Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Неконтролируемое кровотечение является одной из основных причин смерти.Достижение быстрого гемостаза обеспечивает выживание субъекта в качестве первой помощи во время боевых действий, дорожно-транспортных происшествий и операций по снижению смертности.Нанопористый композитный каркас, армированный волокном (NFRCS), полученный из простой гемостатической пленкообразующей композиции (HFFC) в качестве непрерывной фазы, может запускать и усиливать гемостаз.Разработка NFRCS основана на конструкции крыла стрекозы.Структура крыла стрекозы состоит из поперечных и продольных крыльев, а перепонки крыльев соединены друг с другом для сохранения целостности микроструктуры.HFFC равномерно покрывает поверхность волокна пленкой нанометровой толщины и соединяет случайно распределенную толщину хлопка (Ct) (дисперсную фазу) с образованием нанопористой структуры.Сочетание непрерывной и дисперсной фаз снижает стоимость продукта в десять раз по сравнению с коммерчески доступными продуктами.Модифицированные NFRCS (тампоны или браслеты) можно использовать в различных биомедицинских целях.Исследования in vivo пришли к выводу, что разработанный Cp NFRCS запускает и усиливает процесс коагуляции в месте нанесения.NFRCS может модулировать микроокружение и действовать на клеточном уровне благодаря своей нанопористой структуре, что приводит к лучшему заживлению ран в модели эксцизионной раны.
Неконтролируемое кровотечение в боевых, интраоперационных и экстренных ситуациях может представлять серьезную угрозу жизни раненых1.Эти состояния в дальнейшем приводят к общему увеличению периферического сосудистого сопротивления, что приводит к геморрагическому шоку.Надлежащие меры по остановке кровотечения во время и после операции считаются потенциально опасными для жизни2,3.Повреждение крупных сосудов приводит к массивной кровопотере, в результате чего смертность составляет ≤ 50 % в бою и 31 % во время операции1.Массивная кровопотеря приводит к уменьшению объема тела, что снижает сердечный выброс.Увеличение общего периферического сосудистого сопротивления и прогрессирующее нарушение микроциркуляции приводят к гипоксии в органах жизнеобеспечения.Геморрагический шок может возникнуть, если состояние продолжается без эффективного вмешательства1,4,5.Другие осложнения включают прогрессирование гипотермии и метаболического ацидоза, а также нарушение коагуляции, препятствующее процессу свертывания крови.Тяжелый геморрагический шок связан с более высоким риском смерти6,7,8.При шоке III степени (прогрессирующем) переливание крови необходимо для выживания пациента во время интраоперационной и послеоперационной заболеваемости и смертности.Чтобы преодолеть все вышеперечисленные опасные для жизни ситуации, мы разработали нанопористый армированный волокном композитный каркас (NFRCS), в котором используется минимальная концентрация полимера (0,5%) с использованием комбинации водорастворимых гемостатических полимеров.
С использованием армирования волокном можно разрабатывать экономически эффективные продукты.Беспорядочно расположенные волокна напоминают структуру крыла стрекозы, уравновешенную горизонтальными и вертикальными полосами на крыльях.Поперечные и продольные жилки крыла сообщаются с крыловой перепонкой (рис. 1).NFRCS состоит из армированного Ct в качестве каркасной системы с лучшей физической и механической прочностью (рис. 1).Из-за доступности и мастерства хирурги предпочитают использовать калибры из хлопчатобумажной нити (Ct) во время операций и перевязок. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Следовательно, следует ожидать его преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в выявлении гемостатической активности), Ct используется в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Поэтому, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе более 90% кристаллической целлюлозы (участвующей в повышенной гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9 , 10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Поэтому, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе более 90% кристаллической целлюлозы (помогает повысить гемостатическую активность), Ct использовали в качестве основы для NFRCS9,10.Ct покрывали поверхностно (наблюдалось образование нанотолстой пленки) и соединяли между собой гемостатической пленкообразующей композицией (ГППК).HFFC действует как матригель, удерживая случайно расположенные Ct вместе.Разработанная конструкция передает напряжение в пределах дисперсной фазы (армирующих волокон).Сложно получить нанопористые структуры с хорошей механической прочностью при минимальных концентрациях полимера.Кроме того, непросто настроить разные формы для различных биомедицинских применений.
На рисунке показана схема конструкции NFRCS, основанная на структуре крыла стрекозы (A).На этом изображении показана сравнительная аналогия строения крыла стрекозы (пересекающиеся и продольные жилки крыла соединены между собой) и микрофотография поперечного сечения Cp NFRCS (B).Схематическое изображение NFRCS.
