем подсчета бляшек в соответствии с инструкциями производителя (руководство по эксплуатации системы T7Select).Селекцию фагов проводили внутривенной инъекцией очищенных библиотек в хвостовую вену или повторной инъекцией фага, извлеченного из спинномозговой жидкости из предыдущего раунда отбора, а последующие сборы проводили через 10, 30, 60, 90, 120, 180 и 240 минут соответственно в образцах спинномозговой жидкости и крови.Всего было проведено четыре раунда пэннинга in vivo, в которых две выбранные ветви отдельно хранились и анализировались в течение первых трех раундов отбора.Все фаговые вставки, выделенные из ЦСЖ в ходе первых двух раундов селекции, подвергали пиросеквенированию 454/Roche, в то время как все клоны, выделенные из ЦСЖ в ходе последних двух раундов селекции, секвенировали вручную.Все фаги крови из первого раунда селекции также были подвергнуты пиросеквенированию 454/Roche.Для инъекции фаговых клонов выбранные фаги амплифицировали в E. coli (BL5615) на чашках площадью 500 см2 при 37°С в течение 4 часов.Индивидуально отобранные и секвенированные вручную клоны размножали в среде TB.После выделения фага, очистки и удаления эндотоксина (как описано выше) внутривенно в одну хвостовую вену вводили 2×1010 фагов/животное в 300 мкл.
Предварительная обработка и качественная фильтрация данных секвенирования.Необработанные данные 454/Roche были преобразованы из стандартного двоичного формата карты потока (sff) в удобочитаемый формат Pearson (fasta) с использованием программного обеспечения поставщика.Дальнейшую обработку нуклеотидной последовательности проводили с использованием проприетарных программ и скриптов на языке C (неизданный программный пакет), как описано ниже.Анализ первичных данных включает строгие процедуры многоступенчатой ​​фильтрации.Чтобы отфильтровать чтения, которые не содержали действительной 12-членной вставной последовательности ДНК, чтения были последовательно выровнены по начальной метке (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп-метке (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) и фоновой вставке (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) с использованием глобального теста Нидлмана-Вунша.выравнивание, допускающее до 2 несоответствий на выравнивание31.Поэтому чтения без стартовых и стоповых тегов, а также чтения, содержащие фоновые вставки, т. е. выравнивания, превышающие допустимое количество несоответствий, были удалены из библиотеки.Что касается остальных прочтений, последовательность N-мерной ДНК, простирающаяся от начальной метки и заканчивающаяся перед конечной меткой, вырезалась из исходной прочитанной последовательности и дополнительно обрабатывалась (далее именуемая «вставка»).После трансляции вставки часть после первого стоп-кодона на 5'-конце праймера удаляется из вставки.Кроме того, нуклеотиды, ведущие к неполным кодонам на 3'-конце праймера, также были удалены.Для исключения вставок, содержащих только фоновые последовательности, были также удалены транслированные вставки, начинающиеся с аминокислотного паттерна «PAG».Пептиды с посттрансляционной длиной менее 3 аминокислот удаляли из библиотеки.Наконец, удалите избыточность в пуле вставок и определите частоту каждой уникальной вставки.Результаты этого анализа включали список нуклеотидных последовательностей (вставок) и их (прочитанных) частот (дополнительные рисунки 1c и 2).
Группировка вставок N-мерной ДНК по сходству последовательностей. Чтобы исключить ошибки секвенирования, характерные для 454/Roche (такие как проблемы с секвенированием гомополимерных удлинений), и удалить менее важные дублирующие элементы, ранее отфильтрованные вставки последовательностей ДНК N-меров (вставки) сортируются по сходству.вставки (допускается до 2 несовпадающих оснований) с использованием итеративного алгоритма, определяемого следующим образом: вставки сортируются сначала по их частоте (от наибольшей к наименьшей), а если они одинаковы, по их вторичной сортировке по длине (от самой длинной к самой короткой)).Таким образом, самые частые и длинные вставки определяют первую «группу».Групповая частота устанавливается на ключевую частоту.Затем каждую вставку, оставшуюся в отсортированном списке, пытались добавить в группу путем попарного выравнивания Нидлмана-Вунша.Если количество несоответствий, вставок или удалений в выравнивании не превышает пороговое значение 2, вставка добавляется в группу, а общая групповая частота увеличивается на то, как часто добавлялась вставка.Вставки, добавленные в группу, помечаются как использованные и исключаются из дальнейшей обработки.Если последовательность вставки не может быть добавлена ​​в уже существующую группу, последовательность вставки используется для создания новой группы с соответствующей частотой вставки и помечается как использованная.Итерация заканчивается, когда каждая последовательность вставки либо используется для формирования новой группы, либо может быть включена в уже существующую группу.Ведь сгруппированные вставки, состоящие из нуклеотидов, со временем транслируются в пептидные последовательности (пептидные библиотеки).Результатом этого анализа является набор вставок и соответствующих им частот, которые составляют количество последовательных чтений (дополнительный рис. 2).
