Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Жидкая биопсия (ЖБ) — это концепция, которая быстро набирает популярность в биомедицинской сфере.Концепция в основном основана на обнаружении фрагментов циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA), которые в основном высвобождаются в виде небольших фрагментов после гибели клеток в различных тканях.Небольшая часть этих фрагментов происходит из чужеродных (инородных) тканей или организмов.В текущей работе мы применили эту концепцию к мидиям, видам-дозорным, известным своей высокой способностью фильтрации морской воды.Мы используем способность мидий действовать как естественные фильтры для улавливания фрагментов ДНК окружающей среды из различных источников, чтобы предоставить информацию о биоразнообразии морских прибрежных экосистем.Наши результаты показывают, что гемолимфа мидий содержит фрагменты ДНК, которые сильно различаются по размеру, от 1 до 5 т.п.н.Секвенирование методом дробовика показало, что большое количество фрагментов ДНК имеют чужеродное микробное происхождение.Среди них мы обнаружили фрагменты ДНК бактерий, архей и вирусов, включая вирусы, которые, как известно, заражают множество хозяев, обычно встречающихся в прибрежных морских экосистемах.В заключение, наше исследование демонстрирует, что концепция LB применительно к мидиям представляет собой богатый, но еще не изученный источник знаний о микробном разнообразии в морских прибрежных экосистемах.
Влияние изменения климата (ИК) на биоразнообразие морских экосистем является быстрорастущей областью исследований.Глобальное потепление не только вызывает важные физиологические стрессы, но и раздвигает эволюционные пределы термоустойчивости морских организмов, влияя на среду обитания ряда видов, побуждая их к поиску более благоприятных условий [1, 2].В дополнение к влиянию на биоразнообразие многоклеточных животных, CC нарушает хрупкий баланс взаимодействия между хозяином и микробами.Этот микробный дисбактериоз представляет серьезную угрозу для морских экосистем, так как делает морские организмы более восприимчивыми к инфекционным патогенам [3, 4].Считается, что СС играют важную роль в массовых смертях, что является серьезной проблемой для управления глобальными морскими экосистемами [5, 6].Это важный вопрос, учитывая экономическое, экологическое и пищевое воздействие многих морских видов.Это особенно актуально для двустворчатых моллюсков, обитающих в полярных регионах, где воздействие ЦК более непосредственное и тяжелое [6, 7].Фактически двустворчатые моллюски, такие как Mytilus spp.широко используются для мониторинга воздействия ИК на морские экосистемы.Неудивительно, что для мониторинга их здоровья было разработано относительно большое количество биомаркеров, часто с использованием двухуровневого подхода, включающего функциональные биомаркеры, основанные на ферментативной активности или клеточных функциях, таких как жизнеспособность клеток и фагоцитарная активность [8].К этим методам относится также измерение концентрации специфических показателей давления, которые накапливаются в мягких тканях после поглощения большого количества морской воды.Однако высокая фильтрующая способность и полуоткрытая система кровообращения двустворчатых моллюсков дают возможность разработать новые биомаркеры гемолимфы с использованием концепции жидкой биопсии (LB), простого и минимально инвазивного подхода к ведению пациентов.образцы крови [9, 10].Хотя в LB человека можно обнаружить несколько типов циркулирующих молекул, эта концепция в первую очередь основана на анализе секвенирования ДНК фрагментов циркулирующей внеклеточной ДНК (ccfDNA) в плазме.На самом деле наличие циркулирующей ДНК в плазме крови человека было известно с середины 20-го века [11], но только в последние годы появление высокопроизводительных методов секвенирования привело к клинической диагностике на основе ccfDNA.Присутствие этих циркулирующих фрагментов ДНК частично связано с пассивным высвобождением геномной ДНК (ядерной и митохондриальной) после гибели клетки. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме невысока (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных, страдающих различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме невысока (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных, страдающих различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. У людей здоровая концентрация вккДНК в норме снижается (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с определенной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к поражению тканей. У здоровых людей концентрация кзкДНК в норме невысока (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или при стрессе, приводящем к повреждению тканей.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мл），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть повышены в 5-10 раз у пациентов с патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями или при стрессе, что приводит к повреждению тканей.Размер фрагментов ccfDNA варьирует в широких пределах, но обычно составляет от 150 до 200 п.н.[12].Анализ ccfDNA собственного происхождения, т. е. ccfDNA из нормальных или трансформированных клеток-хозяев, можно использовать для обнаружения генетических и эпигенетических изменений, присутствующих в ядерном и/или митохондриальном геноме, что помогает клиницистам выбирать специфические молекулярно-направленные методы лечения [13].Однако ccfDNA может быть получена из чужеродных источников, таких как ccfDNA из клеток плода во время беременности или из трансплантированных органов [14,15,16,17].ccfDNA также является важным источником информации для выявления наличия нуклеиновых кислот инфекционного агента (чужеродного), что позволяет неинвазивно выявлять широко распространенные инфекции, не идентифицируемые по посевам крови, избегая инвазивной биопсии инфицированной ткани [18].Недавние исследования действительно показали, что кровь человека содержит богатый источник информации, которую можно использовать для идентификации вирусных и бактериальных патогенов, и что около 1% ccfDNA, обнаруженной в плазме человека, имеет чужеродное происхождение [19].Эти исследования демонстрируют, что биоразнообразие циркулирующего микробиома организма можно оценить с помощью анализа ccfDNA.Однако до недавнего времени это понятие использовалось исключительно у человека и в меньшей степени у других позвоночных [20, 21].
