Спасибо за посещение Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий», чтобы перемещаться по трем слайдам одновременно, или используйте кнопки слайдера в конце, чтобы перемещаться по трем слайдам одновременно.
Самоорганизующиеся нейронные органеллы представляют собой многообещающую платформу in vitro для моделирования развития и болезней человека. Однако органоидам не хватает связности, которая существует in vivo, что ограничивает созревание и препятствует интеграции с другими контурами, которые контролируют поведение. Здесь мы показываем, что кортикальные органоиды, полученные из человеческих стволовых клеток, трансплантированные в соматосенсорную кору новорожденных голых крыс, развивают зрелые типы клеток, которые интегрируются в сенсорные и мотивационные контуры. МРТ выявила посттрансплантационный рост органоидов в нескольких линиях стволовых клеток и животных, в то время как одноядерный анализ выявил прогрессирование кортикогенеза и возникновение программы транскрипции, зависящей от активности. Действительно, трансплантированные кортикальные нейроны демонстрируют более сложные морфологические, синаптические и внутренние мембранные свойства, чем их аналоги in vitro, что позволяет обнаруживать нейрональные дефекты у пациентов с синдромом Тимоти. Анатомическое и функциональное отслеживание показало, что трансплантированные органеллы получают таламокортикальные и кортикокортикальные входы, а записи нейронной активности in vivo показывают, что эти входы могут генерировать сенсорные реакции в клетках человека. Наконец, кортикальные органоиды распространяют аксоны по всему мозгу крысы, и их оптогенетическая активация приводит к поведению поиска вознаграждения. Таким образом, трансплантированные нейроны коры человека созревают и участвуют в цепях хозяина, которые контролируют поведение. Мы ожидаем, что этот подход облегчит обнаружение фенотипов на уровне нитей в клетках, полученных от пациента, которые не могут быть обнаружены другими способами.
Развитие человеческого мозга представляет собой замечательный самоорганизующийся процесс, в котором клетки размножаются, дифференцируются, мигрируют и соединяются, образуя функциональные нейронные цепи, которые далее совершенствуются посредством сенсорного опыта. Ключевой проблемой в понимании развития человеческого мозга, особенно в контексте заболеваний, является отсутствие доступа к мозговой ткани. Самоорганизующиеся органеллы, включая органоиды коры человека (hCO; также известные как сферы коры человека), могут генерировать 2,3,4,5,6. Однако несколько ограничений ограничивают их более широкое применение для понимания развития и функционирования нейронных цепей. В частности, неясно, ограничивается ли созревание hCO отсутствием определенных микросредовых и сенсорных входов, присутствующих in vivo. Кроме того, поскольку hCO не интегрированы в цепи, которые могут генерировать поведенческие результаты, их полезность в моделировании генетически сложных и поведенческих нейропсихиатрических расстройств в настоящее время ограничена.
Трансплантация hCO в неповрежденный живой мозг может преодолеть эти ограничения. Предыдущие исследования показали, что человеческие нейроны, трансплантированные в кору грызунов, способны выживать, проецироваться и общаться с клетками грызунов7,8,9,10,11,12. Однако эти эксперименты обычно проводятся на взрослых животных, что может ограничивать синаптическую и аксональную интеграцию. Здесь мы описываем парадигму трансплантации, в которой мы трансплантировали 3D hCO, полученный из клеток hiPS, в первичную соматосенсорную кору (S1) иммунодефицитных крыс на ранней стадии пластического развития. Трансплантированные нейроны hCO (t-hCO) претерпевают существенное созревание, получают таламокортикальные и корково-кортикальные входы, которые вызывают сенсорные реакции, и расширяют аксональные проекции в мозг крысы, чтобы управлять поведением поиска вознаграждения. Длительное созревание t-hCO выявило нейрональные дефекты у пациентов с синдромом Тимоти (СТ), тяжелым генетическим заболеванием, вызванным мутациями в чувствительном к потенциалу кальциевом канале L-типа CaV1.2 (кодируется CACNA1C).
Для изучения человеческих корковых нейронов в контурах in vivo мы стереотаксически трансплантировали неповрежденный 3D hCO в S1 ранних постнатальных бестимусных крыс (3-7 дней постнатально) (рис. 1a и расширенные данные рис. 1a-c). На этом этапе таламокортикальные и кортикокортикальные аксональные проекции еще не завершили свою иннервацию S1 (ссылка 13). Таким образом, этот подход разработан для максимизации интеграции t-hCO при минимизации воздействия на эндогенные контуры. Для визуализации расположения t-hCO у живых животных мы провели T2-взвешенные МРТ-реконструкции мозга крыс через 2-3 месяца после трансплантации (рис. 1b и расширенные данные, рис. 1d). t-hCO3 легко наблюдалось, а измерения объема t-hCO3 были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (Расширенные данные, рис. 1d,e; P > 0,05). t-hCO3 легко наблюдалось, а измерения объема t-hCO3 были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (Расширенные данные, рис. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных резов (расширенные данные, рис. 1d, e; P>0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных сечений (расширенные данные, рис. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO （扩展数据图1d、e;P > 0,05).很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO t-hCO легко наблюдал, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных резов (расширенные данные, рис. 1d, e; P>0,05). t-hCO3 легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO3 были аналогичны рассчитанным для фиксированных сечений (расширенные данные, рис. 1d, e; P > 0,05).Мы определили t-hCO у 81% трансплантированных животных примерно через 2 месяца после трансплантации (n = 72 животных; hCO из 10 линий клеток hiPS; линии клеток hiPS в Дополнительной таблице 1). Из них 87% были расположены в коре головного мозга (рис. 1c). Выполняя серийные сканирования МРТ в несколько временных точек у одной и той же трансплантированной крысы, мы обнаружили девятикратное увеличение объема t-hCO в течение 3 месяцев (рис. 1d и расширенные данные, рис. 1f). Трансплантированные животные имели высокий уровень выживаемости (74%) через 12 месяцев после трансплантации (расширенные данные, рис. 1g и Дополнительная таблица 2), и не было обнаружено явных нарушений моторики или памяти, глиоза или электроэнцефалограммы (ЭЭГ). Данные рис. 1g и дополнительная таблица 2). 1h–m и 3e).
a, Схема экспериментального дизайна. hCO, полученный из клеток hiPS, был трансплантирован в S1 новорожденных голых крыс на 30-60-й день дифференциации. b, T2-взвешенные коронарные и горизонтальные МРТ-изображения, показывающие t-hCO в S1 через 2 месяца после трансплантации. Масштабная линейка: 2 мм. c, Количественная оценка показателей успешности приживления, показанная для каждой линии клеток hiPS (n = 108, числа внутри полос указывают количество t-hCO на линию клеток hIPS) и корковое или подкорковое расположение (n = 88). d, МРТ-изображение коронарной артерии (слева; масштабная линейка: 3 мм) и соответствующая объемная 3D-реконструкция (масштабная линейка: 3 мм), показывающая увеличение t-hCO за 3 месяца. e, Обзор паттернов t-hCO в коре головного мозга крыс. Масштабная линейка: 1 мм. f, Типичные иммуноцитохимические изображения t-hCO, показанные сверху слева направо (во время дифференциации): PPP1R17 (возраст 4 месяца), NeuN (возраст 8 месяцев), SOX9 и GFAP (возраст 8 месяцев), PDGFRα; (8 месяцев), MAP2 (8 месяцев) и IBA1 (8 месяцев). Масштабная линейка: 20 мкм. Коэкспрессия HNA указывает на клетки человеческого происхождения. g, snRNA-seq: унифицированная визуализация с уменьшением размерности проекции и многообразия (UMAP) всех высококачественных ядер t-hCO после интеграции Сера (n=3 образца t-hCO, n=2 линии клеток hiPS). Астроциты, клетки линии астроцитов; cyc prog, циркулирующие предшественники; GluN DL, глубокие глутаматергические нейроны; GluN DL/SP, глубокие и субламеллярные глутаматергические нейроны; GluN UL, глутаматергические нейроны верхнего слоя; олигодендроциты, олигодендроциты; OPC, клетки-предшественники олигодендроцитов; RELN, рилиновые нейроны. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) генов, экспрессия которых значительно повышена (скорректированное P < 0,05, кратность изменения > 2, экспрессия не менее чем в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) генов, экспрессия которых значительно повышена (скорректированное P < 0,05, кратность изменения > 2, экспрессия не менее чем в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, Анализ обогащения терминов Онтологии генов (GO) для генов со резервной активацией (скорректированный P <0,05, краткие изменения > 2, экспрессия хотя бы на 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированное P<0,05, кратность изменения >2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05, 2, 10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ,变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменений> 2, экспрессируется хотя бы на 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термина ограничения. h, гены были значительно повышены (скорректированное P < 0,05, кратность изменения > 2, экспрессировались по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения.Пунктирная линия указывает на значение aq, равное 0,05. i, UMAP-визуализация типов клеток GluN в t-hCO с использованием переноса метки из референтного набора данных 22 snRNA-seq взрослой моторной коры. CT — кортикоталамические клетки, ET — экстрацеребральные клетки, IT — внутренние теленцефалические клетки, NP — ближняя проекция.
