Некоторые темы по устранению неполадок ЖХ никогда не устаревают, поскольку в практике ЖХ существуют проблемы, даже несмотря на то, что технология приборов со временем совершенствуется. Существует множество способов, при которых в системе ЖХ могут возникнуть проблемы, приводящие к плохой форме пика. При возникновении проблем, связанных с формой пика, краткий список возможных причин этих результатов помогает упростить процесс устранения неполадок.
Было весело писать эту колонку «Устранение неполадок в ЖХ» и думать о темах каждый месяц, потому что некоторые темы никогда не выходят из моды. В то время как в области хроматографических исследований определенные темы или идеи устаревают, поскольку их вытесняют более новые и лучшие идеи, в области устранения неполадок с момента появления первой статьи об устранении неполадок в этом журнале (LC Journal в то время), поскольку некоторые темы все еще актуальны) в 1983 году (1). За последние несколько лет я посвятил несколько разделов «Устранение неполадок в ЖХ» современным тенденциям, влияющим на жидкостную хроматографию (ЖХ) (например, относительное сравнение нашего понимания влияния давления на удерживание [2] Новые достижения). Наша интерпретация результатов ЖХ и способы устранения неполадок с помощью современных приборов для ЖХ. В выпуске этого месяца я продолжаю свою серию (3), которая началась в декабре 2021 года и была посвящена некоторым «жизненно важным» темам устранения неполадок в ЖХ — элементы, которые отлично подходят для любого специалиста по устранению неполадок, имеют важное значение, независимо от возраста Система, которую мы используем. Основная тема этой серии очень важна для знаменитой настенной диаграммы LCGC «Руководство по устранению неполадок в ЖХ» (4), висящей во многих лабораториях. В третьей части этой серии я решил сосредоточиться на вопросах, связанных с формой пика или характеристиками пика. Невероятно, но на настенной диаграмме перечислены 44 различные потенциальные причины плохой формы пика! Мы не можем подробно рассмотреть все эти проблемы в одной статье, поэтому в этой первой части по этой теме я сосредоточусь на некоторых из тех, которые я вижу чаще всего. Я надеюсь, что молодые и старые пользователи ЖХ найдут для себя полезные советы и напоминания по этой важной теме.
Я все чаще замечаю, что на вопросы по устранению неполадок отвечаю фразой «все возможно». Этот ответ может показаться простым, если рассматривать наблюдения, которые трудно интерпретировать, но я нахожу его часто уместным. При наличии множества возможных причин плохой формы пика важно сохранять непредвзятость при рассмотрении того, в чем может заключаться проблема, и уметь расставлять приоритеты среди потенциальных причин, чтобы начать наши усилия по устранению неполадок, сосредоточившись на наиболее распространенных возможностях. Этот момент очень важен. Возможно.
Ключевым шагом в любом упражнении по устранению неполадок — но, по-моему, недооцененным — является признание наличия проблемы, которую необходимо решить. Признание наличия проблемы часто означает признание того, что то, что происходит с инструментом, отличается от наших ожиданий, которые сформированы теорией, эмпирическими знаниями и опытом (5). «Форма пика», упомянутая здесь, на самом деле относится не только к форме пика (симметричный, асимметричный, гладкий, пушистый, передний край, хвост и т. д.), но и к ширине. Наши ожидания относительно фактической формы пика просты. Теория (6) хорошо подтверждает ожидание из учебника, что в большинстве случаев хроматографические пики должны быть симметричными и соответствовать форме гауссовского распределения, как показано на рисунке 1а. То, что мы ожидаем от ширины пиков, — более сложный вопрос, и мы обсудим эту тему в будущей статье. Другие формы пиков на рисунке 1 показывают некоторые другие возможности, которые можно было бы наблюдать, — другими словами, некоторые из способов, которыми что-то может пойти не так. В оставшейся части этой части мы обсудим некоторые конкретные примеры ситуаций, которые могут привести к появлению этих типов фигур.
Иногда пики вообще не наблюдаются на хроматограмме, где они, как ожидается, должны элюироваться. Приведенная выше настенная диаграмма показывает, что отсутствие пика (при условии, что образец действительно содержит целевой аналит в концентрации, которая должна сделать реакцию детектора достаточной для его обнаружения на фоне шума) обычно связано с какой-то проблемой прибора или неправильными условиями подвижной фазы (если они вообще наблюдаются). пики, как правило, слишком «слабые»). Краткий список потенциальных проблем и решений в этой категории можно найти в Таблице I.