В настоящей статье мы используем потенциал LB для анализа ccfDNA Aulacomya atra, южного вида, обычно встречающегося на субантарктических островах Кергелен, группе островов на вершине большого плато, которое образовалось 35 миллионов лет назад.извержение вулкана.Используя экспериментальную систему in vitro, мы обнаружили, что фрагменты ДНК в морской воде быстро поглощаются мидиями и попадают в отсек гемолимфы.Секвенирование дробовиком показало, что ccfDNA гемолимфы мидии содержит фрагменты ДНК собственного и несамостоятельного происхождения, включая симбиотические бактерии и фрагменты ДНК из биомов, типичных для холодных вулканических морских прибрежных экосистем.ccfDNA гемолимфы также содержит вирусные последовательности, происходящие от вирусов с разными диапазонами хозяев.Мы также нашли фрагменты ДНК многоклеточных животных, таких как костистые рыбы, морские анемоны, водоросли и насекомые.В заключение, наше исследование демонстрирует, что концепция LB может быть успешно применена к морским беспозвоночным для создания богатого геномного репертуара в морских экосистемах.
Имаго (длиной 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) и Aulacomya atra (A. atra) были собраны с литоральных скалистых берегов Порт-о-Франс (049°21,235 ю.ш., 070°13,490 в.д.).Острова Кергелен, декабрь 2018 г. Другие взрослые голубые мидии (Mytilus spp.) были получены от коммерческого поставщика (PEI Mussel King Inc., Остров Принца Эдуарда, Канада) и помещены в аэрируемый резервуар с регулируемой температурой (4°C), содержащий 10–20 л искусственного рассола 32‰.(искусственная морская соль Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, США).Для каждого эксперимента измеряли длину и вес отдельных раковин.
Бесплатный протокол открытого доступа для этой программы доступен в Интернете (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Вкратце, гемолимфу LB собирали из отводящих мышц, как описано [22].Гемолимфу осветляли центрифугированием при 1200×g в течение 3 минут, супернатант замораживали (-20°С) до использования.Для выделения и очистки вкДНК образцы (1,5–2,0 мл) размораживали и обрабатывали с использованием набора для вкДНК NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) в соответствии с инструкциями производителя.ccfDNA хранили при -80°C до дальнейшего анализа.В некоторых экспериментах ccfDNA выделяли и очищали с использованием набора QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада).Очищенную ДНК количественно определяли с использованием стандартного анализа PicoGreen.Распределение фрагментов выделенной ccfDNA анализировали с помощью капиллярного электрофореза с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния) с использованием набора ДНК высокой чувствительности.Анализ проводили с использованием 1 мкл образца ccfDNA в соответствии с инструкциями производителя.
Для секвенирования фрагментов ccfDNA гемолимфы компания Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) подготовила библиотеки дробовиков, используя набор Illumina DNA Mix из набора Illumina MiSeq PE75.Использовался стандартный адаптер (BioO).Файлы необработанных данных доступны в архиве NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 и SRR8924809).Базовое качество чтения оценивали с помощью FastQC [23].Trimmomatic [24] использовался для отсечения адаптеров и считывания низкого качества.Чтения Shotgun с парными концами были объединены FLASH в более длинные одиночные чтения с минимальным перекрытием 20 п.н., чтобы избежать несовпадений [25]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей стабильной точности было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и гомология 90%), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 пыль [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩 ​​蔽 掩 蔽Объединенные базы чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей жесткости было выполнено с использованием DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и гомология 90%), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26].Прочтения были разделены на две группы: связанные с последовательностями двустворчатых моллюсков (названные здесь самопрочтениями) и не связанные (несамопрочтения).Две группы были собраны отдельно с помощью MEGAHIT для создания контигов [27].Между тем, таксономическое распределение прочтений чужеродного микробиома было классифицировано с помощью Kraken2 [28] и графически представлено круговой диаграммой Krona на Galaxy [29, 30].Оптимальный kmers был определен как kmers-59 из наших предварительных экспериментов. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Затем собственные контиги были идентифицированы обычным образом с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Затем собственные контиги идентифицировали путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации прямого выбора с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Затем для окончательной аннотации были идентифицированы собственные контиги путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно контиги чужеродных групп были аннотированы с помощью BLASTN (база данных NT NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, невероятные к принадлежащей группе, были аннотированы с помощью данных BLASTN (база nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Параллельно несобственные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX также выполнял несамостоятельные контигации с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белков nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%).Пулы несамостоятельных контигов BLASTN и BLASTX представляют собой окончательные контиги (см. Дополнительный файл).
Праймеры, используемые для ПЦР, перечислены в таблице S1.ДНК-полимеразу Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) использовали для амплификации генов-мишеней ccfDNA.Использовали следующие условия реакции: денатурация при 95°С в течение 3 минут, 95°С в течение 1 минуты, установленная температура отжига в течение 1 минуты, удлинение при 72°С в течение 1 минуты, 35 циклов и, наконец, 72°С в течение 10 минут..Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в агарозных гелях (1,5%), содержащих гель-краситель SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) при 95 В.