Генерация мотива: на основе списка уникальных пептидов была создана библиотека, содержащая все возможные структуры аминокислот (аа), как показано ниже.Из пептида извлекали каждый возможный паттерн длины 3 и добавляли его обратный паттерн вместе с общей библиотекой мотивов, содержащей все паттерны (трипептиды).Библиотеки часто повторяющихся мотивов были секвенированы, а избыточность удалена.Затем для каждого трипептида в библиотеке мотивов мы проверили его присутствие в библиотеке с помощью вычислительных инструментов.В этом случае добавляется частота пептида, содержащего найденный мотив трипептида, и назначается мотиву в библиотеке мотивов («количество мотивов»).Результатом генерации мотива является двумерный массив, содержащий все вхождения трипептидов (мотивов) и их соответствующие значения, которые представляют собой количество ридов секвенирования, которые приводят к соответствующему мотиву, когда риды фильтруются, группируются и транслируются.Метрики подробно описаны выше.
Нормализация количества мотивов и соответствующих диаграмм рассеяния: количество мотивов для каждого образца нормализовали с использованием
где ni — количество прочтений, содержащих тему i.Таким образом, vi представляет процентную частоту прочтений (или пептидов), содержащих мотив i в образце.P-значения для ненормализованного количества мотивов были рассчитаны с использованием точного критерия Фишера.Что касается коррелограмм количества мотивов, корреляции Спирмена были рассчитаны с использованием нормализованного количества мотивов с R.
Для визуализации содержания аминокислот в каждой позиции в пептидной библиотеке были созданы веб-логограммы 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Во-первых, содержание аминокислот в каждом положении 12-мерного пептида хранится в матрице 20×12.Затем набор из 1000 пептидов, содержащих одинаковое относительное содержание аминокислот в каждом положении, генерируется в формате fasta-sequence и предоставляется в качестве входных данных для web-logo 3, который генерирует графическое представление относительного содержания аминокислот в каждом положении.для данной библиотеки пептидов.Для визуализации многомерных наборов данных были созданы тепловые карты с использованием разработанного внутри R инструмента (biosHeatmap, еще не выпущенный пакет R).Дендрограммы, представленные на тепловых картах, были рассчитаны с использованием метода иерархической кластеризации Уорда с метрикой евклидова расстояния.Для статистического анализа данных оценки мотивов значения P для ненормализованной оценки рассчитывали с использованием точного критерия Фишера.P-значения для других наборов данных были рассчитаны в R с использованием t-критерия Стьюдента или ANOVA.
Отобранные фаговые клоны и фаги без вставок вводили внутривенно через хвостовую вену (2×1010 фагов/животное в 300 мкл PBS).За десять минут до перфузии и последующей фиксации тем же животным внутривенно вводили 100 мкл лектина, меченного DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Через 60 минут после инъекции фага крысам перфузировали через сердце 50 мл PBS, а затем 50 мл 4% PFA/PBS.Образцы мозга дополнительно фиксировали в течение ночи в 4% PFA/PBS и замачивали в 30% сахарозе в течение ночи при 4°C.Образцы мгновенно замораживают в смеси ОСТ.Иммуногистохимический анализ замороженных образцов проводили при комнатной температуре на криосрезах размером 30 мкм, блокированных 1% БСА и инкубированных с поликлональными FITC-мечеными антителами против фага Т7 (Novus NB 600-376A) при 4 °С.Инкубируйте в течение ночи.Наконец, срезы промывали 3 раза PBS и исследовали с помощью конфокального лазерного микроскопа (Leica TCS SP5).
Все пептиды с минимальной чистотой 98% были синтезированы GenScript USA, биотинилированы и лиофилизированы.Биотин связывается через дополнительный тройной глициновый спейсер на N-конце.Проверьте все пептиды с помощью масс-спектрометрии.