NFRC были разработаны с использованием HFFC в качестве непрерывной фазы для устранения вышеуказанных ограничений.HFFC состоит из различных пленкообразующих гемостатических полимеров, включая хитозан (в качестве основного гемостатического полимера) с метилцеллюлозой (MC), гидроксипропилметилцеллюлозой (HPMC 50 cp) и поливиниловым спиртом (PVA)) (125 кДа) в качестве поддерживающего полимера, который способствует образованию тромбов.формирование.Добавление поливинилпирролидина К30 (ПВП К30) улучшило влагопоглощающую способность NFRCS.Полиэтиленгликоль 400 (PEG 400) добавляли для улучшения сшивания полимера в смесях связанных полимеров.На Ct наносили три различных гемостатических композиции HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC и Cp HFFC), а именно хитозан с MC (Cm), хитозан с HPMC (Ch) и хитозан с PVA (Cp).Различные исследования характеристик in vitro и in vivo подтвердили гемостатическую и ранозаживляющую активность NFRCS.Композитные материалы, предлагаемые NFRCS, могут использоваться для изготовления строительных лесов различных форм в соответствии с конкретными потребностями.
Кроме того, НФРК может быть модифицирована в виде повязки или валика для покрытия всей зоны поражения нижних конечностей и других частей тела.Специально для боевых травм конечностей разработанная конструкция NFRCS может быть изменена на половину руки или всю ногу (дополнительный рисунок S11).NFRCS можно превратить в браслет с тканевым клеем, который можно использовать для остановки кровотечения при тяжелых суицидальных травмах запястья.Наша главная цель — разработать NFRCS с минимальным количеством полимера, который можно было бы доставить большому населению (за чертой бедности) и который можно было бы поместить в аптечку.Простая, эффективная и экономичная система NFRCS приносит пользу местным сообществам и может иметь глобальные последствия.
Хитозан (молекулярная масса 80 кДа) и амарант были приобретены у Merck, Индия.Гидроксипропилметилцеллюлоза 50 Cp, полиэтиленгликоль 400 и метилцеллюлоза были приобретены у Loba Chemie Pvt.ООО, Мумбаи.Поливиниловый спирт (молекулярная масса 125 кДа) (87-90% гидролиза) был приобретен у National Chemicals, Gujarat.Поливинилпирролидин К30 был приобретен у Molychem, Мумбаи, стерильные тампоны были приобретены у Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамил Наду, с водой Milli Q (система очистки воды Direct-Q3, Merck, Индия) в качестве носителя.
NFRCS был разработан с использованием метода лиофилизации11,12.Все композиции HFFC (таблица 1) были приготовлены с использованием механической мешалки.Готовят 0,5% раствор хитозана с использованием 1% уксусной кислоты в воде путем непрерывного перемешивания при 800 об/мин на механической мешалке.Точную массу загруженного полимера, указанную в таблице 1, добавляли к раствору хитозана и перемешивали до получения прозрачного раствора полимера.К полученной смеси добавляли ПВП К30 и ПЭГ 400 в количествах, указанных в таблице 1, и продолжали перемешивание до получения прозрачного вязкого раствора полимера.Полученную ванну с полимерным раствором обрабатывали ультразвуком в течение 60 минут для удаления захваченных пузырьков воздуха из полимерной смеси.Как показано на дополнительном рисунке S1 (b), Ct был равномерно распределен в каждой лунке 6-луночного планшета (формы), дополненного 5 мл HFFC.
Планшет с шестью лунками обрабатывали ультразвуком в течение 60 мин для достижения равномерного смачивания и распределения HFFC в сети Ct.Затем заморозьте шестилуночный планшет при -20°C на 8-12 часов.Планшеты для замораживания лиофилизировали в течение 48 часов для получения различных составов NFRCS.Одна и та же процедура используется для производства различных форм и структур, таких как тампоны или цилиндрические тампоны, или любой другой формы для различных применений.
Точную навеску хитозана (80 кДа) (3%) растворяют в 1% уксусной кислоте с помощью магнитной мешалки.К полученному раствору хитозана добавляли 1% ПЭГ 400 и перемешивали в течение 30 минут.Перелейте полученный раствор в квадратную или прямоугольную емкость и заморозьте при температуре -80°С в течение 12 часов.Замороженные образцы лиофилизировали в течение 48 часов для получения пористого Cs13.
Разработанный NFRCS был подвергнут экспериментам с использованием инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токио, Япония) для подтверждения химической совместимости хитозана с другими полимерами14,15.Спектры FTIR (ширина спектрального диапазона от 400 до 4000 см-1) всех испытанных образцов были получены путем выполнения 32 сканирований.