Мидии (Mytilus spp.) акклиматизировались в 500 мл насыщенной кислородом морской воды (32 PSU) в течение 24 часов при 4°C.Плазмидную ДНК, содержащую вставку, кодирующую последовательность кДНК галектина-7 человека (инвентарный номер NCBI L07769), добавляли во флакон в конечной концентрации 190 мкг/мкл.Мидии, инкубированные в тех же условиях без добавления ДНК, служили контролем.Третий контрольный резервуар содержал ДНК без мидий.Для контроля качества ДНК в морской воде пробы морской воды (20 мкл; три повторения) отбирали из каждого резервуара в указанное время.Для отслеживания плазмидной ДНК мидии LB собирали в указанное время и анализировали с помощью количественной ПЦР и ддПЦР.Из-за высокого содержания соли в морской воде аликвоты разбавляли в воде качества ПЦР (1:10) перед всеми анализами ПЦР.
Цифровую капельную ПЦР (ddPCR) проводили с использованием протокола BioRad QX200 (Миссиссога, Онтарио, Канада).Используйте температурный профиль для определения оптимальной температуры (таблица S1).Капли генерировали с помощью генератора капель QX200 (BioRad).ddPCR проводили следующим образом: 95°C в течение 5 мин, 50 циклов 95°C в течение 30 с и заданной температуры отжига в течение 1 мин и 72°C в течение 30 с, 4°C в течение 5 мин и 90°C в течение 5 мин.Количество капель и положительных реакций (количество копий/мкл) измеряли с помощью ридера капель QX200 (BioRad).Образцы с количеством капель менее 10 000 отбраковывались.Контроль образца не выполнялся каждый раз при проведении ddPCR.
кПЦР проводили с использованием Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) и специфических праймеров LGALS7.Все количественные ПЦР выполняли в 20 мкл с использованием набора QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).кПЦР начинали с 15-минутной инкубации при 95°С, затем следовали 40 циклов при 95°С в течение 10 секунд и при 60°С в течение 60 секунд с одним сбором данных.Кривые плавления были построены с использованием последовательных измерений при 95°С в течение 5 с, 65°С в течение 60 с и 97°С в конце количественной ПЦР.Каждую кПЦР проводили в трех повторностях, за исключением контрольных образцов.
Поскольку мидии известны своей высокой скоростью фильтрации, мы сначала исследовали, могут ли они фильтровать и удерживать фрагменты ДНК, присутствующие в морской воде.Нас также интересовало, накапливаются ли эти фрагменты в их полуоткрытой лимфатической системе.Мы решили этот вопрос экспериментально, проследив судьбу растворимых фрагментов ДНК, добавленных в аквариумы с голубыми мидиями.Для облегчения отслеживания фрагментов ДНК мы использовали чужеродную (не собственную) плазмидную ДНК, содержащую ген галектина-7 человека.ddPCR отслеживает фрагменты плазмидной ДНК в морской воде и мидиях.Наши результаты показывают, что если количество фрагментов ДНК в морской воде оставалось относительно постоянным во времени (до 7 дней) в отсутствие мидий, то в присутствии мидий этот уровень почти полностью исчезал в течение 8 часов (рис. 1а,б).Фрагменты экзогенной ДНК легко обнаруживались в течение 15 мин во внутриклапанной жидкости и гемолимфе (рис. 1в).Эти фрагменты все еще можно было обнаружить в течение 4 часов после воздействия.Эта фильтрующая активность по отношению к фрагментам ДНК сравнима с фильтрующей активностью бактерий и водорослей [31].Эти результаты свидетельствуют о том, что мидии могут фильтровать и накапливать чужеродную ДНК в своих жидкостных отсеках.
Относительные концентрации плазмидной ДНК в морской воде в присутствии (A) или в отсутствие (B) мидий, измеренные с помощью ddPCR.В A результаты выражены в процентах, при этом границы прямоугольников представляют 75-й и 25-й процентили.Подогнанная логарифмическая кривая показана красным цветом, а область, заштрихованная серым цветом, представляет 95% доверительный интервал.В B красная линия представляет среднее значение, а синяя линия представляет 95% доверительный интервал для концентрации.C Накопление плазмидной ДНК в гемолимфе и клапанной жидкости мидий в разные сроки после добавления плазмидной ДНК.Результаты представлены в виде обнаруженных абсолютных копий/мл (±SE).
Затем мы исследовали происхождение ccfDNA у мидий, собранных с зарослей мидий на островах Кергелен, удаленной группе островов с ограниченным антропогенным влиянием.Для этого кзкДНК из гемолимф мидий выделяли и очищали методами, обычно используемыми для очистки кзкДНК человека [32, 33].Мы обнаружили, что средние концентрации ccfDNA гемолимфы в мидиях находятся в диапазоне низких микрограммов на мл гемолимфы (см. Таблицу S2, Дополнительную информацию).Этот диапазон концентраций значительно больше, чем у здоровых людей (низкие нанограммы на миллилитр), но в редких случаях у онкологических больных уровень ccfDNA может достигать нескольких микрограммов на миллилитр [34, 35].Анализ распределения размеров ccfDNA гемолимфы показал, что эти фрагменты сильно различаются по размеру, в пределах от 1000 п.н. до 1000 п.н.до 5000 пн (рис. 2).Аналогичные результаты были получены с использованием набора QIAamp Investigator Kit на основе диоксида кремния, метода, обычно используемого в криминалистике для быстрого выделения и очистки геномной ДНК из образцов ДНК с низкой концентрацией, включая ccfDNA [36].
Репрезентативная электрофореграмма ccfDNA гемолимфы мидий.Экстрагировано с помощью набора NucleoSnap Plasma Kit (вверху) и набора QIAamp DNA Investigator Kit.B Скрипичный график, показывающий распределение концентраций ccfDNA гемолимфы (±SE) в мидиях.Черные и красные линии представляют собой медиану и первый и третий квартили соответственно.
Примерно 1% ccfDNA у человека и приматов имеет чужеродный источник [21, 37].Учитывая полуоткрытую систему кровообращения двустворчатых моллюсков, богатую микробами морскую воду и распределение по размерам ccfDNA мидий, мы предположили, что ccfDNA гемолимфы мидий может содержать богатый и разнообразный пул микробной ДНК.Чтобы проверить эту гипотезу, мы секвенировали ccfDNA гемолимфы из образцов Aulacomya atra, собранных на островах Кергелен, что дало более 10 миллионов прочтений, 97,6% из которых прошли контроль качества.Затем показания были классифицированы в соответствии с собственными и чужими источниками с использованием баз данных двустворчатых моллюсков BLASTN и NCBI (рис. S1, дополнительная информация).
У человека в кровоток может попадать как ядерная, так и митохондриальная ДНК [38].Однако в настоящем исследовании не было возможности подробно описать ядерную геномную ДНК мидий, учитывая, что геном A. atra не секвенирован и не описан.Однако мы смогли идентифицировать ряд фрагментов ccfDNA нашего собственного происхождения, используя библиотеку двустворчатых моллюсков (рис. S2, дополнительная информация).Мы также подтвердили наличие фрагментов ДНК собственного происхождения с помощью направленной ПЦР-амплификации тех генов A. atra, которые были секвенированы (рис. 3).Точно так же, учитывая, что митохондриальный геном A. atra доступен в общедоступных базах данных, можно найти доказательства присутствия митохондриальных фрагментов ccfDNA в гемолимфе A. atra.Наличие фрагментов митохондриальной ДНК было подтверждено с помощью ПЦР-амплификации (рис. 3).
Различные митохондриальные гены присутствовали в гемолимфе A. atra (красные точки — инвентарный номер: SRX5705969) и M. platensis (синие точки — инвентарный номер: SRX5705968), амплифицированных с помощью ПЦР.Рисунок адаптирован из Breton et al., 2011 B Амплификация супернатанта гемолимфы из A. atra Хранится на бумаге FTA.Используйте пробойник диаметром 3 мм, чтобы добавить непосредственно в пробирку для ПЦР, содержащую смесь для ПЦР.
Учитывая обильное микробное содержание в морской воде, мы первоначально сосредоточились на характеристике микробных последовательностей ДНК в гемолимфе.Для этого мы используем две разные стратегии.Первая стратегия использовала Kraken2, программу классификации последовательностей на основе алгоритма, которая может идентифицировать микробные последовательности с точностью, сравнимой с BLAST и другими инструментами [28].Было определено, что более 6719 прочтений имеют бактериальное происхождение, а 124 и 64 - от архей и вирусов соответственно (рис. 4).Наиболее распространенными бактериальными фрагментами ДНК были Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) и Bacteroidetes (17%) (рис. 4а).Это распределение согласуется с предыдущими исследованиями микробиома морской голубой мидии [39, 40].Гаммапротеобактерии были основным классом протеобактерий (44%), включая многие Vibrionales (рис. 4б).Метод ddPCR подтвердил наличие фрагментов ДНК Vibrio в ccfDNA гемолимфы A. atra (рис. 4в) [41].Чтобы получить больше информации о бактериальном происхождении ccfDNA, был использован дополнительный подход (рис. S2, дополнительная информация). В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как нативные (двустворчатые моллюски) или неоригинальные с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двутворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или неоригинальные с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%.Поскольку геном A. atra еще не секвенирован, мы использовали стратегию сборки de novo ассемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).В общей сложности 147 188 контигов были идентифицированы как зависимые (двустворчатые моллюски) происхождения.Затем эти контиги были взорваны с e-значениями 1e-10 с использованием BLASTN и BLASTX.Эта стратегия позволила нам идентифицировать 482 недвустворчатых фрагмента, присутствующих в ccfDNA A. atra.Более половины (57%) этих фрагментов ДНК получено от бактерий, в основном от жаберных симбионтов, в том числе сульфотрофных симбионтов, и от жаберных симбионтов Solemya velum (рис. 5).
Относительная численность на типовом уровне.B Микробное разнообразие двух основных типов (Firmicutes и Proteobacteria).Репрезентативная амплификация ddPCR C Vibrio spp.А. Фрагменты гена 16S рРНК (синие) в трех атрагемолимфах.
Всего было проанализировано 482 собранных контига.Общий профиль таксономического распределения аннотаций метагеномных контигов (прокариоты и эукариоты).B Подробное распределение фрагментов бактериальной ДНК, идентифицированных с помощью BLASTN и BLASTX.