Затем мы оценили цитоархитектуру и общий клеточный состав t-hCO. Окрашивание эндотелиальных клеток крыс антителами выявило васкуляризацию с t-hCO, в то время как окрашивание IBA1 выявило наличие микроглии крысы по всему трансплантату (рис. 1f и расширенные данные, рис. 3c,d). Иммуноокрашивание выявило клетки, положительные по ядерному антигену человека (HNA), коэкспрессирующие PPP1R17 (кортикальные предшественники), NeuN (нейроны), SOX9 и GFAP (глиальные клетки) или PDGFRα (предшественники олигодендроцитов) (рис. 1f). Для изучения клеточного состава t-hCO с разрешением одной клетки мы провели секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) примерно через 8 месяцев дифференциации. Фильтрация большого объема и удаление ядер крысы дали 21 500 высококачественных карт мононуклеарных клеток человека (рис. 1g и расширенные данные, рис. 4a,b). Паттерны экспрессии типичных маркеров типов клеток идентифицировали кластеры основных классов корковых клеток, включая глубокие и поверхностные глутаматергические нейроны, циркулирующие предшественники, олигодендроциты и линию астроцитов (рис. 1g, расширенные данные, рис. 4c и дополнительная таблица 3). Иммуноокрашивание для SATB2 и CTIP2 показало, что, несмотря на наличие корковых подтипов, t-hCO не показал четкой анатомической стратификации (расширенные данные, рис. 3a). Совпадающие по стадии snRNA-seq hCO производили в целом схожие классы клеток, за несколькими исключениями, включая отсутствие олигодендроцитов и наличие ГАМКергических нейронов, что может отражать ранее описанные благоприятные условия in vitro для латеральных клеток-предшественников15 (расширенные данные, рис. 4f – i и дополнительная таблица 4). Анализ дифференциальной экспрессии генов выявил значительные различия в глутаматергических нейронах между t-hCO и hCO (дополнительная таблица 5), включая активацию наборов генов, связанных с созреванием нейронов, таких как синаптическая сигнализация, дендритная локализация и активность потенциалзависимых каналов (рисунок 1h и дополнительная таблица 5). таблица 6). Соответственно, кортикальные глутаматергические нейроны t-hCO демонстрировали ускоренное транскрипционное созревание.
Чтобы выяснить, связаны ли эти транскрипционные изменения в t-hCO с морфологическими различиями между hCO in vitro и t-hCO in vivo, мы реконструировали соответствующие по стадии заполненные биоцитином hCO и hCO в острых срезах после 7–8 месяцев дифференциации. нейроны hCO (рис. 2a). нейроны t-hCO были значительно крупнее, имели в 1,5 раза больший диаметр сомы, вдвое больше дендритов и общее шестикратное увеличение общей длины дендритов по сравнению с hCO in vitro (рис. 2b). Кроме того, мы наблюдали значительно более высокую плотность дендритных шипиков в нейронах t-hCO, чем в нейронах hCO (рис. 2c). Это говорит о том, что нейроны t-hCO претерпевают обширное удлинение и ветвление дендритов, что в сочетании с продолжающейся пролиферацией клеток может способствовать интенсивному росту t-hCO после трансплантации (рис. 1d и расширенные данные, рис. 1f). Это побудило нас исследовать электрофизиологические свойства. Емкость мембраны была в восемь раз выше (расширенные данные, рис. 8d), мембранный потенциал в состоянии покоя был более гиперполяризованным (приблизительно 20 мВ), а инъекция тока вызывала более высокую максимальную скорость возбуждения в нейронах t-hCO, чем в нейронах hCO. in vitro (рис. 2d), e), что согласуется с более крупными и сложными морфологическими особенностями t-hCO. Кроме того, частота спонтанных возбуждающих постсинаптических токовых событий (EPSC) была значительно выше в нейронах t-hCO (рис. 2f), что позволяет предположить, что повышенная плотность дендритных шипиков, наблюдаемая в нейронах t-hCO, связана с функциональной возбудимостью. половой синапс. Мы подтвердили незрелый характер нейронов hCO in vitro, записав меченые глутаматергические нейроны (расширенные данные, рис. 6a-c).
а, 3D-реконструкция нейронов hCO и t-hCO, заполненных биоцитином, после 8 месяцев дифференцировки. б) Количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). б) Количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б) количественная оценка морфологических признаков (n=8 нейронов hCO, n=6 нейронов t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 и ***P<0,0001). b, 形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 b, 形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б) количественная оценка морфологических признаков (n=8 нейронов hCO, n=6 нейронов t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 и ***P<0,0001).c, 3D-реконструкция дендритных ветвей hCO и t-hCO после 8 месяцев дифференциации. Красные звездочки обозначают предполагаемые дендритные шипики. Количественная оценка плотности дендритных шипиков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; **P = 0,0092). d, Количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). d, Количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). г, количественная характеристика мембранного потенциала (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). d, 静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元;***P < 0,0001). d, 静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元;***P < 0,0001). г, количественная характеристика мембранного потенциала (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). e. Повторяющаяся активация потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванная увеличением инъекций тока, и количественная оценка максимальной частоты активации (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). e. Повторяющаяся активация потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванная увеличением инъекций тока, и количественная оценка максимальной частоты активации (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). д, повторное действие способности возбуждения в hCO и t-hCO, вызванное изменение тока, и количественная мощность максимальной скорости активации (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, повторное включение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной частоты включения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P < 0,0001). e, 通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 д, многократно активируемая способность действия hCO и t-hCO, вызванное источником подачи тока, и количественная мощность максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, повторяющаяся активация потенциалов действия hCO и t-hCO, вызванная увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной частоты активации (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P < 0,0001). f, Спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференциации и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). f, Спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференциации и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P < 0,0001). е, спонтанные ВПСТ (сВПСТ) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественную оценку частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференциации и количественной оценки частоты синаптических событий (n=25 нейронов hCO, n=17 нейронов t-hCO; ***P<0,0001). f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . е, спонтанные ВПСТ (сВПСТ) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественную оценку частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференциации и количественной оценки частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P < 0,0001).Для bf hCO и t-hCO в линии 1208-2 были взяты из одной и той же партии дифференциации, поддерживаемой параллельно. g. Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) генов, значительно активируемых (скорректированное P < 0,05, кратность изменения > 2, экспрессируемых по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO с наборами генов, зависящих от активности как раннего ответа (ERG), так и позднего ответа (LRG), идентифицированными в исследовании мышей in vivo16 и специфичных для человека LRG из нейронов in vitro17. g. Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) генов, значительно активируемых (скорректированное P < 0,05, кратность изменения > 2, экспрессируемых по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO с наборами генов, зависящих от активности как раннего ответа (ERG), так и позднего ответа (LRG), идентифицированными в исследовании мышей in vivo16 и специфичных для человека LRG из нейронов in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (одна дополнительная генетическая критерий Фишера) генов со снижением активации (скорректированный P <0,05, кратность изменений > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как ранних (ERG), так и позднего (LRG) генов, определений их активности, определяемых в определении на мышах in vivo16 и особенностях для человека LRG из нейронов in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (точный односторонний тест Фишера) генов со значительной активацией (скорректированное P < 0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с наборами глутаматергических нейронов hCO как ранних (ERG), так и поздних (LRG) зависимых от активности генов, идентифицированных у мышей in vivo16 и специфичных для человека LRG из нейронов in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比, t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2, 在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F Ишер 精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 体外神经元17 中的人类特异性LRG. g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）)体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG。 г, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменений> 2, не менее 10% Анализ увеличения набора генов (одностороннее определение теста Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего генов, определение от активности ответа (LRG), идентифицированных в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах в vitro17, специфичные для человека. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированное P < 0,05, кратность изменения > 2, по крайней мере 10% Анализ обогащения генов раннего ответа (ERG) и позднего ответа (точный односторонний критерий Фишера) гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные у мышей in vivo16 и нейронов in vitro17. Специфичные для человека LRG.Пунктирная линия указывает на скорректированное по Бонферрони значение P, равное 0,05. h, экспрессия гена GluN (псевдоупаковка и масштабирование каждого гена) была значительно повышена в репликах snRNA-seq генов LRG в глутаматергических нейронах t-hCO. i, иммуноокрашивание, показывающее экспрессию SCG2 в нейронах t-hCO (вверху) и hCO (внизу). Белые стрелки указывают на клетки SCG2+. Масштабная линейка: 25 мкм. Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение.
На основе повышенной активности t-hCO, наблюдаемой в срезах ex vivo, snRNA-seq выявил зависимую от активности регуляцию генных транскриптов в t-hCO по сравнению с hCO in vitro. Глутаматергические нейроны t-hCO экспрессировали более высокие уровни генов, регулирующих активность позднего ответа (рис. 2g,h), которые были обнаружены в предыдущих исследованиях на нейронах мышей и человека16,17. Например, BDNF18, SCG2 и OSTN, специфичный для приматов ген, регулирующий активность, показали повышенную экспрессию в нейронах t-hCO по сравнению с нейронами hCO (рис. 2g-i). Таким образом, нейроны t-hCO продемонстрировали улучшенные характеристики созревания по сравнению с нейронами hCO по данным транскрипционного, морфологического и функционального анализов.
Для дальнейшей оценки связи созревания t-hCO с развитием человеческого мозга мы провели транскриптомные сравнения фетальных и взрослых типов корковых клеток19,20 и взрослых21,22, а также обширные данные по экспрессии корковых генов23 во время развития (расширенные данные, рис. 5). ). с предыдущей работой24, глобальный статус созревания транскриптома hCO и t-hCO на 7–8 месяце дифференциации в целом соответствует времени развития in vivo и наиболее эквивалентен поздней фетальной жизни (расширенные данные, рис. 5a). В частности, мы наблюдали повышенную зрелость транскриптома в t-hCO по сравнению с соответствующим по возрасту hCO, а также активацию транскриптома, связанную с синаптогенезом, астрогенезом и миелинизацией (расширенные данные, рис. 5b-d). На клеточном уровне мы обнаружили доказательства более тонкого подтипа коры в t-hCO, с кластерами глутаматергических нейронов, перекрывающимися с подтипами взрослых нейронов L2/3, L5 и L6 (рисунок 1i). Напротив, перекрытие кластеров между глутаматергическими нейронами t-hCO и фетальными корковыми нейронами было более ограниченным в середине беременности (расширенные данные, рисунок 5e-j). Чтобы определить, являются ли нейроны t-hCO функционально схожими с постнатальными неокортикальными нейронами человека, мы провели электрофизиологические записи и анатомические реконструкции пирамидальных нейронов человека L2/3 в острых срезах постнатальной коры человека (расширенные данные, рисунок 7a). Электрофизиологические свойства пирамидальных нейронов L2/3 были аналогичны свойствам пирамидальных нейронов t-hCO (расширенные данные, рисунок 7e). Морфологически нейроны L2/3 из постнатальных образцов человека были больше похожи на t-hCO, чем на hCO, хотя клетки L2/3 были длиннее, содержали больше ветвей в целом и имели более высокую плотность шипиков (рис. 3g и расширенные данные, рис. 7b-). G).
