Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Плодовитость птиц зависит от их способности хранить достаточно жизнеспособной спермы в течение длительного периода времени в канальцах для хранения спермы (SST). Точный механизм, посредством которого сперматозоиды входят, находятся в и покидают SST, остается спорным. Сперма кур шаркаси показала высокую тенденцию к агглютинации, образуя подвижные нитевидные пучки, содержащие много клеток. Из-за сложности наблюдения за подвижностью и поведением сперматозоидов в непрозрачной фаллопиевой трубе мы использовали микрофлюидное устройство с поперечным сечением микроканала, аналогичным поперечным сечением сперматозоидов, для изучения агглютинации и подвижности сперматозоидов. В этом исследовании обсуждается, как образуются пучки сперматозоидов, как они движутся и их возможная роль в продлении срока пребывания сперматозоидов в SST. Мы исследовали скорость сперматозоидов и реологическое поведение, когда поток жидкости создавался в микрофлюидном канале гидростатическим давлением (скорость потока = 33 мкм/с). Сперматозоиды имеют тенденцию плыть против течения (положительная реология), а скорость пучка сперматозоидов значительно снижена по сравнению с одиночными сперматозоидами. Было замечено, что пучки сперматозоидов движутся по спирали и увеличиваются в длину и толщину по мере привлечения большего количества одиночных сперматозоидов. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать уноса со скоростью потока жидкости > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать уноса со скоростью потока жидкости > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов появляются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать уноса при скорости потока жидкости >33 мкм/с.Скорость передачи данных выше 33 мкм/с.33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов появляются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потока жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать уноса потоком жидкости со скоростью >33 мкм/с.Сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия выявила, что пучки сперматозоидов поддерживаются обильным плотным материалом. Полученные данные демонстрируют уникальную подвижность сперматозоидов цыплят Шаркази, а также способность сперматозоидов агглютинироваться и образовывать подвижные пучки, что способствует лучшему пониманию долгосрочного хранения сперматозоидов в SMT.
Для достижения оплодотворения у людей и большинства животных сперма и яйцеклетки должны прибыть к месту оплодотворения в нужное время. Поэтому спаривание должно произойти до или во время овуляции. С другой стороны, некоторые млекопитающие, такие как собаки, а также немлекопитающие виды, такие как насекомые, рыбы, рептилии и птицы, хранят сперму в своих репродуктивных органах в течение длительного периода времени, пока их яйцеклетки не будут готовы к оплодотворению (асинхронное оплодотворение 1 ). Птицы способны поддерживать жизнеспособность сперматозоидов, способных оплодотворить яйцеклетки, в течение 2–10 недель2.
Это уникальная особенность, которая отличает птиц от других животных, так как она обеспечивает высокую вероятность оплодотворения после однократного оплодотворения в течение нескольких недель без одновременного спаривания и овуляции. Основной орган хранения спермы, называемый канальцем хранения спермы (SST), расположен во внутренних складках слизистой оболочки в области маточно-влагалищного соединения. На сегодняшний день механизмы, посредством которых сперма попадает в банк спермы, находится там и выходит из него, до конца не изучены. На основе предыдущих исследований было выдвинуто много гипотез, но ни одна из них не была подтверждена.
Forman4 выдвинул гипотезу, что сперматозоиды сохраняют свое местопребывание в полости SST посредством непрерывного колебательного движения против направления потока жидкости через белковые каналы, расположенные на эпителиальных клетках SST (реология). АТФ истощается из-за постоянной жгутиковой активности, необходимой для удержания сперматозоидов в просвете SST, и подвижность в конечном итоге снижается до тех пор, пока сперматозоиды не будут вынесены из банка спермы потоком жидкости и не начнут новое путешествие по восходящей фаллопиевой трубе для оплодотворения спермы. Яйцеклетка (Forman4). Эта модель хранения спермы подтверждается обнаружением с помощью иммуноцитохимии аквапоринов 2, 3 и 9, присутствующих в эпителиальных клетках SST. На сегодняшний день отсутствуют исследования реологии куриной спермы и ее роли в хранении SST, вагинальном отборе сперматозоидов и конкуренции сперматозоидов. У кур сперма попадает во влагалище после естественного спаривания, но более 80% сперматозоидов выбрасываются из влагалища вскоре после спаривания. Это говорит о том, что влагалище является основным местом отбора сперматозоидов у птиц. Кроме того, сообщалось, что менее 1% сперматозоидов, оплодотворенных во влагалище, попадают в SST2. При искусственном оплодотворении цыплят во влагалище количество сперматозоидов, достигающих SST, имеет тенденцию к увеличению через 24 часа после оплодотворения. До сих пор механизм отбора сперматозоидов во время этого процесса неясен, и подвижность сперматозоидов может играть важную роль в поглощении сперматозоидов SST. Из-за толстых и непрозрачных стенок фаллопиевых труб трудно напрямую контролировать подвижность сперматозоидов в фаллопиевых трубах птиц. Поэтому у нас нет базовых знаний о том, как сперматозоиды переходят в SST после оплодотворения.