Скорость всасывания в кровь (BAR) для всех составов оценивали с использованием метода, описанного Chen et al.16 с небольшими изменениями.Разработанные НФРК всех составов высушивали в вакуумной печи при 105°С в течение ночи для удаления остаточного растворителя.30 мг NFRCS (исходная масса образца – W0) и 30 мг Ct (положительный контроль) помещали в отдельные чашки, содержащие премикс 3,8% цитрата натрия.Через заданные промежутки времени, т.е. 5, 10, 20, 30, 40 и 60 секунд, NFRCS удаляли и очищали их поверхности от неабсорбированной крови, помещая образцы на Ct на 30 секунд.Конечный вес крови, поглощенной NFRCS 16, рассматривали (W1) в каждый момент времени.Рассчитайте процент BAR, используя следующую формулу:
Время свертывания крови (BCT) определяли, как сообщает Wang et al.17 .Время, необходимое для свертывания цельной крови (крысиной крови, предварительно смешанной с 3,8% цитратом натрия) в присутствии NFRCS, рассчитывали как BCT испытуемого образца.Различные компоненты NFRCS (30 мг) помещали в 10 мл флаконы с завинчивающимися крышками и инкубировали при 37°C.Во флакон добавляли кровь (0,5 мл) и добавляли 0,3 мл 0,2 М CaCl2 для активации свертывания крови.Наконец, переворачивайте флакон каждые 15 секунд (до 180°) до образования плотного сгустка.BCT выборки оценивается по количеству флипов vails17,18.На основе BCT были выбраны два оптимальных состава из NFRCS Cm, Ch и Cp для дальнейших характеристических исследований.
BCT композиций Ch NFRCS и Cp NFRCS определяли, применяя метод, описанный Li et al.19 .Поместите 15 x 15 мм2 Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs (положительный контроль) в отдельные чашки Петри (37 ° C).Кровь, содержащую 3,8 % цитрата натрия, смешивали с 0,2 М CaCl2 в объемном соотношении 10:1 для запуска процесса свертывания крови.На поверхность образца наносили 20 мкл 0,2 М смеси крови крыс CaCl2 и помещали в пустую чашку Петри.Контролем служила кровь, перелитая в пустые чашки Петри без Ct.С фиксированными интервалами в 0, 3 и 5 минут останавливайте свертывание, добавляя 10 мл деионизированной (DI) воды к образцу, содержащему чашку, не нарушая сгусток.Несвернувшиеся эритроциты (эритроциты) подвергаются гемолизу в присутствии деионизированной воды и выделяют гемоглобин.Гемоглобин в разные моменты времени (HA(t)) измеряли при 540 нм (λmax гемоглобина) с использованием спектрофотометра UV-Vis.Абсолютное поглощение гемоглобина (АН(0)) за 0 мин 20 мкл крови в 10 мл деионизированной воды принимали за эталон сравнения.Относительное поглощение гемоглобина (RHA) коагулированной кровью рассчитывали по соотношению HA(t)/HA(0) с использованием той же партии крови.
С помощью анализатора текстуры (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Брукфилд, США) определяли адгезивные свойства НФРК к поврежденной ткани.Прижмите цилиндрическую форму с открытым дном к внутренней части свиной кожи (без слоя жира).Образцы (Ch NFRCS и Cp NFRCS) наносили через канюлю в цилиндрические формы для создания адгезии к коже свиньи.После 3-минутной инкубации при комнатной температуре (КТ) (25°С) адгезионную прочность NFRCS регистрировали с постоянной скоростью 0,5 мм/сек.
Основной особенностью хирургических герметиков является повышение свертываемости крови при снижении кровопотери.Коагуляция без потерь в NFRCS оценивалась с использованием ранее опубликованного метода с небольшими модификациями 19 .Сделайте микроцентрифужную пробирку (2 мл) (внутренний диаметр 10 мм) с отверстием 8 × 5 мм2 на одной стороне центрифужной пробирки (представляющей собой открытую рану).NFRCS используется для закрытия отверстия, а лента используется для герметизации внешних краев.Добавьте 20 мкл 0,2 М CaCl2 в микроцентрифужную пробирку, содержащую премикс 3,8% цитрата натрия.Через 10 мин микроцентрифужные пробирки извлекали из чашек и определяли прирост массы чашек за счет истечения крови из НФРК (n = 3).Кровопотеря Ch NFRCS и Cp NFRCS сравнивали с Cs.
Влажную целостность NFRCS определяли на основе метода, описанного Mishra и Chaudhary21, с небольшими изменениями.Поместите NFRCS в колбу Эрленмейера на 100 мл с 50 мл воды и взболтайте в течение 60 с, не формируя верх.Визуальный осмотр и определение приоритетности образцов на физическую целостность на основе сбора.