а, трансплантация hCO, продуцируемого контрольными и TS hiPS клеточными линиями, новорожденным крысам. б, 3D-реконструкция заполненных биоцитином нейронов t-hCO после 8 месяцев дифференциации. в, количественная оценка средней длины дендритов (n = 19 контрольных нейронов, n = 21 TS нейрон; **P = 0,0041). d, 3D-реконструированные дендритные ветви из контрольной группы и группы TS t-hCO через 8 месяцев дифференциации и количественная оценка плотности дендритных шипиков (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 нейрон группы TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструированные дендритные ветви из контрольной группы и группы TS t-hCO через 8 месяцев дифференциации и количественная оценка плотности дендритных шипиков (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 нейрон группы TS, ***P < 0,0001). г, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контрольной группы и t-hCO TS через 8 месяцев дифференциации и количественная оценка плотности дендритных шипиков (n=16 контрольных нейронов, n=21 нейрон TS, ***P<0,0001). d, 分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支,以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元, n = 21 个 ts 神经, *** p <0,0001 ）。 г, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-реконструкция контрольных дендритных ветвей и TS t-hCO через 8 месяцев дифференциации и количественная оценка плотности дендритных шипиков (n=16 контрольных нейронов, n=21 нейрон TS, ***P<0,0001).Красные звездочки обозначают предполагаемые дендритные шипики. e, спонтанные EPSC в контрольных и TS t-hCO нейронах после 8 месяцев дифференциации. f, график кумулятивной частоты и количественная оценка частоты и амплитуды синаптических событий (n=32 контрольных нейрона, n=26 TS нейронов; **P=0,0076 и P=0,8102). g, анализ Шолла TS и контрольных нейронов в hCO и t-hCO. Пунктирные линии показывают человеческие L2/3 постнатальные пирамидальные нейроны для сравнения (n = 24 контрольных t-hCO нейрона, n = 21 TS t-hCO нейрон, n = 8 контрольных hCO нейронов и n = 7 TS hCO нейронов). Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение
Способность t-hCO воспроизводить морфологические и функциональные особенности нейронов коры головного мозга человека на высоком уровне побудила нас исследовать, можно ли использовать t-hCO для выявления фенотипов заболеваний. Мы сосредоточились на TS, тяжелом нарушении нейроразвития, вызванном мутациями с усилением функции в гене, кодирующем CaV1.2, который инициирует зависимую от активности транскрипцию генов в нейронах. Мы получили hCO от трех пациентов с TS, несущих наиболее распространенную замену (p.G406R), и трех контрольных пациентов (рис. 3a). После трансплантации мы обнаружили, что морфология дендритов была изменена в нейронах TS по сравнению с контрольными пациентами (рис. 3b и расширенные данные, рис. 8a,b), с двукратным увеличением числа первичных дендритов и общим увеличением среднего значения и общим уменьшением длины дендритов (рис. 3c и расширенные данные, рис. 8c). Это было связано с повышенной плотностью шипиков и повышенной частотой спонтанных EPSC в TS по сравнению с контрольными нейронами (рис. 3d–f и расширенные данные, рис. 8g). Дальнейший анализ выявил закономерности аномального ветвления дендритов в t-hCO TS по сравнению с контрольными, но не в in vitro TS hCO на аналогичной стадии дифференциации (рис. 3g). Это согласуется с нашими предыдущими сообщениями о зависимом от активности сокращении дендритов в TS и подчеркивает способность этой трансплантационной платформы обнаруживать фенотипы заболеваний in vivo.
Затем мы спросили, в какой степени клетки t-hCO функционально интегрированы в S1 крысы. S1 у грызунов получает сильные синаптические входы от ипсилатеральных вентральных базальных и задних ядер таламуса, а также от ипсилатеральной моторной и вторичной соматосенсорной коры и контралатерального S1 (рис. 4а). Чтобы восстановить схему иннервации, мы инфицировали hCO вирусом бешенства-dG-GFP/AAV-G и трансплантировали hCO крысе S1 через 3 дня. Мы наблюдали плотную экспрессию GFP в нейронах ипсилатерального S1 и вентральных базальных ганглиев через 7–14 дней после трансплантации (рис. 4b, c). Кроме того, окрашивание антителами таламического маркера нетрина G1 выявило наличие таламических окончаний в t-hCO (рис. 4d, e). Чтобы оценить, могут ли эти афферентные проекции вызывать синаптические ответы в клетках t-hCO, мы провели полноклеточную регистрацию клеток человека в острых срезах таламокортикального слоя. Электрическая стимуляция S1 крысы, внутренней капсулы, белого вещества, волокон вблизи t-hCO или оптогенетическая активация опсин-экспрессирующих таламических окончаний в t-hCO индуцировала коротколатентные EPSC в нейронах t-hCO, подвергнутых воздействию антагониста рецептора AMPA NBQX. (рис. 4f, g и расширенные данные, рис. 9a–g). Эти данные показывают, что t-hCO анатомически интегрирован в мозг крысы и может активироваться тканью хозяина крысы.
a, Схематическая диаграмма эксперимента по отслеживанию бешенства. b, Экспрессия GFP и специфического для человека STEM121 между t-hCO и корой головного мозга крысы (верхняя панель). Также показана экспрессия GFP в ипсилатеральном вентральном базальном ядре (VB) крысы (внизу слева) и ипсилатеральном S1 (внизу справа). Масштабная линейка, 50 мкм. Красные квадраты представляют области мозга, где были сделаны изображения. c, количественное определение клеток, экспрессирующих GFP (n = 4 крысы). d, e — Таламические терминали Netrin G1+ в t-hCO. d показывает коронарный срез, содержащий t-hCO и ядра VB. Масштабная линейка, 2 мм. e показывает экспрессию Netrin G1 и STEM121 в нейронах t-hCO (слева) и VB (справа). Масштабная линейка, 50 мкм. Оранжевая пунктирная линия обозначает границу t-hCO. f, g, Текущие следы нейронов t-hCO после электрической стимуляции у крысы S1 (f) или внутренней капсулы (g), с (фиолетовым) или без (черным) NBQX (слева). Амплитуды EPSC с NBQX и без него (n = 6 нейронов S1, *P = 0,0119; и n = 6 нейронов внутренней капсулы, **P = 0,0022) (в центре). Процент нейронов t-hCO, показывающих EPSC в ответ на электрическую стимуляцию крысы S1 (f) или внутренней капсулы (g) (справа). aCSF, искусственная спинномозговая жидкость. h, схематическая диаграмма эксперимента по визуализации 2P (слева). Экспрессия GCaMP6s в t-hCO (посередине). Масштабная линейка, 100 мкм. Покадровая съемка флуоресценции GCaMP6s (справа). i, Z-оценка флуоресценции спонтанной активности. j, схематическая иллюстрация стимуляции усов. k, траектории флуоресценции 2P с z-оценкой в ​​одном испытании, выровненные с отклонением усов в нулевой момент времени (пунктирная линия) в клетках-образцах. l, усредненные по популяции ответы z-оценки всех клеток, выровненные с отклонением усов в нулевой момент времени (пунктирная линия) (красная) или случайно сгенерированные временные метки (серые). m. Схематическая диаграмма эксперимента по оптической маркировке. n, необработанные кривые напряжения из клетки-образца t-hCO во время стимуляции синим лазером или отклонения усов. Красные стрелки указывают на первые всплески, вызванные светом (вверху) или вызванные отклонением усов (внизу). Серая заливка указывает на периоды отклонения усов. o, пиковые формы световых волн и ответы отклонения усов. p, всплески одной попытки, выровненные с отклонением усов в клетках-образцах. 0 указывает на отклонение усов (пунктирная линия). q, усредненная по популяции частота срабатывания z-оценки для всех светочувствительных клеток, выровненная с отклонением вибрисс в нулевое время (пунктирная линия) (красная) или случайно сгенерированными временными метками (серая). r, Доля светочувствительных единиц, значительно модулированных отклонением вибрисс (n = 3 крысы) (слева). Пиковая латентность z-оценки (n = 3 крысы; n = 5 (светло-зеленый), n = 4 (темно-зеленый) и n = 4 (голубой) единиц модуляции отклонения вибрисс на крысу) (справа). Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение
Затем мы задались вопросом, может ли t-hCO активироваться сенсорными стимулами in vivo. Мы трансплантировали hCO, экспрессирующий генетически кодируемые кальциевые индикаторы GCaMP6, крысам S1. Через 150 дней мы провели волоконную фотометрию или двухфотонную кальциевую визуализацию (рис. 4h и расширенные данные, рис. 10a). Мы обнаружили, что клетки t-hCO проявляли синхронизированную ритмическую активность (рис. 4i, расширенные данные, рис. 10b и дополнительное видео 1). Чтобы охарактеризовать пиковую активность t-hCO, мы провели внеклеточные электрофизиологические записи у анестезированных трансплантированных крыс (расширенные данные, рис. 10c-f). Мы сгенерировали стереотаксические координаты из изображений МРТ; таким образом, эти зарегистрированные единицы представляют собой предполагаемые человеческие нейроны, хотя электрофизиология сама по себе не позволяет определить вид происхождения. Мы наблюдали синхронизированные всплески активности (расширенные данные, рис. 10d). Всплески длились около 460 мс и были разделены периодами молчания около 2 с (расширенные данные, рис. 10d, e). Отдельные единицы в среднем выстреливали около трех выстрелов за всплеск, что составляет примерно 73% зарегистрированных единиц за всплеск. Активность отдельных единиц была сильно коррелирована, и эти корреляции были выше, чем у единиц, идентифицированных у невакцинированных животных, зарегистрированных в тех же условиях (расширенные данные, рис. 10f). Чтобы дополнительно охарактеризовать спайковые реакции идентифицированных человеческих нейронов, мы провели эксперименты по световому мечению на анестезированных крысах, которым трансплантировали hCO, экспрессирующий светочувствительный катионный канал родопсин 2 (hChR2), через который нейроны t-hCO распознают коротколатентное (менее 10 мс) в ответ на стимулы синего света (рис. 4m–o). Нейроны t-hCO демонстрировали всплески спонтанной активности на частотах, аналогичных наблюдаемым при кальциевой визуализации, а также электрофизиологических записях, выполненных в t-hCO при отсутствии световой маркировки (расширенные данные, рис. 10c-g). Спонтанной активности не наблюдалось на соответствующих стадиях hCO, зарегистрированных in vitro. Чтобы оценить, может ли t-hCO активироваться сенсорными стимулами, мы ненадолго отклонили вибриссы крысы от t-hCO (рис. 4j,m и расширенные данные, рис. 10h,k). Согласно предыдущим исследованиям8,10, подгруппа клеток t-hCO показала повышенную активность в ответ на отклонение вибрисс, чего не наблюдалось при сравнении данных со случайными временными отметками (рис. 4k–q и расширенные данные, рис. 10h–q). Действительно, около 54% ​​опто-меченых отдельных единиц показали значительно повышенную скорость возбуждения после стимуляции вибрисс, достигнув пика примерно через 650 мс (рис. 4r). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что t-hCO получает соответствующие функциональные входы и может активироваться под воздействием внешних стимулов.