Как упоминалось выше, вопрос о том, насколько следует допускать расширение пика, прежде чем обращать на него внимание и пытаться исправить его, является сложной темой, которую я рассмотрю в будущей статье. Мой опыт показывает, что значительное расширение пика часто сопровождается значительным изменением формы пика, а размывание пика встречается чаще, чем пред-пик или расщепление. Однако номинально симметричные пики также расширяются, что может быть вызвано несколькими различными причинами:
Каждая из этих проблем подробно обсуждалась в предыдущих выпусках Troubleshooting LC, и читатели, интересующиеся этими темами, могут обратиться к этим предыдущим статьям для получения информации о коренных причинах и потенциальных решениях этих проблем. Подробнее.
Размывание пика, размывание фронта пика и расщепление могут быть вызваны химическими или физическими явлениями, и список потенциальных решений этих проблем сильно различается в зависимости от того, имеем ли мы дело с химической или физической проблемой. Часто, сравнивая различные пики на хроматограмме, можно найти важные подсказки о том, какой из них является виновником. Если все пики на хроматограмме имеют схожую форму, причина, скорее всего, не физическая. Если затронут только один или несколько пиков, а остальные выглядят нормально, причина, скорее всего, химическая.
Химические причины размытия пиков слишком сложны, чтобы кратко обсуждать их здесь. Заинтересованного читателя отсылаем к недавнему выпуску «Устранение неполадок в LC» для более глубокого обсуждения (10). Однако, можно легко попробовать уменьшить массу вводимого аналита и посмотреть, улучшится ли форма пика. Если это так, то это хороший признак того, что проблема заключается в «перегрузке по массе». В этом случае метод должен быть ограничен вводом небольших масс аналита или хроматографические условия должны быть изменены таким образом, чтобы можно было получить хорошую форму пика даже при вводе больших масс.
Существует также множество потенциальных физических причин размытия пиков. Читатели, заинтересованные в подробном обсуждении возможностей, могут обратиться к другому недавнему выпуску «Устранение неполадок LC» (11). Одной из наиболее распространенных физических причин размытия пиков является плохое соединение в точке между инжектором и детектором (12). Крайний пример показан на рисунке 1d, полученном в моей лаборатории несколько недель назад. В этом случае мы построили систему с новым клапаном впрыска, который мы раньше не использовали, и установили контур впрыска небольшого объема с наконечником, который был отформован на капилляре из нержавеющей стали. После некоторых первоначальных экспериментов по устранению неполадок мы поняли, что глубина порта в статоре клапана впрыска была намного больше, чем мы привыкли, что привело к большому мертвому объему в нижней части порта. Эта проблема легко решается заменой контура впрыска другой трубкой, мы можем отрегулировать наконечник в правильное положение, чтобы устранить мертвый объем в нижней части порта.
Фронты пиков, подобные показанным на рисунке 1e, также могут быть вызваны физическими или химическими проблемами. Распространенной физической причиной переднего края является то, что слой частиц в колонке неплотно упакован или что частицы реорганизовались с течением времени. Как и в случае с размытием пиков, вызванным этим физическим явлением, лучший способ исправить это — заменить колонку и продолжить работу. По сути, формы пиков переднего края с химическим происхождением часто возникают из-за того, что мы называем «нелинейными» условиями удерживания. В идеальных (линейных) условиях количество аналита, удерживаемого неподвижной фазой (следовательно, фактор удерживания), линейно связано с концентрацией аналита в колонке. Хроматографически это означает, что по мере увеличения массы аналита, введенного в колонку, пик становится выше, но не шире. Эта связь нарушается, когда поведение удерживания нелинейно, и пики становятся не только выше, но и шире по мере ввода большей массы. Кроме того, нелинейные формы определяют форму хроматографических пиков, что приводит к появлению лидирующих или замыкающих края. Как и в случае с перегрузкой по массе, которая вызывает размытие пика (10), опережение пика, вызванное нелинейным удерживанием, также можно диагностировать путем уменьшения массы введенного аналита. Если форма пика улучшается, необходимо изменить метод, чтобы не превышать качество ввода, вызывающее передний фронт, или необходимо изменить хроматографические условия, чтобы минимизировать это поведение.
Иногда мы наблюдаем то, что кажется «разделенным» пиком, как показано на рисунке 1f. Первым шагом в решении этой проблемы является определение того, обусловлена ​​ли форма пика частичным совместным элюированием (т. е. наличием двух различных, но близко элюирующихся соединений). Если на самом деле есть два разных аналита, элюирующихся близко друг к другу, то это вопрос улучшения их разрешения (например, путем увеличения селективности, удерживания или количества тарелок), а кажущиеся «разделенные» пики связаны с физическими характеристиками, которые не имеют ничего общего с самой колонкой. Часто наиболее важным ключом к этому решению является то, все ли пики на хроматограмме демонстрируют разделенную форму или только один или два. Если это только один или два, то, вероятно, это проблема совместного элюирования; если все пики разделены, то, вероятно, это физическая проблема, скорее всего, связанная с самой колонкой.