Стрептавидин (Sigma S0677) смешивали с 5-кратным эквимолярным избытком биотинилированного пептида, биотинилированного пептида, ингибирующего ВАСЕ1, или комбинации (соотношение 3:1) биотинилированного пептида, ингибирующего ВАСЕ1, и пептида, ингибирующего ВАСЕ1, в 5–10% ДМСО/инкубировали в PBS.1 час при комнатной температуре перед инъекцией.Пептиды, конъюгированные со стрептавидином, вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг в одну из хвостовых вен крыс с полостью головного мозга.
Концентрацию стрептавидин-пептидных комплексов оценивали с помощью ИФА.Планшеты для микротитрования Nunc Maxisorp (Sigma) покрывали в течение ночи при 4°C 1,5 мкг/мл мышиного антитела против стрептавидина (Thermo, MA1-20011).После блокирования (блокирующий буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ ЭДТА, 0,05% NP40, 0,25% желатина, 1% БСА) при комнатной температуре в течение 2 часов планшет промывали 0,05% Tween-20/PBS (промывочный буфер) в течение 3 секунд, образцы СМЖ и плазмы добавляли в лунки, разведенные блокирующим буфером (плазма 1:10000, СМЖ 1). :115).Затем планшет инкубировали в течение ночи при 4°C с детектирующим антителом (1 мкг/мл, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239).После трех стадий промывки стрептавидин обнаруживали путем инкубации в растворе субстрата ТМБ (Roche) до 20 мин.После остановки развития окраски с помощью 1M H2SO4 измерьте оптическую плотность при 450 нм.
Функцию комплекса стрептавидин-пептид-ингибитор BACE1 оценивали с помощью Aβ(1-40) ELISA в соответствии с протоколом производителя (Wako, 294-64701).Вкратце, образцы ЦСЖ разводили в стандартном растворителе (1:23) и инкубировали в течение ночи при 4°С в 96-луночных планшетах, покрытых захватывающим антителом BNT77.После пяти стадий промывки добавляли HRP-конъюгированное антитело ВА27 и инкубировали в течение 2 часов при 4°C, после чего следовали пять стадий промывки.Aβ(1–40) обнаруживали путем инкубации в растворе ТМБ в течение 30 минут при комнатной температуре.После остановки развития окраски стоп-раствором измерьте оптическую плотность при 450 нм.Образцы плазмы подвергали твердофазной экстракции перед ИФА Aβ(1–40).Плазму добавляли к 0,2% ДЭА (Sigma) в 96-луночные планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.После последовательного промывания планшетов для ТФЭ (Oasis, 186000679) водой и 100% метанолом в планшеты для ТФЭ добавляли образцы плазмы и удаляли всю жидкость.Образцы промывали (сначала 5% метанолом, затем 30% метанолом) и элюировали смесью 2% NH4OH/90% метанола.После сушки элюата при 55°С в течение 99 мин при постоянном токе азота образцы восстанавливали в стандартных разбавителях и измеряли Aβ(1–40), как описано выше.
Как цитировать эту статью: Urich, E. et al.Доставка грузов в мозг с помощью транзитных пептидов, идентифицированных in vivo.наука.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Дж., Скьорринге Т., Томсен Л.Б. и Моос Т. Доставка макромолекулярных препаратов в мозг с помощью таргетной терапии.Журнал нейрохимии 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич И., Штайнбуш Х.В., Шмитц С. и Мартинес-Мартинес П. Доставка пептидных и белковых препаратов через гематоэнцефалический барьер.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, В. М. Гематоэнцефалический барьер: узкое место в разработке лекарств для головного мозга.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Дж.А., Стопа, Э.Г., и Берд, А. Перспективы улучшения доставки лекарств и нацеливания на головной мозг через путь сосудистое сплетение-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Модернизация биофармацевтических препаратов с помощью молекулярных троянских коней для доставки в мозг.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, транспорт пептидов, опосредованный рецептором WM, через гематоэнцефалический барьер.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Увеличьте проникновение в мозг и эффективность терапевтических антител с помощью моновалентных молекулярных шаттлов.Нейрон 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Бьен-Ли, Н. и др.Транспорт рецептора трансферрина (TfR) определяет поглощение мозгом аффинных вариантов антител TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).