Недавно реология была признана важным фактором, контролирующим транспорт спермы в гениталиях млекопитающих. Основываясь на способности подвижных сперматозоидов мигрировать противотоком, Заферани и др.8 использовали микрожидкостную систему Corra для пассивной изоляции подвижных сперматозоидов из образцов спермы, содержащихся в пергаменте. Этот тип сортировки спермы необходим для лечения бесплодия и клинических исследований и является предпочтительным по сравнению с традиционными методами, которые требуют много времени и труда и могут нарушить морфологию и структурную целостность сперматозоидов. Однако на сегодняшний день не было проведено никаких исследований по влиянию выделений из половых органов кур на подвижность сперматозоидов.
Независимо от механизма, который поддерживает сперму, хранящуюся в SST, многие исследователи наблюдали, что резидентные сперматозоиды агглютинируют голова к голове в SST кур 9, 10, перепелов 2 и индеек 11, образуя агглютинированные пучки спермы. Авторы предполагают, что существует связь между этой агглютинацией и длительным хранением сперматозоидов в SST.
Tingari и Lake12 сообщили о сильной связи между сперматозоидами в принимающей сперму железе курицы и задались вопросом, агглютинируют ли сперматозоиды птиц так же, как сперматозоиды млекопитающих. Они полагают, что глубокие связи между сперматозоидами в семявыносящих протоках могут быть вызваны стрессом, вызванным присутствием большого количества сперматозоидов в небольшом пространстве.
При оценке поведения сперматозоидов на свежих подвесных предметных стеклах можно увидеть временные признаки агглютинации, особенно по краям капель спермы. Однако агглютинация часто нарушалась вращательным действием, связанным с непрерывным движением, что объясняет временный характер этого явления. Исследователи также заметили, что при добавлении разбавителя к сперме появлялись удлиненные «нитевидные» клеточные агрегаты.
Ранние попытки имитировать сперматозоид были сделаны путем удаления тонкой проволоки из висячей капли, что привело к удлиненной спермоподобной везикуле, выступающей из капли семени. Сперматозоиды немедленно выстроились параллельно внутри пузырька, но вся единица быстро исчезла из-за ограничения 3D. Поэтому для изучения агглютинации сперматозоидов необходимо наблюдать за подвижностью и поведением сперматозоидов непосредственно в изолированных канальцах для хранения спермы, что труднодостижимо. Поэтому необходимо разработать инструмент, имитирующий сперматозоиды, для поддержки исследований подвижности сперматозоидов и поведения агглютинации. Brillard et al13 сообщили, что средняя длина канальцев для хранения спермы у взрослых цыплят составляет 400–600 мкм, но некоторые SST могут достигать 2000 мкм. Меро и Огасавара14 разделили семенные железы на увеличенные и неувеличенные канальцы для хранения спермы, обе из которых были одинаковы по длине (~500 мкм) и ширине шейки (~38 мкм), но средний диаметр просвета канальцев составлял 56,6 и 56,6 мкм. . , соответственно 11,2 мкм, соответственно. В текущем исследовании мы использовали микрофлюидное устройство с размером канала 200 мкм × 20 мкм (Ш × В), поперечное сечение которого несколько близко к поперечному сечению усиленного SST. Кроме того, мы исследовали подвижность сперматозоидов и поведение агглютинации в текущей жидкости, что согласуется с гипотезой Формана о том, что жидкость, вырабатываемая эпителиальными клетками SST, удерживает сперму в просвете в противоточном (реологическом) направлении.
Целью данного исследования было преодоление проблем наблюдения за подвижностью сперматозоидов в фаллопиевой трубе и избежание трудностей изучения реологии и поведения сперматозоидов в динамической среде. Было использовано микрофлюидное устройство, которое создает гидростатическое давление для имитации подвижности сперматозоидов в гениталиях курицы.
При загрузке капли разбавленного образца спермы (1:40) в микроканальное устройство можно было идентифицировать два типа подвижности сперматозоидов (изолированные сперматозоиды и связанные сперматозоиды). Кроме того, сперматозоиды имели тенденцию плыть против течения (положительная реология; видео 1, 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем одиночные сперматозоиды (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; Таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем одиночные сперматозоиды (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; Таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (р < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (р < 0,001; таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем отдельные сперматозоиды (p < 0,001), они увеличили процент сперматозоидов, показывающих положительный реотаксис (p < 0,001; Таблица 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001）, 但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (р < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (р < 0,001; таблица 2). Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у отдельных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличили процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; Таблица 2).Положительная реология для отдельных сперматозоидов и пучков оценивается примерно в 53% и 85% соответственно.
Было замечено, что сперматозоиды кур шаркаши сразу после эякуляции образуют линейные пучки, состоящие из десятков особей. Эти пучки увеличиваются в длину и толщину с течением времени и могут оставаться in vitro в течение нескольких часов, прежде чем рассеяться (видео 3). Эти нитевидные пучки имеют форму сперматозоидов ехидны, которые образуются на конце придатка яичка. Было обнаружено, что сперма кур шаркаши имеет высокую тенденцию к агглютинации и образованию сетчатого пучка менее чем за одну минуту после сбора. Эти пучки динамичны и способны прилипать к любым близлежащим стенам или статическим объектам. Хотя пучки спермы снижают скорость сперматозоидов, очевидно, что макроскопически они увеличивают их линейность. Длина пучков варьируется в зависимости от количества сперматозоидов, собранных в пучки. Были выделены две части пучка: начальная часть, включающая свободную головку агглютинированного сперматозоида, и конечная часть, включающая хвост и весь дистальный конец сперматозоида. Используя высокоскоростную камеру (950 кадров в секунду), свободные головки агглютинированных сперматозоидов были обнаружены в начальной части пучка, которые отвечают за движение пучка из-за их колебательного движения, увлекая оставшиеся в пучок спиральным движением (Видео 4). Однако в длинных пучках было замечено, что некоторые свободные головки сперматозоидов прилипли к телу, а конечная часть пучка действует как лопасти, помогая продвигать пучок.