Разделенные пики, связанные с физическими свойствами самой колонки, обычно возникают из-за частично заблокированных входных или выходных фритт или реорганизации частиц в колонке, что позволяет подвижной фазе течь быстрее, чем подвижная фаза в определенных областях формирования канала колонки, а в других областях (11). Частично забитую фритту иногда можно очистить, изменив направление потока через колонку; однако, по моему опыту, это обычно краткосрочное, а не долгосрочное решение. Это часто оказывается фатальным для современных колонок, если частицы рекомбинируют внутри колонки. На этом этапе лучше всего заменить колонку и продолжить.
Пик на рисунке 1g, также из недавнего случая в моей собственной лаборатории, обычно указывает на то, что сигнал настолько высок, что он достиг верхней границы диапазона отклика. Для детекторов оптического поглощения (в данном случае УФ-видимого), когда концентрация аналита очень высока, аналит поглощает большую часть света, проходящего через проточную ячейку детектора, оставляя очень мало света для обнаружения. В этих условиях электрический сигнал от фотодетектора сильно зависит от различных источников шума, таких как рассеянный свет и «темновой ток», что делает сигнал очень «размытым» по внешнему виду и независимым от концентрации аналита. Когда это происходит, проблему часто можно легко решить, уменьшив объем инъекции аналита — уменьшив объем инъекции, разбавив образец или сделав и то, и другое.
В школе хроматографии мы используем сигнал детектора (т. е. ось Y на хроматограмме) в качестве индикатора концентрации аналита в образце. Поэтому кажется странным видеть хроматограмму с сигналом ниже нуля, поскольку простая интерпретация заключается в том, что это указывает на отрицательную концентрацию аналита, что, конечно, физически невозможно. По моему опыту, отрицательные пики чаще всего наблюдаются при использовании детекторов оптического поглощения (например, УФ-видимого диапазона).
В этом случае отрицательный пик просто означает, что молекулы, элюирующие из колонки, поглощают меньше света, чем сама подвижная фаза непосредственно перед и после пика. Это может произойти, например, при использовании относительно низких длин волн детектирования (<230 нм) и добавок подвижной фазы, которые поглощают большую часть света на этих длинах волн. Такими добавками могут быть компоненты растворителя подвижной фазы, такие как метанол, или буферные компоненты, такие как ацетат или формиат. Фактически можно использовать отрицательные пики для подготовки калибровочной кривой и получения точной количественной информации, поэтому нет никаких фундаментальных причин избегать их как таковых (этот метод иногда называют «косвенным УФ-детектированием») (13). Однако, если мы действительно хотим полностью избежать отрицательных пиков, в случае детектирования поглощения наилучшим решением будет использование другой длины волны детектирования, чтобы аналит поглощал больше, чем подвижная фаза, или изменение состава подвижной фазы, чтобы они поглощали меньше света, чем аналиты.
Отрицательные пики также могут появляться при использовании обнаружения показателя преломления (RI), когда показатель преломления компонентов, отличных от аналита в образце, таких как матрица растворителя, отличается от показателя преломления подвижной фазы. Это также происходит при обнаружении в УФ-видимом диапазоне, но этот эффект, как правило, ослабевает по сравнению с обнаружением RI. В обоих случаях отрицательные пики можно минимизировать, более точно соответствуя составу матрицы образца составу подвижной фазы.
В третьей части, посвященной базовой теме устранения неполадок ЖХ, я рассмотрел ситуации, в которых наблюдаемая форма пика отличается от ожидаемой или нормальной формы пика. Эффективное устранение таких проблем начинается со знания ожидаемых форм пиков (основанных на теории или предыдущем опыте использования существующих методов), поэтому отклонения от этих ожиданий очевидны. Проблемы с формой пика имеют множество различных потенциальных причин (слишком широкий, с размытым хвостом, с передним фронтом и т. д.). В этой части я подробно рассмотрю некоторые из причин, с которыми я сталкиваюсь чаще всего. Знание этих деталей дает хорошую отправную точку для начала устранения неполадок, но не охватывает все возможности. Читатели, заинтересованные в более подробном списке причин и решений, могут обратиться к настенной таблице LCGC «Руководство по устранению неполадок ЖХ».
(4) Настенная диаграмма LCGC «Руководство по устранению неполадок в LC». https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелингер, Анализ данных и обработка сигналов в хроматографии (Elsevier, Нью-Йорк, 1998), стр. 43-96.
(8) Вахаб МФ, Дасгупта П.К., Каджо АФ и Армстронг Д.В., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.