Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Фертильность птиц зависит от их способности хранить достаточное количество жизнеспособной спермы в течение длительного периода времени в канальцах для хранения спермы (SST).Точный механизм, с помощью которого сперматозоиды входят, находятся и покидают SST, остается спорным.Сперма кур шаркаси проявляла высокую склонность к агглютинации, образуя подвижные нитевидные пучки, содержащие много клеток.Из-за сложности наблюдения за подвижностью и поведением сперматозоидов в непрозрачной фаллопиевой трубе мы использовали микрожидкостное устройство с поперечным сечением микроканала, подобным сечению сперматозоидов, для изучения агглютинации и подвижности сперматозоидов.В этом исследовании обсуждается, как формируются пучки сперматозоидов, как они двигаются и их возможная роль в продлении пребывания сперматозоидов в SST.Мы исследовали скорость сперматозоидов и реологическое поведение, когда поток жидкости генерировался в микрожидкостном канале гидростатическим давлением (скорость потока = 33 мкм/с).Сперматозоиды имеют тенденцию плыть против течения (положительная реология), а скорость пучка сперматозоидов значительно снижена по сравнению с одиночными сперматозоидами.Было замечено, что пучки сперматозоидов движутся по спирали и увеличиваются в длину и толщину по мере набора большего количества одиночных сперматозоидов. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Было потеряно, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать смешения со скоростью потока жидкости> 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются к боковым стенкам микрофлюидных каналов и прилипают к ним, чтобы их не смыло при скорости потока жидкости> 33 мкм / с.33 мкм/с 扫过。33 мкм/с. Было потеряно, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать смешения потока жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются к боковым стенкам микрофлюидного канала и прилипают к ним, чтобы их не смыло потоком жидкости со скоростью> 33 мкм / с.Сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия выявили, что пучки сперматозоидов поддерживаются обильным плотным материалом.Полученные данные демонстрируют уникальную подвижность сперматозоидов цыплят Шаркази, а также способность сперматозоидов к агглютинации и образованию подвижных пучков, что способствует лучшему пониманию длительного хранения сперматозоидов при СМТ.
Для достижения оплодотворения у людей и большинства животных сперматозоиды и яйцеклетки должны прибыть к месту оплодотворения в нужное время.Следовательно, спаривание должно происходить до или во время овуляции.С другой стороны, некоторые млекопитающие, такие как собаки, а также немлекопитающие виды, такие как насекомые, рыбы, рептилии и птицы, сохраняют сперму в своих репродуктивных органах в течение длительного периода времени, пока их яйцеклетки не будут готовы к оплодотворению (асинхронное оплодотворение 1 ).Птицы способны сохранять жизнеспособность сперматозоидов, способных оплодотворять яйцеклетки, в течение 2-10 недель2.
Это уникальная особенность, отличающая птиц от других животных, так как обеспечивает высокую вероятность оплодотворения после однократного осеменения в течение нескольких недель без одновременного спаривания и овуляции.Основной орган хранения спермы, называемый канальцем хранения спермы (SST), расположен во внутренних складках слизистой оболочки в области маточно-влагалищного перехода.На сегодняшний день механизмы, с помощью которых сперматозоиды входят, находятся и выходят из банка спермы, до конца не изучены.На основании предыдущих исследований было выдвинуто множество гипотез, но ни одна из них не была подтверждена.
Forman4 предположил, что сперматозоиды поддерживают свое пребывание в полости SST за счет непрерывного колебательного движения против направления потока жидкости через белковые каналы, расположенные на эпителиальных клетках SST (реология).АТФ истощается из-за постоянной жгутиковой активности, необходимой для удержания сперматозоидов в просвете SST, и подвижность в конечном итоге снижается до тех пор, пока сперматозоиды не выносятся из банка спермы потоком жидкости и не начинают новое путешествие по восходящей фаллопиевой трубе для оплодотворения спермы.Яйцо (Форман4).Эта модель хранения спермы подтверждается обнаружением с помощью иммуноцитохимии аквапоринов 2, 3 и 9, присутствующих в эпителиальных клетках SST.На сегодняшний день исследования реологии куриной спермы и ее роли в хранении SST, вагинальной селекции сперматозоидов и конкуренции сперматозоидов отсутствуют.У кур сперматозоиды попадают во влагалище после естественного спаривания, но более 80% сперматозоидов выбрасываются из влагалища вскоре после спаривания.Это говорит о том, что влагалище является основным местом отбора сперматозоидов у птиц.Кроме того, сообщалось, что менее 1% сперматозоидов, оплодотворенных во влагалище, попадают в SST2.При искусственном осеменении цыплят во влагалище количество сперматозоидов, достигающих SST, имеет тенденцию к увеличению через 24 часа после осеменения.До сих пор механизм отбора сперматозоидов во время этого процесса неясен, и подвижность сперматозоидов может играть важную роль в поглощении сперматозоидов SST.Из-за толстых и непрозрачных стенок фаллопиевых труб трудно напрямую контролировать подвижность сперматозоидов в фаллопиевых трубах птиц.Поэтому нам не хватает базовых знаний о том, как сперматозоиды переходят в SST после оплодотворения.
Реология недавно была признана важным фактором, контролирующим транспорт сперматозоидов в гениталиях млекопитающих.Основываясь на способности подвижных сперматозоидов мигрировать противотоком, Zaferani et al8 использовали микрофлюидную систему Corra для пассивного выделения подвижных сперматозоидов из образцов спермы, помещенных в бокс.Этот тип сортировки спермы необходим для медицинского лечения бесплодия и клинических исследований, и он предпочтительнее традиционных методов, которые требуют много времени и труда и могут нарушить морфологию и структурную целостность сперматозоидов.Однако до настоящего времени не проводились исследования влияния выделений из половых органов кур на подвижность сперматозоидов.
Независимо от механизма, который поддерживает сперму, хранящуюся в SST, многие исследователи наблюдали, что резидентные сперматозоиды агглютинируют лицом к лицу в SST кур 9, 10, перепелов 2 и индеек 11 с образованием агглютинированных пучков сперматозоидов.Авторы предполагают, что существует связь между этой агглютинацией и длительным хранением сперматозоидов в СПВ.
Tingari и Lake12 сообщили о сильной связи между сперматозоидами в принимающей сперму железе курицы и задались вопросом, агглютинируют ли птичьи сперматозоиды так же, как сперматозоиды млекопитающих.Они считают, что глубокие связи между сперматозоидами в семявыносящих протоках могут быть связаны со стрессом, вызванным присутствием большого количества сперматозоидов в небольшом пространстве.
При оценке поведения сперматозоидов на свежеповешенных предметных стеклах можно увидеть преходящие признаки агглютинации, особенно по краям капелек спермы.Однако агглютинация часто нарушалась вращательным действием, связанным с непрерывным движением, что объясняет преходящий характер этого явления.Исследователи также заметили, что при добавлении разбавителя в сперму появлялись удлиненные «нитевидные» агрегаты клеток.
Ранние попытки имитировать сперматозоид были предприняты путем удаления тонкой проволоки из висящей капли, в результате чего из капли спермы выступал удлиненный спермоподобный пузырек.Сперматозоиды сразу же выстроились параллельным образом внутри пузырька, но вся единица быстро исчезла из-за ограничения 3D.Поэтому для изучения агглютинации сперматозоидов необходимо наблюдать за подвижностью и поведением сперматозоидов непосредственно в изолированных канальцах хранения спермы, чего добиться трудно.Таким образом, необходимо разработать инструмент, который имитирует сперматозоиды для поддержки исследований подвижности сперматозоидов и поведения агглютинации.Brillard et al13 сообщили, что средняя длина канальцев для хранения спермы у взрослых цыплят составляет 400–600 мкм, но некоторые SST могут достигать 2000 мкм.Меро и Огасавара [14] разделили семенные железы на увеличенные и неувеличенные канальцы для хранения спермы, оба из которых были одинаковыми по длине (~ 500 мкм) и ширине шейки (~ 38 мкм), но средний диаметр просвета канальцев составлял 56,6 и 56,6 мкм.., соответственно 11,2 мкм соответственно.В текущем исследовании мы использовали микрожидкостное устройство с размером канала 200 мкм × 20 мкм (Ш × В), поперечное сечение которого несколько близко к сечению амплифицированного SST.Кроме того, мы исследовали подвижность сперматозоидов и поведение агглютинации в текущей жидкости, что согласуется с гипотезой Формана о том, что жидкость, продуцируемая эпителиальными клетками SST, удерживает сперматозоиды в просвете в противоточном (реологическом) направлении.
Целью данного исследования было преодолеть проблемы наблюдения за подвижностью сперматозоидов в маточной трубе и избежать трудностей изучения реологии и поведения сперматозоидов в динамической среде.Использовали микрожидкостное устройство, создающее гидростатическое давление для имитации подвижности сперматозоидов в половых органах курицы.
Когда каплю разбавленного образца спермы (1:40) загружали в микроканальное устройство, можно было идентифицировать два типа подвижности сперматозоидов (изолированные сперматозоиды и связанные сперматозоиды).Кроме того, сперматозоиды имели тенденцию плыть против течения (положительная реология; видео 1, 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Несмотря на то, что пучки сперматозоидов занимают более высокую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивают процент сперматозоидов, получающих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем одиночные сперматозоиды (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (р < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (р < 0,001; табл. 2).Положительная реология для одиночных сперматозоидов и пучков оценивается примерно в 53% и 85% соответственно.
Замечено, что сперматозоиды кур шаркази сразу после эякуляции образуют линейные пучки, состоящие из десятков особей.Эти пучки со временем увеличиваются в длину и толщину и могут оставаться in vitro в течение нескольких часов, прежде чем исчезнут (видео 3).Эти нитевидные пучки по форме напоминают сперматозоиды ехидны, которые образуются на конце придатка яичка.Было обнаружено, что сперма кур шаркаши имеет высокую тенденцию к агглютинации и формированию сетчатого пучка менее чем через одну минуту после сбора.Эти лучи являются динамическими и могут прилипать к любым близлежащим стенам или статическим объектам.Хотя пучки сперматозоидов снижают скорость сперматозоидов, ясно, что макроскопически они увеличивают их линейность.Длина пучков варьируется в зависимости от количества сперматозоидов, собранных в пучки.Выделяли две части пучка: начальную часть, включающую свободную головку агглютинированного спермия, и терминальную часть, включающую хвост и весь дистальный конец спермия.С помощью высокоскоростной камеры (950 к/с) наблюдали свободные головки агглютинированных сперматозоидов в начальной части пучка, ответственные за движение пучка за счет их колебательного движения, втягивая оставшиеся в пучок винтовым движением (Видео 4).Однако было замечено, что в длинных пучках некоторые свободные головки сперматозоидов, прилипшие к телу и концевой части пучка, действуют как лопасти, помогая продвигать пучок.
Находясь в медленном течении жидкости, пучки сперматозоидов движутся параллельно друг другу, однако начинают перекрываться и прилипать ко всему, что неподвижно, чтобы не быть смыты текущим потоком по мере увеличения скорости потока.Пучки формируются, когда горстка сперматозоидов сближается, они начинают синхронно двигаться и обвивать друг друга, а затем прилипают к липкому веществу.На рисунках 1 и 2 показано, как сперматозоиды приближаются друг к другу, образуя соединение, когда хвосты обвиваются друг вокруг друга.
Исследователи применили гидростатическое давление для создания потока жидкости в микроканале для изучения реологии сперматозоидов.Использовался микроканал размером 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) и длиной 3,6 мкм.Используйте микроканалы между контейнерами со шприцами, установленными на концах.Чтобы сделать каналы более заметными, использовали пищевой краситель.
Прикрепите соединительные кабели и аксессуары к стене.Видео снято с помощью фазово-контрастного микроскопа.С каждым изображением представлены фазово-контрастная микроскопия и картографические изображения.(A) Соединение между двумя потоками сопротивляется потоку из-за спирального движения (красная стрелка).(B) Соединение между трубным пучком и стенкой канала (красные стрелки), в то же время они соединены с двумя другими пучками (желтые стрелки).(C) Пучки сперматозоидов в микрожидкостном канале начинают соединяться друг с другом (красные стрелки), образуя сетку из пучков сперматозоидов.(D) Формирование сети пучков сперматозоидов.
Когда капля разбавленной спермы загружалась в микрожидкостное устройство и создавался поток, наблюдалось движение пучка спермы против направления потока.Пучки плотно прилегают к стенкам микроканалов, а свободные головки в начальной части пучков плотно прилегают к ним (видео 5).Они также прилипают к любым стационарным частицам на своем пути, например к мусору, чтобы их не унесло течением.Со временем эти пучки превращаются в длинные нити, захватывающие другие отдельные сперматозоиды, и в более короткие пучки (видео 6).Когда поток начинает замедляться, длинные линии сперматозоидов начинают формировать сеть линий спермы (видео 7; рисунок 2).
При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения ни усиливаются, поскольку они перехватывают большое количество сперматозоидов, образующих пучки, лучше противостоят дрейфующей силе потока. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока.在高流速(V > 33 мкм/с)地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 мкм/с) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей Максимальное количество сперматозоидов, образующих пучки, лучше сопротивляться силе дрейфа потока. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиралевидное движение филаментов увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока.На боковины также пытались приделать микроканалы.
Пучки сперматозоидов идентифицировали как скопления головок сперматозоидов и закручивающихся хвостов с помощью световой микроскопии (LM).Пучки сперматозоидов с различными агрегатами также были идентифицированы как скрученные головки и агрегаты жгутиков, множественные сросшиеся хвосты сперматозоидов, головки сперматозоидов, прикрепленные к хвостику, и головки сперматозоидов с изогнутыми ядрами как множественные сросшиеся ядра.просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ).Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) показала, что пучки сперматозоидов представляли собой покрытые оболочкой агрегаты головок сперматозоидов, а агрегаты сперматозоидов демонстрировали прикрепленную сеть обернутых хвостов.
Морфологию и ультраструктуру сперматозоидов, формирование пучков сперматозоидов изучали с помощью световой микроскопии (половина среза), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), мазки спермы окрашивали акридиновым оранжевым и исследовали с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.
Окрашивание мазков спермы акридиновым оранжевым (рис. 3Б) показало, что головки сперматозоидов слиплись и покрыты секреторным материалом, что привело к образованию крупных пучков (рис. 3Г).Пучки сперматозоидов состояли из агрегатов сперматозоидов с сетью прикрепленных хвостов (рис. 4А-С).Пучки сперматозоидов состоят из слипшихся друг с другом хвостов многих сперматозоидов (рис. 4D).Секреты (рис. 4Д,Е) покрыты пучками головок сперматозоидов.
Формирование пучка сперматозоидов. С помощью фазово-контрастной микроскопии и мазков спермы, окрашенных акридиновым оранжевым, показано, что головки сперматозоидов слипаются.(A) Раннее формирование пучка сперматозоидов начинается со спермия (белый кружок) и трех сперматозоидов (желтый кружок), при этом спираль начинается с хвоста и заканчивается на голове.(B) Микрофотография мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая прилипшие головки сперматозоидов (стрелки).Выделения покрывают голову (головы).Увеличение × 1000. (C) Развитие большого луча, транспортируемого потоком в микрофлюидном канале (с использованием высокоскоростной камеры со скоростью 950 кадров в секунду).(D) Микрофотография мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым, с большими пучками (стрелки).Увеличение: ×200.
Сканирующая электронная микрофотография пучка спермы и мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым.(A, B, D, E) представляют собой цифровые цветные сканирующие электронные микрофотографии сперматозоидов, а C и F представляют собой микрофотографии мазков спермы, окрашенных акридиновым оранжевым, показывающие прикрепление множества сперматозоидов, обертывающих каудальную паутину.(AC) Агрегаты сперматозоидов показаны в виде сети прикрепленных хвостов (стрелки).(D) Слипание нескольких сперматозоидов (с клейким веществом, розовый контур, стрелка), обвивающих хвост.(E и F) Агрегаты головки сперматозоида (указатели), покрытые клейким материалом (указатели).Сперматозоиды сформировали пучки с несколькими вихреобразными структурами (F).(C) ×400 и (F) ×200 увеличения.
Используя просвечивающую электронную микроскопию, мы обнаружили, что пучки сперматозоидов имели прикрепленные хвосты (рис. 6А, С), головки, прикрепленные к хвостам (рис. 6В), или головки, прикрепленные к хвостам (рис. 6Г).Головки сперматозоидов в пучке изогнуты, представляя в разрезе две ядерные области (рис. 6D).В разрезе сперматозоиды имели скрученную головку с двумя ядерными областями и множественными жгутиковыми областями (рис. 5А).
Цифровая цветная электронная микрофотография, показывающая соединительные хвосты в пучке сперматозоидов и агглютинирующий материал, соединяющий головки сперматозоидов.(A) Прикрепленный хвост большого количества сперматозоидов.Обратите внимание, как хвост выглядит как в портретной (стрелка), так и в альбомной (стрелка) проекциях.(B) Головка (стрелка) сперматозоида соединена с хвостом (стрелка).(C) Несколько хвостов сперматозоидов (стрелки) прикреплены.(D) Материал агглютинации (AS, синий) соединяет четыре головки сперматозоидов (фиолетовый).
Сканирующая электронная микроскопия использовалась для обнаружения головок сперматозоидов в пучках сперматозоидов, покрытых выделениями или мембранами (рис. 6В), что указывает на то, что пучки сперматозоидов были закреплены внеклеточным материалом.Агглютинированный материал концентрировался в головке спермия (сборка, похожая на голову медузы; рис. 5B) и расширялся дистально, придавая блестяще-желтый вид при флуоресцентной микроскопии при окрашивании акридиновым оранжевым (рис. 6C).Это вещество хорошо видно под сканирующим микроскопом и считается связующим.Полутонкие срезы (рис. 5C) и мазки спермы, окрашенные акридиновым оранжевым, показали пучки сперматозоидов, содержащие плотно упакованные головки и закрученные хвосты (рис. 5D).
Различные микрофотографии, показывающие агрегацию головок сперматозоидов и загнутых хвостов различными методами.(A) Цифровая цветная просвечивающая электронная микрофотография поперечного сечения пучка сперматозоидов, показывающая спиральную головку сперматозоида с ядром, состоящим из двух частей (синий) и несколькими жгутиковыми частями (зеленый).(B) Цифровая цветная сканирующая электронная микрофотография, показывающая скопление медузоподобных головок сперматозоидов (стрелки), которые кажутся покрытыми.(C) Полутонкий срез, показывающий агрегированные головки сперматозоидов (стрелки) и закрученные хвосты (стрелки).(D) Микрофотография мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая агрегаты головок сперматозоидов (стрелки) и закрученные прилипшие хвосты (стрелки).Обратите внимание, что липкое вещество (S) покрывает головку сперматозоида.(D) × 1000 увеличение.
С помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 7А) также было отмечено, что головки сперматозоидов были закручены, а ядра имели спиралевидную форму, что подтверждалось окрашиванием мазков спермы акридиновым оранжевым и исследованием с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 7Б).
(A) Цифровая цветная просвечивающая электронная микрофотография и (B) Мазок спермы, окрашенный акридиновым оранжевым, показывающий закрученные головки и прикрепление головок и хвостов сперматозоидов (стрелки).(Б) × 1000 увеличение.
Интересным открытием является то, что сперматозоиды Шаркази собираются в подвижные нитевидные пучки.Свойства этих пучков позволяют понять их возможную роль в поглощении и хранении сперматозоидов в ССТ.
После спаривания сперматозоиды попадают во влагалище и подвергаются интенсивному процессу отбора, в результате чего лишь ограниченное количество сперматозоидов попадает в SST15,16.На сегодняшний день механизмы, посредством которых сперматозоиды входят и выходят из SST, неясны.У домашней птицы сперматозоиды хранятся в SST в течение продолжительного периода от 2 до 10 недель, в зависимости от вида6.Споры остаются о состоянии спермы во время хранения в SST.Они в движении или в покое?Другими словами, как сперматозоидам удается так долго сохранять свое положение в SST?
Forman4 предположил, что пребывание и выброс SST можно объяснить с точки зрения подвижности сперматозоидов.Авторы предполагают, что сперматозоиды сохраняют свое положение, плывя против потока жидкости, создаваемого эпителием SST, и что сперматозоиды выбрасываются из SST, когда их скорость падает ниже точки, в которой они начинают двигаться назад из-за недостатка энергии.Zaniboni5 подтвердил наличие аквапоринов 2, 3 и 9 в апикальной части эпителиальных клеток SST, что может косвенно поддерживать модель хранения спермы Foreman.В текущем исследовании мы обнаружили, что почти половина сперматозоидов Шаркаши имеют положительную реологию в протекающей жидкости, и что агглютинированные пучки сперматозоидов увеличивают количество сперматозоидов, демонстрирующих положительную реологию, хотя агглютинация замедляет их.Как сперматозоиды перемещаются вверх по фаллопиевой трубе птицы к месту оплодотворения, до конца не изучено.У млекопитающих фолликулярная жидкость притягивает сперматозоиды.Однако считается, что хемоаттрактанты направляют сперматозоиды на большие расстояния7.Следовательно, за транспорт сперматозоидов отвечают другие механизмы.Сообщается, что способность сперматозоидов ориентироваться и течь против жидкости фаллопиевых труб, выделяемой после спаривания, является основным фактором нацеливания сперматозоидов у мышей.Паркер 17 предположил, что сперматозоиды пересекают яйцеводы, плывя против цилиарного тока у птиц и рептилий.Хотя это не было экспериментально продемонстрировано на птицах, Адольфи18 был первым, кто обнаружил, что птичья сперма дает положительные результаты, когда тонкий слой жидкости между покровным стеклом и предметным стеклом создается с помощью полоски фильтровальной бумаги.Реология.Hino и Yanagimachi [19] поместили мышиный комплекс яичник-труба-матка в перфузионное кольцо и ввели 1 мкл чернил в перешеек, чтобы визуализировать поток жидкости в фаллопиевых трубах.Они заметили очень активное движение сокращения и расслабления в маточной трубе, при котором все чернильные шарики неуклонно двигались к ампуле маточной трубы.Авторы подчеркивают важность потока трубной жидкости из нижних фаллопиевых труб в верхние для подъема сперматозоидов и оплодотворения.Brillard20 сообщил, что у кур и индеек сперматозоиды мигрируют путем активного движения от входа во влагалище, где они накапливаются, к маточно-вагинальному соединению, где они накапливаются.Однако это движение не требуется между маточно-влагалищным соединением и воронкой, потому что сперматозоиды транспортируются путем пассивного смещения.Зная эти предыдущие рекомендации и результаты, полученные в текущем исследовании, можно предположить, что способность сперматозоидов двигаться вверх по течению (реология) является одним из свойств, на которых основан процесс селекции.Это определяет прохождение сперматозоидов через влагалище и их поступление в ЦКТ для хранения.Как предположил Forman4, это также может облегчить процесс проникновения сперматозоидов в SST и его среду обитания в течение определенного периода времени, а затем выхода, когда их скорость начинает замедляться.
С др. стороны, Matsuzaki и Sasanami 21 предположили, что птичьи сперматозоиды претерпевают изменения подвижности от покоящихся до подвижных в мужских и женских половых путях.Ингибирование резидентной подвижности сперматозоидов в SST было предложено для объяснения длительного времени хранения сперматозоидов, а затем омоложения после выхода из SST.В условиях гипоксии Matsuzaki et al.1 сообщили о высокой продукции и высвобождении лактата в SST, что может привести к ингибированию резидентной подвижности сперматозоидов.В данном случае значение реологии спермы выражается в отборе и поглощении сперматозоидов, а не в их хранении.
Паттерн агглютинации сперматозоидов считается правдоподобным объяснением длительного периода хранения сперматозоидов в SST, поскольку это распространенный паттерн задержки сперматозоидов у домашней птицы2,22,23.Бакст и др.2 наблюдали, что большинство сперматозоидов слипались друг с другом, образуя фасцикулярные агрегаты, а одиночные сперматозоиды редко обнаруживались в КМС перепелов.С другой стороны, Вен и соавт.24 наблюдали большее количество рассеянных сперматозоидов и меньшее количество пучков сперматозоидов в просвете SST у цыплят.На основании этих наблюдений можно предположить, что склонность к агглютинации сперматозоидов различается между птицами и между сперматозоидами в одном и том же эякуляте.Кроме того, Van Krey et al.9 предположили, что случайная диссоциация агглютинированных сперматозоидов ответственна за постепенное проникновение сперматозоидов в просвет маточной трубы.Согласно этой гипотезе, сперматозоиды с более низкой способностью к агглютинации должны быть изгнаны из SST в первую очередь.В этом контексте способность сперматозоидов к агглютинации может быть фактором, влияющим на результат конкуренции сперматозоидов у грязных птиц.Кроме того, чем дольше диссоциирует агглютинированный сперматозоид, тем дольше сохраняется фертильность.
Хотя агрегация сперматозоидов и их объединение в пучки наблюдались в нескольких исследованиях2,22,24, они не были подробно описаны из-за сложности их кинематического наблюдения в рамках SST.Было предпринято несколько попыток изучения агглютинации сперматозоидов in vitro.Обширная, но преходящая агрегация наблюдалась, когда тонкая проволока была удалена из оборванной капли семени.Это приводит к тому, что из капли выпячивается продолговатый пузырь, имитирующий семенную железу.Из-за ограничений 3D и короткого времени капельной сушки весь блок быстро пришел в негодность9.В текущем исследовании, используя цыплят Шаркаши и микрожидкостные чипы, мы смогли описать, как формируются эти пучки и как они двигаются.Сгустки сперматозоидов формировались сразу после сбора спермы и, как было обнаружено, двигались по спирали, демонстрируя положительную реологию при наличии в потоке.Кроме того, при макроскопическом рассмотрении было замечено, что пучки сперматозоидов увеличивают линейность подвижности по сравнению с изолированными сперматозоидами.Это говорит о том, что агглютинация сперматозоидов может происходить до проникновения SST и что продукция сперматозоидов не ограничивается небольшой областью из-за стресса, как предполагалось ранее (Tingari and Lake12).При образовании пучка сперматозоиды плавают синхронно до тех пор, пока не образуют соединение, затем их хвосты обвивают друг друга, а головка сперматозоида остается свободной, но хвост и дистальная часть сперматозоида слипаются липким веществом.Следовательно, за движение отвечает свободная головка связки, волоча за собой остальную часть связки.Сканирующая электронная микроскопия пучков сперматозоидов показала прикрепленные головки сперматозоидов, покрытые большим количеством липкого материала, что позволяет предположить, что головки сперматозоидов были прикреплены в покоящихся пучках, что могло произойти после достижения места хранения (SST).
Когда мазок спермы окрашивается акридиновым оранжевым, внеклеточный клейкий материал вокруг сперматозоидов можно увидеть под флуоресцентным микроскопом.Это вещество позволяет пучкам сперматозоидов прилипать и цепляться за любые окружающие поверхности или частицы, чтобы они не дрейфовали с окружающим потоком.Таким образом, наши наблюдения показывают роль адгезии сперматозоидов в виде подвижных пучков.Их способность плыть против течения и прилипать к близлежащим поверхностям позволяет сперматозоидам дольше оставаться в SST.
Rothschild25 использовал гемоцитометрическую камеру для изучения плавающего распределения бычьей спермы в капле суспензии, делая микрофотографии через камеру как с вертикальной, так и с горизонтальной оптической осью микроскопа.Результаты показали, что сперматозоиды притягивались к поверхности камеры.Авторы предполагают, что могут существовать гидродинамические взаимодействия между спермой и поверхностью.Принимая это во внимание, а также способность спермы цыплят шаркаши образовывать липкие пучки, может увеличиться вероятность того, что сперма прилипнет к стенке SST и будет храниться в течение длительного периода времени.
Bccetti и Afzeliu26 сообщили, что гликокаликс сперматозоидов необходим для распознавания и агглютинации гамет.Forman10 наблюдал, что гидролиз α-гликозидных связей в гликопротеиново-гликолипидных покрытиях путем обработки птичьей спермы нейраминидазой приводил к снижению фертильности, не влияя на подвижность сперматозоидов.Авторы предполагают, что действие нейраминидазы на гликокаликс ухудшает секвестрацию сперматозоидов в маточно-вагинальном соединении, тем самым снижая фертильность.Их наблюдения не могут игнорировать возможность того, что лечение нейраминидазой может снизить распознавание сперматозоидов и ооцитов.Forman и Engel10 обнаружили, что фертильность снижается при интравагинальном осеменении кур спермой, обработанной нейраминидазой.Однако ЭКО со спермой, обработанной нейраминидазой, не влияло на фертильность по сравнению с контрольными цыплятами.Авторы пришли к выводу, что изменения в гликопротеиново-гликолипидном покрытии вокруг мембраны сперматозоидов снижают способность сперматозоидов к оплодотворению за счет нарушения секвестрации сперматозоидов в маточно-вагинальном соединении, что, в свою очередь, увеличивает потерю сперматозоидов из-за скорости маточно-вагинального соединения, но не влияет на распознавание сперматозоидов и яйцеклеток.
У индеек Бакст и Баухан 11 обнаружили в просвете СПВ мелкие везикулы и фрагменты мембраны и заметили, что часть этих гранул срослась с оболочкой спермия.Авторы предполагают, что эти взаимосвязи могут способствовать длительному хранению сперматозоидов в СПВ.Однако исследователи не уточнили источник этих частиц, секретируются ли они эпителиальными клетками ССТ, вырабатываются и секретируются мужской репродуктивной системой или вырабатываются самой спермой.Также эти частицы ответственны за агглютинацию.Grützner et al 27 сообщили, что эпителиальные клетки придатка яичка продуцируют и секретируют специфический белок, необходимый для образования однопоровых семенных путей.Авторы также сообщают, что дисперсия этих пучков зависит от взаимодействия эпидидимальных белков.Nixon и соавт.28 обнаружили, что придатки секретируют белок, кислый, богатый цистеином остеонектин;SPARC участвует в формировании пучков сперматозоидов у короткоклювых ехидн и утконосов.Рассеяние этих лучей связано с потерей этого белка.
В текущем исследовании ультраструктурный анализ с помощью электронной микроскопии показал, что сперматозоиды прилипли к большому количеству плотного материала.Считается, что эти вещества ответственны за агглютинацию, которая конденсируется между прилипшими головками и вокруг них, но в более низких концентрациях в области хвоста.Мы предполагаем, что это агглютинирующее вещество выводится из мужской половой системы (придатка яичка или семявыводящего протока) вместе со спермой, так как мы часто наблюдаем отделение спермы от лимфы и семенной плазмы при эякуляции.Сообщалось, что когда птичьи сперматозоиды проходят через придатки яичка и семявыносящие протоки, они претерпевают изменения, связанные с созреванием, которые поддерживают их способность связывать белки и приобретать гликопротеины, связанные с леммой плазмы.Персистенция этих белков на резидентных мембранах сперматозоидов в SST предполагает, что эти белки могут влиять на приобретение стабильности мембран сперматозоидов 30 и определять их фертильность 31 .Ahammad et al32 сообщили, что сперматозоиды, полученные из различных частей мужской репродуктивной системы (от семенников до дистальных отделов семявыносящего протока), показали прогрессивное повышение жизнеспособности в условиях жидкого хранения, независимо от температуры хранения, а жизнеспособность цыплят также увеличивается в фаллопиевых трубах после искусственного осеменения.
Пучки спермы цыплят шаркаши имеют другие характеристики и функции, чем у других видов, таких как ехидны, утконосы, лесные мыши, оленьи крысы и морские свинки.У кур шаркаси образование пучков сперматозоидов снижало скорость их плавания по сравнению с одиночными сперматозоидами.Однако эти пучки увеличивали процент реологически положительных сперматозоидов и повышали способность сперматозоидов стабилизировать себя в динамической среде.Таким образом, наши результаты подтверждают предыдущее предположение о том, что агглютинация сперматозоидов при ССТ связана с длительным хранением сперматозоидов.Мы также предполагаем, что склонность сперматозоидов к образованию пучков может контролировать скорость потери сперматозоидов при SST, что может изменить результат конкуренции сперматозоидов.Согласно этому предположению, сперматозоиды с низкой способностью к агглютинации первыми выделяют SST, в то время как сперматозоиды с высокой способностью к агглютинации производят большую часть потомства.Формирование однопоровых пучков сперматозоидов полезно и влияет на соотношение родителей и детей, но использует другой механизм.У ехидн и утконосов сперматозоиды расположены параллельно друг другу, чтобы увеличить поступательную скорость луча.Пучки ехидн передвигаются примерно в три раза быстрее, чем одиночные сперматозоиды.Считается, что образование таких пучков сперматозоидов у ехидн является эволюционной адаптацией для сохранения доминирования, поскольку самки ведут беспорядочные половые связи и обычно спариваются с несколькими самцами.Поэтому сперматозоиды из разных эякулятов яростно конкурируют за оплодотворение яйцеклетки.
Агглютинированные сперматозоиды кур шаркази легко визуализировать с помощью фазово-контрастной микроскопии, которая считается выгодной, поскольку позволяет легко изучать поведение сперматозоидов in vitro.Механизм, с помощью которого образование пучков сперматозоидов способствует размножению у кур шаркаси, также отличается от механизма, наблюдаемого у некоторых плацентарных млекопитающих, представляющих кооперативное поведение сперматозоидов, таких как лесные мыши, где некоторые сперматозоиды достигают яиц, помогая другим родственным особям достигать их яиц и повреждать их.чтобы проявить себя.альтруистическое поведение.Самооплодотворение 34. Другой пример кооперативного поведения сперматозоидов был обнаружен у мышей-оленей, где сперматозоиды были способны идентифицировать и объединяться с наиболее генетически родственными сперматозоидами и формировать кооперативные группы для увеличения их скорости по сравнению с неродственными сперматозоидами35.
Результаты, полученные в данном исследовании, не противоречат теории Фомана о длительном хранении сперматозоидов в МВС.Исследователи сообщают, что сперматозоиды продолжают двигаться в потоке эпителиальных клеток, выстилающих SST, в течение длительного периода времени, и по истечении определенного периода времени запасы энергии сперматозоидов истощаются, что приводит к снижению скорости, что позволяет вытеснять вещества с малой молекулярной массой.энергии сперматозоидов с поступлением жидкости из просвета ССТ Полость маточной трубы.В текущем исследовании мы наблюдали, что половина одиночных сперматозоидов продемонстрировала способность плавать против текущих жидкостей, а их адгезия в пучке увеличила их способность демонстрировать положительную реологию.Кроме того, наши данные согласуются с данными Matsuzaki et al.1, которые сообщили, что повышенная секреция лактата при SST может ингибировать резидентную подвижность сперматозоидов.Однако наши результаты описывают формирование подвижных связок сперматозоидов и их реологическое поведение в присутствии динамической среды внутри микроканала в попытке выяснить их поведение при SST.Будущие исследования могут быть сосредоточены на определении химического состава и происхождения агглютинирующего агента, что, несомненно, поможет исследователям разработать новые способы хранения жидкой спермы и увеличить продолжительность фертильности.
Пятнадцать 30-недельных самцов шаркази с голой шеей (гомозиготный доминант; Na Na) были выбраны в качестве доноров спермы в исследовании.Птицы выращивались на исследовательской птицефабрике сельскохозяйственного факультета Ашитского университета, мухафаза Ашит, Египет.Птиц содержали в индивидуальных клетках (30 х 40 х 40 см), подвергали световой программе (16 часов света и 8 часов темноты) и кормили рационом, содержащим 160 г сырого протеина, 2800 ккал обменной энергии, 35 г кальция каждая.5 грамм доступного фосфора на килограмм рациона.
По данным 36, 37, сперму у самцов собирали путем массажа живота.В общей сложности было собрано 45 образцов спермы у 15 мужчин в течение 3 дней.Сперму (n = 15/день) немедленно разбавляли 1:1 (об:об) разбавителем спермы Belsville Poultry Semen Diluent, который содержит дифосфат калия (1,27 г), моногидрат глутамата натрия (0,867 г), фруктозу (0,5 г), безводный натрий.ацетат (0,43 г), трис(гидроксиметил)аминометан (0,195 г), моногидрат цитрата калия (0,064 г), монофосфат калия (0,065 г), хлорид магния (0,034 г) и H2O (100 мл), pH = 7, 5, осмолярность 333 мОсм/кг38.Разбавленные образцы спермы сначала исследовали под световым микроскопом, чтобы убедиться в хорошем качестве спермы (влажности), а затем хранили на водяной бане при 37°C до использования в течение получаса после сбора.
Кинематика и реология сперматозоидов описываются с помощью системы микрофлюидных устройств.Образцы спермы были дополнительно разбавлены до 1:40 в разбавителе спермы птиц Белтсвилля, загружены в микрофлюидное устройство (см. ниже), и кинетические параметры были определены с использованием системы компьютерного анализа спермы (CASA), ранее разработанной для микрофлюидной характеристики.на подвижность сперматозоидов в жидких средах (кафедра машиностроения инженерного факультета Университета Асьют, Египет).Плагин можно загрузить по адресу: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Измеряли кривую скорость (VCL, мкм/с), линейную скорость (VSL, мкм/с) и среднюю траекторную скорость (VAP, мкм/с).Видео сперматозоидов снимали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Optika XDS-3 (с 40-кратным объективом), подключенного к камере Tucson ISH1000, со скоростью 30 кадров в секунду в течение 3 с.Используйте программное обеспечение CASA для изучения как минимум трех областей и 500 траекторий сперматозоидов на образец.Записанное видео обрабатывалось с помощью самодельного CASA.Определение подвижности в подключаемом модуле CASA основано на скорости плавания сперматозоидов по сравнению со скоростью потока и не включает другие параметры, такие как движение из стороны в сторону, поскольку было обнаружено, что это более надежно в потоке жидкости.Реологическое движение описывается как движение сперматозоидов против направления потока жидкости.Сперматозоиды с реологическими свойствами разделяли по количеству подвижных сперматозоидов;сперматозоиды, находящиеся в покое, и конвективно движущиеся сперматозоиды исключались из подсчета.
Все используемые химические вещества были получены от Elgomhoria Pharmaceuticals (Каир, Египет), если не указано иное.Устройство было изготовлено, как описано El-sherry et al.40 с некоторыми изменениями.Материалы, использованные для изготовления микроканалов, включали стеклянные пластины (Howard Glass, Worcester, MA), негативный резист SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), диацетоновый спирт (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) и полиацетон.-184, Доу Корнинг, Мидленд, Мичиган).Микроканалы изготавливаются с использованием мягкой литографии.Сначала на принтере с высоким разрешением (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) была напечатана прозрачная защитная маска для лица с желаемой микроканальной конструкцией.Мастера были изготовлены с использованием стеклянных пластин в качестве подложек.Планшеты очищали в ацетоне, изопропаноле и деионизированной воде, а затем покрывали слоем SU8-25 толщиной 20 мкм методом центрифугирования (3000 об/мин, 1 мин).Затем слои SU-8 осторожно сушили (65°С, 2 мин и 95°С, 10 мин) и подвергали воздействию УФ-излучения в течение 50 с.Выпекание после воздействия при 65°C и 95°C в течение 1 мин и 4 мин для сшивания экспонированных слоев SU-8 с последующим проявлением в диацетоновом спирте в течение 6,5 мин.Жестко испечь вафли (200 ° C в течение 15 мин), чтобы еще больше укрепить слой SU-8.
ПДМС готовили путем смешивания мономера и отвердителя в весовом соотношении 10:1, затем дегазировали в вакуум-эксикаторе и заливали на основной корпус СУ-8.ПДМС отверждали в печи (120°C, 30 мин), затем вырезали каналы, отделяли от мастера и перфорировали, чтобы можно было прикрепить трубки на входе и выходе микроканала.Наконец, микроканалы PDMS были постоянно прикреплены к предметным стеклам микроскопа с использованием портативного коронного процессора (Electro-Technic Products, Чикаго, Иллинойс), как описано в другом месте.Микроканал, использованный в этом исследовании, имеет размеры 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) и длину 3,6 см.
Индуцированное гидростатическим давлением внутри микроканала течение жидкости достигается за счет поддержания уровня жидкости во входном резервуаре выше перепада высот Δh39 в выходном резервуаре (рис. 1).
где f — коэффициент трения, определяемый как f = C/Re для ламинарного течения в прямоугольном канале, где C — константа, зависящая от соотношения сторон канала, L — длина микроканала, Vav — средняя скорость внутри микроканала, Dh — гидравлический диаметр канала, g — ускорение свободного падения.Используя это уравнение, среднюю скорость канала можно рассчитать, используя следующее уравнение: