Благодарим вас за посещение Nature.com. Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для получения наилучших результатов мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Частицы пористого диоксида кремния были приготовлены золь-гель методом с некоторыми модификациями для получения макропористых частиц. Эти частицы были дериватизированы с помощью полимеризации с обратимой аддитивной фрагментацией с передачей цепи (ОПЦ) с N-фенилмалеимидом-метилвинилизоцианатом (ПМИ) и стиролом для получения стационарной фазы интеркаляции N-фенилмалеимидом полистирола (ПМП). хроматографическая характеристика разделения на колонке PMP смеси пептидов, состоящей из пяти пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) и расщепление сывороточного альбумина человека (HAS) трипсином. 0 тарелок/м². Сравнивая характеристики разделения разработанной колонки с коммерческой колонкой Ascentis Express RP-Amide, было замечено, что эффективность разделения колонки PMP превосходит коммерческую колонку с точки зрения эффективности разделения и разрешения.
В последние годы биофармацевтическая промышленность стала расширяющимся глобальным рынком со значительным увеличением доли рынка. В связи со взрывным ростом биофармацевтической промышленности1,2,3 анализ пептидов и белков очень востребован. Помимо целевого пептида, во время синтеза пептидов образуется несколько примесей, поэтому для получения пептидов желаемой чистоты требуется хроматографическая очистка. одного образца. Хотя масс-спектрометрия является эффективным инструментом для секвенирования пептидов и белков, если такие образцы вводятся в масс-спектрометр за один проход, разделение не будет идеальным. Эту проблему можно смягчить, внедрив разделение с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ) перед МС-анализом, что уменьшит количество аналитов, поступающих в масс-спектрометр в данный момент времени4,5,6. тесты и повышение чувствительности обнаружения МС. Жидкостная хроматография (ЖХ) значительно продвинулась за последнее десятилетие и стала популярным методом протеомного анализа7,8,9,10.
Жидкостная хроматография с обращенной фазой (ОФ-ЖХ) широко используется для очистки и разделения смесей пептидов с использованием октадецил-модифицированного диоксида кремния (ОДС) в качестве неподвижной фазы11,12,13. Однако неподвижные фазы ОФ не обеспечивают удовлетворительного разделения пептидов и белков из-за их сложной структуры и амфифильной природы 14,15. Поэтому для анализа пептидов и белков с полярными и неполярными фрагментами требуются специально разработанные неподвижные фазы Смешанная хроматография, которая обеспечивает мультимодальные взаимодействия, может быть альтернативой ОФ-ЖХ для разделения пептидов, белков и других сложных смесей. Было приготовлено несколько смешанных неподвижных фаз, и колонки, заполненные этими фазами, использовались для разделения пептидов и белков17,18,19,20,21. полярная интеркаляция/RPLC) подходят для разделения пептидов и белков благодаря наличию как полярных, так и неполярных групп22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. Аналогично, полярные интеркалирующие неподвижные фазы с ковалентно связанными полярными группами демонстрируют хорошую разделительную способность и уникальную селективность для полярных и неполярных аналитов, поскольку разделение зависит от взаимодействия между аналитом и неподвижной фазой.Мультимодальные взаимодействия 29, 30, 31, 32. Недавно Zhang et al.30 получили стационарную фазу полиамина с концевой додецилгруппой и успешно разделили углеводороды, антидепрессанты, флавоноиды, нуклеозиды, эстрогены и ряд других аналитов. название колонок Ascentis Express RP-Amide, но эти колонки используются только для анализа амина 33.