Прочность связывания HFFC с Ct изучали с использованием ранее опубликованных методов с небольшими модификациями.Целостность поверхностного покрытия оценивали путем воздействия на НФРК акустических волн (внешний раздражитель) в присутствии воды milliQ (Ct).Разработанные NFRCS Ch NFRCS и Cp NFRCS помещали в химический стакан, наполненный водой, и обрабатывали ультразвуком в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 30 мин соответственно.После сушки процентную разницу между начальным и конечным весом NFRCS использовали для расчета процентной потери материала (HFFC).In vitro BCT дополнительно поддерживал прочность связывания или потерю поверхностных материалов.Эффективность связывания HFFC с Ct обеспечивает свертывание крови и эластичное покрытие на поверхности Ct22.
Однородность разработанной НФРК определяли с помощью БХТ образцов (30 мг), взятых из случайно выбранных общих мест НФРК.Следуйте ранее упомянутой процедуре BCT, чтобы определить соответствие NFRCS.Близость между всеми пятью образцами обеспечивает равномерное покрытие поверхности и отложение HFFC в сетке Ct.
Номинальную площадь контакта с кровью (NBCA) определяли, как сообщалось ранее, с некоторыми изменениями.Коагулируйте кровь, зажимая 20 мкл крови между двумя поверхностями Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs.Через 1 час две части стента разделили и вручную измерили площадь сгустка.Среднее значение трех повторений считалось NBCA NFRCS19.
Анализ динамической сорбции паров (DVS) использовался для оценки эффективности NFRCS для поглощения воды из внешней среды или из места повреждения, ответственного за инициирование коагуляции.DVS оценивает или регистрирует поглощение и потерю паров в образце гравиметрически, используя сверхчувствительные весы с разрешением по массе ±0,1 мкг.Парциальное давление пара (относительная влажность) создается электронным регулятором массового расхода вокруг образца путем смешивания насыщенного и сухого газов-носителей. В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи, в зависимости от процента поглощения влаги образцами, образцы были разделены на 4 категории (0–0,012 % по весу – негигроскопичные, 0,2–2 % по весу слабо гигроскопичные, 2–15 % умеренно гигроскопичные и > 15 % очень гигроскопичные)23. В соответствии с руководящими принципами Европейской фармакопеи, в зависимости от процента поглощения влаги образцами, образцы были разделены на 4 категории (0–0,012 % масс.– негигроскопичные, 0,2–2 % масс./масс. слегка гигроскопичные, 2–15 % умеренно гигроскопичные и > 15 % очень гигроскопичные)23.В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи, в зависимости от процента поглощения влаги образцами, образцы были разделены на 4 категории (0–0,012 % по массе – негигроскопичные, 0,2–2 % по массе слабогигроскопичные, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23.0-0,012% вес. /w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （(0-0,012% масс./масс.)湿 性 、 、 、 、 0,2-2% по весу 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15% 非常吸湿）23。В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи образцы подразделяются на 4 класса в зависимости от процента поглощенной образцом влаги (0-0,012 % по массе – негигроскопичные, 0,2-2 % по массе слабогигроскопичные, 2-15 % по массе).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % умеренно гигроскопичен, > 15% очень гигроскопичен) 23.Гигроскопическую эффективность НФХС Х НФХС и ЦН НФХС определяли на анализаторе ДВС ТА TGA Q5000 SA.В ходе этого процесса были получены данные о времени работы, относительной влажности (RH) и весе образца в реальном времени при 25°C24.Содержание влаги рассчитывается путем точного анализа массы NFRCS с использованием следующего уравнения:
MC – влажность NFRCS.m1 – сухая масса НПВП.m2 — масса NFRCS в реальном времени при данной RH.
Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по дозированию азотом после опорожнения проб при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Полную площадь поверхности оценивали с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25°C в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 торр) 后, 使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。在 25°С Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по дозированию азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 x 10-3 торр).Общая площадь поверхности, объем пор и размер пор NFRCS определяли с помощью Quantachrome от NOVA 1000e, Австрия, с использованием программного обеспечения RS 232.
Подготовьте 5% эритроцитов (физиологический раствор в качестве разбавителя) из цельной крови.Затем перенесите аликвоту HFFC (0,25 мл) на 96-луночный планшет и 5% массы эритроцитов (0,1 мл).Инкубируйте смесь при 37°C в течение 40 минут.Смесь эритроцитов и сыворотки рассматривали как положительный контроль, а смесь физиологического раствора и эритроцитов - как отрицательный контроль.Гемагглютинацию определяли по шкале Стаицкого.Предлагаемые чешуи следующие: + + + + плотные зернистые агрегаты;+ + + гладкие нижние накладки с изогнутыми краями;+ + гладкие нижние колодки с рваными краями;+ узкие красные кольца по краям гладких подушечек;– (минус) дискретная красная кнопка 12 в центре нижнего колодца.
Гемосовместимость NFRCS изучали по методу Международной организации по стандартизации (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Гравиметрический метод, описанный Singh et al.Незначительные модификации были сделаны для оценки образования тромбов в присутствии или на поверхности NFRCS.500 мг Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS инкубировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 24 часов при 37°C.Через 24 часа PBS удаляли и NFRCS обрабатывали 2 мл крови, содержащей 3,8% цитрата натрия.На поверхность NFRCS добавьте 0,04 мл 0,1 М CaCl2 к инкубированным образцам.Через 45 минут добавляли 5 мл дистиллированной воды для остановки коагуляции.Коагулированную кровь на поверхности НФРК обрабатывали 36-38% раствором формальдегида.Сгустки, зафиксированные формальдегидом, высушивали и взвешивали.Процент тромбоза оценивали путем расчета веса стакана без крови и пробы (отрицательный контроль) и стакана с кровью (положительный контроль).
В качестве первоначального подтверждения образцы были визуализированы под оптическим микроскопом, чтобы понять способность поверхностного покрытия HFFC, взаимосвязей Ct и сети Ct образовывать поры.Тонкие срезы Ch и Cp из NFRCS обрезали лезвием скальпеля.Полученный срез помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом, края фиксировали клеем.Подготовленные препараты просматривали под оптическим микроскопом и фотографировали при различном увеличении.
Отложение полимера в сетях Ct визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, основанной на методе, описанном Rice et al.29. Композицию HFFC, используемую для состава, смешивали с флуоресцентным красителем (амарант) и получали NFRCS (Ch и Cp) в соответствии с ранее упомянутым способом. Композицию HFFC, используемую для состава, смешивали с флуоресцентным красителем (амарант) и получали NFRCS (Ch и Cp) в соответствии с ранее упомянутым способом.Композицию HFFC, используемую для приготовления, смешивали с флуоресцентным красителем (амарант) и получали NFRCS (Ch и Cp) в соответствии с ранее упомянутым способом.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。Композицию HFFC, используемую в рецептуре, смешивали с флуоресцентным красителем (Amaranth) и получали NFRCS (Ch и Cp), как упоминалось ранее.Из полученных образцов вырезали тонкие срезы НФРК, помещали на предметные стекла и закрывали покровными стеклами.Соблюдайте подготовленные слайды под флуоресцентным микроскопом с использованием зеленого фильтра (310-380 нм).Изображения были сделаны при 4-кратном увеличении, чтобы понять взаимосвязь Ct и избыточное отложение полимера в сетке Ct.
Топографию поверхности NFRCS Ch и Cp определяли с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) со сверхострым кантилевером TESP в режиме постукивания: 42 Н/м, 320 кГц, ROC 2-5 нм, Bruker, Тайвань.Шероховатость поверхности определяли по среднеквадратичному значению (RMS) с использованием программного обеспечения (Scanning Probe Image Processor).Различные местоположения NFRCS были визуализированы на 3D-изображениях для проверки однородности поверхности.Стандартное отклонение оценки для данной области определяется как шероховатость поверхности.Уравнение RMS использовалось для количественной оценки шероховатости поверхности NFRCS31.
Исследования на основе FESEM проводились с использованием FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, чтобы понять морфологию поверхности Ch NFRCS и Cp NFRCS, которые показали лучший BCT, чем Cm NFRCS.Исследование FESEM проводили по методу, описанному Zhao et al.32 с небольшими изменениями.NFRCS 20-30 мг Ch NFRCS и Cp NFRCS предварительно смешивали с 20 мкл 3,8% цитрата натрия, предварительно смешанного с крысиной кровью.К образцам, обработанным кровью, добавляли 20 мкл 0,2 М CaCl2 для инициации коагуляции, и образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут.Кроме того, излишки эритроцитов удаляли с поверхности НФРК путем промывки физиологическим раствором.
Последующие образцы обрабатывали 0,1% глутаровым альдегидом, а затем сушили в сушильном шкафу с горячим воздухом при 37°C для удаления влаги.Высушенные образцы покрывали и анализировали 32 .Другими изображениями, полученными в ходе анализа, были образование сгустков на поверхности отдельных хлопковых волокон, отложение полимера между Ct, морфология (форма) эритроцитов, целостность сгустка и морфология эритроцитов в присутствии NFRCS.Необработанные области NFRCS и области NFRCS, обработанные Ch и Cp, инкубированные с кровью, сканировали на наличие элементарных ионов (натрия, калия, азота, кальция, магния, цинка, меди и селена)33.Сравните процентное содержание элементарных ионов между обработанными и необработанными образцами, чтобы понять накопление элементарных ионов во время образования сгустка и гомогенность сгустка.
Толщина поверхностного покрытия Cp HFFC на поверхности Ct определялась с помощью FESEM.Поперечные сечения Cp NFRCS были вырезаны из каркаса и покрыты напылением.Полученные образцы покрытия напылением наблюдали с помощью FESEM и измеряли толщину поверхностного покрытия 34 , 35 , 36 .
Рентгеновская микро-КТ обеспечивает трехмерную неразрушающую визуализацию высокого разрешения и позволяет изучить внутреннее структурное устройство НФРК.Микро-КТ использует рентгеновский луч, проходящий через образец, для регистрации локального коэффициента линейного затухания рентгеновских лучей в образце, что помогает получить морфологическую информацию.Внутреннее расположение Ct в Cp NFRCS и обработанных кровью Cp NFRCS исследовали с помощью микро-КТ, чтобы понять эффективность абсорбции и свертывание крови в присутствии NFRCS37,38,39.Трехмерные структуры обработанных кровью и необработанных образцов Cp NFRCS были реконструированы с использованием микро-КТ (V|tome|x S240, Phoenix, Германия).С помощью программного обеспечения VG STUDIO-MAX версии 2.2 было сделано несколько рентгеновских снимков под разными углами (в идеале охват 360°) для разработки 3D-изображений для NFRCS.Собранные проекционные данные были реконструированы в трехмерные объемные изображения с использованием соответствующего простого программного обеспечения 3D ScanIP Academic.
Кроме того, чтобы понять распределение сгустка, в NFRCS добавляли 20 мкл предварительно смешанной цитратной крови и 20 мкл 0,2 М CaCl2, чтобы инициировать свертывание крови.Подготовленные образцы оставляют затвердевать.Поверхность НФРК обрабатывали 0,5% глутаровым альдегидом и сушили в сушильном шкафу при температуре 30–40°С в течение 30 мин.Сгусток крови, образовавшийся на НФРК, сканировали, реконструировали и визуализировали 3D-изображение сгустка крови.
Антибактериальные анализы проводили на Cp NFRCS (лучше всего по сравнению с Ch NFRCS) с использованием ранее описанного метода с небольшими модификациями.Антибактериальную активность Cp NFRCS и Cp HFFC определяли с использованием трех различных тест-микроорганизмов [S.aureus (грамположительные бактерии), E.coli (грамотрицательные бактерии) и белой Candida (C.albicans)], растущих на агаре в чашках Петри в инкубаторе.Равномерно инокулировать 50 мл разведенной суспензии бактериальной культуры в концентрации 105-106 КОЕ мл-1 на агаризованную среду.Перелейте среду в чашку Петри и дайте ей затвердеть.На поверхности агаровой пластины делали лунки для заполнения HFFC (3 лунки для HFFC и 1 для отрицательного контроля).Добавьте 200 мкл HFFC в 3 лунки и 200 мкл pH 7,4 PBS в 4-ю лунку.С другой стороны чашки Петри поместите диск 12 мм Cp NFRCS на затвердевший агар и смочите PBS (pH 7,4).Таблетки ципрофлоксацина, ампициллина и флуконазола считаются эталонными стандартами для Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans.Измерьте зону торможения вручную и сделайте цифровое изображение зоны торможения.
После институционального этического одобрения исследование было проведено в Медицинском колледже образования и исследований Кастурба в Манипале, штат Карнатака, на юге Индии.Экспериментальный протокол TEG in vitro был рассмотрен и одобрен Комитетом по институциональной этике Медицинского колледжа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020).Субъекты были набраны из добровольных доноров крови (в возрасте от 18 до 55 лет) из больничного банка крови.Кроме того, от добровольцев была получена форма информированного согласия на забор образцов крови.Нативный ТЭГ (N-ТЭГ) использовали для изучения влияния состава Cp HFFC на цельную кровь, предварительно смешанную с цитратом натрия.N-TEG широко известен своей ролью в реанимации по месту оказания медицинской помощи, что создает проблемы для клиницистов из-за возможности клинически значимой задержки результатов (обычные тесты на коагуляцию).Анализ N-TEG проводили с использованием цельной крови.Информированное согласие и подробный анамнез были получены от всех участников.В исследование не включались участники с гемостатическими или тромботическими осложнениями, такими как беременность/послеродовой период или заболевания печени.Субъекты, принимающие препараты, влияющие на каскад коагуляции, также были исключены из исследования.Основные лабораторные анализы (гемоглобин, протромбиновое время, активированный тромбопластин и количество тромбоцитов) были выполнены всем участникам в соответствии со стандартными процедурами.N-TEG определяет вязкоупругость сгустка крови, начальную структуру сгустка, взаимодействие частиц, укрепление сгустка и лизис сгустка.Анализ N-TEG предоставляет графические и числовые данные о коллективных эффектах нескольких клеточных элементов и плазмы.Анализ N-TEG проводили на двух разных объемах Cp HFFC (10 мкл и 50 мкл).В результате к 10 мкл ЦП ГФФК добавляли 1 мл цельной крови с лимонной кислотой.Добавьте 1 мл (Cp HFFC + цитратная кровь), 340 мкл смешанной крови в чашку с 20 мкл 0,2 М CaCl2, содержащую ТЭГ.После этого чашки TEG загружали в TEG® 5000, US для измерения R, K, угла альфа, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% образцов крови в присутствии Cp HFFC41.
Протокол исследования in vivo был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по этике животных (IAEC), Медицинской школой Кастурбы, Манипальским институтом высшего образования, Манипал (IAEC/KMC/69/2020).Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных (CPCSEA).Все исследования NFRCS in vivo (2 × 2 см2) проводили на крысах-самках Wistar (массой от 200 до 250 г).Все животные были акклиматизированы при температуре 24-26°С, животные имели свободный доступ к стандартному корму и воде вволю.Все животные были случайным образом разделены на разные группы, каждая группа состояла из трех животных.Все исследования были выполнены в соответствии с Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Перед исследованием животных анестезировали внутрибрюшинным (в/б) введением смеси 20-50 мг кетамина (на 1 кг массы тела) и 2-10 мг ксилазина (на 1 кг массы тела).После исследования объем обескровливания рассчитывали путем оценки разницы между начальной и конечной массой образцов, за объем обескровливания образца принимали среднее значение, полученное из трех испытаний.
Модель ампутации крысиного хвоста была реализована, чтобы понять потенциал NFRCS для модуляции кровотечения при травме, бою или дорожно-транспортном происшествии (модель травмы).Отрежьте 50% хвоста лезвием скальпеля и поместите на воздух на 15 с, чтобы обеспечить нормальное кровотечение.Кроме того, тестируемые образцы помещали на хвост крысы путем приложения давления (Ct, Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS).Кровотечение и ПКТ были зарегистрированы для испытуемых образцов (n = 3)17,45.
Эффективность контроля давления НФРК в бою исследовали на модели поверхностной бедренной артерии.Бедренная артерия обнажается, пунктируется троакаром 24G и обескровливается в течение 15 секунд.После того, как наблюдается неконтролируемое кровотечение, испытуемый образец помещают в место прокола с приложением давления.Сразу после нанесения испытуемого образца фиксировали время свертывания и наблюдали гемостатическую эффективность в течение следующих 5 минут.Ту же процедуру повторили с Cs и Ct46.
Доулинг и др.47 предложили модель повреждения печени для оценки гемостатического потенциала гемостатических материалов в контексте интраоперационного кровотечения.BCT регистрировали для образцов Ct (отрицательный контроль), каркаса Cs (положительный контроль), образцов Ch NFRCS и образцов Cp NFRCS.Надпеченочную полую вену крысы обнажали, выполняя срединную лапаротомию.После этого ножницами вырезали дистальную часть левой доли.Сделайте надрез в печени лезвием скальпеля и дайте ему кровоточить в течение нескольких секунд.Точно взвешенные тестовые образцы Ch NFRCS и Cp NFRCS помещали на поврежденную поверхность без какого-либо положительного давления и регистрировали BCT.Затем контрольная группа (Ct) применила давление, а затем Cs 30 s47, не сломав травму.
Анализы заживления ран in vivo проводились с использованием модели эксцизионной раны для оценки свойств заживления ран разработанных NFRCS на основе полимера.Модели эксцизионных ран были выбраны и выполнены в соответствии с ранее опубликованными методами с небольшими модификациями19,32,48.Всех животных анестезировали, как описано ранее.Используйте перфоратор для биопсии (12 мм), чтобы сделать круговой глубокий разрез на коже спины.Подготовленные раневые участки были перевязаны Cs (положительный контроль), Ct (учитывая, что ватные диски мешают заживлению), Ch NFRCS и Cp NFRCS (экспериментальная группа) и отрицательный контроль без какой-либо обработки.В каждый день исследования у всех крыс измеряли площадь раны.С помощью цифровой камеры сделайте снимок области раны и наденьте новую повязку.Процент закрытия раны измеряли по следующей формуле:
На основании процента закрытия ран на 12-й день исследования кожу крыс лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) иссекали и исследовали с помощью окрашивания гематоксилин-эозином и трихромного окрашивания по Массону. На основании процента закрытия ран на 12-й день исследования кожу крыс лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) иссекали и исследовали с помощью окрашивания гематоксилин-эозином и трихромного окрашивания по Массону.По проценту закрытия раны на 12-й день исследования кожу крыс лучшей группы ((Цп НФРКС) и контрольной группы) иссекали и исследовали путем окрашивания гематоксилин-эозином и трихромом Массона.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Mas сын三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Крыс в лучшей группе ((Cp NFRCS) и контрольной группе) вырезали для окрашивания гематоксилин-эозином и окрашивания трихромом Массона на основе процентного закрытия раны на 12-й день исследования.Внедренная процедура окрашивания проводилась в соответствии с ранее описанными методами49,50.Вкратце, после фиксации в 10% формалине образцы обезвоживали с использованием ряда спиртов определенной степени.Используйте микротом для получения тонких срезов (толщиной 5 мкм) иссеченной ткани.Тонкие серийные срезы контролей и Cp NFRCS обрабатывали гематоксилином и эозином для изучения гистопатологических изменений.Окрашивание трихромом по Массону использовали для обнаружения образования коллагеновых фибрилл.Полученные результаты были слепо изучены патологоанатомами.
Стабильность образцов Cp NFRCS изучали при комнатной температуре (25°C ± 2°C/60% относительной влажности ± 5%) в течение 12 месяцев51.Cp NFRCS (обесцвечивание поверхности и рост микробов) подвергали визуальному осмотру и тестированию на износостойкость при сгибе и BCT в соответствии с вышеуказанными методами, описанными в разделе «Материалы и методы».
Масштабируемость и воспроизводимость Cp NFRCS проверяли путем приготовления Cp NFRCS размером 15×15 см2.Кроме того, образцы по 30 мг (n = 5) вырезали из различных фракций Cp NFRCS и оценивали BCT исследуемых образцов, как описано ранее в разделе «Методы».
Мы попытались разработать различные формы и структуры с использованием композиций Cp NFRCS для различных биомедицинских применений.Такие формы или конфигурации включают конические тампоны для носовых кровотечений, стоматологические процедуры и цилиндрические тампоны для вагинальных кровотечений.
Все наборы данных выражены как среднее значение ± стандартное отклонение и были проанализированы с помощью ANOVA с использованием Prism 5.03 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США) с последующим тестом множественных сравнений Бонферрони (*p<0,05).
Все процедуры, проведенные в исследованиях на людях, соответствовали стандартам Института и Национального исследовательского совета, а также Хельсинкской декларации 1964 г. и последующим поправкам к ней или аналогичным этическим стандартам.Все участники были проинформированы об особенностях исследования и его добровольном характере.Данные участников остаются конфиденциальными после сбора.Экспериментальный протокол TEG in vitro был рассмотрен и одобрен Комитетом по институциональной этике Медицинского колледжа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020).Добровольцы подписали информированное согласие на сбор образцов крови.
Все процедуры, проведенные в исследованиях на животных, проводились в соответствии с Медицинским факультетом Кастубы Манипальского института высшего образования, Манипал (IAEC/KMC/69/2020).Все спланированные эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных (CPCSEA).Все авторы следуют рекомендациям ARRIVE.
Спектры FTIR всех NFRCS были проанализированы и сопоставлены со спектром хитозана, показанным на рисунке 2A.Характерные спектральные пики хитозана (зарегистрированные) при 3437 см-1 (растяжение OH и NH, перекрытие), 2945 и 2897 см-1 (растяжение CH), 1660 см-1 (штамм NH2), 1589 см-1 (изгиб NH), 1157 см-1 (мостиковое растяжение O-), 1067 см-1 (растяжение C-O, вторичный гидроксил), 993 см -1 (растяжка CO, Bo-OH) 52.53.54.В дополнительной таблице S1 показаны значения спектра поглощения FTIR NFRCS для хитозана (репортер), чистого хитозана, Cm, Ch и Cp.Спектры FTIR всех NFRCS (Cm, Ch и Cp) показали те же характерные полосы поглощения, что и чистый хитозан, без каких-либо существенных изменений (рис. 2А).Результаты FTIR подтвердили отсутствие химических или физических взаимодействий между полимерами, использованными для разработки NFRCS, что указывает на инертность используемых полимеров.
In vitro характеристика Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs.(A) представляет объединенные FTIR-спектры композиций хитозана и Cm NFRCS, Ch NFRCS и Cp NFRCS при сжатии.(B) a) Скорость поглощения цельной кровью NFRCS Cm, Ch, Cp и Cg (n = 3);Образцы Ct показали более высокий BAR, потому что ватный тампон имеет более высокую эффективность поглощения;б) Кровь после абсорбции крови Иллюстрация абсорбированного образца.Графическое представление BCT тестового образца C (Cp NFRCS имел лучший BCT (15 с, n = 3)). Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей отклонений стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, ***p<0,0001. C, D, E 和G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p<0,0001。 C, D, E 和G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p<0,0001。 Данные в C, D, E и G показывают среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, ***p<0,0001.