Затем мы исследовали, может ли t-hCO активировать цепи у крыс для управления поведением. Сначала мы исследовали, проецируются ли аксоны нейронов t-hCO в окружающие ткани крысы. Мы инфицировали hCO лентивирусом, кодирующим hChR2, слитый с EYFP (hChR2-EYFP). Через 110 дней мы наблюдали экспрессию EYFP в ипсилатеральных областях коры, включая слуховую, моторную и соматосенсорную кору, а также в подкорковых областях, включая полосатое тело, гиппокамп и таламус (рис. 5а). Чтобы оценить, могут ли эти эфферентные проекции вызывать синаптические ответы в клетках крысы, мы оптически активировали клетки t-hCO, экспрессирующие hChR2-EYFP, регистрируя клетки коры головного мозга крысы в ​​острых срезах мозга. Активация аксонов t-hCO синим светом индуцировала коротколатентные EPSC в пирамидальных нейронах коры головного мозга крыс, которые блокировались NBQX (рис. 5b–g). Кроме того, эти ответы могли блокироваться тетродотоксином (TTX) и восстанавливаться 4-аминопиридином (4-AP), что позволяет предположить, что они были вызваны моносинаптическими связями (рис. 5e).
a, Схематическая диаграмма отслеживания аксонов (слева). Экспрессия t-hCO EYFP (справа). Масштабная линейка, 100 мкм. A1, слуховая кора, ACC, передняя поясная кора, d. полосатое тело, дорсальное полосатое тело, HPC, гиппокамп; диафрагма, латеральная перегородка, mPFC, медиальная префронтальная кора, piri, грушевидная кора, v. полосатое тело, вентральное полосатое тело, VPM, вентропостомедиальное ядро ​​таламуса, VTA, вентральная область покрышки. Красные квадраты представляют области мозга, где были сделаны изображения. b, Схематическая диаграмма эксперимента по стимуляции. c, d, Примеры реакции на вызванный синим светом фототок (вверху) и напряжение (внизу) в человеческих (c) EYFP+ t-hCO или крысиных (d) EYFP- клетках. e, f, Текущие следы нейронов крысы после стимуляции синим светом аксонов t-hCO с TTX и 4-AR (зеленый), TTX (серый) или aCSF (черный) (e), с (фиолетовым) или без (черный) ) ) NBQX (e). g, задержка ответов, вызванных синим светом в клетках крысы (n = 16 клеток); горизонтальные полосы указывают среднюю задержку (7,13 мс) (слева). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с использованием NBQX или без него (n = 7 клеток; ***P < 0,0001) (в середине). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с использованием NBQX или без него (n = 7 клеток; ***P < 0,0001) (в середине). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Амплитуда светоиндуцированных EPSC, зарегистрированных с использованием или без использования NBQX (n = 7 клеток; ***P < 0,0001) (в центре).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Амплитуда светоиндуцированных EPSC, зарегистрированных с использованием или без использования NBQX (n = 7 клеток; ***P < 0,0001) (в центре).Процент клеток крысы, показывающих EPSC, которые реагируют на синий свет (справа). h, Схематическая диаграмма поведенческой задачи. d0, день 0. i. Показатели образцовых животных на 1-й день (слева) или 15-й день (справа) обучения. Среднее количество облизываний, выполненных в первый день (слева) или в пятнадцатый день (справа в центре) (n = 150 попыток с синим светом, n = 150 попыток с красным светом; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в первый день (слева) или в пятнадцатый день (справа в центре) (n = 150 попыток с синим светом, n = 150 попыток с красным светом; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в первый день (слева) или в пятнадцатый день (в центре справа) (n = 150 попыток с синим светом, n = 150 попыток с красным светом; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в первый день (слева) или в пятнадцатый день (в центре справа) (n = 150 попыток с синим светом, n = 150 попыток с красным светом; ***P < 0,0001).Кумулятивное лизание для испытаний с красным и синим светом на 1-й день (в центре слева) или на 15-й день (справа). NS, незначимо. j,k, Поведенческие характеристики всех животных, которым трансплантировали t-hCO, экспрессирующий hChR2-EYFP (j) или контрольный флуорофор (k) на 1-й или 15-й день (hChR2-EYFP: n = 9 крыс, ** P = 0,0049; контроль: n = 9, P = 0,1497). l, Эволюция оценки предпочтений (n = 9 hChR2, n = 9 контроль; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция оценки предпочтений (n = 9 hChR2, n = 9 контроль; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Выбор показателя Эволюция (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Эволюция оценки предпочтений (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, 偏好评分的演变（n = 9 hChR2, n = 9 对照；**P < 0,001, ***P < 0,0001). l, 偏好评分的演变（n = 9 hChR2, n = 9 对照；**P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателей выбора (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Эволюция оценок предпочтений (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, Экспрессия FOS в ответ на оптогенетическую активацию t-hCO в S1. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественной оценки (n = 3 на группу; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (справа). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественной оценки (n = 3 на группу; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (справа). Показаны изображения экспрессии ФОС (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественной оценки (n = 3 на группу; *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001) (справа).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 Показаны изображения экспрессии ФОС (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественной оценки (n = 3 на группу; *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001) (справа).Масштабная линейка: 100 мкм. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка BLA, базолатеральной миндалины, MDT, дорсомедиального таламического ядра, PAG, периакведуктального серого вещества.
Наконец, мы задались вопросом, может ли t-hCO модулировать поведение крыс. Чтобы проверить это, мы трансплантировали hCO, экспрессирующий hChR2-EYFP, в S1, а через 90 дней имплантировали оптические волокна в t-hCO для подачи света. Затем мы обучили крыс с помощью модифицированной парадигмы оперантного обусловливания (рис. 5h). Мы поместили животных в камеру для поведенческих тестов и случайным образом применяли 5-секундные синие (473 нм) и красные (635 нм) лазерные стимулы. Животные получали вознаграждение в виде воды, если они лизали во время стимуляции синим светом, но не лизали во время стимуляции красным светом. В первый день обучения животные не показали никакой разницы в облизывании при стимуляции синим или красным светом. Однако на 15-й день животные, которым трансплантировали hCO, экспрессирующий hChR2-EYFP, показали более активное лизание при стимуляции синим светом по сравнению со стимуляцией красным светом. Эти изменения в поведении лизания не наблюдались у контрольных животных, которым трансплантировали hCO, экспрессирующий контрольный флуорофор (уровень успешности обучения: hChR2 89%, EYFP 0%, рисунок 5i-1 и дополнительное видео 2). Эти данные свидетельствуют о том, что клетки t-hCO могут активировать нейроны крыс для стимуляции поведения поиска вознаграждения. Чтобы выяснить, какие нейронные цепи t-hCO крыс могут быть вовлечены в эти поведенческие изменения, мы оптогенетически активировали t-hCO у обученных животных и собрали ткани через 90 минут. Иммуногистохимия выявила экспрессию белка FOS, зависящего от активности, в нескольких областях мозга, участвующих в мотивированном поведении, включая медиальную префронтальную кору, медиальный таламус и периакведуктальное серое вещество, которое было выражено либо у нестимулированных контрольных животных, либо у животных. рис. 5m). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что t-hCO может модулировать нейронную активность крыс для управления поведением.
Нейронные органоиды представляют собой многообещающую систему для изучения развития и заболеваний человека in vitro, но они ограничены отсутствием связей между цепями, которые существуют in vivo. Мы разработали новую платформу, в которой мы трансплантировали hCO в S1 иммунодефицитных ранних постнатальных крыс для изучения развития и функционирования человеческих клеток in vivo. Мы показали, что t-hCO развивает зрелые типы клеток, не наблюдаемые in vitro28, и что t-hCO анатомически и функционально интегрирован в мозг грызунов. Интеграция t-hCO в нейронные цепи грызунов позволила нам установить связь между клеточной активностью человека и изученным поведением животных, показав, что нейроны t-hCO могут модулировать нейронную активность крысы, чтобы управлять поведенческими реакциями.