В настоящем исследовании была приготовлена ​​и оценена полярная неподвижная фаза (полистирол, залитый N-фенилмалеимидом) для разделения пептидов и трипсиновых гидролизатов HSA. Неподвижная фаза была приготовлена ​​с использованием следующей стратегии. Частицы пористого кремнезема были приготовлены в соответствии с процедурой, описанной в нашей предыдущей публикации, с некоторыми изменениями в протоколе приготовления. Соотношение мочевины, полиэтиленгликоля (ПЭГ), ТМОС, воды и уксусной кислоты было скорректировано для получения частиц кремнезема с большим размером пор. cond, новый лиганд, фенилмалеимид-метилвинилизоцианат, был синтезирован и использован для дериватизации частиц кремнезема для приготовления полярной встроенной стационарной фазы. Полученную стационарную фазу набивали в колонку из нержавеющей стали (100 × 1,8 мм id) с использованием оптимизированной схемы насадки. Набивка колонки сопровождается механической вибрацией, чтобы обеспечить формирование однородного слоя внутри колонки. Оценить разделение насадочной колонки смесей пептидов, состоящих из пяти пептидов;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) и трипсиновый гидролизат человеческого сывороточного альбумина (HAS). Наблюдалось разделение пептидной смеси и трипсинового гидролизата HSA с хорошим разрешением и эффективностью. быть хорошо разрешенными и эффективными на колонке PMP, которая была более эффективной, чем колонка Ascentis Express RP-Amide.
ПЭГ (полиэтиленгликоль), мочевина, уксусная кислота, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, сывороточный альбумин человека (HSA), хлорид аммония, мочевина, гексан-метилдисилазан (HMDS), метакрилоилхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоилпероксид (BPO), ацетонитрил для ВЭЖХ ( ACN), метанол, 2-пропанол и ацетон, приобретенные у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).
Смесь мочевины (8 г), полиэтиленгликоля (8 г) и 8 мл 0,01 н. уксусной кислоты перемешивали в течение 10 минут, а затем к ней добавляли 24 мл ТМОС в условиях охлаждения льдом. Реакционную смесь нагревали при 40°С в течение 6 часов, а затем при 120°С в течение 8 часов в автоклаве из нержавеющей стали. Воду сливали, а остаток сушили при 70°С в течение 12 часов. высушенную мягкую массу измельчали ​​в печи и прокаливали при 550°С в течение 12 часов. Были приготовлены и охарактеризованы три партии для проверки воспроизводимости размера частиц, размера пор и площади поверхности.
Модификацией поверхности частиц диоксида кремния предварительно синтезированным лигандом фенилмалеимид-метилвинилизоцианатом (PCMP) с последующей радиальной полимеризацией со стиролом было получено соединение, содержащее полярную группу.Неподвижная фаза для заполнителей и полистирольных цепей. Процесс приготовления описан ниже.
N-фенилмалеимид (200 мг) и метилвинилизоцианат (100 мг) растворяли в сухом толуоле и добавляли 0,1 мл 2,2'-азоизобутиронитрила (AIBN) в реакционную колбу для получения сополимера фенилмалеимида-метилвинилизоцианата (PMCP). Смесь нагревали при 60°C в течение 3 часов, фильтровали и сушили в печи при 40°C в течение 3 часа.
Сухие частицы кремнезема (2 г) диспергировали в сухом толуоле (100 мл), перемешивали и обрабатывали ультразвуком в круглодонной колбе на 500 мл в течение 10 мин. ПМСР (10 мг) растворяли в толуоле и по каплям добавляли в реакционную колбу через капельную воронку. Частицы CP-связанного диоксида кремния (100 г) растворяли в толуоле (200 мл) и добавляли 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) в присутствии 100 мкл дилаурата дибутилолова в качестве катализатора. Смесь перемешивали при 50°C в течение 8 часов, фильтровали и сушили при 50°C в течение 3 часов.
Стирол (1 мл), бензоилпероксид БПО (0,5 мл) и частицы кремнезема, присоединенные к ТЕМПО-ПМСР (1,5 г), диспергировали в толуоле и продували азотом. Полимеризацию стирола проводили при 100°С в течение 12 часов. Полученный продукт промывали метанолом и сушили при 60°С в течение ночи. Общая схема реакции представлена ​​на рис. 1.
Образцы дегазировали при 393 К в течение 1 часа, чтобы получить остаточное давление менее 10-3 Торр. Количество азота, адсорбированного при относительном давлении P/P0 = 0,99, использовали для определения общего объема пор. алюминиевую колонку с использованием клейкой углеродной ленты. На образцы наносили золото с помощью устройства для напыления Q150T, а на образцы наносили слой Au толщиной 5 нм. Это повышает эффективность процесса при низком напряжении и обеспечивает мелкозернистое холодное напыление. распределение частиц по размерам. Частицы диоксида кремния без покрытия и частицы диоксида кремния, связанные с лигандом (по 5 мг каждый) диспергировали в 5 мл изопропанола, обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут, встряхивали в течение 5 минут и помещали на оптическую скамью Mastersizer. Термогравиметрический анализ проводили со скоростью 5 ° C в минуту в диапазоне температур от 30 до 800 ° C.
Футерованные стекловолокном колонны с узким отверстием из нержавеющей стали размером (100 × 1,8 мм в диаметре) набивали методом набивки суспензией, применяя ту же процедуру, что и в работе.31. Колонна из нержавеющей стали (стеклянная, внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) с выходным патрубком, содержащим фритту 1 мкм, была соединена с пакером для суспензии (Alltech Deerfield, IL, USA). Приготовили суспензию неподвижной фазы путем суспендирования 150 мг неподвижной фазы в 1,2 мл метанола и отправили ее в накопительную колонку. Метанол использовали в качестве растворителя суспензии, а также в качестве проталкивающего растворителя. колонку последовательно, применяя давление 100 МПа в течение 10 минут, 80 МПа в течение 15 минут и 60 МПа в течение 30 минут. Во время набивки применялась механическая вибрация с помощью двух встряхивателей колонок GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) для обеспечения равномерной набивки колонки. Система LC для проверки ее работоспособности.
Насос для ЖХ (10AD Shimadzu, Япония), инжектор (Valco (США) C14 W.05) с петлей ввода 50 нл, мембранный дегазатор (Shimadzu DGU-14A), капиллярное окно для УФ-видимого излучения. Был сконструирован специальный детектор устройства для микроЖХ (UV-2075) и микроколонки со стеклянным покрытием. Используйте очень узкие и короткие соединительные трубки, чтобы свести к минимуму эффект расширения полосы дополнительной колонки. Внутренний диаметр 365 мкм и капилляры переходного патрубка (50 мкм) были установлены на выходе 1/16″ переходного патрубка. Сбор данных и хроматографическая обработка проводились с использованием программного обеспечения Multichro 2000. Мониторинг при 254 нм Аналиты тестировали на УФ-поглощение. Хроматографические данные анализировали с помощью OriginPro8 (Нортгемптон, Массачусетс).
Альбумин из сыворотки крови человека, лиофилизированный порошок, ≥ 96% (электрофорез в агарозном геле) 3 мг, смешанный с трипсином (1,5 мг), 4,0 М мочевиной (1 мл) и 0,2 М бикарбонатом аммония (1 мл). хранить при температуре ниже 4 ° C.
Разделение смесей пептидов и трипсиновых гидролизатов ЧСА оценивали отдельно на колонках PMP. Проверьте разделение пептидной смеси и трипсиновых гидролизатов ЧСА на колонке PMP и сравните результаты с результатами на колонке Ascentis Express RP-Amide. Теоретическое количество тарелок рассчитывается следующим образом:
СЭМ-изображения частиц диоксида кремния без покрытия и частиц диоксида кремния, связанных лигандом, показаны на фиг.2 СЭМ-изображения частиц чистого кремнезема (A, B) показывают, что, в отличие от наших предыдущих исследований, эти частицы имеют сферическую форму, в которой частицы вытянуты или имеют неправильную симметрию. Поверхность частиц кремнезема, связанных лигандом (C, D), более гладкая, чем у частиц чистого кремнезема, что может быть связано с покрытием цепочек полистирола на поверхности частиц кремнезема.
Изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа чистых частиц кремнезема (A, B) и частиц кремнезема, связанных лигандом (C, D).
Распределение размеров частиц чистого кремнезема и частиц кремнезема, связанных с лигандом, показано на рисунке 3 (A). Кривые объемного распределения частиц по размерам показали, что размер частиц кремнезема увеличился после химической модификации (рис. 3A). Данные о распределении частиц кремнезема по размерам из текущего исследования и предыдущего исследования сравниваются в таблице 1 (A). Объемный размер частиц d (0,5) PMP составляет 3,36 мкм по сравнению с нашим предыдущим исследованием с ad (0,5) значение 3,05 мкм (частицы диоксида кремния, связанные с полистиролом)34. Эта партия имела более узкое распределение частиц по размерам по сравнению с нашим предыдущим исследованием из-за различных соотношений ПЭГ, мочевины, ТМОС и уксусной кислоты в реакционной смеси. Размер частиц фазы ПМП немного больше, чем размер частиц фазы частиц диоксида кремния, связанных с полистиролом, который мы исследовали ранее. 0,97 мкм) на поверхности кремнезема, тогда как в фазе ПМП толщина слоя составляла 1,38 мкм.
Распределение размера частиц (A) и распределение размера пор (B) частиц чистого кремнезема и частиц кремнезема, связанных лигандом.
Размер пор, объем пор и площадь поверхности частиц кремнезема в текущем исследовании приведены в таблице 1 (B). Профили PSD частиц чистого кремнезема и частиц кремнезема, связанных с лигандом, показаны на рисунке 3 (B). Результаты сопоставимы с результатами нашего предыдущего исследования. Кривая показана на рис. 3(Б). Аналогичным образом, объем пор частиц кремнезема после химической модификации уменьшился с 0,67 до 0,58 см3/г. Удельная поверхность изучаемых в настоящее время частиц кремнезема составляет 116 м2/г, что сравнимо с нашим предыдущим исследованием (124 м2/г). 5 м2/г после химической модификации.
Результаты элементного анализа стационарной фазы представлены в табл. 2. Содержание углерода в текущей неподвижной фазе составляет 6,35 %, что ниже, чем содержание углерода в нашем предыдущем исследовании (частицы диоксида кремния, связанные полистиролом, 7,93 %35 и 10,21 % соответственно) Использовали ид-метилвинилизоцианат (PCMP) и 4-гидрокси-TEMPO. Весовой процент азота в текущей неподвижной фазе составляет 2,21% по сравнению с 0,1735 и 0,85 вес.% азота в предыдущих исследованиях, соответственно. Это означает, что весовой процент азота выше в текущей неподвижной фазе из-за фенилмалеимида. , соответственно, в то время как загрузка углеродом конечного продукта (6) составляла 6,35%, как показано в таблице 2. Потеря массы была проверена с неподвижной фазой ПМП, и кривая ТГА показана на рисунке 4. Кривая ТГА показывает потерю массы 8,6%, что хорошо согласуется с загрузкой углерода (6,35%), поскольку лиганды содержат не только C, но также N, O и H.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцианатный лиганд был выбран для модификации поверхности частиц кремнезема, поскольку он имеет полярные фенилмалеимидные группы и винилизоцианатные группы. Винилизоцианатные группы могут в дальнейшем реагировать со стиролом путем живой радикальной полимеризации. Вторая причина заключается в том, чтобы вставить группу, которая имеет умеренное взаимодействие с аналитом и не имеет сильного электростатического взаимодействия между аналитом и неподвижной фазой, поскольку фенилмалеимидный фрагмент не имеет виртуального заряда при нормальном pH. .Полярность стационарной фазы можно контролировать с помощью оптимального количества стирола и времени реакции свободнорадикальной полимеризации. Последний этап реакции (радикальная полимеризация) является критическим и может изменить полярность неподвижной фазы. Для проверки содержания углерода в этих неподвижных фазах был проведен элементный анализ. различные загрузки углерода. Опять же, загрузите эти неподвижные фазы в колонки из нержавеющей стали и проверьте их хроматографические характеристики (селективность, разрешение, значение N и т. д.). На основании этих экспериментов был выбран оптимизированный состав для приготовления неподвижной фазы PMP, чтобы обеспечить контролируемую полярность и хорошее удерживание аналита.
Смеси пяти пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) также оценивали с использованием колонки PMP с использованием подвижной фазы;60/40 (об./об.) ацетонитрил/вода (0,1% ТФУ) при скорости потока 80 мкл/мин. При оптимальных условиях элюирования теоретическое количество тарелок (N) на колонку (100 × 1,8 мм внутр. диаметра) составляет 20 000 ± 100 (200 000 тарелок/м²). В таблице 3 приведены значения N для трех колонок PMP, а хроматограммы показаны на рисунке. 5A. Быстрый анализ на колонке PMP при высокой скорости потока (700 мкл/мин), пять пептидов были элюированы в течение одной минуты, значения N были очень хорошими, 13 500 ± 330 на колонку (100 × 1,8 мм id), что соответствует 135 000 тарелок/м (рис. 5B). Три колонки одинакового размера (100 × 1,8 мм id) были заполнены тремя разными партиями P Стационарная фаза MP для проверки воспроизводимости. Концентрация аналита для каждой колонки была записана с использованием оптимальных условий элюирования, количества теоретических тарелок N и времени удерживания для разделения одной и той же тестируемой смеси на каждой колонке. Данные воспроизводимости для колонок PMP показаны в таблице 4. Воспроизводимость колонки PMP хорошо коррелирует с очень низкими значениями %RSD, как показано в таблице 3.
Разделение смеси пептидов на колонке PMP (B) и колонке Ascentis Express RP-Amide (A);подвижная фаза 60/40 ACN/H2O (ТФУ 0,1%), размеры колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм);аналитический Порядок элюирования соединений: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(лейциновый кислый энкефалин)).
Колонка PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) была оценена для разделения триптических гидролизатов сывороточного альбумина человека с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматограмма на рис. 6 показывает, что образец хорошо разделен и разрешение очень хорошее. Гидролизы HSA анализировали с использованием скорости потока 100 мкл/мин, подвижной фазы 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% ТФУ. Расщепление SA было разделено на 17 пиков, соответствующих 17 пептидам. Была рассчитана эффективность разделения каждого пика в расщеплении HSA, и значения приведены в таблице 5.
Триптический гидролизат HSA (100 × 1,8 мм в диаметре) разделяли на колонке PMP;скорость потока (100 мкл/мин), подвижная фаза 60/40 ацетонитрил/вода с 0,1% ТФУ.
где L — длина колонки, η — вязкость подвижной фазы, ΔP — противодавление в колонке, u — линейная скорость подвижной фазы. Проницаемость колонки ПМП составляла 2,5 × 10–14 м2, скорость потока — 25 мкл/мин, использовалось 60/40 об./об. АЦН/вода. Проницаемость колонки ПМП (100 × 1,8 мм внутр. предыдущее исследование Ref.34. Проницаемость колонки, заполненной поверхностно пористыми частицами, составляет: 1,7 × 10–15 для частиц размером 1,3 мкм, 3,1 × 10–15 для частиц размером 1,7 мкм, 5,2 × 10–15 и 2,5 × 10–14 м2 для частиц размером 2,6 мкм. Для частиц размером 5 мкм 43. Следовательно, проницаемость P Фаза MP аналогична фазе частиц ядро-оболочка размером 5 мкм.
где Wx — вес колонки, заполненной хлороформом, Wy — вес колонки, заполненной метанолом, а ρ — плотность растворителя. Плотности метанола (ρ = 0,7866) и хлороформа (ρ = 1,484). 0,63 и 0,55 соответственно. Это означает, что присутствие мочевинных лигандов снижает проницаемость неподвижной фазы. С другой стороны, общая пористость колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) составляет 0,60. Проницаемость колонок PMP ниже, чем у колонок, заполненных частицами кремнезема, связанными С18, потому что в стационарных фазах типа С18 лиганды С18 присоединены к частицам кремнезема в виде линейных цепочек. , тогда как в стационарных фазах типа полистирола вокруг нее образуется относительно толстый полимерный слой. В типичном эксперименте пористость колонки рассчитывается как:
На рис. 7A, B показаны колонка PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) и колонка Ascentis Express RP-Amide (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) с использованием одинаковых условий элюирования (т. е. 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA).) графика ван Деемтера.Выбранные смеси пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) готовили в объеме 20 мкл/. Минимальная скорость потока для обеих колонок составляет 800 мкл/мин. Минимальные значения HETP при оптимальной скорости потока (80 мкл/мин) для колонки PMP и Ascentis Express RP-Am ide составляли 2,6 мкм и 3,9 мкм соответственно. Значения HETP показывают, что эффективность разделения колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) намного выше, чем у имеющейся в продаже колонки Ascentis Express RP-Amide (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм). График Ван Деемтера на рис. колонка PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) по сравнению с колонкой Ascentis Express RP-Amide основана на улучшении формы и размера частиц и сложных процедурах упаковки колонки, используемых в текущей работе34.
(A) График Ван Деемтера (HETP в зависимости от линейной скорости подвижной фазы), полученный с использованием колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) в 60/40 ACN/H2O с 0,1% TFA. (B) График Ван Деемтера (HETP в зависимости от линейной скорости подвижной фазы), полученный с использованием колонки Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм в диаметре) в 60/40 ACN/H2O с 0,1 % ТФУ.
Стационарная фаза из полистирола с полярной заливкой была приготовлена ​​и оценена для разделения смесей синтетических пептидов и трипсиновых гидролизатов человеческого сывороточного альбумина (HAS) в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматографические характеристики колонок PMP для смесей пептидов превосходны по эффективности разделения и разрешению. , низкое противодавление колонки при высоких скоростях потока является еще одним преимуществом этой стационарной фазы. Колонки PMP демонстрируют хорошую воспроизводимость и могут использоваться для анализа смесей пептидов и трипсинового расщепления различных белков. Мы намерены использовать эту колонку для разделения натуральных продуктов, биоактивных соединений из лекарственных растений и экстрактов грибов в жидкостной хроматографии. В будущем колонки PMP также будут оцениваться для разделения белков и моноклональных антител.
Филд, Дж. К., Оуэрби, М. Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов с помощью хроматографии с обращенной фазой, часть I: Разработка протокола характеристики колонки.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Улучшенные активные пептиды, разработанные для лечения инфекционных заболеваний. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.
Влиге П., Лисовски В., Мартинес Дж. и Хрещатиски М. Синтетические терапевтические пептиды: наука и рынок. Открытие лекарств. 15 (1–2) сегодня, 40–56.
Се, Ф., Смит, Р.Д. и Шен, Ю. Усовершенствованная протеомная жидкостная хроматография.Хроматография. А 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Усовершенствованная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия позволяет использовать широко направленные методы метаболомики и протеомики.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. и Солсбери, Дж.Дж. Роль УВЭЖХ в разработке лекарств.Сентябрь Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. и Клаузен, А. М. Фундаментальные и практические аспекты жидкостной хроматографии сверхвысокого давления для быстрого разделения.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. и Челищефф, П. Применение сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии при разработке лекарств.Хроматография. 1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Монолитные макропористые гидрогели, приготовленные из эмульсий масло-в-воде с высокой внутренней фазой для эффективной очистки энтеровирусов.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. и Уилкинс, Дж. А. Роль жидкостной хроматографии в протеомике.Хроматография. А 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veutey, J.-L. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дали, А.Э. и Геблер, Дж. К. Двумерное разделение пептидов с использованием системы ОФ-ОФ-ВЭЖХ с использованием различных значений рН в первом и втором измерениях разделения.Сентябрь Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. и др. Были исследованы характеристики массопереноса и кинетические характеристики высокоэффективных хроматографических колонок, заполненных полностью и поверхностно пористыми частицами С18 размером менее 2 мкм.Сентябрь Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Последние тенденции и аналитические проблемы в выделении, идентификации и валидации биоактивных пептидов растений. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж. Б. и др. Протеомный ландшафт царства жизни. Природа 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Последующая обработка терапевтических пептидов с помощью препаративной жидкостной хроматографии. Molecule (Базель, Швейцария) 26 (15), 4688 (2021).
Ян, Ю. и Гэн, X. Хроматография смешанного режима и ее применение к биополимерам.Хроматография. А 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао Г., Донг X.-Y. и Сун Ю. Лиганды для смешанной хроматографии белков: принцип, характеристика и дизайн.Биотехнология. 144(1), 3-11 (2009).