Некоторые темы по поиску и устранению неполадок ЖХ никогда не устаревают, поскольку в практике ЖХ возникают проблемы, несмотря на то, что технология приборов со временем совершенствуется. Существует много причин, по которым проблемы могут возникнуть в системе ЖХ и в конечном итоге привести к плохой форме пика. Когда возникают проблемы, связанные с формой пика, краткий список возможных причин таких результатов помогает упростить поиск и устранение неисправностей.
Было весело писать эту колонку «Устранение неполадок LC» и думать о темах каждый месяц, потому что некоторые темы никогда не выходят из моды. В то время как в области исследований в области хроматографии некоторые темы или идеи устаревают, поскольку они вытесняются более новыми и лучшими идеями, в области устранения неполадок, начиная с первой статьи об устранении неполадок, появившейся в этом журнале (в то время LC Journal), поскольку некоторые темы все еще актуальны) в 1983 году (1). За последние несколько лет я сосредоточил внимание на нескольких Разделы «Устранение неполадок ЖХ», посвященные современным тенденциям, влияющим на жидкостную хроматографию (ЖХ) (например, относительное сравнение нашего понимания влияния давления на удерживание [2] Новые достижения). Наша интерпретация результатов ЖХ и способы устранения неполадок с помощью современных приборов ЖХ. Система, которую мы используем. Основная тема этой серии статей имеет прямое отношение к знаменитой настенной диаграмме LCGC «Руководство по устранению неполадок LC» (4), которая висит во многих лабораториях. В третьей части этой серии я решил сосредоточиться на вопросах, связанных с формой пика или его характеристиками. Невероятно, но настенная диаграмма перечисляет 44 различных потенциальных причины плохой формы пика! .Я надеюсь, что молодые и старые пользователи LC найдут для себя несколько полезных советов и напоминаний по этой важной теме.
Я обнаружил, что все чаще отвечаю на вопросы по устранению неполадок словами «все возможно». Этот ответ может показаться простым, если рассматривать наблюдения, которые трудно интерпретировать, но я нахожу его часто уместным. Учитывая множество возможных причин плохой формы пика, важно сохранять непредвзятость при рассмотрении возможной проблемы и иметь возможность расставить приоритеты потенциальных причин, чтобы начать наши усилия по устранению неполадок, сосредоточив внимание на наиболее распространенных возможностях, этот момент очень важен.
Ключевой шаг в любом устранении неполадок — но я думаю, что его недооценивают — это признание наличия проблемы, которую необходимо решить. Признание наличия проблемы часто означает признание того, что то, что происходит с инструментом, отличается от наших ожиданий, которые формируются теорией, эмпирическими знаниями и опытом (5). Упоминаемая здесь «форма пика» на самом деле относится не только к форме пика (симметричный, асимметричный, гладкий, пушистый, передний край, хвост и т. д.), но и к его ширине. Ожидания относительно фактической формы пиков просты. Теория (6) хорошо подтверждает хрестоматийное ожидание, что в большинстве случаев хроматографические пики должны быть симметричными и соответствовать форме распределения Гаусса, как показано на рис. 1а. То, что мы ожидаем от ширины пиков, является более сложным вопросом, и мы обсудим эту тему в следующей статье. Другие формы пиков на рис. мы потратим время на обсуждение некоторых конкретных примеров ситуаций, которые могут привести к этим типам фигур.
Иногда пики вообще не наблюдаются на хроматограмме, где они должны быть элюированы. Приведенная выше настенная диаграмма указывает на то, что отсутствие пика (при условии, что образец действительно содержит целевой аналит в концентрации, которая должна сделать отклик детектора достаточным, чтобы увидеть его выше шума) обычно связано с какой-либо проблемой прибора или неправильными условиями подвижной фазы (если они вообще наблюдаются).пики, обычно слишком «слабые»). Краткий список потенциальных проблем и решений в этой категории можно найти в Таблице I.
