Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Неконтролируемое кровотечение является одной из основных причин смерти. Достижение быстрого гемостаза обеспечивает выживание субъекта в качестве первой помощи во время боевых действий, дорожно-транспортных происшествий и операций по снижению смертности. Нанопористый армированный волокном композитный каркас (NFRCS), полученный из простого гемостатического пленкообразующего состава (HFFC) в качестве непрерывной фазы, может запускать и усиливать гемостаз. Разработка NFRCS основана на конструкции крыла стрекозы. Структура крыла стрекозы состоит из поперечных и продольных крыльев, а мембраны крыльев соединены друг с другом для поддержания целостности микроструктуры. HFFC равномерно покрывает поверхность волокна пленкой нанометровой толщины и соединяет случайно распределенную толщину хлопка (Ct) (дисперсную фазу), образуя нанопористую структуру. Сочетание непрерывной и дисперсной фаз снижает стоимость продукта в десять раз по сравнению с коммерчески доступными продуктами. Модифицированные NFRCS (тампоны или напульсники) могут использоваться в различных биомедицинских приложениях. Исследования in vivo пришли к выводу, что разработанный Cp NFRCS запускает и усиливает процесс коагуляции в месте применения. NFRCS может модулировать микросреду и действовать на клеточном уровне благодаря своей нанопористой структуре, что приводит к лучшему заживлению ран в модели иссечения ран.
Неконтролируемое кровотечение во время боя, интраоперационных и чрезвычайных ситуаций может представлять серьезную угрозу для жизни раненых1. Эти состояния далее приводят к общему повышению периферического сосудистого сопротивления, что приводит к геморрагическому шоку. Соответствующие меры по контролю кровотечения во время и после операции считаются потенциально опасными для жизни2,3. Повреждение крупных сосудов приводит к массивной кровопотере, в результате чего уровень смертности составляет ≤ 50% в бою и 31% во время операции1. Массивная кровопотеря приводит к уменьшению объема тела, что снижает сердечный выброс. Увеличение общего периферического сосудистого сопротивления и прогрессирующее нарушение микроциркуляции приводят к гипоксии в органах жизнеобеспечения. Геморрагический шок может возникнуть, если состояние продолжается без эффективного вмешательства1,4,5. Другие осложнения включают прогрессирование гипотермии и метаболического ацидоза, а также нарушение свертываемости крови, которое затрудняет процесс коагуляции. Тяжелый геморрагический шок связан с более высоким риском смерти6,7,8. При шоке III степени (прогрессирующем) переливание крови необходимо для выживания пациента во время интраоперационной и послеоперационной заболеваемости и смертности. Чтобы преодолеть все вышеперечисленные опасные для жизни ситуации, мы разработали нанопористый армированный волокнами композитный каркас (NFRCS), который использует минимальную концентрацию полимера (0,5%) с использованием комбинации водорастворимых гемостатических полимеров.
Используя армирование волокнами, можно разрабатывать экономически эффективные продукты. Хаотично расположенные волокна напоминают структуру крыла стрекозы, уравновешенную горизонтальными и вертикальными полосами на крыльях. Поперечные и продольные жилки крыла сообщаются с мембраной крыла (рис. 1). NFRCS состоит из армированного Ct в качестве каркасной системы с лучшей физической и механической прочностью (рис. 1). Благодаря доступности и мастерству хирурги предпочитают использовать калибры из хлопчатобумажной нити (Ct) во время операций и перевязок. Таким образом, учитывая его многочисленные преимущества, включая > 90% кристаллической целлюлозы (способствует повышению гемостатической активности), Ct был использован в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Таким образом, учитывая его многочисленные преимущества, включая > 90% кристаллической целлюлозы (способствует повышению гемостатической активности), Ct был использован в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Следовательно, вследствие его преобладания, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct используется в скелетной системе NFRCS9,10. Таким образом, учитывая его многочисленные преимущества, включая >90% кристаллической целлюлозы (участвующей в повышении гемостатической активности), Ct был использован в качестве скелетной системы NFRCS9,10.因此, 考虑到它的多重益处, 包括> 90% 的结晶纤维素(有助于增强止血活性),Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此, 考虑到它的多重益处, 包括> 90%Таким образом, учитывая его многочисленные преимущества, включая содержание более 90% кристаллической целлюлозы (способствует повышению гемостатической активности), Ct был использован в качестве каркаса для NFRCS9,10.Ct был поверхностно покрыт (наблюдалось образование нано-толстой пленки) и соединен с гемостатическим пленкообразующим составом (HFFC). HFFC действует как матригель, удерживая случайно размещенные Ct вместе. Разработанная конструкция передает напряжение в пределах дисперсной фазы (армирующие волокна). Трудно получить нанопористые структуры с хорошей механической прочностью, используя минимальные концентрации полимера. Кроме того, непросто настраивать различные формы для различных биомедицинских применений.
На рисунке представлена ​​схема конструкции NFRCS на основе структуры крыла стрекозы (A). На этом изображении показана сравнительная аналогия структуры крыла стрекозы (пересекающиеся и продольные жилки крыла соединены между собой) и микрофотография поперечного сечения Cp NFRCS (B). Схематическое изображение NFRCS.
NFRC были разработаны с использованием HFFC в качестве непрерывной фазы для устранения вышеуказанных ограничений. HFFC состоит из различных пленкообразующих гемостатических полимеров, включая хитозан (как основной гемостатический полимер) с метилцеллюлозой (MC), гидроксипропилметилцеллюлозой (HPMC 50 cp) и поливиниловым спиртом (PVA)) (125 кДа) в качестве поддерживающего полимера, который способствует образованию тромба. образование. Добавление поливинилпирролидина K30 (PVP K30) улучшило способность NFRCS поглощать влагу. Полиэтиленгликоль 400 (PEG 400) был добавлен для улучшения сшивания полимеров в связанных полимерных смесях. Три различных гемостатических состава HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC и Cp HFFC), а именно хитозан с MC (Cm), хитозан с HPMC (Ch) и хитозан с PVA (Cp), были применены к Ct. Различные исследования in vitro и in vivo подтвердили кровоостанавливающую и ранозаживляющую активность NFRCS. Композитные материалы, предлагаемые NFRCS, могут использоваться для настройки различных форм каркасов в соответствии с конкретными потребностями.
Кроме того, NFRCS можно модифицировать как бинт или рулон, чтобы покрыть всю область травмы нижних конечностей и других частей тела. Специально для боевых травм конечностей разработанная конструкция NFRCS может быть изменена на половину руки или полную ногу (дополнительный рисунок S11). NFRCS можно сделать в виде напульсника с тканевым клеем, который можно использовать для остановки кровотечения при тяжелых суицидальных травмах запястья. Наша главная цель — разработать NFRCS с как можно меньшим количеством полимера, который можно доставить большому количеству населения (ниже черты бедности) и который можно поместить в аптечку первой помощи. Простой, эффективный и экономичный по конструкции, NFRCS приносит пользу местным сообществам и может иметь глобальное влияние.
Хитозан (молекулярная масса 80 кДа) и амарант были приобретены в Merck, Индия. Гидроксипропилметилцеллюлоза 50 Cp, полиэтиленгликоль 400 и метилцеллюлоза были приобретены в Loba Chemie Pvt. LLC, Мумбаи. Поливиниловый спирт (молекулярная масса 125 кДа) (87-90% гидролизованный) был приобретен в National Chemicals, Гуджарат. Поливинилпирролидин K30 был приобретен в Molychem, Мумбаи, стерильные тампоны были приобретены в Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамил Наду, с водой Milli Q (система очистки воды Direct-Q3, Merck, Индия) в качестве носителя.
NFRCS был разработан с использованием метода лиофилизации11,12. Все композиции HFFC (таблица 1) были приготовлены с использованием механической мешалки. Приготовьте 0,5% раствор хитозана с использованием 1% уксусной кислоты в воде путем непрерывного перемешивания при 800 об/мин на механической мешалке. Точный вес загруженного полимера, указанный в таблице 1, был добавлен к раствору хитозана и перемешивался до получения прозрачного раствора полимера. К полученной смеси были добавлены PVP K30 и PEG 400 в количествах, указанных в таблице 1, и перемешивание продолжалось до получения прозрачного вязкого раствора полимера. Полученную ванну с раствором полимера обрабатывали ультразвуком в течение 60 минут для удаления захваченных пузырьков воздуха из полимерной смеси. Как показано на дополнительном рисунке S1(b), Ct был равномерно распределен в каждой лунке 6-луночного планшета (формы), дополненного 5 мл HFFC.
Шестилуночный планшет обрабатывали ультразвуком в течение 60 минут для достижения равномерного смачивания и распределения HFFC в сети Ct. Затем заморозьте шестилуночный планшет при температуре -20°C на 8-12 часов. Замороженные планшеты лиофилизировали в течение 48 часов для получения различных формул NFRCS. Та же процедура используется для производства различных форм и структур, таких как тампоны или цилиндрические тампоны, или любой другой формы для различных применений.
Точно взвешенный хитозан (80 кДа) (3%) растворяют в 1% уксусной кислоте с помощью магнитной мешалки. К полученному раствору хитозана добавляют 1% ПЭГ 400 и перемешивают в течение 30 минут. Полученный раствор выливают в квадратный или прямоугольный контейнер и замораживают при температуре -80°С в течение 12 часов. Замороженные образцы лиофилизируют в течение 48 часов для получения пористого Cs13.
Разработанный NFRCS был подвергнут экспериментам с использованием инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токио, Япония) для подтверждения химической совместимости хитозана с другими полимерами14,15. Спектры FTIR (ширина спектрального диапазона от 400 до 4000 см-1) всех испытанных образцов были получены путем выполнения 32 сканирований.
Скорость абсорбции крови (BAR) для всех составов оценивали с использованием метода, описанного Ченом и др. 16 с небольшими модификациями. Разработанные NFRK всех составов сушили в вакуумной печи при 105 °C в течение ночи для удаления остаточного растворителя. 30 мг NFRCS (исходный вес образца – W0) и 30 мг Ct (положительный контроль) помещали в отдельные чашки, содержащие премикс 3,8% цитрата натрия. Через заданные промежутки времени, т. е. 5, 10, 20, 30, 40 и 60 секунд, NFRCS удаляли, а их поверхности очищали от неабсорбированной крови, помещая образцы на Ct на 30 секунд. Конечный вес крови, абсорбированной NFRCS 16, учитывали (W1) в каждой временной точке. Рассчитайте процент BAR, используя следующую формулу:
Время свертывания крови (BCT) определялось, как сообщают Ван и др. 17 . Время, необходимое для свертывания цельной крови (крысиная кровь, предварительно смешанная с 3,8% цитрата натрия) в присутствии NFRCS, рассчитывалось как BCT тестового образца. Различные компоненты NFRCS (30 мг) помещались во флаконы с завинчивающейся крышкой объемом 10 мл и инкубировались при температуре 37 °C. Кровь (0,5 мл) добавлялась во флакон и 0,3 мл 0,2 М CaCl2 добавлялось для активации свертывания крови. Наконец, переворачивайте флакон каждые 15 секунд (до 180 °) до образования прочного сгустка. BCT образца оценивается по количеству переворотов17,18. На основе BCT были выбраны два оптимальных состава из NFRCS Cm, Ch и Cp для дальнейших исследований по характеристике.
BCT композиций Ch NFRCS и Cp NFRCS определяли, применяя метод, описанный Ли и др. 19 . Поместите 15 x 15 мм2 Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs (положительный контроль) в отдельные чашки Петри (37 °C). Кровь, содержащую 3,8% цитрата натрия, смешивали с 0,2 M CaCl2 в объемном соотношении 10:1, чтобы начать процесс свертывания крови. 20 мкл смеси 0,2 M CaCl2 с кровью крысы наносили на поверхность образца и помещали в пустую чашку Петри. Контролем служила кровь, налитая в пустые чашки Петри без Ct. Через фиксированные интервалы 0, 3 и 5 минут останавливайте свертывание, добавляя 10 мл деионизированной (DI) воды в образец, содержащий чашку, не нарушая сгусток. Некоагулированные эритроциты (эритроциты) подвергаются гемолизу в присутствии деионизированной воды и высвобождают гемоглобин. Гемоглобин в различные моменты времени (HA(t)) измеряли при 540 нм (λmax гемоглобин) с помощью спектрофотометра UV-Vis. Абсолютное поглощение гемоглобина (AH(0)) за 0 мин 20 мкл крови в 10 мл деионизированной воды было принято в качестве стандарта сравнения. Относительное поглощение гемоглобина (RHA) коагулированной крови рассчитывали из соотношения HA(t)/HA(0) с использованием той же партии крови.
Используя анализатор текстуры (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), были определены адгезионные свойства NFRK к поврежденным тканям. Прижмите цилиндрическую чашку с открытым дном к внутренней стороне свиной шкуры (без слоя жира). Образцы (Ch NFRCS и Cp NFRCS) были нанесены с помощью канюли в цилиндрические формы для создания адгезии к коже свиньи. После 3-минутной инкубации при комнатной температуре (КТ) (25 °C) адгезионная прочность NFRCS была зарегистрирована с постоянной скоростью 0,5 мм/сек.
Главной особенностью хирургических герметиков является повышение свертываемости крови при одновременном снижении кровопотери. Коагуляция без потерь при NFRCS оценивалась с использованием ранее опубликованного метода с небольшими модификациями 19 . Изготовьте микроцентрифужную пробирку (2 мл) (внутренний диаметр 10 мм) с отверстием 8 × 5 мм2 на одной стороне центрифужной пробирки (представляющим открытую рану). NFRCS используется для закрытия отверстия, а клейкая лента используется для герметизации внешних краев. Добавьте 20 мкл 0,2 М CaCl2 в микроцентрифужную пробирку, содержащую премикс 3,8% цитрата натрия. Через 10 минут микроцентрифужные пробирки извлекали из чашек и определяли увеличение массы чашек за счет оттока крови из NFRK (n = 3). Кровопотерю Ch NFRCS и Cp NFRCS сравнивали с Cs.
Влажная целостность NFRCS определялась на основе метода, описанного Мишрой и Чаудхари21 с небольшими модификациями. Поместите NFRCS в колбу Эрленмейера объемом 100 мл с 50 мл воды и вращайте в течение 60 с, не образуя верха. Визуальный осмотр и расстановка приоритетов образцов по физической целостности на основе сбора.
Прочность связывания HFFC с Ct изучалась с использованием ранее опубликованных методов с небольшими модификациями. Целостность поверхностного покрытия оценивалась путем воздействия на NFRK акустических волн (внешний стимул) в присутствии воды milliQ (Ct). Разработанные NFRCS Ch NFRCS и Cp NFRCS помещались в стакан, наполненный водой, и обрабатывались ультразвуком в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 30 минут соответственно. После высыхания процентная разница между начальным и конечным весом NFRCS использовалась для расчета процента потери материала (HFFC). In vitro BCT дополнительно подтверждала прочность связывания или потерю поверхностных материалов. Эффективность связывания HFFC с Ct обеспечивает свертывание крови и эластичное покрытие на поверхности Ct22.
Однородность разработанного NFRCS определялась BCT образцов (30 мг), взятых из случайно выбранных общих мест NFRCS. Следуйте ранее упомянутой процедуре BCT для определения соответствия NFRCS. Близость между всеми пятью образцами обеспечивает равномерное покрытие поверхности и осаждение HFFC в сетке Ct.
Номинальная площадь контакта крови (NBCA) определялась, как сообщалось ранее, с некоторыми изменениями. Коагулируйте кровь, зажимая 20 мкл крови между двумя поверхностями Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. Через 1 час две части стента разделялись и вручную измерялась площадь сгустка. Среднее значение трех повторений считалось NBCA NFRCS19.
Анализ динамической сорбции паров (DVS) использовался для оценки эффективности NFRCS для поглощения воды из внешней среды или из места повреждения, ответственного за инициирование коагуляции. DVS оценивает или регистрирует поглощение и потерю паров в образце гравиметрическим методом с использованием сверхчувствительных весов с разрешением по массе ±0,1 мкг. Парциальное давление паров (относительная влажность) создается электронным контроллером массового расхода вокруг образца путем смешивания насыщенных и сухих газов-носителей. В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи, на основе процента поглощения влаги образцами, образцы были разделены на 4 категории (0–0,012% по весу — негигроскопичные, 0,2–2% по весу — слегка гигроскопичные, 2–15% — умеренно гигроскопичные и > 15% — очень гигроскопичные)23. В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи, на основе процента поглощения влаги образцами образцы были разделены на 4 категории (0–0,012% по весу — негигроскопичные, 0,2–2% по весу — слегка гигроскопичные, 2–15% — умеренно гигроскопичные и > 15% — очень гигроскопичные)23.В соответствии с рекомендациями Европейской Фармакопеи в зависимости от процента поглощения влаги образцами образцы были разделены на 4 категории (0–0,012% по массе – негигроскопичные, 0,2–2% по массе – слабогигроскопичные, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % умеренно гигроскопичны и > 15% очень гигроскопичны)23.0-0,012% мас./мас.非吸湿性、0,2-2% по массе 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% Масс.- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 мас.% 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 % масс.В соответствии с рекомендациями Европейской Фармакопеи образцы подразделяются на 4 класса в зависимости от процента поглощенной образцом влаги (0-0,012% по массе – негигроскопичные, 0,2-2% по массе слабогигроскопичные, 2-15% по массе).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % умеренно гигроскопичен, > 15% очень гигроскопичен) 23.Гигроскопическая эффективность NFCS X NFCS и TsN NFCS была определена на анализаторе DVS TA TGA Q5000 SA. В ходе этого процесса были получены время выполнения, относительная влажность (RH) и реальный вес образца при 25°C24. Содержание влаги рассчитывается путем точного анализа массы NFRCS с использованием следующего уравнения:
MC — влажность NFRCS. m1 — сухая масса НПВП. m2 — масса NFRCS в реальном времени при заданной относительной влажности.
Общая площадь поверхности была оценена с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °C в течение 10 часов (<7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности была оценена с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °C в течение 10 часов (<7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности измерялась с помощью эксперимента по адсорбции жидкого азота после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности была оценена с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25°C в течение 10 часов (<7 × 10–3 Торр).Температура 25°C и температура 10°C (< 7 × 10-3 Торр).Температура 25°C Общая площадь поверхности измерялась с помощью экспериментов по адсорбции жидкого азота после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Общая площадь поверхности была оценена с помощью экспериментов по адсорбции азота с жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (<7 x 10-3 торр).Общая площадь поверхности, объем пор и размер пор NFRCS определялись с помощью Quantachrome от NOVA 1000e, Австрия, с использованием программного обеспечения RS 232.
Подготовьте 5% эритроцитов (физиологический раствор в качестве разбавителя) из цельной крови. Затем перенесите аликвоту HFFC (0,25 мл) в 96-луночный планшет и 5% массы эритроцитов (0,1 мл). Инкубируйте смесь при 37°C в течение 40 минут. Смесь эритроцитов и сыворотки рассматривалась как положительный контроль, а смесь физиологического раствора и эритроцитов как отрицательный контроль. Гемагглютинацию определяли по шкале Стажицкого. Предлагаемые шкалы следующие: + + + + плотные зернистые агрегаты; + + + гладкие нижние подушечки с изогнутыми краями; + + гладкие нижние подушечки с рваными краями; + узкие красные кольца по краям гладких подушечек; – (отрицательно) дискретная красная кнопка 12 в центре нижней лунки.
Гемосовместимость NFRCS изучалась по методу Международной организации по стандартизации (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Гравиметрический метод, описанный Сингхом и др. Незначительные изменения были сделаны для оценки образования тромбов в присутствии или на поверхности NFRCS. 500 мг Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS инкубировали в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 24 часов при 37 °C. Через 24 часа PBS удаляли, а NFRCS обрабатывали 2 мл крови, содержащей 3,8% цитрата натрия. На поверхность NFRCS добавляли 0,04 мл 0,1 М CaCl2 к инкубированным образцам. Через 45 минут добавляли 5 мл дистиллированной воды для остановки коагуляции. Свернувшуюся кровь на поверхности НФРК обрабатывали 36-38% раствором формальдегида. Зафиксированные формальдегидом сгустки высушивали и взвешивали. Процент тромбообразования оценивали, рассчитывая вес стакана без крови и образца (отрицательный контроль) и стакана с кровью (положительный контроль).
В качестве первоначального подтверждения образцы были визуализированы под оптическим микроскопом, чтобы понять способность поверхностного покрытия HFFC, Ct взаимосвязанных и сети Ct образовывать поры. Тонкие срезы Ch и Cp из NFRCS были обрезаны лезвием скальпеля. Полученный срез был помещен на предметное стекло, накрыт покровным стеклом, а края зафиксированы клеем. Подготовленные слайды были просмотрены под оптическим микроскопом, и были сделаны фотографии при разных увеличениях.
Отложение полимера в сетях Ct визуализировалось с помощью флуоресцентной микроскопии на основе метода, описанного Райсом и др.29. Состав HFFC, используемый для рецептуры, смешивался с флуоресцентным красителем (амарантом), а NFRCS (Ch и Cp) готовились в соответствии с ранее упомянутым методом. Состав HFFC, используемый для рецептуры, смешивался с флуоресцентным красителем (амарантом), а NFRCS (Ch и Cp) готовились в соответствии с ранее упомянутым методом.Состав HFFC, используемый для приготовления рецептуры, смешивался с флуоресцентным красителем (амарантом), а NFRCS (Ch и Cp) получался по ранее упомянутому методу.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & КП）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & КП）。Состав HFFC, используемый в рецептуре, смешивали с флуоресцентным красителем (Амарант) и получали NFRCS (Ch и Cp), как упоминалось ранее.Из полученных образцов вырезали тонкие срезы NFRK, помещали на предметные стекла и покрывали покровными стеклами. Рассматривали подготовленные слайды под флуоресцентным микроскопом с использованием зеленого фильтра (310-380 нм). Изображения делали при 4-кратном увеличении, чтобы понять соотношения Ct и избыточное отложение полимера в сети Ct.
Топография поверхности NFRCS Ch и Cp была определена с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) с ультраострым кантилевером TESP в режиме постукивания: 42 Н/м, 320 кГц, ROC 2-5 нм, Bruker, Тайвань. Шероховатость поверхности была определена методом среднеквадратичного отклонения (RMS) с использованием программного обеспечения (Scanning Probe Image Processor). Различные местоположения NFRCS были визуализированы на 3D-изображениях для проверки однородности поверхности. Стандартное отклонение оценки для данной области определяется как шероховатость поверхности. Уравнение RMS было использовано для количественной оценки шероховатости поверхности NFRCS31.
Исследования на основе FESEM проводились с использованием FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, для понимания морфологии поверхности Ch NFRCS и Cp NFRCS, которые показали лучшую BCT, чем Cm NFRCS. Исследование FESEM проводилось в соответствии с методом, описанным Zhao et al. 32 с небольшими модификациями. NFRCS 20–30 мг Ch NFRCS и Cp NFRCS предварительно смешивали с 20 мкл 3,8% цитрата натрия, предварительно смешанного с кровью крысы. 20 мкл 0,2 М CaCl2 добавляли к образцам, обработанным кровью, для инициирования коагуляции, и образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Кроме того, избыток эритроцитов удаляли с поверхности NFRCS путем промывания физиологическим раствором.
Последующие образцы обрабатывались 0,1% глутаральдегидом, а затем высушивались в печи с горячим воздухом при температуре 37 °C для удаления влаги. Высушенные образцы покрывались и анализировались32. Другие изображения, полученные во время анализа, включали образование сгустков на поверхности отдельных хлопковых волокон, отложение полимера между Ct, морфологию (форму) эритроцитов, целостность сгустка и морфологию эритроцитов в присутствии NFRCS. Необработанные области NFRCS и области NFRCS, обработанные Ch и Cp, инкубированные с кровью, сканировались на наличие элементарных ионов (натрия, калия, азота, кальция, магния, цинка, меди и селена)33. Сравните процентное содержание элементарных ионов между обработанными и необработанными образцами, чтобы понять накопление элементарных ионов во время образования сгустка и однородность сгустка.
Толщина поверхностного покрытия Cp HFFC на поверхности Ct определялась с помощью FESEM. Поперечные сечения Cp NFRCS были вырезаны из каркаса и покрыты распылением. Полученные образцы покрытия распылением наблюдались с помощью FESEM, и толщина поверхностного покрытия была измерена 34 , 35 , 36 .
Рентгеновская микро-КТ обеспечивает получение трехмерных неразрушающих изображений высокого разрешения и позволяет изучать внутреннюю структурную организацию NFRK. Микро-КТ использует рентгеновский пучок, проходящий через образец, для регистрации локального линейного коэффициента ослабления рентгеновских лучей в образце, что помогает получить морфологическую информацию. Внутреннее расположение Ct в Cp NFRCS и обработанном кровью Cp NFRCS было исследовано с помощью микро-КТ для понимания эффективности поглощения и свертывания крови в присутствии NFRCS37,38,39. Трехмерные структуры обработанных кровью и необработанных образцов Cp NFRCS были реконструированы с помощью микро-КТ (V|tome|x S240, Phoenix, Германия). С помощью программного обеспечения VG STUDIO-MAX версии 2.2 было сделано несколько рентгеновских снимков под разными углами (в идеале с охватом 360°) для разработки трехмерных изображений для NFRCS. Собранные проекционные данные были реконструированы в трехмерные объемные изображения с использованием соответствующего простого программного обеспечения 3D ScanIP Academic.
Кроме того, для понимания распределения сгустка в NFRCS добавляли 20 мкл предварительно смешанной цитратной крови и 20 мкл 0,2 М CaCl2 для инициирования свертывания крови. Подготовленные образцы оставляли затвердевать. Поверхность NFRK обрабатывали 0,5% глутаральдегидом и высушивали в печи с горячим воздухом при температуре 30–40 °C в течение 30 мин. Образовавшийся на NFRCS сгусток крови сканировали, реконструировали и визуализировали трехмерное изображение сгустка крови.
Антибактериальные анализы проводились на Cp NFRCS (лучший по сравнению с Ch NFRCS) с использованием ранее описанного метода с небольшими модификациями. Антибактериальная активность Cp NFRCS и Cp HFFC определялась с использованием трех различных тестовых микроорганизмов [S.aureus (грамположительные бактерии), E.coli (грамотрицательные бактерии) и белая Candida (C.albicans)], растущих на агаре в чашках Петри в инкубаторе. Равномерно инокулируйте 50 мл разведенной суспензии бактериальной культуры в концентрации 105-106 КОЕ мл-1 на агаровую среду. Вылейте среду в чашку Петри и дайте ей застыть. На поверхности агаровой пластины были сделаны лунки для заполнения HFFC (3 лунки для HFFC и 1 для отрицательного контроля). Добавьте 200 мкл HFFC в 3 лунки и 200 мкл pH 7,4 PBS в 4-ю лунку. С другой стороны чашки Петри поместите диск Cp NFRCS диаметром 12 мм на застывший агар и смочите его PBS (pH 7,4). Таблетки ципрофлоксацина, ампициллина и флуконазола считаются эталонными стандартами для Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. Измерьте зону ингибирования вручную и сделайте цифровое изображение зоны ингибирования.
После институционального этического одобрения исследование было проведено в Медицинском колледже образования и исследований Кастурба в Манипале, Карнатака, на юге Индии. Экспериментальный протокол in vitro TEG был рассмотрен и одобрен Комитетом по институциональной этике Медицинского колледжа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Испытуемые были набраны из числа добровольных доноров крови (в возрасте от 18 до 55 лет) из больничного банка крови. Кроме того, от добровольцев была получена форма информированного согласия на сбор образцов крови. Нативный TEG (N-TEG) ​​использовался для изучения влияния формулы Cp HFFC на цельную кровь, предварительно смешанную с цитратом натрия. N-TEG широко известен своей ролью в реанимации по месту оказания помощи, что создает проблемы для врачей из-за потенциальной клинически значимой задержки результатов (рутинные тесты на коагуляцию). Анализ N-TEG проводился с использованием цельной крови. У всех участников было получено осознанное согласие и подробная история болезни. В исследование не включались участники с гемостатическими или тромботическими осложнениями, такими как беременность/послеродовой период или заболевания печени. Из исследования также были исключены субъекты, принимающие препараты, влияющие на каскад коагуляции. Базовые лабораторные анализы (гемоглобин, протромбиновое время, активированный тромбопластин и количество тромбоцитов) проводились у всех участников в соответствии со стандартными процедурами. N-TEG определяет вязкоупругость сгустка крови, начальную структуру сгустка, взаимодействие частиц, укрепление сгустка и лизис сгустка. Анализ N-TEG предоставляет графические и числовые данные о коллективных эффектах нескольких клеточных элементов и плазмы. Анализ N-TEG проводился на двух разных объемах Cp HFFC (10 мкл и 50 мкл). В результате 1 мл цельной крови с лимонной кислотой добавляли к 10 мкл Cp HFFC. Добавьте 1 мл (Cp HFFC + цитратная кровь), 340 мкл смешанной крови к 20 мкл 0,2 M CaCl2, содержащей чашку TEG. После этого чашки TEG загружали в TEG® 5000, US для измерения R, K, угла альфа, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% образцов крови в присутствии Cp HFFC41.
Протокол исследования in vivo был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по этике животных (IAEC), Медицинской школой Кастурбы, Институтом высшего образования Манипала, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных (CPCSEA). Все исследования NFRCS in vivo (2 × 2 см2) проводились на самках крыс Wistar (весом от 200 до 250 г). Все животные были акклиматизированы при температуре 24-26 °C, животные имели свободный доступ к стандартной пище и воде ad libitum. Все животные были случайным образом разделены на разные группы, каждая группа состояла из трех животных. Все исследования проводились в соответствии с Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 . Перед исследованием животных анестезировали путем внутрибрюшинного (в/б) введения смеси 20-50 мг кетамина (на 1 кг массы тела) и 2-10 мг ксилазина (на 1 кг массы тела). После исследования объем кровотечения рассчитывали путем оценки разницы между исходным и конечным весом образцов, среднее значение, полученное из трех тестов, принимали за объем кровотечения образца.
Модель ампутации хвоста крысы была реализована для понимания потенциала NFRCS для модуляции кровотечения при травме, бою или дорожно-транспортном происшествии (модель травмы). Отрежьте 50% хвоста лезвием скальпеля и поместите на воздух на 15 с, чтобы обеспечить нормальное кровотечение. Кроме того, тестовые образцы были помещены на хвост крысы путем приложения давления (Ct, Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS). Кровотечение и PCT были зарегистрированы для тестовых образцов (n = 3)17,45.
Эффективность контроля давления NFRCS в бою была исследована на модели поверхностной бедренной артерии. Бедренная артерия обнажается, пунктируется троакаром 24G и кровоточит в течение 15 секунд. После того, как наблюдается неконтролируемое кровотечение, тестовый образец помещается на место прокола с приложением давления. Сразу после нанесения тестового образца регистрировалось время свертывания и в течение следующих 5 минут наблюдалась гемостатическая эффективность. Та же процедура была повторена с Cs и Ct46.
Доулинг и др. 47 предложили модель повреждения печени для оценки гемостатического потенциала гемостатических материалов в контексте интраоперационного кровотечения. BCT регистрировали для образцов Ct (отрицательный контроль), каркаса Cs (положительный контроль), образцов Ch NFRCS и образцов Cp NFRCS. Надпеченочная полая вена крысы была обнажена путем выполнения срединной лапаротомии. После этого дистальная часть левой доли была вырезана ножницами. Сделайте надрез в печени лезвием скальпеля и дайте ей кровоточить в течение нескольких секунд. Точно взвешенные тестовые образцы Ch NFRCS и Cp NFRCS были помещены на поврежденную поверхность без какого-либо положительного давления, и BCT регистрировалась. Затем контрольная группа (Ct) приложила давление, а затем Cs 30 s47, не нарушая повреждения.
Анализы заживления ран in vivo проводились с использованием модели эксцизионной раны для оценки свойств заживления ран разработанных полимерных NFRCS. Модели эксцизионных ран были выбраны и выполнены в соответствии с ранее опубликованными методами с небольшими модификациями19,32,48. Все животные были анестезированы, как описано ранее. Используйте биопсийный пробойник (12 мм), чтобы сделать круговой глубокий надрез на коже спины. Подготовленные раневые участки были перевязаны Cs (положительный контроль), Ct (признавая, что ватные диски мешают заживлению), Ch NFRCS и Cp NFRCS (экспериментальная группа) и отрицательным контролем без какого-либо лечения. В каждый день исследования площадь раны измерялась у всех крыс. Используйте цифровую камеру, чтобы сфотографировать область раны и наложить новую повязку. Процент закрытия раны измерялся по следующей формуле:
На основании процента закрытия ран на 12-й день исследования кожа крыс лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) была иссечена и исследована с помощью окраски гематоксилином и эозином и трихрома по Массону. На основании процента закрытия ран на 12-й день исследования кожа крыс лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) была иссечена и исследована с помощью окраски гематоксилином и эозином и трихрома по Массону.На основании процента закрытия ран на 12-й день исследования у крыс лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) иссекали кожу и исследовали путем окрашивания гематоксилин-эозином и трихромом по Массону.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS), компания H&E, компания Masson, компания Masson, компания NFRCS.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Крысы в ​​лучшей группе ((Cp NFRCS) и контрольных группах) были иссечены для окраски гематоксилином-эозином и трихромом по Массону на основе процента закрытия ран на 12-й день исследования.Реализованная процедура окрашивания проводилась в соответствии с ранее описанными методами49,50. Вкратце, после фиксации в 10% формалине образцы дегидратировались с использованием серии градуированных спиртов. Используйте микротом для получения тонких срезов (толщиной 5 мкм) иссеченной ткани. Тонкие серийные срезы контролей и Cp NFRCS обрабатывались гематоксилином и эозином для изучения гистопатологических изменений. Трихромное окрашивание по Массону использовалось для обнаружения образования коллагеновых фибрилл. Полученные результаты были изучены патологоанатомами вслепую.
Стабильность образцов Cp NFRCS изучалась при комнатной температуре (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) в течение 12 месяцев51. Cp NFRCS (изменение цвета поверхности и рост микроорганизмов) визуально проверялись и тестировались на износостойкость при сгибании и BCT в соответствии с методами, описанными выше в разделе «Материалы и методы».
Масштабируемость и воспроизводимость Cp NFRCS были исследованы путем подготовки Cp NFRCS размером 15×15 см2. Кроме того, образцы по 30 мг (n = 5) были вырезаны из различных фракций Cp NFRCS, и BCT исследуемых образцов была оценена, как описано ранее в разделе «Методы».
Мы попытались разработать различные формы и структуры с использованием композиций Cp NFRCS для различных биомедицинских применений. Такие формы или конфигурации включают конические тампоны для носовых кровотечений, стоматологических процедур и цилиндрические тампоны для вагинальных кровотечений.
Все наборы данных выражены как среднее значение ± стандартное отклонение и проанализированы с помощью ANOVA с использованием Prism 5.03 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США) с последующим применением теста множественных сравнений Бонферрони (*p<0,05).
Все процедуры, выполненные в исследованиях на людях, соответствовали стандартам Института и Национального исследовательского совета, а также Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим поправкам или аналогичным этическим стандартам. Все участники были проинформированы об особенностях исследования и его добровольном характере. Данные участников остаются конфиденциальными после сбора. Экспериментальный протокол TEG in vitro был рассмотрен и одобрен Институциональным этическим комитетом Медицинского колледжа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Добровольцы подписали информированное согласие на сбор образцов крови.
Все процедуры, выполненные в исследованиях на животных, были выполнены в соответствии с Медицинским факультетом Кастуба, Институтом высшего образования Манипала, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Все разработанные эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных (CPCSEA). Все авторы следуют руководящим принципам ARRIVE.
Спектры FTIR всех NFRCS были проанализированы и сравнены со спектром хитозана, показанным на рисунке 2A. Характерные спектральные пики хитозана (записанные) при 3437 см-1 (растяжение OH и NH, перекрытие), 2945 и 2897 см-1 (растяжение CH), 1660 см-1 (растяжение NH2), 1589 см-1 (изгиб N–H), 1157 см-1 (растяжение мостика O-), 1067 см-1 (растяжение C–O, вторичный гидроксил), 993 см-1 (растяжение CO, Bo-OH) 52,53,54. Дополнительная таблица S1 показывает значения спектра поглощения FTIR NFRCS для хитозана (репортер), чистого хитозана, Cm, Ch и Cp. Спектры FTIR всех NFRCS (Cm, Ch и Cp) показали те же характерные полосы поглощения, что и чистый хитозан, без каких-либо существенных изменений (рис. 2A). Результаты FTIR подтвердили отсутствие химических или физических взаимодействий между полимерами, использованными для разработки NFRCS, что указывает на то, что используемые полимеры инертны.
Характеристика Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs in vitro. (A) представляет собой объединенные спектры FTIR композиций хитозана и Cm NFRCS, Ch NFRCS и Cp NFRCS под давлением. (B) a) Скорость поглощения цельной кровью NFRCS Cm, Ch, Cp и Cg (n = 3); Образцы Ct показали более высокий BAR, поскольку ватный тампон имеет более высокую эффективность поглощения; b) Кровь после поглощения крови Иллюстрация поглощенного образца. Графическое представление BCT тестового образца C (Cp NFRCS имел наилучший BCT (15 с, n = 3)). Данные в C, D, E и G представлены как среднее значение ± SD, а планки погрешностей представляют собой SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее значение ± SD, а планки погрешностей представляют собой SD, ***p < 0,0001. Данные C, D, E и G представляют собой среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p<0,0001. C, D, E и G 中的数据显示为平均值± SD, 代表SD,***p < 0,0001. C, D, E и G 中的数据显示为平均值± SD, 代表SD,***p < 0,0001. Данные C, D, E и G показывают, как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p<0,0001.