Анализ Kraken2 также показал, что ccfDNA мидии содержит фрагменты ДНК архей, в том числе фрагменты ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) и Thaurmarcheota (11%) (рис. 6а).Присутствие фрагментов ДНК, происходящих от Euryarchaeota и Crenarchaeota, ранее обнаруженных в микробном сообществе калифорнийских мидий, не должно вызывать удивления [42].Хотя Euryarchaeota часто ассоциируется с экстремальными условиями, в настоящее время признано, что и Euryarchaeota, и Crenarcheota являются одними из наиболее распространенных прокариот в морской криогенной среде [43, 44].Присутствие метаногенных микроорганизмов в мидиях неудивительно, учитывая недавние сообщения об обширных утечках метана из донных течений на плато Кергелен [45] и возможном микробном образовании метана, наблюдаемом у побережья островов Кергелен [46].
Затем наше внимание переключилось на показания ДНК-вирусов.Насколько нам известно, это первое нецелевое исследование вирусного содержания мидий.Как и ожидалось, мы обнаружили фрагменты ДНК бактериофагов (Caudovirales) (рис. 6б).Однако наиболее распространенная вирусная ДНК происходит из типа нуклеоцитовирусов, также известного как ядерно-цитоплазматический большой ДНК-вирус (NCLDV), который имеет самый большой геном среди всех вирусов.Внутри этого типа большинство последовательностей ДНК принадлежат семействам Mimimidoviridae (58%) и Poxviridae (21%), естественными хозяевами которых являются позвоночные и членистоногие, тогда как небольшая часть этих последовательностей ДНК принадлежит известным вирусологическим водорослям.Заражает морские эукариотические водоросли.Последовательности были также получены из вируса Пандора, гигантского вируса с самым большим размером генома среди всех известных родов вирусов.Интересно, что диапазон хозяев, о которых известно, что они инфицированы вирусом, как определено секвенированием гемолимфы ccfDNA, был относительно большим (рисунок S3, дополнительная информация).Он включает вирусы, поражающие насекомых, такие как Baculoviridae и Iridoviridae, а также вирусы, поражающие амебы, водоросли и позвоночных.Мы также обнаружили последовательности, совпадающие с геномом Pithovirus sibericum.Питовирусы (также известные как «зомби-вирусы») были впервые выделены из вечной мерзлоты возрастом 30 000 лет в Сибири [47].Таким образом, наши результаты согласуются с предыдущими отчетами, показывающими, что не все современные виды этих вирусов вымерли [48] и что эти вирусы могут присутствовать в удаленных субарктических морских экосистемах.
Наконец, мы проверили, сможем ли мы найти фрагменты ДНК других многоклеточных животных.Всего с помощью BLASTN и BLASTX с библиотеками nt, nr и RefSeq (геномными и белковыми) было идентифицировано 482 чужеродных контига.Наши результаты показывают, что среди чужеродных фрагментов ccfDNA многоклеточных животных преобладает ДНК костных костей (рис. 5).Также были обнаружены фрагменты ДНК насекомых и других видов.Относительно большая часть фрагментов ДНК не идентифицирована, возможно, из-за недопредставленности большого числа морских видов в геномных базах данных по сравнению с наземными видами [49].
В настоящей статье мы применяем концепцию LB к мидиям, утверждая, что секвенирование гемолимфы ccfDNA может дать представление о составе морских прибрежных экосистем.В частности, мы обнаружили, что 1) гемолимфа мидий содержит относительно высокие концентрации (микрограммы) относительно больших (~ 1-5 т.п.н.) циркулирующих фрагментов ДНК;2) эти фрагменты ДНК как независимые, так и ненезависимые 3) Среди чужеродных источников этих фрагментов ДНК нами обнаружена бактериальная, архейная и вирусная ДНК, а также ДНК других многоклеточных животных;4) Накопление этих чужеродных фрагментов вккДНК в гемолимфе происходит быстро и способствует внутренней фильтрационной деятельности мидий.В заключение, наше исследование демонстрирует, что концепция LB, которая до сих пор применялась в основном в области биомедицины, кодирует богатый, но неизведанный источник знаний, который можно использовать для лучшего понимания взаимодействия между видами-сентинелами и окружающей их средой.
Помимо приматов, о выделении ccfDNA сообщалось у млекопитающих, включая мышей, собак, кошек и лошадей [50, 51, 52].Однако, насколько нам известно, наше исследование является первым, в котором сообщается об обнаружении и секвенировании ccfDNA у морских видов с открытой системой циркуляции.Эта анатомическая особенность и фильтрующая способность мидий могут, по крайней мере частично, объяснить различные характеристики размера циркулирующих фрагментов ДНК по сравнению с другими видами.У человека большинство фрагментов ДНК, циркулирующих в крови, представляют собой небольшие фрагменты размером от 150 до 200 п.н.с максимальным пиком 167 п.н. [34, 53].Небольшая, но значительная часть фрагментов ДНК имеет размер от 300 до 500 п.н., а около 5% длиннее 900 п.н.[54].Причина такого распределения размеров заключается в том, что основной источник ccfDNA в плазме возникает в результате гибели клеток, либо из-за гибели клеток, либо из-за некроза циркулирующих гемопоэтических клеток у здоровых людей, либо из-за апоптоза опухолевых клеток у больных раком (так называемая циркулирующая опухолевая ДНК)., ктДНК).Распределение размеров ccfDNA гемолимфы, которое мы обнаружили у мидий, колебалось от 1000 до 5000 п.н., что свидетельствует о другом происхождении ccfDNA мидий.Это логичная гипотеза, поскольку мидии имеют полуоткрытую сосудистую систему и обитают в морской водной среде, содержащей высокие концентрации микробной геномной ДНК.Действительно, наши лабораторные эксперименты с использованием экзогенной ДНК показали, что мидии накапливают фрагменты ДНК в морской воде, по крайней мере, через несколько часов они деградируют после поглощения клетками и/или высвобождаются и/или сохраняются в различных организациях.Учитывая редкость клеток (как прокариотических, так и эукариотических), использование внутриклапанных компартментов уменьшит количество ccfDNA из собственных источников, а также из чужеродных источников.Принимая во внимание важность врожденного иммунитета двустворчатых моллюсков и большое количество циркулирующих фагоцитов, мы также предположили, что даже чужеродная ccfDNA обогащена циркулирующими фагоцитами, которые накапливают чужеродную ДНК при проглатывании микроорганизмов и/или клеточного дебриса.Взятые вместе, наши результаты показывают, что двустворчатая гемолимфа ccfDNA является уникальным хранилищем молекулярной информации и укрепляет их статус как вида-дозорного.
Наши данные показывают, что секвенирование и анализ фрагментов ccfDNA гемолимфы бактериального происхождения может предоставить ключевую информацию о бактериальной флоре хозяина и бактериях, присутствующих в окружающей морской экосистеме.Методы секвенирования выстрелов выявили последовательности комменсальных бактерий A. atra gill, которые были бы упущены, если бы использовались обычные методы идентификации рРНК 16S, отчасти из-за систематической ошибки эталонной библиотеки.Фактически, наше использование данных LB, собранных из M. platensis в том же слое мидий в Кергелене, показало, что состав бактериальных симбионтов, связанных с жабрами, был одинаковым для обоих видов мидий (рис. S4, дополнительная информация).Это сходство двух генетически разных мидий может отражать состав бактериальных сообществ холодных, сернистых и вулканических отложений Кергелена [55, 56, 57, 58].Более высокие уровни сероредуцирующих микроорганизмов были хорошо описаны при сборе мидий в биотурбированных прибрежных районах [59], таких как побережье Порт-о-Франс.Другая возможность заключается в том, что комменсальная флора мидий может быть затронута горизонтальной передачей [60, 61].Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить корреляцию между морской средой, поверхностью морского дна и составом симбиотических бактерий в мидиях.Эти исследования в настоящее время продолжаются.
Длина и концентрация ccfDNA гемолимфы, простота ее очистки и высокое качество, позволяющее быстро секвенировать дробовик, являются одними из многих преимуществ использования ccfDNA мидий для оценки биоразнообразия в морских прибрежных экосистемах.Этот подход особенно эффективен для характеристики вирусных сообществ (виромов) в данной экосистеме [62, 63].В отличие от бактерий, архей и эукариот вирусные геномы не содержат филогенетически консервативных генов, таких как последовательности 16S.Наши результаты показывают, что жидкие биоптаты видов-индикаторов, таких как мидии, могут использоваться для идентификации относительно большого количества фрагментов вируса ccfDNA, которые, как известно, инфицируют хозяев, которые обычно обитают в прибрежных морских экосистемах.Сюда входят вирусы, поражающие простейшие, членистоногих, насекомых, растения и бактериальные вирусы (например, бактериофаги).Аналогичное распределение было обнаружено, когда мы исследовали виром ccfDNA гемолимфы голубых мидий (M. platensis), собранных в том же слое мидий в Кергелене (таблица S2, дополнительная информация).Прямое секвенирование ccfDNA действительно является новым подходом, набирающим обороты в изучении вирома человека или других видов [21, 37, 64].Этот подход особенно полезен для изучения двухцепочечных ДНК-вирусов, поскольку ни один ген не является консервативным среди всех двухцепочечных ДНК-вирусов, представляющих самый разнообразный и широкий класс вирусов в Балтиморе [65].Хотя большинство этих вирусов остаются неклассифицированными и могут включать вирусы из совершенно неизвестной части вирусного мира [66], мы обнаружили, что виромы и диапазоны хозяев мидий A. atra и M. platensis находятся между двумя видами.аналогично (см. рисунок S3, дополнительная информация).Это сходство неудивительно, так как оно может отражать отсутствие избирательности в поглощении ДНК, присутствующей в окружающей среде.В настоящее время необходимы дальнейшие исследования с использованием очищенной РНК для характеристики вирома РНК.
В нашем исследовании мы использовали очень строгий конвейер, адаптированный из работы Коварски и его коллег [37], которые использовали двухэтапное удаление объединенных прочтений и контигов до и после сборки нативной ccfDNA, что привело к высокой доле некартированных прочтений.Поэтому мы не можем исключить, что некоторые из этих некартированных прочтений все же могут иметь собственное происхождение, в первую очередь потому, что у нас нет эталонного генома для этого вида мидий.Мы также использовали этот конвейер, потому что нас беспокоили химеры между самостоятельными и несамостоятельными считываниями, а также длины считываний, генерируемые Illumina MiSeq PE75.Другая причина большинства неотмеченных данных заключается в том, что многие морские микробы, особенно в отдаленных районах, таких как Кергелен, не были аннотированы.Мы использовали Illumina MiSeq PE75, предполагая, что длина фрагмента ccfDNA аналогична длине ccfDNA человека.Для будущих исследований, учитывая наши результаты, показывающие, что ccfDNA гемолимфы имеет более длинные чтения, чем люди и / или млекопитающие, мы рекомендуем использовать платформу секвенирования, более подходящую для более длинных фрагментов ccfDNA.Эта практика значительно облегчит выявление дополнительных показаний для более глубокого анализа.Получение недоступной в настоящее время полной последовательности ядерного генома A. atra также значительно облегчило бы различение ccfDNA из собственных и чужих источников.Учитывая, что наше исследование было сосредоточено на возможности применения концепции жидкой биопсии к мидиям, мы надеемся, что по мере использования этой концепции в будущих исследованиях будут разработаны новые инструменты и конвейеры для увеличения потенциала этого метода для изучения микробного разнообразия мидий.морская экосистема.
В качестве неинвазивного клинического биомаркера повышенные уровни ccfDNA в плазме человека связаны с различными заболеваниями, повреждением тканей и стрессовыми состояниями [67,68,69].Это увеличение связано с высвобождением фрагментов ДНК собственного происхождения после повреждения тканей.Мы решили эту проблему с помощью острого теплового стресса, при котором мидии кратковременно подвергались воздействию температуры 30 °C.Мы провели этот анализ на трех разных типах мидий в трех независимых экспериментах.Однако мы не обнаружили никаких изменений в уровнях ccfDNA после острого теплового стресса (см. рисунок S5, дополнительная информация).Это открытие может объяснить, по крайней мере частично, тот факт, что мидии имеют полуоткрытую кровеносную систему и накапливают большое количество чужеродной ДНК из-за их высокой фильтрующей активности.С другой стороны, мидии, как и многие беспозвоночные, могут быть более устойчивыми к стресс-индуцированному повреждению тканей, тем самым ограничивая высвобождение ccfDNA в их гемолимфе [70, 71].
На сегодняшний день анализ ДНК биоразнообразия в водных экосистемах в основном сосредоточен на метабаркодировании ДНК окружающей среды (эДНК).Однако этот метод обычно ограничен в анализе биоразнообразия, когда используются праймеры.Использование дробового секвенирования позволяет обойти ограничения ПЦР и предвзятый выбор наборов праймеров.Таким образом, в некотором смысле наш метод ближе к недавно использованному высокопроизводительному методу секвенирования eDNA Shotgun, который способен напрямую секвенировать фрагментированную ДНК и анализировать практически все организмы [72, 73].Однако есть ряд фундаментальных проблем, которые отличают LB от стандартных методов eDNA.Конечно, основное различие между eDNA и LB заключается в использовании естественных фильтров-хозяев.Сообщалось об использовании морских видов, таких как губки и двустворчатые моллюски (Dresseina spp.), в качестве естественного фильтра для изучения эДНК [74, 75].Однако в исследовании Дрейссены использовались биопсии тканей, из которых была извлечена ДНК.Анализ ccfDNA из LB не требует биопсии ткани, специализированного и иногда дорогостоящего оборудования и логистики, связанной с биопсией eDNA или ткани.Фактически, мы недавно сообщили, что ccfDNA из LB может храниться и анализироваться с поддержкой FTA без поддержания холодовой цепи, что является серьезной проблемой для исследований в отдаленных районах [76].Извлечение ccfDNA из жидких биоптатов также просто и обеспечивает высококачественную ДНК для секвенирования дробовиком и ПЦР-анализа.Это большое преимущество, учитывая некоторые технические ограничения, связанные с анализом эДНК [77].Простота и низкая стоимость метода отбора проб особенно подходят для долгосрочных программ мониторинга.Помимо высокой фильтрующей способности, еще одной известной особенностью двустворчатых моллюсков является химический мукополисахаридный состав их слизи, способствующий поглощению вирусов [78, 79].Это делает двустворчатых моллюсков идеальным естественным фильтром для характеристики биоразнообразия и воздействия изменения климата на данную водную экосистему.Хотя наличие фрагментов ДНК, происходящих от хозяина, можно рассматривать как ограничение метода по сравнению с эДНК, стоимость, связанная с наличием такой нативной ccfDNA по сравнению с эДНК, одновременно понятна с учетом огромного количества информации, доступной для медицинских исследований.офсетный хост.Это включает наличие вирусных последовательностей, интегрированных в геном хозяина-хозяина.Это особенно важно для мидий, учитывая наличие горизонтально передающихся лейкемических ретровирусов у двустворчатых моллюсков [80, 81].Другое преимущество LB перед eDNA заключается в том, что он использует фагоцитарную активность циркулирующих клеток крови в гемолимфе, которая поглощает микроорганизмы (и их геномы).Фагоцитоз является основной функцией клеток крови у двустворчатых моллюсков [82].Наконец, в методе используется высокая фильтрующая способность мидий (в среднем 1,5 л/ч морской воды) и двухдневная циркуляция, которые увеличивают перемешивание различных слоев морской воды, что позволяет улавливать гетерологичную эДНК.[83, 84].Таким образом, анализ ccfDNA мидий является интересным направлением, учитывая влияние мидий на питание, экономику и окружающую среду.Подобно анализу LB, собранного у людей, этот метод также открывает возможность измерения генетических и эпигенетических изменений в ДНК хозяина в ответ на экзогенные вещества.Например, можно предусмотреть технологии секвенирования третьего поколения для проведения полногеномного анализа метилирования в нативной ccfDNA с использованием секвенирования нанопор.Этому процессу должен способствовать тот факт, что длина фрагментов ccfDNA мидии идеально совместима с платформами для секвенирования с длинным считыванием, которые позволяют проводить полногеномный анализ метилирования ДНК из одного цикла секвенирования без необходимости химических трансформаций.85,86].Следовательно, он может дать ценную информацию об основных механизмах, управляющих реакцией после воздействия изменения климата или загрязняющих веществ [87].Однако использование LB не лишено ограничений.Разумеется, для этого необходимо присутствие в экосистеме видов-индикаторов.Как упоминалось выше, использование LB для оценки биоразнообразия данной экосистемы также требует строгого конвейера биоинформатики, который учитывает присутствие фрагментов ДНК из источника.Еще одной серьезной проблемой является наличие эталонных геномов морских видов.Есть надежда, что такие инициативы, как проект геномов морских млекопитающих и недавно созданный проект Fish10k [88], облегчат такой анализ в будущем.Применение концепции LB к морским организмам-фильтраторам также совместимо с последними достижениями в технологии секвенирования, что делает ее хорошо подходящей для разработки многоомных биомаркеров для предоставления важной информации о состоянии морской среды обитания в ответ на экологический стресс.
Данные секвенирования генома были депонированы в архиве NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 под Bioprojects SRR8924808.
Брайерли А.С., Кингсфорд М.Дж. Влияние изменения климата на морскую жизнь и экосистемы.Коул Биология.2009 г.;19: С602–С614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Учитывайте комбинированное воздействие изменения климата и других локальных факторов стресса на морскую среду.общенаучная среда.2021;755:142564.
Карелла Ф., Антуофермо Э., Фарина С., Салати Ф., Мандас Д., Прадо П. и др.).Наука первого марта.2020;7:48.
Серонт Л., Никастро К.Р., Зарди Г.И., Гобервиль Э. Снижение устойчивости к жаре в условиях повторяющегося теплового стресса объясняет высокую летнюю смертность голубых мидий.Научный отчет 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Недавние изменения в частоте, причинах и масштабах падежа животных.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Скарпа Ф., Санна Д., Аззена И., Мугетти Д., Черрути Ф., Хоссейни С. и др.Множественные невидоспецифические патогены могли вызвать массовую гибель Pinna nobilis.Жизнь.2020;10:238.
Брэдли М., Куттс С.Дж., Дженкинс Э., О'Хара ТМ.Потенциальное влияние изменения климата на арктические зоонозные заболевания.Int J Циркумполярное здоровье.2005 г.;64:468–77.
Бейер Дж., Грин Н.В., Брукс С., Аллан И.Дж., Руус А., Гомес Т. и другие.Голубые мидии (Mytilus edulis spp.) как сигнальные организмы в мониторинге загрязнения прибрежных зон: обзор.март Окружающая среда Res 2017;130:338-65.
Сиравенья Г., Марсони С., Сиена С., Барделли А. Интеграция жидкостной биопсии в лечение рака.Nat Rev Clean Oncol.2017;14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Созревание жидкой биопсии: позволяет ДНК опухоли циркулировать.Нат Рев Рак.2017;17:223–38.
Мандель П., Метаис П. Нуклеиновые кислоты в плазме человека.Протоколы собраний дочерних компаний Soc Biol.1948 год;142:241-3.
Бронкхорст А.Дж., Унгерер В., Холденридер С. Новая роль бесклеточной ДНК в качестве молекулярного маркера для лечения рака.Количественный биомолярный анализ.2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж Г.В., Джеффри С.С. Жидкая биопсия входит в клинику – вопросы внедрения и будущие задачи.Nat Rev Clin Oncol.2021;18: 297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент И.Л., Редман К.В. и другие.Фетальная ДНК присутствует в материнской плазме и сыворотке.Ланцет.1997 год;350:485-7.
Муфаррей М.Н., Вонг Р.Дж., Шоу Г.М., Стивенсон Д.К., Квейк С.Р. Изучение течения беременности и ее осложнений с использованием циркулирующей внеклеточной РНК в крови женщин во время беременности.Допедиатрия.2020;8:605219.
Оллерих М., Шервуд К., Киоун П., Шютц Э., Бек Дж., Стегбауэр Дж. и др.Жидкая биопсия: бесклеточная ДНК донора используется для выявления аллогенных поражений трансплантата почки.Нат Рев Нефрол.2021;17: 591–603.
Хуан Ф.К., Ло Ю.М. Инновации в пренатальной диагностике: секвенирование генома материнской плазмы.Анна МД.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Быстрое обнаружение патогенов с помощью метагеномного секвенирования инфицированных биологических жидкостей нового поколения.Нат Медицина.2021;27:115-24.