Как упоминалось выше, вопрос о том, насколько уширение пика следует допустить, прежде чем обращать на него внимание и пытаться его исправить, является сложной темой, которую я буду обсуждать в одной из будущих статей. Мой опыт показывает, что значительное расширение пика часто сопровождается значительным изменением формы пика, а хвост пика встречается чаще, чем пре-пик или расщепление. Однако номинально симметричные пики также уширяются, что может быть вызвано несколькими различными причинами:
Каждая из этих проблем подробно обсуждалась в предыдущих выпусках журнала Troubleshooting LC, и читатели, интересующиеся этими темами, могут обратиться к этим предыдущим статьям за информацией об основных причинах и возможных решениях этих проблем.Подробнее.
Пиковые хвосты, пиковые фронты и расщепление могут быть вызваны химическими или физическими явлениями, а список потенциальных решений этих проблем широко варьируется в зависимости от того, имеем ли мы дело с химической или физической проблемой. Пока, сравнивая различные пики в хроматограмме, вы можете найти важные подсказки, которые, скорее всего, не имеют, что у всех, кто, вероятно, не есть, что у них нет пиков. Затронутые, но остальные выглядят хорошо, причиной, скорее всего, химическим.
Химические причины схождения пиков слишком сложны, чтобы кратко обсуждать их здесь. Заинтересованный читатель может обратиться к недавнему выпуску «Устранение неполадок ЖХ» для более подробного обсуждения (10). Однако можно легко попытаться уменьшить массу вводимого аналита и посмотреть, улучшится ли форма пика. Если да, то это хороший признак того, что проблема заключается в «массовой перегрузке». хорошие формы пиков могут быть получены даже при введении больших масс.
Существует также много потенциальных физических причин пикового спада. Читатели, заинтересованные в подробном обсуждении возможностей, могут обратиться к другому недавнему выпуску «LC Troubleshooting» (11). Одной из наиболее распространенных физических причин пикового спада является плохое соединение в точке между инжектором и детектором (12). Крайний пример показан на рис. 1d, полученном в моей лаборатории несколько недель назад. который был отформован на капилляре из нержавеющей стали. После некоторых первоначальных экспериментов по устранению неполадок мы поняли, что глубина порта в статоре инжекторного клапана была намного больше, чем мы привыкли, что привело к большому мертвому объему на дне порта. Эта проблема легко решается путем замены контура инжекции другой трубкой, мы можем отрегулировать наконечник в правильном положении, чтобы устранить мертвый объем на дне порта.
Фронты пиков, подобные показанным на рис. 1е, также могут быть вызваны физическими или химическими проблемами. Обычной физической причиной переднего фронта является то, что слой частиц в колонке плохо упакован или что частицы реорганизовались с течением времени. te, удерживаемый стационарной фазой (следовательно, коэффициент удерживания), линейно связан с концентрацией аналита в колонке. Хроматографически это означает, что по мере увеличения массы аналита, вводимого в колонку, пик становится выше, но не шире. Эта зависимость нарушается, когда характер удерживания нелинейный, и пики становятся не только выше, но и шире по мере введения большей массы. перегрузку, которая вызывает хвост пика (10), опережение пика, вызванное нелинейным удерживанием, также можно диагностировать путем уменьшения массы вводимого аналита. Если форма пика улучшается, метод необходимо изменить, чтобы не превышать качество ввода, которое вызывает передний фронт, или необходимо изменить хроматографические условия, чтобы свести к минимуму это поведение.
Иногда мы наблюдаем то, что кажется «расщепленным» пиком, как показано на рис. 1f. Первым шагом в решении этой проблемы является определение того, вызвана ли форма пика частичной совместной элюцией (т. е. присутствием двух различных, но близко элюирующихся соединений). Если на самом деле два разных аналита элюируются близко друг к другу, то это вопрос улучшения их разрешения (например, за счет повышения селективности, удерживания или количества чашек), а кажущиеся «раздвоенные» пики связаны с физическими характеристиками и не имеют ничего общего с самой колонкой. Часто наиболее важным ключом к этому решению является то, все ли пики на хроматограмме имеют расщепленную форму или только один или два. Если это только один или два, это, вероятно, проблема совместного элюирования;если все пики разделены, это, вероятно, физическая проблема, скорее всего, связанная с самой колонкой.