Описанная нами платформа имеет несколько преимуществ по сравнению с предыдущими исследованиями по трансплантации человеческих клеток в мозг грызунов. Во-первых, мы трансплантировали hCO в развивающуюся кору ранних постнатальных крыс, что может способствовать анатомической и функциональной интеграции. Во-вторых, мониторинг МРТ t-hCO позволил нам изучить положение и рост трансплантата у живых животных, что позволило нам проводить долгосрочные исследования на нескольких животных и установить надежность нескольких линий клеток hiPS. Наконец, мы трансплантировали целые органоиды, а не изолированные суспензии отдельных клеток, которые менее разрушительны для человеческих клеток и могут способствовать интеграции и образованию нейронов коры человека в мозге крыс.
Мы признаем, что, несмотря на достижения в этой платформе, временные, пространственные и межвидовые ограничения препятствуют формированию нейронных цепей человека с высокой точностью, даже после трансплантации на ранней стадии развития. Например, неясно, представляет ли спонтанная активность, наблюдаемая в t-hCO, фенотип развития, аналогичный ритмической активности, наблюдаемой во время развития коры, или это связано с отсутствием подавляющих типов клеток, присутствующих в t-hCO. Аналогично, неясно, в какой степени отсутствие ламинирования в t-hCO влияет на связность цепей30. Дальнейшая работа будет сосредоточена на интеграции других типов клеток, таких как человеческая микроглия, человеческие эндотелиальные клетки и различные пропорции ГАМКергических интернейронов, как показано с использованием сборки 6 in vitro, а также на понимании того, как нейронная интеграция и обработка могут происходить в измененном t-hCO. транскрипционном, синаптическом и поведенческом уровнях в клетках, полученных от пациентов.
В целом, эта платформа in vivo представляет собой мощный ресурс, который может дополнить развитие человеческого мозга in vitro и исследования заболеваний. Мы ожидаем, что эта платформа позволит нам обнаружить новые фенотипы на уровне нитей в иным образом неуловимых клетках, полученных от пациентов, и протестировать новые терапевтические стратегии.
Мы генерировали hCO2.5 из клеток HiPS, как описано ранее. Чтобы инициировать производство hCO из клеток hiPS, культивируемых на фидерных слоях, интактные колонии клеток hiPS были удалены из культуральных чашек с помощью диспазы (0,35 мг/мл) и перенесены в пластиковые культуры со сверхнизким прикреплением, содержащие чашки со средой для культивирования клеток hiPS. (Corning) с добавлением двух ингибиторов SMAD дорсоморфина (5 мкМ; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 мкМ; 1614, Tocris) и ингибитора ROCK Y-27632 (10 мкМ; S1049, Selleckchem). В течение первых 5 дней среда для клеток hiPS менялась ежедневно, и добавлялись дорсоморфин и SB-431542. На шестой день в суспензии нейральные сфероиды были перенесены в нейронную среду, содержащую нейробазальный-A (10888, Life Technologies), добавку B-27 без витамина A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополненную эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems) до 24 дня. С 25 по 42 день среда была дополнена нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) и нейротрофином 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) со сменой среды через день. На шестой день в суспензии нейральные сфероиды были перенесены в нейронную среду, содержащую нейробазальный-A (10888, Life Technologies), добавку B-27 без витамина A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополненную эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems) до 24 дня. С 25 по 42 день среда была дополнена нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) и нейротрофином 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) со сменой среды через день.На шестой день суспензии нейральные сфероиды были перенесены в нейронную среду, содержащую Neurobasal-A (10888, Life Technologies), добавку B-27 без витамина A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и добавки эпидермального роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и вызывают рост фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. и стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня.С 25-го по 42-й день в среду добавляли нейротрофический фактор головного мозга (BDNF; 20 нг/мл, Peprotech) и нейротрофин 3 (NT3; 20 нг/мл, Peprotech), меняя среду через день.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A (10888, Life Technologies), 不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Технологии）并辅以表皮生长因子（EGF；20 нг мл-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 нг мл-1；НИОКР Системы）直至第24 часа.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 Neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a 的b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1:100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1:100 ， Life Технологии） 表皮 生长 因子 （（（20 нг мл-1 ； системы исследований и разработок） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 нг мл-1；системы исследований и разработок）直至第24天。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин-нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20). нг мл-1; R&D Systems) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; На 6-й день суспензии нейросфер были переведены на добавку, содержащую нейробазальный-А (10888, Life Technologies), добавку B-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), нейтрализованный пенициллином стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; R&D Systems) до 24-го дня. R&D Systems) до 24-го дня.С 25 по 42 день в культуральную среду через день добавляли нейротрофический фактор мозга (BDNF; 20 нг мл-1, Peprotech) и нейротрофический фактор 3 (NT3; 20 нг мл-1, Peprotech). Среду меняли один раз.Начиная с 43-го дня hCO поддерживали в недополненной нейробазальной среде A (NM; 1088022, Thermo Fisher) со сменой среды каждые 4–6 дней. Для получения hCO из клеток hiPS, культивируемых в условиях без фидера, клетки hiPS инкубировали с Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) при 37°C в течение 7 минут, диссоциировали на отдельные клетки и высевали на планшеты AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) с плотностью 3 × 106 отдельных клеток на лунку в среде Essential 8, дополненной ингибитором ROCK Y-27632 (10 мкМ; S1049, Selleckchem). Через 24 часа среду в лунках пипетировали вверх и вниз в среду, содержащую среду Essential 6 (A1516401, Life Technologies) с добавлением дорзоморфина (2,5 мкМ; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 мкМ; 1614). , Tocrida). Со 2-го по 6-й день среду Essential 6 ежедневно заменяли дорзоморфином и добавкой SB-431542. С шестого дня суспензии нейросфер переносили в нейробазальную среду и поддерживали, как описано выше.
Все процедуры с животными проводились в соответствии с рекомендациями по уходу за животными, одобренными Административным комитетом по уходу за лабораторными животными Стэнфордского университета (APLAC). Беременные эутимические крысы RNU (rnu/+) были приобретены (Charles River Laboratories) или размещены. Животных содержали в 12-часовом цикле свет-темнота с едой и водой ad libitum. Детеныши голых крыс (FOXN1–/–) в возрасте от трех до семи дней были идентифицированы по росту незрелых вибрисс перед выбраковкой. Щенков (самцов и самок) анестезировали 2-3% изофлураном и помещали на стереотаксическую раму. Была проведена трепанация черепа диаметром приблизительно 2-3 мм выше S1 с сохранением целостности твердой мозговой оболочки. Затем используйте иглу 30-G (приблизительно 0,3 мм) сразу за краниотомией, чтобы проткнуть твердую мозговую оболочку. Затем нанесите HCO на тонкий парафильм размером 3×3 см и удалите излишки среды. Используя шприц Гамильтона, прикрепленный к игле 23 G, 45°, осторожно наберите hCO в самый дистальный конец иглы. Затем установите шприц на шприцевой насос, подключенный к стереотаксическому устройству. Затем поместите кончик иглы над предварительно сделанным проколом шириной 0,3 мм в твердой мозговой оболочке (z = 0 мм) и сузьте шприц на 1–2 мм (z = приблизительно –1,5 мм), пока игла не окажется между твердой мозговой оболочкой A. не образуется плотное уплотнение. Затем поднимите шприц к центру кортикальной поверхности на z = -0,5 мм и введите hCO со скоростью 1–2 мкл в минуту. После завершения инъекции hCO иглу оттягивают со скоростью 0,2–0,5 мм в минуту, кожу зашивают, и щенка немедленно помещают на теплую грелку до полного выздоровления. Некоторых животных пересаживали билатерально.
Все процедуры с животными проводились в соответствии с рекомендациями по уходу за животными, одобренными APLAC Стэнфордского университета. Крысы (более 60 дней после трансплантации) подвергались анестезии 5% изофлураном и анестезировались 1-3% изофлураном во время визуализации. Для визуализации использовался активно экранированный горизонтальный скважинный сканер 7 Тесла Bruker (Bruker Corp.) с градиентным приводом International Electric Company (IECO), экранированная градиентная вставка с внутренним диаметром 120 мм (600 мТл/м, 1000 Тл/м/с) с использованием AVANCE. III, восьмиканальных многокатушечных РЧ и многоядерных возможностей, а также сопутствующей платформы Paravision 6.0.1. Запись проводилась с использованием активно развязанной объемной РЧ-катушки с внутренним диаметром 86 мм и четырехканальной криоохлаждаемой РЧ-катушки только для приема. Аксиальный 2D Turbo-RARE (время повторения = 2500 мс, время эха = 33 мс, 2 усреднения) с 16 захватами срезов, толщина среза 0,6–0,8 мм, содержащий 256 × 256 образцов. Сигналы были получены с помощью квадратурной приемопередающей объемной РЧ-катушки с внутренним диаметром 2 см (Rapid MR International, LLC). Наконец, используйте встроенные функции оценки поверхности Imaris (BitPlane) для 3D-рендеринга и анализа объема. Успешная трансплантация была определена как та, при которой области непрерывного T2-взвешенного МРТ-сигнала были сформированы в трансплантированном полушарии. Отторжение трансплантата было определено как трансплантат, который не дал областей непрерывного T2-взвешенного МРТ-сигнала в трансплантированном полушарии. Субкортикальный t-hCO был исключен из последующего анализа.
Для стабильной экспрессии GCaMP6s в hCO для двухфотонной кальциевой визуализации клетки hiPS были инфицированы pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro с последующим выбором антибиотиков. Вкратце, клетки были диссоциированы с помощью EDTA и суспендированы в 1 мл среды Essential 8 при плотности приблизительно 300 000 клеток в присутствии полибрена (5 мкг/мл) и 15 мкл вируса. Затем клетки были инкубированы в суспензии в течение 60 минут и высеяны при плотности 50 000 клеток на лунку. После слияния клетки были обработаны 5-10 мкг мл-1 пуромицина в течение 5-10 дней или до появления стабильных колоний. Острое инфицирование hCO было выполнено, как описано ранее5 с некоторыми модификациями. Вкратце, перенесите hCO 30-45 дней в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки Eppendorf, содержащие 100 мкл нервной среды. Затем приблизительно 90 мкл среды удаляют, в пробирку добавляют 3-6 мкл лентивируса с высоким титром (от 0,5 x 108 до 1,2 x 109), и hCO переносят в инкубатор на 30 минут. Затем добавьте 90-100 мкл среды в каждую пробирку и верните пробирки в инкубатор на ночь. На следующий день перенесите hCO в свежую нервную среду в планшетах с низким прикреплением. Через 7 дней hCO переносят в 24-луночные стеклянные планшеты для визуализации и оценки качества инфекции. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE и pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE были созданы с помощью VectorBuilder. Лентивирус используется в большинстве экспериментов, поскольку он интегрирован в геном хозяина, что позволяет экспрессировать репортерный ген в инфицированных клеточных линиях. Для последующего наблюдения за бешенством, на 30-45 день hCO коинфицировали rabies-ΔG-eGFP и AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмида № 67528, Addgene), тщательно промывали в течение 3 дней и трансплантировали крысам в S1 и поддерживали in vivo в течение 7-14 дней.
Для иммуноцитохимии животных анестезировали и транскардиально перфузировали PBS, а затем 4% параформальдегидом (PFA в PBS; Electron Microscopy Sciences). Мозг фиксировали в 4% PFA в течение 2 часов или в течение ночи при температуре 4°C, криоконсервировали в 30% сахарозе в PBS в течение 48-72 часов и заливали в 1:1, 30% сахарозу: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek), и коронарные срезы были сделаны на 30 мкм с использованием криостата (Leica). Для иммуногистохимии толстых срезов животных перфузировали PBS, а мозг препарировали и делали коронарные срезы на 300-400 мкм с использованием вибратома (Leica), и срезы были зафиксированы в 4% PFA в течение 30 минут. Затем криосрезы или толстые срезы промывали PBS, блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре (10% нормальной ослиной сыворотки (NDS) и 0,3% Тритона X-100, разведенного в PBS) и блокировали блокирующим раствором при 4°C. – Инкубация Криосрезы инкубировали в течение ночи, а толстые срезы инкубировали в течение 5 дней. Были использованы следующие основные антитела: анти-NeuN (мышиный, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиный, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличий, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышиный, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кроличий, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кроличий, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кроличий, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышиный, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam). Были использованы следующие основные антитела: анти-NeuN (мышиный, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиный, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличий, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышиный, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кроличий, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кроличий, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кроличий, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышиный, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кроличий, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышиный, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кроличий, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (козий, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). В качестве основных антител были использованы: анти-NeuN (мышиный, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиный, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличий, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышиный, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кроличий, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кроличий, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кроличий, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышиный, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кроличий, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышиный, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кроличий, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (козий, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是:抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Дако），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Санта-Крус），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Дако），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Санта-Крус），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，НИОКР Системы）1:20, ;Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam)。В качестве первичных антител использовались: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako). , анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, антитело Atlas), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).Затем срезы промывали PBS и инкубировали со вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре (замороженные срезы) или в течение ночи при 4°C (толстые срезы). Использовали вторичные антитела Alexa Fluor (Life Technologies), разведенные 1:1000 в блокирующем растворе. После промывки PBS ядра визуализировали с помощью Hoechst 33258 (Life Technologies). Наконец, слайды помещали на микроскоп с покровными стеклами (Fisher Scientific) с использованием Aquamount (Polysciences) и анализировали на флуоресцентном микроскопе Keyence (анализатор BZ-X) или конфокальном микроскопе Leica TCS SP8 (Las-X) на изображении. Изображения обрабатывали с помощью программы ImageJ (Fiji). Для количественной оценки доли человеческих нейронов в t-hCO и коре головного мозга крысы были сделаны прямоугольные изображения шириной 387,5 мкм в центре t-hCO, на краю коры головного мозга крысы или около него. Границы трансплантата определялись путем оценки изменений прозрачности ткани, ядер HNA+ и/или наличия аутофлуоресценции ткани. На каждом изображении общее количество клеток NeuN+ и HNA+ делилось на общее количество клеток NeuN+ в той же области. Чтобы гарантировать, что подсчитываются только клетки с ядрами в плоскости изображения, в расчет включаются только клетки, которые также являются Hoechst+. Два изображения, разделенные по крайней мере на 1 мм, усреднялись для уменьшения статистической ошибки.
За неделю до сбора образцов поместите животных с трансплантатом hCO (примерно 8 месяцев дифференциации) в темную комнату с подстриженными усами для минимизации сенсорной стимуляции. Выделение ядер проводили, как описано ранее, с некоторыми изменениями. Вкратце, t-hCO и hCO разрушали с помощью механического лизиса клеток детергентом и стеклянной тканевой мельницы объемом 2 мл (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Затем сырые ядра отфильтровывали с помощью фильтра 40 мкм и центрифугировали при 320 g в течение 10 минут при 4 °C перед выполнением градиента плотности сахарозы. После этапа центрифугирования (320 g в течение 20 мин при 4°C) образцы были ресуспендированы в 0,04% BSA/PBS с добавлением 0,2 единиц ингибитора РНКазы мкл-1 (40 u мкл-1, AM2682, Ambion) и пропущены через фильтр с размером пор 40 мкм. Затем диссоциированные ядра были ресуспендированы в PBS, содержащем 0,02% BSA, и загружены на чип Chromium Single Cell 3′ (оценочное восстановление 8000 клеток на дорожку). Библиотеки snRNA-seq были подготовлены с помощью набора Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были подготовлены с помощью набора Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были подготовлены с использованием набора Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq подготовили с использованием Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотека snRNA-seq была подготовлена ​​с использованием набора Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Библиотеки из разных образцов были объединены и секвенированы компанией Admera Health на NovaSeq S4 (Illumina).
Уровни экспрессии генов для каждого предполагаемого ядерного штрихкода были количественно оценены с использованием пакета программного обеспечения для анализа 10x Genomics CellRanger (версия 6.1.2). В частности, чтения были сопоставлены с комбинацией референсных геномов человека (GRCh38, Ensemble, версия 98) и крысы (Rnor_6.0, Ensemble, версия 100), созданных с помощью команды mkref и с использованием count с командой –include-introns=TRUE для количественного включения показаний, сопоставленных с интронными областями. Для образцов t-hCO человеческие ядра были идентифицированы на основе консервативного требования, чтобы по крайней мере 95% всех сопоставленных прочтений соответствовали человеческому геному. Все последующие анализы были выполнены на отфильтрованном массиве штрихкодов, выведенном из CellRanger с использованием пакета R (версия 4.1.2) Seurat (версия 4.1.1)32.
Чтобы гарантировать включение в последующий анализ только высококачественных ядер, для каждого образца был реализован итеративный процесс фильтрации. Сначала идентифицируются и удаляются низкокачественные ядра с менее чем 1000 найденными уникальными генами и более чем 20% от общего числа митохондрий. Затем матрица исходных генов была нормализована с помощью регуляризованной отрицательной биномиальной регрессии с использованием функции sctransform(vst.flavor="v2"), которая также определила 3000 наиболее вариабельных генов с использованием параметров по умолчанию. Сокращение размерности было выполнено для верхних вариабельных генов с использованием анализа главных компонент (PCA) с параметрами по умолчанию с использованием размерности набора данных 30 (dims = 30 было выбрано на основе визуального осмотра участков колена и использовалось для всех образцов и ансамблевых анализов). Затем мы провели несколько раундов итеративной кластеризации (разрешение = 1) для классификации генов на основе аномально низкого количества генов (медиана ниже 10-го процентиля), аномально высокого количества митохондриальных генов (медиана выше 95-го процентиля) для выявления и удаления предполагаемых клеток низкого качества. кластеры и/или высокая доля предполагаемых близнецов, идентифицированных с помощью пакета DoubletFinder33 (средняя оценка DoubletFinder выше 95-го процентиля). образцы t-hCO (n=3) и образцы hCO (n=3) были интегрированы отдельно с использованием функции IntegrateData с указанными выше параметрами. Затем был выполнен еще один раунд качественной фильтрации интегрированного набора данных, как описано выше.
После удаления ядер низкого качества интегрированный набор данных был сгруппирован (разрешение = 0,5) и встроен для визуализации UMAP34. Гены-маркеры для каждого кластера были определены с помощью функции FindMarkers с параметрами по умолчанию, рассчитанными из нормализованных данных экспрессии генов. Мы идентифицируем и классифицируем основные классы клеток, объединяя фетальные и взрослые референтные наборы данных коры с экспрессией маркерных генов 19,20,21,35 и аннотацией. В частности, циркулирующие предшественники были идентифицированы по экспрессии MKI67 и TOP2A. Кластеры предшественников были определены по отсутствию митотических транскриптов, высокому перекрытию с мультипотентными кластерами глиальных предшественников, описанными в поздней метафазе фетальной коры, и экспрессии EGFR и OLIG1. Мы используем термин астроцит для охвата нескольких состояний дифференцировки астроцитов, от поздней радиальной глии до созревания астроцитов. Кластеры астроцитов экспрессируют высокие уровни SLC1A3 и AQP4 и, как было показано, картируются с подтипами фетальной радиальной глии и/или взрослых астроцитов. OPC экспрессируют PDGFRA и SOX10, в то время как олигодендроциты экспрессируют маркеры миелинизации (MOG и MYRF). Глутаматергические нейроны были идентифицированы по наличию нейрональных транскриптов (SYT1 и SNAP25), отсутствию ГАМКергических маркеров (GAD2) и экспрессии NEUROD6, SLC17A7, BCL11B или SATB2. Нейроны GluN были далее разделены на верхние (экспрессия SATB2 и потеря BCL11B) и глубокие (экспрессия BCL11B) подклассы. Предполагаемые субпластинчатые (SP) нейроны экспрессируют известные маркеры SP18, такие как ST18 и SORCS1, в дополнение к глубоким маркерам GluN. Клетки, подобные сосудистому сплетению, были идентифицированы по экспрессии TTR, а клетки, подобные менингеальным оболочкам, экспрессировали гены, связанные с фибробластами, и картировали пиальные/сосудистые клетки референтного набора данных.
Дифференциальный анализ экспрессии генов между подклассами t-hCO и hCO был выполнен с использованием недавно разработанного псевдопакетного метода, воспроизведенного в образцах, реализованных с использованием пакета Libra R (версия 1.0.0). В частности, тесты логарифмического правдоподобия edgeR (версия 3.36.0, пакет R) были выполнены для групп путем суммирования количества генов в клетках для данного класса клеток для каждой репликации образца. Для визуализации тепловой карты нормализованные значения на миллион (CPM) вычисляются с использованием edgeR (функция cpm()) и масштабируются (для достижения среднего = 0, стандартного отклонения = 1). Был выполнен анализ обогащения Gene Ontology (GO) значительно активированных генов t-hCO GluN (скорректированное по Бенджамини-Хохбергу значение P менее 0,05, выраженное по крайней мере в 10% клеток t-hCO GluN, и кратность увеличения изменения по крайней мере в 2 раза). выполнено с использованием ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Мы используем приложение ToppFun с параметрами по умолчанию и сообщаем P-значения с поправкой Бенджамини-Хохберга, рассчитанные с помощью гипергеометрических тестов с аннотациями GO.
Чтобы сопоставить наши кластеры snRNA-seq с аннотированными кластерами клеток из референтных исследований первичной одноклеточной РНК-seq или взрослой snRNA-seq19,20,21,22, мы применили подход интеграции парных наборов данных. Мы использовали рабочий процесс нормализации SCTransform (v2) в Seurat для интеграции и сравнения перекрытий кластеров между наборами данных (используя те же параметры, что и выше). Отдельные наборы данных были случайным образом разделены на подмножества до 500 клеток или ядер на исходный кластер для вычислительной эффективности. Используя аналогичный подход, описанный ранее, перекрытие кластеров определялось как доля клеток или ядер в каждом объединенном кластере, которые перекрывались с меткой референтного кластера. Для дальнейшей классификации GluN мы использовали рабочий процесс TransferData Seurat для данных подмножества GluN, чтобы назначить метки референтных наборов данных нашим клеткам GluN.
Чтобы оценить статус созревания глобального транскриптома образцов t-hCO и hCO, мы сравнили наши псевдо-объемные образцы с BrainSpan/psychENCODE23, который состоит из большой последовательности РНК, охватывающей развитие человеческого мозга. Мы выполнили PCA на комбинированной нормализованной по шаблону матрице экспрессии генов из образцов коры через 10 недель после зачатия и позже, в 5567 генах (вместе с нашими данными), которые ранее были идентифицированы как активные в образцах коры BrainSpan (определяемых как более 50% в дисперсии развития, объясненной возрастом с помощью кубической модели)38. Кроме того, мы вывели гены, связанные с основными транскриптомными сигнатурами нейроразвития, с помощью неотрицательной матричной факторизации, как описано ранее. Веса образцов, рассчитанные с помощью процедуры неотрицательной матричной факторизации, представлены на рис. 5b с расширенными данными для каждой из пяти сигнатур, описанных Чжу и др.38. Опять же, транскрипционные маркеры, зависящие от активности, были получены из ранее опубликованных исследований. В частности, ERG и LRG были значительно повышены в глутаматергических нейронах, идентифицированных с помощью коллекции snRNA-seq зрительной коры мыши после визуальной стимуляции из Дополнительной таблицы 3 Hrvatin et al.16. Обогащенные человеком LRG были получены из культур человеческого эмбрионального мозга, активированных KCl, и собраны через 6 часов после стимуляции, и отфильтрованные гены были значительно повышены у людей, но не у грызунов (Дополнительная таблица 4). Анализ обогащения набора генов с использованием этих наборов генов был выполнен с использованием одностороннего точного теста Фишера.
Анестезируйте крыс изофлураном, извлеките мозг и поместите его в холодный (приблизительно 4°C) оксигенированный (95% O2 и 5% CO2) раствор сахарозы для срезов, содержащих: 234 мМ сахарозы, 11 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ. NaH2PO4, 10 мМ MgSO4 и 0,5 мМ CaCl2 (около 310 мОсм). Коронарные срезы мозга крысы (300–400 мкм), содержащие t-hCO, были сделаны с использованием вибратома Leica VT1200, как описано ранее39. Затем срезы переносили в секционную камеру с непрерывной оксигенацией при комнатной температуре, содержащую aCSF, приготовленную из: 10 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaHPO4, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2 и 126 мМ NaCl (298 мОсм). по крайней мере за 45 минут до регистрации. Срезы регистрировали в погруженной камере, где они непрерывно перфузировались aCSF (флакон с 95% O2 и 5% CO2). Все данные регистрировали при комнатной температуре. Нейроны t-hCO были терминированы пипеткой из боросиликатного стекла, заполненной раствором, содержащим 127 мМ глюконата калия, 8 мМ NaCl, 4 мМ АТФ магния, 0,3 мМ ГТФ натрия, 10 мМ HEPES и 0,6 мМ EGTA, pH 7,2, внутренний раствор отрегулирован с помощью KOH (290 мОсм). Для восстановления в регистрирующий раствор был добавлен биоцитин (0,2%).
Данные были получены с использованием усилителя MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитайзера Digidata 1550B (Molecular Devices), отфильтрованы по низким частотам на частоте 2 кГц, оцифрованы на частоте 20 кГц и проанализированы с использованием Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). и пользовательских функций MATLAB (Mathworks). Потенциал перехода был рассчитан с помощью JPCalc, а записи были скорректированы до расчетного значения -14 мВ. Операция IV состоит из серии шагов тока с шагом 10-25 пА, от -250 до 750 пА.
Таламус, белое вещество и афференты S1 электрически стимулировались в таламокортикальных срезах во время записи патч-клампа нейронов hCO, как описано ранее. Вкратце, мозг помещали на стол для 3D-печати, наклоненный под углом 10°, а переднюю часть мозга разрезали под углом 35°. Затем мозг приклеивали к поверхности среза и разрезали, сохраняя выступающие таламокортикальные аксоны. Биполярные вольфрамовые электроды (0,5 МОм) устанавливали на второй микроманипулятор и стратегически позиционировали для стимуляции четырех областей на клетку (внутренняя капсула, белое вещество, S1 и hCO). Записывали синаптические ответы после фазической стимуляции 300 мкА при 0,03–0,1 Гц.
hChR2-экспрессирующие нейроны hCO активировались при 480 нм, и световые импульсы, генерируемые светодиодом (Prizmatix), подавались через объектив ×40 (0,9 NA; Olympus) для регистрации экспрессии hChR2 вблизи клеток. Диаметр освещенного поля составляет приблизительно 0,5 мм, а общая мощность составляет 10-20 мВт. Ширина импульса была установлена ​​на уровне 10 мс, что соответствует импульсу, подаваемому во время эксперимента по поведенческому обучению. Использовались различные частоты стимуляции, от 1 до 20 Гц, но для количественной оценки использовался только первый импульс серии. Интервалы между сериями обычно длиннее 30 с, чтобы минимизировать влияние на синаптические ингибирующие или облегчающие пути. Чтобы проверить, был ли ответ hChR2 моносинаптическим, мы добавляли TTX (1 мкМ) в ванну до тех пор, пока не исчезла реакция EPSC, а затем добавляли 4-аминопиридин (4-AP; 100 мкМ). Обычно ответ возвращается в течение нескольких минут, с немного большей задержкой между срабатыванием светодиода и генерацией EPSC. NBQX (10 мкМ) использовался для проверки того, вызван ли ответ рецепторами AMPA.
Острые срезы hCO были созданы, как описано ранее. Вкратце, срезы hCO были заключены в 4% агарозу и перенесены в клетки, содержащие 126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2, 26 мМ NaHCO3 и 10 мМ d-(+)-глюкозу в Срезы были нарезаны на 200–300 мкм при комнатной температуре с помощью вибратора Leica VT1200 и хранились в ASF при комнатной температуре. Затем была проведена запись патч-кэмпа целых клеток на срезах hCO под прямым микроскопом SliceScope (Scientifica). Срезы были перфузированы aCSF (95% O2 и 5% CO2), и клеточные сигналы были записаны при комнатной температуре. Нейроны hCO наносились с помощью пипетки из боросиликатного стекла, заполненной раствором, содержащим 127 мМ глюконата калия, 8 мМ NaCl, 4 мМ АТФ магния, 0,3 мМ ГТФ натрия, 10 мМ HEPES и 0,6 мМ EGTA, внутренний pH 7,2, отрегулированный с помощью KOH (осмолярность 290). Для восстановления добавьте 0,2% Биоцитина во внутренний раствор.