В медленном потоке жидкости пучки сперматозоидов движутся параллельно друг другу, однако они начинают перекрываться и прилипать ко всему, что неподвижно, чтобы не быть смытыми потоком тока по мере увеличения скорости потока. Пучки образуются, когда горстка сперматозоидов приближается друг к другу, они начинают двигаться синхронно и обвиваются друг вокруг друга, а затем прилипают к липкой субстанции. На рисунках 1 и 2 показано, как сперматозоиды приближаются друг к другу, образуя соединение, когда хвосты обвиваются друг вокруг друга.
Исследователи применили гидростатическое давление для создания потока жидкости в микроканале для изучения реологии спермы. Использовался микроканал размером 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) и длиной 3,6 мкм. Используйте микроканалы между контейнерами со шприцами, установленными на концах. Для того, чтобы сделать каналы более заметными, использовался пищевой краситель.
Привяжите соединительные кабели и аксессуары к стене. Видео снято с помощью фазово-контрастного микроскопа. С каждым изображением представлены изображения фазово-контрастной микроскопии и картирования. (A) Соединение между двумя потоками сопротивляется потоку из-за винтового движения (красная стрелка). (B) Соединение между пучком трубок и стенкой канала (красные стрелки), в то же время они соединены с двумя другими пучками (желтые стрелки). (C) Пучки сперматозоидов в микрофлюидном канале начинают соединяться друг с другом (красные стрелки), образуя сетку из пучков сперматозоидов. (D) Формирование сети из пучков сперматозоидов.
Когда капля разбавленной спермы была загружена в микрофлюидное устройство и был создан поток, было замечено, что пучок спермы двигался против направления потока. Пучки плотно прилегали к стенкам микроканалов, а свободные головки в начальной части пучков плотно прилегали к ним (видео 5). Они также прилипали к любым неподвижным частицам на своем пути, таким как мусор, чтобы противостоять сносу потоком. Со временем эти пучки превращались в длинные нити, захватывающие другие одиночные сперматозоиды и более короткие пучки (видео 6). По мере того, как поток начинает замедляться, длинные линии спермы начинали формировать сеть линий спермы (видео 7; рисунок 2).
При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиральные движения нитей усиливаются, поскольку попытка уловить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, лучше противостоят дрейфовой силе потока. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиральные движения нитей усиливаются, поскольку попытка уловить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, лучше противостоят дрейфовой силе потока. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиральвидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образуя пучки, которые способны лучше противостоять дрейфовой силе потока.在高流速(V > 33 мкм/с)时, 螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 мкм/с) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ,从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в захвате, захватывая множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше стабилизироваться силам дрейфа потока. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей усиливается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образуя пучки для лучшего сопротивления дрейфовым силам потока.Они также попытались прикрепить микроканалы к боковым стенкам.
С помощью световой микроскопии (СМ) пучки сперматозоидов были идентифицированы как кластеры головок сперматозоидов и закрученных хвостов. Пучки сперматозоидов с различными агрегатами также были идентифицированы как скрученные головки и жгутиковые агрегаты, множественные слитые хвосты сперматозоидов, головки сперматозоидов, прикрепленные к хвосту, и головки сперматозоидов с изогнутыми ядрами как множественные слитые ядра. просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) показала, что пучки сперматозоидов представляли собой покрытые оболочкой агрегаты головок сперматозоидов, а агрегаты сперматозоидов демонстрировали прикрепленную сеть завернутых хвостов.
Морфологию и ультраструктуру сперматозоидов, формирование пучков сперматозоидов изучали с помощью световой микроскопии (полусрез), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), мазки спермы окрашивали акридиновым оранжевым и исследовали с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.
Окрашивание мазков спермы акридиновым оранжевым (рис. 3B) показало, что головки сперматозоидов слиплись и покрылись секреторным материалом, что привело к образованию больших пучков (рис. 3D). Сгустки сперматозоидов состояли из агрегатов сперматозоидов с сетью прикрепленных хвостов (рис. 4A-C). Сгустки сперматозоидов состоят из хвостов множества сперматозоидов, слипшихся вместе (рис. 4D). Секреты (рис. 4E,F) покрывали головки пучков сперматозоидов.
Формирование пучка сперматозоидов Использование фазово-контрастной микроскопии и мазков спермы, окрашенных акридиновым оранжевым, показало, что головки сперматозоидов слипаются. (A) Раннее формирование пучка сперматозоидов начинается со сперматозоида (белый круг) и трех сперматозоидов (желтый круг), причем спираль начинается с хвоста и заканчивается головкой. (B) Микрофотография мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая слипшиеся головки сперматозоидов (стрелки). Выделение покрывает головку(и). Увеличение: × 1000. (C) Развитие большого пучка, транспортируемого потоком в микрофлюидном канале (с использованием высокоскоростной камеры со скоростью 950 кадров в секунду). (D) Микрофотография мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая большие пучки (стрелки). Увеличение: × 200.