Расщепленные пики, связанные с физическими свойствами самой колонки, обычно возникают из-за частичной блокировки фритты на входе или выходе или реорганизации частиц в колонке, что позволяет подвижной фазе течь быстрее, чем подвижная фаза, в определенных областях формирования канала колонки, в других областях (11). Частично забитую фритту иногда можно очистить, изменив направление потока через колонку;однако, по моему опыту, это обычно краткосрочное, а не долгосрочное решение. Это часто фатально для современных колонок, если частицы рекомбинируют внутри колонки. В этот момент лучше заменить колонку и продолжить.
Пик на рис. 1g, также полученный недавно в моей собственной лаборатории, обычно указывает на то, что сигнал настолько высок, что достиг верхней границы диапазона отклика. Для детекторов оптического поглощения (в данном случае УФ-видимого) при очень высокой концентрации аналита аналит поглощает большую часть света, проходящего через проточную кювету детектора, оставляя очень мало света для обнаружения. В этих условиях на электрический сигнал фотодетектора сильно влияют различные источники шума, такие как рассеянный свет и « темновой ток», что делает сигнал очень «нечетким» по внешнему виду и независимым от концентрации аналита.Когда это происходит, проблему часто можно легко решить, уменьшив объем вводимого аналита — уменьшив объем впрыска, разбавив образец или и то, и другое.
В школе хроматографии мы используем сигнал детектора (т. е. ось Y на хроматограмме) в качестве индикатора концентрации аналита в образце. Поэтому кажется странным видеть хроматограмму с сигналом ниже нуля, поскольку простая интерпретация состоит в том, что это указывает на отрицательную концентрацию аналита, что, конечно, физически невозможно. По моему опыту, отрицательные пики чаще всего наблюдаются при использовании детекторов оптического поглощения (например, УФ-видимого).
В этом случае отрицательный пик просто означает, что молекулы, элюирующиеся из колонки, поглощают меньше света, чем сама подвижная фаза непосредственно перед и после пика. Это может произойти, например, при использовании относительно низких длин волн обнаружения (<230 нм) и добавок подвижной фазы, которые поглощают большую часть света на этих длинах волн. Такими добавками могут быть компоненты растворителя подвижной фазы, такие как метанол, или буферные компоненты, такие как ацетат или формиат. se (этот метод иногда называют «непрямым УФ-детектированием») (13). Однако, если мы действительно хотим вообще избежать отрицательных пиков, в случае определения поглощения лучшим решением будет использование другой длины волны детектирования, чтобы аналит поглощал больше, чем подвижная фаза, или изменить состав подвижной фазы, чтобы они поглощали меньше света, чем аналиты.
Отрицательные пики также могут появляться при использовании определения показателя преломления (ПП), когда показатель преломления компонентов, отличных от анализируемого вещества в образце, таких как матрица растворителя, отличается от показателя преломления подвижной фазы. Это также происходит при обнаружении в УФ-видимой области, но этот эффект имеет тенденцию к ослаблению по сравнению с обнаружением по показателю преломления. В обоих случаях отрицательные пики можно свести к минимуму путем более точного подбора состава матрицы образца к составу подвижной фазы.
В третьей части, посвященной основной теме устранения неполадок LC, я обсуждал ситуации, в которых наблюдаемая форма пика отличается от ожидаемой или нормальной формы пика. Эффективное устранение таких проблем начинается со знания ожидаемых форм пиков (на основе теории или предыдущего опыта использования существующих методов), поэтому отклонения от этих ожиданий очевидны. Проблемы с формой пиков имеют много различных потенциальных причин (слишком широкий, хвост, передний фронт и т. д.). приступить к устранению неполадок, но не охватывает все возможности. Читатели, заинтересованные в более подробном списке причин и решений, могут обратиться к настенной диаграмме LCGC «Руководство по устранению неполадок LC».
(4) Настенная диаграмма LCGC «Руководство по устранению неполадок ЖХ». https://www.chromographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелингер, Анализ данных и обработка сигналов в хроматографии (Эльзевир, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, 1998), стр. 43-96.
(8) Вахаб М.Ф., Дасгупта П.К., Каджо А.Ф. и Армстронг Д.В., Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.