Данные были получены Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) с использованием усилителя MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитайзера Digidata 1550B (Molecular Devices), отфильтрованы по низким частотам на частоте 2 кГц, оцифрованы на частоте 20 кГц и проанализированы с помощью Clampfit (версия 10.6) для анализа, молекулярные устройства) и пользовательских функций MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Потенциал перехода был рассчитан с помощью JPCalc, а записи были скорректированы до рассчитанного потенциала перехода -14 мВ. Операция IV состоит из серии шагов тока с шагом 5-10 пА от -50 до 250 пА.
Для морфологической реконструкции защемленных нейронов во внутренний раствор добавляли 0,2% биоцитина (Sigma-Aldrich). Клетки запитывали в течение не менее 15 минут после взлома. Затем пипетку медленно втягивали в течение 1–2 минут, пока зарегистрированная мембрана не будет полностью запечатана. После процедуры физиологии срезов срезы фиксировали в течение ночи при 4° C в 4% PFA, промывали PBS X3 и разбавляли 1:1000 конъюгированным со стрептавидином DyLight 549 или DyLight 405 (Vector Labs). Клетки, заполненные биоцитином (2%; Sigma-Aldrich), метили во время записи патч-кламп при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем срезы монтировали на предметные стекла микроскопа с помощью Aquamount (Thermo Scientific) и визуализировали на следующий день на конфокальном микроскопе Leica TCS SP8 с использованием масляного иммерсионного объектива с числовой апертурой ×40 1,3, увеличением ×0,9–1,0, xy. Частота дискретизации составляет приблизительно 7 пикселей на микрон. Z-стеки с интервалом 1 мкм получали последовательно, и мозаики z-стеков и автоматическое сшивание на основе Leica выполнялись для покрытия всего дендритного дерева каждого нейрона. Затем нейроны отслеживались полуручным способом с помощью интерфейса neuTube 40, и были созданы файлы SWC. Затем файлы загружались в плагин SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, версия 2.1.0; NIH).
Человеческая корковая ткань была получена с информированного согласия в соответствии с протоколом, одобренным Институциональным наблюдательным советом Стэнфордского университета. Два образца человеческой послеродовой ткани (3 и 18 лет) были получены путем резекции лобной коры (средняя лобная извилина) в рамках хирургии рефрактерной эпилепсии. После резекции соберите ткань в ледяном NMDG-aCSF, содержащем: 92 мМ NMDG, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 30 мМ NaHCO3, 20 мМ HEPES, 25 мМ глюкозы, 2 мМ тиомочевины, 5 мМ аскорбата натрия, 3 мМ пирувата натрия, 0,5 мМ CaCl2 · 4H2O и 10 мМ MgSO4 · 7H2O. Титровать до pH 7,3-7,4 концентрированной соляной кислотой. Ткани были доставлены в лабораторию в течение 30 минут, и были взяты коронарные срезы в соответствии с описанной выше процедурой.
Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями по уходу за животными, одобренными APLAC Стэнфордского университета. Крысы (более 140 дней после трансплантации) были подвергнуты анестезии 5% изофлураном и анестезированы 1-3% изофлураном интраоперационно. Животных помещали в стереотаксическую рамку (Kopf) и подкожно вводили бупренорфин с замедленным высвобождением (SR). Череп обнажался, очищался и вставлялось 3-5 костных винтов. Для нацеливания на t-hCO мы генерировали стереотаксические координаты из изображений МРТ. В интересующем месте просверливалось трепанационное отверстие, и волокна (диаметром 400 мкм, NA 0,48, Doric) опускались на 100 мкм ниже поверхности hCO и закреплялись на черепе с помощью УФ-отверждаемого стоматологического цемента (Relyx).
Волоконно-фотометрические записи выполнялись, как описано ранее42. Для регистрации спонтанной активности крыс помещали в чистую клетку, а волоконно-оптический соединительный кабель диаметром 400 мкм (Doric), соединенный с волоконно-оптической фотометрической системой сбора данных, подключали к имплантированному волоконно-оптическому кабелю. Во время 10-минутной записи двигательной активности животные могли свободно исследовать клетку. Для регистрации вызванной активности крыс (более 140 дней после трансплантации) анестезировали 5% изофлураном для индукции и 1-3% изофлураном для поддержания. Поместите животное в стереотаксическую рамку (Kopf), и усы на противоположной стороне t-hCO обрезают примерно до 2 см и пропускают через сетку, соединенную с пьезоэлектрическим приводом (PI). Волоконно-оптический соединительный кабель диаметром 400 мкм (Doric) подключали к имплантированному волокну и подключали к системе сбора данных. Затем усы на противоположной стороне t-hCO отклонялись 50 раз (2 мм при 20 Гц, 2 с на презентацию) в случайные моменты времени пьезоэлектрическим приводом в течение 20-минутного периода записи. Используйте пакет поддержки Arduino MATLAB для управления временем отклонения с помощью пользовательского кода MATLAB. События синхронизируются с программным обеспечением сбора данных с помощью импульсов транзисторно-транзисторной логики (ТТЛ).
Крысы (более 140 дней после трансплантации) были вызваны 5% изофлураном и анестезированы 1-3% изофлураном интраоперационно. Животных помещали в стереотаксическую рамку (Kopf) и вводили подкожно бупренорфин SR и дексаметазон. Череп обнажали, очищали и вставляли 3-5 костных винтов. Чтобы нацелиться на t-hCO, мы генерировали стереотаксические координаты из изображений МРТ. Круговая краниотомия (приблизительно 1 см в диаметре) была выполнена с помощью высокоскоростной дрели непосредственно над трансплантированным hCO. Как только кость станет максимально тонкой, но перед тем, как просверлить всю кость, используйте щипцы, чтобы удалить оставшийся неповрежденный тазовый диск, чтобы выявить лежащий под ней t-hCO. Краниотомия была заполнена стерильным физиологическим раствором, а покровное стекло и специальный штифт для головки были прикреплены к черепу с помощью УФ-отверждаемого стоматологического цемента (Relyx).
Двухфотонная визуализация была выполнена с использованием многофотонного микроскопа Bruker с объективом Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Визуализация GCaMP6 была выполнена на 920 нм с 1,4-кратным увеличением в одной z-плоскости и 8-кратным средним значением 7,5 кадров в секунду. Крысам вводили анестезию 5% изофлураном и поддерживали 1-3% изофлураном. Крыс помещали в специально изготовленное головное крепление и располагали под линзой. Была получена 3-минутная фоновая запись двигательной активности. В течение 20 минут записи 50 затяжек (каждая подача длительностью 100 мс) случайным образом доставлялись в подушечку усов напротив t-hCO с помощью пикоприбора. Используйте пакет поддержки Arduino MATLAB для управления временем всплеска с помощью специального кода MATLAB. Синхронизируйте события с программным обеспечением для сбора данных (PrairieView 5.5) с помощью импульсов TTL. Для анализа изображения были скорректированы для движения xy с использованием аффинной коррекции в программе MoCo, запущенной на Фиджи. Извлечение флуоресцентных следов из отдельных клеток с использованием CNMF-E43. Флуоресценция была извлечена для каждой интересующей области, преобразована в кривые dF/F, а затем преобразована в z-оценки.
Крысы (более 140 дней после трансплантации) были вызваны 5% изофлураном и анестезированы 1-3% изофлураном интраоперационно. Животных помещали в стереотаксическую рамку (Kopf) и вводили подкожно бупренорфин SR и дексаметазон. Усы на противоположной стороне t-hCO были обрезаны примерно до 2 см и продеты через сетку, соединенную с пьезоэлектрическим приводом. Череп обнажался и очищался. К черепу прикреплялся заземляющий винт из нержавеющей стали. Чтобы нацелиться на t-hCO, мы генерировали стереотаксические координаты из изображений МРТ. Выполните круговую краниотомию (приблизительно 1 см в диаметре) высокоскоростной дрелью чуть выше t-hCO. Как только кость станет максимально тонкой, но перед тем, как просверлить всю кость, используйте щипцы, чтобы удалить оставшийся неповрежденный тазовый диск, чтобы обнаружить лежащий под ней t-hCO. Отдельные клетки регистрировались с помощью 32-канальных или 64-канальных кремниевых зондов высокой плотности (Cambridge Neurotech), заземленных на винты заземления и предварительно усиленных усилителями RHD (Intan). Используйте манипулятор, чтобы опустить электроды к целевому месту через краниотомию, которая заполнена стерильным физиологическим раствором. Сбор данных проводился на частоте 30 кГц с использованием системы сбора данных Open Ephys. Запись продолжалась только тогда, когда мы обнаруживали высококоррелированную ритмическую спонтанную активность в более чем 10 каналах, что предполагало, что электроды были расположены в трансплантате (на основе данных двухфотонной кальциевой визуализации). Была получена 10-минутная фоновая запись двигательной активности. Затем усы на противоположной стороне t-hCO отклонялись 50 раз (2 мм при 20 Гц, 2 с на предъявление) в случайные моменты времени пьезоэлектрическим приводом в течение 20-минутного периода записи. Используя пакет поддержки MATLAB для Arduino (MATLAB 2019b), управляйте временем отклонения с помощью пользовательского кода MATLAB. Используйте импульсы TTL для синхронизации событий с программным обеспечением для сбора данных.
Для экспериментов по оптической маркировке оптический патч-корд 200 мкм (Doric), подключенный к лазеру 473 нм (Omicron), был подключен к оптоволокну 200 мкм, размещенному над краниотомией. Непосредственно перед этим отрегулируйте мощность перемычки до 20 мВт. Используйте манипулятор, чтобы опустить электроды к целевому месту через краниотомию, которая заполнена стерильным физиологическим раствором. В начале записи было излучено десять импульсов света 473 нм (частота 2 Гц, длительность импульса 10 мс). Светочувствительные клетки были определены как клетки, которые показали спайковую реакцию в течение 10 мс света в 70% или более испытаний.