Сканирующая электронная микрофотография пучка спермы и мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым. (A, B, D, E) — это цифровые цветные сканирующие электронные микрофотографии сперматозоидов, а C и F — это микрофотографии мазков спермы, окрашенных акридиновым оранжевым, показывающие прикрепление нескольких сперматозоидов, обвивающих хвостовую перепонку. (AC) Агрегаты спермы показаны в виде сети прикрепленных хвостов (стрелки). (D) Слипание нескольких сперматозоидов (с клейким веществом, розовый контур, стрелка), обвивающих хвост. (E и F) Агрегаты головок сперматозоидов (указатели), покрытые клейким материалом (указатели). Сперматозоиды образовали пучки с несколькими вихреобразными структурами (F). (C) ×400 и (F) ×200 увеличения.
Используя просвечивающую электронную микроскопию, мы обнаружили, что пучки сперматозоидов имели прикрепленные хвосты (рис. 6A, C), головки, прикрепленные к хвостам (рис. 6B), или головки, прикрепленные к хвостам (рис. 6D). Головки сперматозоидов в пучке изогнуты, представляя на срезе две ядерные области (рис. 6D). В пучке надреза сперматозоиды имели скрученную головку с двумя ядерными областями и несколькими жгутиковыми областями (рис. 5A).
Цифровая цветная электронная микрофотография, показывающая соединительные хвосты в пучке сперматозоидов и агглютинирующий материал, соединяющий головки сперматозоидов. (A) Прикрепленный хвост большого количества сперматозоидов. Обратите внимание, как выглядит хвост в портретной (стрелка) и альбомной (стрелка) проекциях. (B) Головка (стрелка) сперматозоида соединена с хвостом (стрелка). (C) Прикреплено несколько хвостов сперматозоидов (стрелки). (D) Агглютинирующий материал (AS, синий) соединяет четыре головки сперматозоидов (фиолетовый).
Сканирующая электронная микроскопия использовалась для обнаружения головок сперматозоидов в пучках сперматозоидов, покрытых секретами или мембранами (рисунок 6B), что указывает на то, что пучки сперматозоидов были закреплены внеклеточным материалом. Агглютинированный материал концентрировался в головке сперматозоида (сборка, похожая на голову медузы; рис. 5B) и расширялся дистально, давая ярко-желтый вид под флуоресцентной микроскопией при окрашивании акридином оранжевым (рисунок 6C). Это вещество хорошо видно под сканирующим микроскопом и считается связующим веществом. Полутонкие срезы (рисунок 5C) и мазки спермы, окрашенные акридином оранжевым, показали пучки сперматозоидов, содержащие плотно упакованные головки и закрученные хвосты (рисунок 5D).
Различные микрофотографии, показывающие агрегацию головок сперматозоидов и сложенных хвостов с использованием различных методов. (A) Поперечный разрез цифрового цветного трансмиссионного электронного микроскопа пучка сперматозоидов, показывающий скрученную головку сперматозоида с двухкомпонентным ядром (синий) и несколькими жгутиковыми частями (зеленый). (B) Цифровой цветной сканирующий электронный микроскоп, показывающий скопление медузоподобных головок сперматозоидов (стрелки), которые кажутся покрытыми. (C) Полутонкий срез, показывающий агрегированные головки сперматозоидов (стрелки) и закрученные хвосты (стрелки). (D) Микрофотография мазка спермы, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая агрегаты головок сперматозоидов (стрелки) и закрученных прилипших хвостов (стрелки). Обратите внимание, что липкое вещество (S) покрывает головку сперматозоида. (D) Увеличение × 1000.
С помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 7А) также было отмечено, что головки сперматозоидов были скручены, а ядра имели спиральную форму, что подтвердилось мазками спермы, окрашенными акридиновым оранжевым и исследованными с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 7Б).
(A) Цифровая цветная трансмиссионная электронная микрофотография и (B) Мазок спермы, окрашенный акридиновым оранжевым, показывающий скрученные головки и прикрепление головок и хвостов сперматозоидов (стрелки). (B) Увеличение × 1000.
Интересным открытием является то, что сперма Шаркази агрегирует, образуя подвижные нитевидные пучки. Свойства этих пучков позволяют нам понять их возможную роль в поглощении и хранении сперматозоидов в SST.
После спаривания сперма попадает во влагалище и проходит интенсивный процесс отбора, в результате чего в SST попадает лишь ограниченное количество сперматозоидов15,16. На сегодняшний день механизмы, посредством которых сперматозоиды попадают в SST и выходят из него, неясны. У домашней птицы сперматозоиды хранятся в SST в течение длительного периода времени от 2 до 10 недель в зависимости от вида6. Остаются споры о состоянии спермы во время хранения в SST. Находятся ли они в движении или в состоянии покоя? Другими словами, как сперматозоиды сохраняют свое положение в SST так долго?
Forman4 предположил, что пребывание и выброс SST можно объяснить с точки зрения подвижности сперматозоидов. Авторы выдвигают гипотезу, что сперматозоиды сохраняют свое положение, плывя против потока жидкости, создаваемого эпителием SST, и что сперматозоиды выбрасываются из SST, когда их скорость падает ниже точки, в которой они начинают двигаться назад из-за недостатка энергии. Zaniboni5 подтвердил наличие аквапоринов 2, 3 и 9 в апикальной части эпителиальных клеток SST, что может косвенно подтверждать модель хранения спермы Forman. В текущем исследовании мы обнаружили, что почти половина сперматозоидов Шаркаши демонстрируют положительную реологию в текущей жидкости, и что агглютинированные пучки сперматозоидов увеличивают количество сперматозоидов, показывающих положительную реологию, хотя агглютинация замедляет их. То, как сперматозоиды перемещаются вверх по фаллопиевой трубе птицы к месту оплодотворения, до конца не изучено. У млекопитающих фолликулярная жидкость хемоаттрактирует сперматозоиды. Однако считается, что хемоаттрактанты направляют сперматозоиды на большие расстояния7. Следовательно, за транспортировку спермы отвечают другие механизмы. Способность сперматозоидов ориентироваться и течь против жидкости фаллопиевой трубы, выделяемой после спаривания, как сообщается, является основным фактором в нацеливании сперматозоидов у мышей. Паркер 17 предположил, что сперматозоиды пересекают яйцеводы, плывя против цилиарного тока у птиц и рептилий. Хотя это не было экспериментально продемонстрировано на птицах, Адольфи 18 был первым, кто обнаружил, что сперма птиц дает положительные результаты, когда тонкий слой жидкости между покровным стеклом и предметным стеклом создается с помощью полоски фильтровальной бумаги. Реология. Хино и Янагимачи [19] поместили комплекс яичника, трубы и матки мыши в перфузионное кольцо и ввели 1 мкл чернил в перешеек, чтобы визуализировать поток жидкости в фаллопиевых трубах. Они заметили очень активное движение сокращения и расслабления в фаллопиевой трубе, при котором все чернильные шарики неуклонно двигались к ампуле фаллопиевой трубы. Авторы подчеркивают важность потока трубной жидкости из нижних в верхние фаллопиевые трубы для подъема спермы и оплодотворения. Brillard20 сообщил, что у кур и индеек сперматозоиды мигрируют путем активного движения от входа во влагалище, где они хранятся, к маточно-влагалищному соединению, где они хранятся. Однако это движение не требуется между маточно-влагалищным соединением и инфундибулумом, поскольку сперматозоиды транспортируются путем пассивного перемещения. Зная эти предыдущие рекомендации и результаты, полученные в текущем исследовании, можно предположить, что способность сперматозоидов двигаться вверх по течению (реология) является одним из свойств, на которых основан процесс отбора. Это определяет прохождение сперматозоидов через влагалище и их попадание в CCT для хранения. Как предположил Форман4, это также может облегчить процесс проникновения сперматозоидов в SST и их среду обитания на определенный период времени, а затем выхода, когда их скорость начинает замедляться.
С другой стороны, Мацузаки и Сасанами 21 предположили, что сперматозоиды птиц претерпевают изменения подвижности от покоя к подвижности в мужских и женских половых путях. Было предложено, что ингибирование подвижности резидентных сперматозоидов в SST объясняет длительное время хранения спермы и ее последующее восстановление после выхода из SST. В условиях гипоксии Мацузаки и др. 1 сообщили о высоком производстве и высвобождении лактата в SST, что может приводить к ингибированию подвижности резидентных сперматозоидов. В этом случае важность реологии сперматозоидов отражается в выборе и поглощении сперматозоидов, а не в их хранении.
Модель агглютинации сперматозоидов считается правдоподобным объяснением длительного периода хранения спермы в SST, поскольку это обычная модель удержания спермы у домашней птицы2,22,23. Бакст и др. 2 наблюдали, что большинство сперматозоидов прилипали друг к другу, образуя пучковые агрегаты, а отдельные сперматозоиды редко встречались в CCM перепелов. С другой стороны, Вэнь и др. 24 наблюдали более разбросанные сперматозоиды и меньшее количество пучков сперматозоидов в просвете SST у кур. Основываясь на этих наблюдениях, можно предположить, что склонность к агглютинации сперматозоидов различается между птицами и между сперматозоидами в одном и том же эякуляте. Кроме того, Ван Крей и др. 9 предположили, что случайная диссоциация агглютинированных сперматозоидов ответственна за постепенное проникновение сперматозоидов в просвет фаллопиевой трубы. Согласно этой гипотезе, сперматозоиды с более низкой агглютинирующей способностью должны быть вытеснены из SST в первую очередь. В этом контексте способность сперматозоидов к агглютинации может быть фактором, влияющим на исход конкуренции сперматозоидов у грязных птиц. Кроме того, чем дольше диссоциирует агглютинированная сперма, тем дольше сохраняется фертильность.
Хотя агрегация сперматозоидов и их объединение в пучки наблюдались в нескольких исследованиях2,22,24, они не были подробно описаны из-за сложности их кинематического наблюдения в пределах SST. Было предпринято несколько попыток изучить агглютинацию сперматозоидов in vitro. Обширная, но временная агрегация наблюдалась, когда тонкая проволока была удалена из свисающей капли семени. Это приводит к тому, что из капли выступает удлиненный пузырек, имитирующий семенную железу. Из-за ограничений 3D и короткого времени высыхания капли весь блок быстро пришел в негодность9. В текущем исследовании с использованием кур Шаркаши и микрофлюидных чипов мы смогли описать, как образуются эти пучки и как они движутся. Пучки спермы образовывались сразу после сбора спермы и, как было обнаружено, двигались по спирали, демонстрируя положительную реологию при наличии в потоке. Кроме того, при макроскопическом рассмотрении было замечено, что пучки сперматозоидов увеличивают линейность подвижности по сравнению с изолированными сперматозоидами. Это говорит о том, что агглютинация сперматозоидов может происходить до проникновения SST и что выработка спермы не ограничивается небольшой областью из-за стресса, как предполагалось ранее (Tingari и Lake12). Во время формирования пучка сперматозоиды плавают синхронно, пока не образуют соединение, затем их хвосты оборачиваются вокруг друг друга, и головка сперматозоида остается свободной, но хвост и дистальная часть сперматозоида склеиваются вместе липким веществом. Таким образом, свободная головка связки отвечает за движение, увлекая за собой остальную часть связки. Сканирующая электронная микроскопия пучков сперматозоидов показала прикрепленные головки сперматозоидов, покрытые большим количеством липкого материала, что позволяет предположить, что головки сперматозоидов были прикреплены в покоящиеся пучки, что могло произойти после достижения места хранения (SST).
При окрашивании мазка спермы акридиновым оранжевым можно увидеть внеклеточный адгезивный материал вокруг сперматозоидов под флуоресцентным микроскопом. Это вещество позволяет пучкам сперматозоидов прилипать и цепляться за любые окружающие поверхности или частицы, так что они не дрейфуют с окружающим потоком. Таким образом, наши наблюдения показывают роль адгезии сперматозоидов в форме подвижных пучков. Их способность плыть против течения и прилипать к близлежащим поверхностям позволяет сперматозоидам дольше оставаться в SST.
Rothschild25 использовал камеру для гемоцитометрии для изучения плавающего распределения бычьего семени в капле суспензии, делая микрофотографии через камеру с вертикальной и горизонтальной оптической осью микроскопа. Результаты показали, что сперматозоиды были привлечены к поверхности камеры. Авторы предполагают, что между спермой и поверхностью могут быть гидродинамические взаимодействия. Принимая это во внимание, а также способность спермы цыплят Sharkashi образовывать липкие пучки, это может увеличить вероятность того, что сперма будет прилипать к стенке SST и храниться в течение длительных периодов времени.
Bccetti и Afzeliu26 сообщили, что гликокаликс сперматозоидов необходим для распознавания гамет и агглютинации. Forman10 наблюдали, что гидролиз α-гликозидных связей в гликопротеин-гликолипидных покрытиях при обработке птичьего семени нейраминидазой привел к снижению фертильности, не влияя на подвижность сперматозоидов. Авторы предполагают, что воздействие нейраминидазы на гликокаликс ухудшает секвестрацию сперматозоидов в маточно-влагалищном соединении, тем самым снижая фертильность. Их наблюдения не могут игнорировать возможность того, что обработка нейраминидазой может снизить распознавание сперматозоидов и ооцитов. Forman и Engel10 обнаружили, что фертильность снижалась, когда кур осеменяли интравагинально спермой, обработанной нейраминидазой. Однако ЭКО с обработанной нейраминидазой спермой не влияло на фертильность по сравнению с контрольными курами. Авторы пришли к выводу, что изменения в гликопротеиново-гликолипидном покрытии вокруг мембраны сперматозоида снижают способность сперматозоидов к оплодотворению за счет нарушения секвестрации сперматозоидов в маточно-влагалищном соединении, что, в свою очередь, увеличивает потерю сперматозоидов из-за скорости движения маточно-влагалищного соединения, но не влияет на распознавание сперматозоидов и яйцеклеток.
У индеек Бакст и Бочан 11 обнаружили небольшие пузырьки и фрагменты мембраны в просвете SST и заметили, что некоторые из этих гранул слились с мембраной спермы. Авторы предполагают, что эти связи могут способствовать длительному хранению сперматозоидов в SST. Однако исследователи не указали источник этих частиц, выделяются ли они эпителиальными клетками CCT, производятся и выделяются мужской репродуктивной системой или производятся самой спермой. Кроме того, эти частицы отвечают за агглютинацию. Грютцнер и др. 27 сообщили, что эпителиальные клетки придатка яичка производят и выделяют специфический белок, который необходим для образования однопоровых семенных путей. Авторы также сообщают, что дисперсия этих пучков зависит от взаимодействия эпидидимальных белков. Никсон и др. 28 обнаружили, что придатки секретируют белок, кислый богатый цистеином остеонектин; SPARC участвует в формировании пучков спермы у короткоклювых ехидн и утконосов. Рассеивание этих пучков связано с потерей этого белка.
В текущем исследовании ультраструктурный анализ с использованием электронной микроскопии показал, что сперматозоиды прилипли к большому количеству плотного материала. Считается, что эти вещества ответственны за агглютинацию, которая конденсируется между и вокруг прилипших головок, но в более низких концентрациях в области хвоста. Мы предполагаем, что это агглютинирующее вещество выделяется из мужской репродуктивной системы (эпидидимиса или семявыносящего протока) вместе со спермой, поскольку мы часто наблюдаем отделение спермы от лимфы и семенной плазмы во время эякуляции. Сообщалось, что когда сперматозоиды птиц проходят через эпидидимис и семявыносящий проток, они претерпевают изменения, связанные с созреванием, которые поддерживают их способность связывать белки и приобретать гликопротеины, связанные с леммой плазмы. Устойчивость этих белков на резидентных мембранах сперматозоидов в SST предполагает, что эти белки могут влиять на приобретение стабильности мембран сперматозоидов 30 и определять их фертильность 31 . Ахаммад и др.32 сообщили, что сперматозоиды, полученные из различных частей мужской репродуктивной системы (от яичек до дистального отдела семявыносящего протока), показали прогрессивное увеличение жизнеспособности в условиях хранения в жидкости, независимо от температуры хранения, а жизнеспособность у кур также увеличивается в фаллопиевых трубах после искусственного осеменения.
Пучки спермы цыплят шаркаши имеют иные характеристики и функции, чем у других видов, таких как ехидны, утконосы, лесные мыши, оленьи крысы и морские свинки. У цыплят шаркаши образование пучков сперматозоидов снижало их скорость плавания по сравнению с одиночными сперматозоидами. Однако эти пучки увеличивали процент реологически положительных сперматозоидов и повышали способность сперматозоидов стабилизироваться в динамической среде. Таким образом, наши результаты подтверждают предыдущее предположение о том, что агглютинация сперматозоидов в SST связана с долгосрочным хранением спермы. Мы также предполагаем, что склонность сперматозоидов к образованию пучков может контролировать скорость потери сперматозоидов в SST, что может изменить исход конкуренции сперматозоидов. Согласно этому предположению, сперматозоиды с низкой способностью к агглютинации первыми выпускают SST, в то время как сперматозоиды с высокой способностью к агглютинации производят большую часть потомства. Образование пучков сперматозоидов с одной порой полезно и влияет на соотношение родитель-потомок, но использует другой механизм. У ехидн и утконосов сперматозоиды располагаются параллельно друг другу, чтобы увеличить скорость движения луча. Связки ехидн движутся примерно в три раза быстрее, чем отдельные сперматозоиды. Считается, что образование таких пучков спермы у ехидн является эволюционной адаптацией для поддержания доминирования, поскольку самки неразборчивы в связях и обычно спариваются с несколькими самцами. Поэтому сперматозоиды из разных эякулятов яростно конкурируют за оплодотворение яйцеклетки.
Агглютинированные сперматозоиды кур шаркаси легко визуализировать с помощью фазово-контрастной микроскопии, которая считается выгодной, поскольку позволяет легко изучать поведение сперматозоидов in vitro. Механизм, посредством которого образование пучка сперматозоидов способствует размножению у кур шаркаси, также отличается от того, который наблюдается у некоторых плацентарных млекопитающих, представляющих кооперативное поведение сперматозоидов, таких как лесные мыши, где некоторые сперматозоиды достигают яйцеклеток, помогая другим родственным особям достичь и повредить их яйцеклетки. проявить себя. альтруистическое поведение. Самооплодотворение 34. Другой пример кооперативного поведения сперматозоидов был обнаружен у мышей-оленей, где сперматозоиды смогли идентифицировать и объединиться с наиболее генетически родственными сперматозоидами и образовать кооперативные группы для увеличения своей скорости по сравнению с неродственными сперматозоидами35.
Результаты, полученные в этом исследовании, не противоречат теории Фомана о долгосрочном хранении сперматозоидов в SWS. Исследователи сообщают, что сперматозоиды продолжают двигаться в потоке эпителиальных клеток, выстилающих SST, в течение длительного периода времени, и по истечении определенного периода времени запасы энергии сперматозоидов истощаются, что приводит к снижению скорости, что позволяет вытеснять вещества с малым молекулярным весом. энергии сперматозоидов с потоком жидкости из просвета SST Полость фаллопиевой трубы. В текущем исследовании мы наблюдали, что половина отдельных сперматозоидов продемонстрировала способность плыть против текущих жидкостей, а их адгезия в пучке увеличила их способность демонстрировать положительную реологию. Кроме того, наши данные согласуются с данными Мацузаки и др. 1, которые сообщили, что повышенная секреция лактата в SST может подавлять подвижность резидентных сперматозоидов. Однако наши результаты описывают формирование подвижных связок сперматозоидов и их реологическое поведение в присутствии динамической среды внутри микроканала в попытке выяснить их поведение в SST. Будущие исследования могут быть сосредоточены на определении химического состава и происхождения агглютинирующего агента, что, несомненно, поможет исследователям разработать новые способы хранения жидкой спермы и увеличения продолжительности фертильности.
В качестве доноров спермы в исследовании были отобраны пятнадцать 30-недельных голошейных самцов шаркаси (гомозиготный доминантный; Na Na). Птицы выращивались на исследовательской птицеводческой ферме факультета сельского хозяйства университета Ашит, мухафаза Ашит, Египет. Птиц содержали в индивидуальных клетках (30 x 40 x 40 см), подвергали световой программе (16 часов света и 8 часов темноты) и кормили рационом, содержащим 160 г сырого протеина, 2800 ккал метаболизируемой энергии, 35 г кальция каждая. 5 граммов доступного фосфора на килограмм рациона.
Согласно данным 36, 37, сперма была собрана у самцов путем массажа живота. Всего было собрано 45 образцов спермы у 15 мужчин в течение 3 дней. Сперма (n = 15/день) была немедленно разбавлена ​​1:1 (об:об) с помощью Belsville Poultry Semen Diluent, который содержит дифосфат калия (1,27 г), моногидрат глутамата натрия (0,867 г), фруктозу (0,5 г), безводный ацетат натрия (0,43 г), трис(гидроксиметил)аминометан (0,195 г), моногидрат цитрата калия (0,064 г), монофосфат калия (0,065 г), хлорид магния (0,034 г) и H2O (100 мл), pH = 7,5, осмолярность 333 мОсм/кг38. Разбавленные образцы спермы сначала исследовали под световым микроскопом, чтобы убедиться в хорошем качестве спермы (влажности), а затем хранили в водяной бане при температуре 37°C до использования в течение получаса после сбора.
Кинематика и реология сперматозоидов описаны с использованием системы микрофлюидных устройств. Образцы спермы были дополнительно разбавлены до 1:40 в Beltsville Avian Semen Diluent, загружены в микрофлюидное устройство (см. ниже), и кинетические параметры были определены с использованием системы компьютерного анализа спермы (CASA), ранее разработанной для микрофлюидной характеристики. о подвижности сперматозоидов в жидких средах (Кафедра машиностроения, Факультет инженерии, Университет Асьют, Египет). Плагин можно загрузить по адресу: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Были измерены скорость кривой (VCL, мкм/с), линейная скорость (VSL, мкм/с) и средняя скорость траектории (VAP, мкм/с). Видео сперматозоидов снимали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Optika XDS-3 (с объективом 40x), подключенного к камере Tucson ISH1000 со скоростью 30 кадров в секунду в течение 3 с. Используйте программное обеспечение CASA для изучения не менее трех областей и 500 траекторий сперматозоидов на образец. Записанное видео обрабатывалось с помощью самодельного CASA. Определение подвижности в плагине CASA основано на скорости движения сперматозоидов по сравнению со скоростью потока и не включает другие параметры, такие как движение из стороны в сторону, поскольку было обнаружено, что это более надежно в потоке жидкости. Реологическое движение описывается как движение сперматозоидов против направления потока жидкости. Сперматозоиды с реологическими свойствами делились на количество подвижных сперматозоидов; сперматозоиды, которые находились в состоянии покоя, и сперматозоиды, движущиеся конвективно, исключались из подсчета.
Все используемые химикаты были получены от Elgomhoria Pharmaceuticals (Каир, Египет), если не указано иное. Устройство было изготовлено, как описано El-sherry et al. 40 с некоторыми изменениями. Материалы, используемые для изготовления микроканалов, включали стеклянные пластины (Howard Glass, Вустер, Массачусетс), негативный резист SU-8-25 (MicroChem, Ньютон, Калифорния), диацетоновый спирт (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия) и полиацетон. -184, Dow Corning, Мидленд, Мичиган). Микроканалы изготавливаются с помощью мягкой литографии. Сначала прозрачная защитная маска для лица с желаемым дизайном микроканала была напечатана на принтере с высоким разрешением (Prismatic, Каир, Египет и Pacific Arts and Design, Маркхэм, Онтарио). Мастер-модели были изготовлены с использованием стеклянных пластин в качестве подложек. Пластины очищали в ацетоне, изопропаноле и деионизированной воде, а затем покрывали слоем SU8-25 толщиной 20 мкм методом центрифугирования (3000 об./мин, 1 мин). Затем слои SU-8 осторожно высушивали (65°C, 2 мин и 95°C, 10 мин) и подвергали воздействию УФ-излучения в течение 50 с. Последующее выпекание при 65°C и 95°C в течение 1 мин и 4 мин для сшивания экспонированных слоев SU-8, после чего проявляли в диацетоновом спирте в течение 6,5 мин. Выпекали вафли в суровой печи (200°C в течение 15 мин) для дальнейшего затвердевания слоя SU-8.
PDMS был приготовлен путем смешивания мономера и отвердителя в весовом соотношении 10:1, затем дегазирован в вакуумном эксикаторе и вылит на основную раму SU-8. PDMS был отвержден в печи (120°C, 30 мин), затем каналы были вырезаны, отделены от мастера и перфорированы, чтобы позволить трубкам быть прикрепленными на входе и выходе микроканала. Наконец, микроканалы PDMS были постоянно прикреплены к предметным стеклам микроскопа с помощью портативного коронного процессора (Electro-Technic Products, Чикаго, Иллинойс), как описано в другом месте. Микроканал, используемый в этом исследовании, имеет размеры 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) и 3,6 см в длину.
Поток жидкости, создаваемый гидростатическим давлением внутри микроканала, достигается за счет поддержания уровня жидкости во входном резервуаре выше перепада высот Δh39 в выходном резервуаре (рис. 1).
где f — коэффициент трения, определяемый как f = C/Re для ламинарного течения в прямоугольном канале, где C — константа, зависящая от соотношения сторон канала, L — длина микроканала, Vav — средняя скорость внутри микроканала, Dh — гидравлический диаметр канала, g — ускорение свободного падения. Используя это уравнение, можно рассчитать среднюю скорость канала с помощью следующего уравнения: