Благодарим вас за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшей работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Пористые частицы кремнезема были получены методом золь-гель с некоторыми модификациями для получения макропористых частиц. Эти частицы были дериватизированы полимеризацией с обратимой фрагментацией цепи (RAFT) с N-фенилмалеимидом-метилвинилизоцианатом (PMI) и стиролом для получения интеркаляции N-фенилмалеимида полистирола (PMP) в качестве неподвижной фазы. Узкие колонки из нержавеющей стали (100 × 1,8 мм id) были заполнены суспензионной насадкой. Оценено разделение на колонке PMP пептидной смеси, состоящей из пяти пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) (хроматографическая эффективность) и трипсиновое расщепление человеческого сывороточного альбумина (HAS). При оптимальных условиях элюирования теоретическое количество тарелок пептидной смеси достигает 280 000 тарелок/м². Сравнивая эффективность разделения разработанной колонки с коммерческой колонкой Ascentis Express RP-Amide, было отмечено, что эффективность разделения колонки PMP превосходит эффективность разделения коммерческой колонки с точки зрения эффективности разделения и разрешения.
В последние годы биофармацевтическая промышленность превратилась в расширяющийся глобальный рынок со значительным увеличением доли рынка. В связи с взрывным ростом биофармацевтической промышленности1,2,3 анализ пептидов и белков становится все более востребованным. Помимо целевого пептида, во время синтеза пептидов образуется несколько примесей, поэтому для получения пептидов желаемой чистоты требуется хроматографическая очистка. Анализ и характеристика белков в биологических жидкостях, тканях и клетках является чрезвычайно сложной задачей из-за большого количества потенциально обнаруживаемых видов в одном образце. Хотя масс-спектрометрия является эффективным инструментом для секвенирования пептидов и белков, если такие образцы вводятся в масс-спектрометр за один проход, разделение не будет идеальным. Эту проблему можно смягчить, внедрив жидкостную хроматографию (ЖХ) разделения перед масс-спектрометрическим анализом, что позволит сократить количество аналитов, поступающих в масс-спектрометр в заданное время4,5,6. Кроме того, во время разделения жидкой фазы аналиты могут быть сосредоточены в узких областях, тем самым концентрируя эти аналиты и повышение чувствительности обнаружения масс-спектрометрии. Жидкостная хроматография (ЖХ) значительно усовершенствовалась за последнее десятилетие и стала популярным методом в протеомном анализе7,8,9,10.
Обращенно-фазовая жидкостная хроматография (RP-LC) широко используется для очистки и разделения смесей пептидов с использованием октадецил-модифицированного силикагеля (ODS) в качестве неподвижной фазы11,12,13. Однако неподвижные фазы RP не обеспечивают удовлетворительного разделения пептидов и белков из-за их сложной структуры и амфифильной природы14,15. Поэтому для анализа пептидов и белков с полярными и неполярными группами требуются специально разработанные неподвижные фазы для взаимодействия с этими аналитами и их удержания16. Смешанная хроматография, которая обеспечивает мультимодальные взаимодействия, может быть альтернативой RP-LC для разделения пептидов, белков и других сложных смесей. Было подготовлено несколько смешанных неподвижных фаз, и колонки, заполненные этими фазами, использовались для разделения пептидов и белков17,18,19,20,21. Смешанные неподвижные фазы (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярная интеркаляция/RPLC) подходят для разделения пептидов и белков из-за наличия как полярных, так и неполярных групп22,23,24,25,26,27,28. Аналогично, полярные интеркалирующие неподвижные фазы с ковалентно связанными полярными группами демонстрируют хорошую разделительную способность и уникальную селективность для полярных и неполярных аналитов, поскольку разделение зависит от взаимодействия между аналитом и неподвижной фазой. Мультимодальные взаимодействия29, 30, 31, 32. Недавно Чжан и др. 30 подготовили неподвижную фазу полиамина с додецильным окончанием и успешно разделили углеводороды, антидепрессанты, флавоноиды, нуклеозиды, эстрогены и несколько других аналитов. Полярный интеркалятор имеет как полярные, так и неполярные группы, поэтому его можно использовать для разделения пептидов и белков, имеющих как гидрофобные, так и гидрофильные фрагменты. Полярно-встроенные колонки (например, колонки C18 с амидным окончанием) коммерчески доступны под торговым наименованием колонок Ascentis Express RP-Amide, но эти колонки используются только для анализа амина 33.
В текущем исследовании была подготовлена ​​и оценена полярно-встроенная неподвижная фаза (полистирол, вставленный в N-фенилмалеимид) для разделения пептидов и трипсиновых гидролизатов HSA. Неподвижная фаза была подготовлена ​​с использованием следующей стратегии. Пористые частицы кремнезема были подготовлены в соответствии с процедурой, приведенной в нашей предыдущей публикации, с некоторыми изменениями в протоколе приготовления. Соотношение мочевины, полиэтиленгликоля (ПЭГ), ТМОС, воды и уксусной кислоты было скорректировано для приготовления частиц кремнезема с большим размером пор. Во-вторых, был синтезирован новый лиганд, фенилмалеимид-метилвинилизоцианат, и использован для дериватизации частиц кремнезема для приготовления полярно-встроенной неподвижной фазы. Полученная неподвижная фаза была упакована в колонку из нержавеющей стали (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) с использованием оптимизированной схемы упаковки. Упаковке колонки способствовала механическая вибрация для обеспечения образования однородного слоя внутри колонки. Оценить разделение набивной колонкой пептидных смесей, состоящих из пяти пептидов; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) и трипсиновый гидролизат человеческого сывороточного альбумина (HAS). Было обнаружено, что пептидная смесь и трипсиновый гидролизат HSA разделяются с хорошим разрешением и эффективностью. Эффективность разделения колонки PMP сравнивали с эффективностью колонки Ascentis Express RP-Amide. Было обнаружено, что как пептиды, так и белки хорошо разделяются и эффективно разделяются на колонке PMP, которая была более эффективной, чем колонка Ascentis Express RP-Amide.
ПЭГ (полиэтиленгликоль), мочевина, уксусная кислота, триметоксиортосиликат (ТМОС), триметилхлорсилан (ТМХС), трипсин, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), хлорид аммония, мочевина, гексанметилдисилазан (ГМДС), метакрилоилхлорид (МХ), стирол, 4-гидрокси-ТЕМПО, перекись бензоила (БПО), ацетонитрил класса ВЭЖХ (ACN), метанол, 2-пропанол и ацетон, приобретенные у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, шт. Миссури, США).
Смесь мочевины (8 г), полиэтиленгликоля (8 г) и 8 мл 0,01 N уксусной кислоты перемешивали в течение 10 минут, а затем добавляли 24 мл ТМОС в условиях охлаждения льдом. Реакционную смесь нагревали при 40 °C в течение 6 часов, а затем при 120 °C в течение 8 часов в автоклаве из нержавеющей стали. Воду сливали, а остаточный материал высушивали при 70 °C в течение 12 часов. Высушенную мягкую массу гладко измельчали ​​в печи и прокаливали при 550 °C в течение 12 часов. Были приготовлены и охарактеризованы три партии для изучения воспроизводимости размера частиц, размера пор и площади поверхности.
Путем поверхностной модификации частиц кремнезема предварительно синтезированным лигандом фенилмалеимид-метилвинилизоцианатом (PCMP) с последующей радиальной полимеризацией со стиролом было получено соединение, содержащее полярную группу. Стационарная фаза для агрегатов и цепей полистирола. Процесс приготовления описан ниже.
N-фенилмалеимид (200 мг) и метилвинилизоцианат (100 мг) растворяли в сухом толуоле и добавляли в реакционную колбу 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрила (AIBN) для приготовления сополимера фенилмалеимида и метилвинилизоцианата (PMCP). Смесь нагревали при температуре 60 °C в течение 3 часов, фильтровали и сушили в печи при температуре 40 °C в течение 3 часов.
Высушенные частицы кремнезема (2 г) диспергировали в сухом толуоле (100 мл), перемешивали и обрабатывали ультразвуком в круглодонной колбе объемом 500 мл в течение 10 мин. PMCP (10 мг) растворяли в толуоле и добавляли по каплям в реакционную колбу через капельную воронку. Смесь кипятили с обратным холодильником при 100 °C в течение 8 часов, фильтровали, промывали ацетоном и сушили при 60 °C в течение 3 часов. Затем связанные с PMCP частицы кремнезема (100 г) растворяли в толуоле (200 мл) и добавляли 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) в присутствии 100 мкл дибутилоловодилаурата в качестве катализатора. Смесь перемешивали при 50 °C в течение 8 часов, фильтровали и сушили при 50 °C в течение 3 часов.
Стирол (1 мл), бензоилпероксид BPO (0,5 мл) и частицы кремнезема, прикрепленные к TEMPO-PMCP (1,5 г), диспергировали в толуоле и продували азотом. Полимеризацию стирола проводили при 100°C в течение 12 часов. Полученный продукт промывали метанолом и сушили при 60°C в течение ночи. Общая схема реакции представлена ​​на рисунке 1.
Образцы дегазировали при 393 К в течение 1 часа для получения остаточного давления менее 10-3 Торр. Количество N2, адсорбированного при относительном давлении P/P0 = 0,99, использовалось для определения общего объема пор. Морфология голых и лигандно-связанных частиц кремния была исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). Высушенные образцы (голый кремний и лигандно-связанные частицы кремния) были помещены на алюминиевую колонку с помощью клейкой углеродной ленты. Золото было нанесено на образцы с помощью распылительного устройства Q150T, и на образцы был нанесен слой Au толщиной 5 нм. Это повышает эффективность процесса при использовании низких напряжений и обеспечивает мелкозернистое холодное напыление. Для элементного анализа использовался элементный анализатор Flash EA1112 Thermo Electron (Waltham, MA, USA). Для получения распределение размеров частиц. Частицы чистого кремнезема и частицы кремнезема, связанные с лигандами (по 5 мг каждая), диспергировали в 5 мл изопропанола, обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин, встряхивали в течение 5 мин и помещали на оптическую скамью Mastersizer. Термогравиметрический анализ проводили со скоростью 5 °C в минуту в диапазоне температур от 30 до 800 °C.
Узкие колонки из нержавеющей стали с эмалированным покрытием и размерами (100 × 1,8 мм внутр. диаметр) были заполнены методом набивки суспензией с применением той же процедуры, что и в работе [1]. 31. Колонка из нержавеющей стали (эмалированная, 100 × 1,8 мм id) с выходным фитингом, содержащим фритту 1 мкм, была присоединена к уплотнителю суспензии (Alltech Deerfield, IL, США). Подготовьте суспензию неподвижной фазы, суспендировав 150 мг неподвижной фазы в 1,2 мл метанола, и отправьте ее в колонку для хранения. Метанол использовался в качестве растворителя суспензии, а также в качестве пропеллента. Последовательно заполните колонку, применяя давление 100 МП в течение 10 минут, 80 МП в течение 15 минут и 60 МП в течение 30 минут. Во время упаковки применялась механическая вибрация с помощью двух шейкеров колонок ГХ (Alltech, Deerfield, IL, США), чтобы обеспечить равномерную упаковку колонки. Закройте упаковщик суспензии и медленно сбросьте давление, чтобы предотвратить повреждение внутри колонки. Отсоедините колонку от насадки суспензии. блок и подключите другой фитинг к входу и к системе LC, чтобы проверить его производительность.
Были сконструированы насос для жидкостной хроматографии (10AD Shimadzu, Япония), инжектор (Valco (США) C14 W.05) с петлей для ввода пробы 50 нл, мембранный дегазатор (Shimadzu DGU-14A), капиллярное окно UV-VIS, специальный детектор устройства µLC (UV-2075) и эмалированные микроколонки. Используйте очень узкие и короткие соединительные трубки, чтобы свести к минимуму эффект дополнительного расширения полосы колонки. После упаковки капилляры (50 мкм, внутренний диаметр 365) и капилляры редукционного соединения (50 мкм) были установлены на выходе 1/16″ редукционного соединения. Сбор данных и хроматографическая обработка проводились с использованием программного обеспечения Multichro 2000. Мониторинг при 254 нм. Аналиты были проверены на поглощение УФ-излучения. Хроматографические данные были проанализированы с помощью OriginPro8 (Нортгемптон, Массачусетс).
Альбумин из сыворотки человека, лиофилизированный порошок, ≥ 96% (электрофорез в агарозном геле), 3 мг, смешанный с трипсином (1,5 мг), 4,0 М мочевиной (1 мл) и 0,2 М бикарбонатом аммония (1 мл). Раствор перемешивали в течение 10 минут и выдерживали на водяной бане при температуре 37 °C в течение 6 часов, затем гасили 1 мл 0,1% ТФУ. Отфильтруйте раствор и храните при температуре ниже 4 °C.
Разделение пептидных смесей и трипсиновых гидролизатов HSA оценивали отдельно на колонках PMP. Проверьте разделение пептидной смеси и трипсинового гидролизата HSA на колонке PMP и сравните результаты с колонкой Ascentis Express RP-Amide. Теоретическое число тарелок рассчитывается следующим образом:
Снимки СЭМ голых частиц кремния и частиц кремния, связанных с лигандами, показаны на ФИГ. 2. Снимки СЭМ голых частиц кремния (A, B) показывают, что, в отличие от наших предыдущих исследований, эти частицы являются сферическими, в которых частицы вытянуты или имеют нерегулярную симметрию. Поверхность частиц кремния, связанных с лигандами (C, D), более гладкая, чем у голых частиц кремния, что может быть связано с покрытием полистирольных цепей на поверхности частиц кремния.
Изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, чистых частиц кремния (A, B) и частиц кремния, связанных лигандами (C, D).
Распределение размеров частиц для чистых частиц кремнезема и частиц кремнезема, связанных с лигандами, показано на рисунке 3(A). Кривые распределения размеров частиц на основе объема показали, что размер частиц кремнезема увеличился после химической модификации (рис. 3A). Данные распределения размеров частиц кремнезема из текущего и предыдущего исследований сравниваются в таблице 1(A). Объемный размер частиц, d(0,5), PMP составляет 3,36 мкм по сравнению с нашим предыдущим исследованием со значением ad(0,5) 3,05 мкм (частицы кремнезема, связанные с полистиролом)34. Эта партия имела более узкое распределение размеров частиц по сравнению с нашим предыдущим исследованием из-за различных соотношений ПЭГ, мочевины, ТМОС и уксусной кислоты в реакционной смеси. Размер частиц фазы PMP немного больше, чем у фазы частиц кремнезема, связанных с полистиролом, которую мы изучали ранее. Это означает, что поверхностная функционализация частиц кремнезема стиролом привела только к осаждению слоя полистирола. (0,97 мкм) на поверхности кремнезема, тогда как в фазе ПМП толщина слоя составила 1,38 мкм.
Распределение размеров частиц (A) и распределение размеров пор (B) чистых частиц кремнезема и частиц кремнезема, связанных с лигандами.
Размер пор, объем пор и площадь поверхности частиц кремния текущего исследования приведены в Таблице 1(B). Профили PSD голых частиц кремния и частиц кремния, связанных с лигандом, показаны на Рисунке 3(B). Результаты сопоставимы с нашим предыдущим исследованием. Размеры пор голых и связанных с лигандом частиц кремния составляют 310 и 241 соответственно, что указывает на то, что размер пор уменьшается на 69 после химической модификации, как показано в Таблице 1(B), а изменение кривой показано на Рис. 3(B). Аналогичным образом, объем пор частиц кремния уменьшился с 0,67 до 0,58 см3/г после химической модификации. Удельная площадь поверхности изучаемых в настоящее время частиц кремния составляет 116 м2/г, что сопоставимо с нашим предыдущим исследованием (124 м2/г). Как показано в Таблице 1(B), площадь поверхности (м2/г) частиц кремния также уменьшилась с 116 м2/г до 105 м2/г после химической модификации.
Результаты элементного анализа неподвижной фазы показаны в таблице 2. Содержание углерода в текущей неподвижной фазе составляет 6,35%, что ниже содержания углерода в нашем предыдущем исследовании (частицы кремнезема, связанные с полистиролом, 7,93%35 и 10,21% соответственно) 42. Содержание углерода в текущей неподвижной фазе низкое, поскольку при получении текущей СП, помимо стирола, использовались некоторые полярные лиганды, такие как фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) и 4-гидрокси-TEMPO. Массовый процент азота в текущей неподвижной фазе составляет 2,21% по сравнению с 0,1735 и 0,85% по весу азота в предыдущих исследованиях соответственно. Это означает, что массовый процент азота в текущей неподвижной фазе выше из-за фенилмалеимида. Аналогично, содержание углерода в продуктах (4) и (5) составляло 2,7% и 2,9% соответственно, в то время как содержание углерода в конечном продукте (6) составила 6,35%, как показано в Таблице 2. Потеря веса была проверена с помощью неподвижной фазы PMP, а кривая ТГА показана на Рисунке 4. Кривая ТГА показывает потерю веса 8,6%, что хорошо согласуется с содержанием углерода (6,35%), поскольку лиганды содержат не только C, но также N, O и H.
Лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат был выбран для модификации поверхности частиц кремнезема, поскольку он имеет полярные фенилмалеимидные группы и винилизоцианатные группы. Винилизоцианатные группы могут далее реагировать со стиролом путем живой радикальной полимеризации. Вторая причина заключается в том, чтобы вставить группу, которая имеет умеренное взаимодействие с аналитом и не имеет сильного электростатического взаимодействия между аналитом и неподвижной фазой, поскольку фрагмент фенилмалеимида не имеет виртуального заряда при нормальном pH. Полярность неподвижной фазы можно контролировать оптимальным количеством стирола и временем реакции свободнорадикальной полимеризации. Последний этап реакции (свободнорадикальная полимеризация) является критическим и может изменить полярность неподвижной фазы. Элементный анализ был проведен для проверки загрузки углерода этих неподвижных фаз. Было отмечено, что увеличение количества стирола и времени реакции увеличивает загрузку углерода неподвижной фазы и наоборот. SP, приготовленные с различными концентрациями стирола, имеют различные загрузки углерода. Опять же, загрузите эти неподвижные фазы в колонки из нержавеющей стали и проверьте их хроматографические характеристики (селективность, разрешение, значение N и т. д.). На основании этих экспериментов была выбрана оптимизированная формула для приготовления неподвижной фазы PMP, обеспечивающая контролируемую полярность и хорошее удерживание аналита.
Пять смесей пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) также были оценены с использованием колонки PMP с использованием подвижной фазы; 60/40 (об./об.) ацетонитрил/вода (0,1% ТФУ) при скорости потока 80 мкл/мин. При оптимальных условиях элюирования теоретическое число тарелок (N) на колонку (100 × 1,8 мм id) составляет 20 000 ± 100 (200 000 тарелок/м²). В таблице 3 приведены значения N для трех колонок PMP, а хроматограммы показаны на рисунке 5A. Быстрый анализ на колонке PMP при высокой скорости потока (700 мкл/мин), пять пептидов были элюированы в течение одной минуты, значения N были очень хорошими, 13 500 ± 330 на колонку (100 × 1,8 мм id), что соответствует 135 000 тарелок/м (рисунок 5B). Три колонки одинакового размера (100 × 1,8 мм id) были заполнены тремя различными партиями неподвижной фазы PMP для проверки воспроизводимости. Концентрация аналита для каждой колонки была записана с использованием оптимальных условий элюирования, числа теоретических тарелок N и времени удерживания для разделения одной и той же тестовой смеси на каждой колонке. Данные о воспроизводимости для колонок PMP показаны в Таблице 4. Воспроизводимость колонки PMP хорошо коррелирует с очень низкими значениями %RSD, как показано в Таблице 3.
Разделение пептидной смеси на колонке PMP (B) и колонке Ascentis Express RP-Amide (A); подвижная фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), размеры колонки PMP (100 × 1,8 мм id); аналитический порядок элюирования соединений: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(лейцин) кислота энкефалин)).
Колонка PMP (100 × 1,8 мм id) была оценена для разделения триптических гидролизатов человеческого сывороточного альбумина в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматограмма на рисунке 6 показывает, что образец хорошо разделен, а разрешение очень хорошее. Гидролизаты HSA были проанализированы с использованием скорости потока 100 мкл/мин, подвижной фазы 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% ТФУ. Как показано на хроматограмме (рисунок 6), гидролизат HSA был разделен на 17 пиков, соответствующих 17 пептидам. Была рассчитана эффективность разделения каждого пика в гидролизате HSA, и значения приведены в таблице 5.
Триптический гидролизат HSA (100 × 1,8 мм id) разделяли на колонке PMP; скорость потока (100 мкл/мин), подвижная фаза 60/40 ацетонитрил/вода с 0,1% ТФУ.
где L — длина колонки, η — вязкость подвижной фазы, ΔP — обратное давление колонки, а u — линейная скорость подвижной фазы. Проницаемость колонки PMP составляла 2,5 × 10-14 м2, скорость потока составляла 25 мкл/мин, и использовалось 60/40 об./об. ACN/вода. Проницаемость колонки PMP (100 × 1,8 мм id) была аналогична проницаемости в нашем предыдущем исследовании Ref.34. Проницаемость колонки, заполненной поверхностно-пористыми частицами, составляет: 1,7 × 10-15 для частиц размером 1,3 мкм, 3,1 × 10-15 для частиц размером 1,7 мкм, 5,2 × 10-15 и 2,5 × 10-14 м2 для частиц размером 2,6 мкм. Для 5 Частицы размером 43 мкм. Следовательно, проницаемость фазы ПМП аналогична проницаемости частиц размером 5 мкм со структурой ядро-оболочка.
где Wx — вес колонки, заполненной хлороформом, Wy — вес колонки, заполненной метанолом, а ρ — плотность растворителя. Плотности метанола (ρ = 0,7866) и хлороформа (ρ = 1,484). Общая пористость колонок SILICA PARTICLES-C18 (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) 34 и колонок C18-Urea 31, которые мы ранее изучали, составляла 0,63 и 0,55 соответственно. Это означает, что присутствие лигандов мочевины снижает проницаемость неподвижной фазы. С другой стороны, общая пористость колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) составляет 0,60. Проницаемость колонок PMP ниже, чем у колонок, заполненных частицами силикагеля, связанными с C18, поскольку в неподвижных фазах типа C18 лиганды C18 прикреплены к частицам кремнезема как к линейным цепям, тогда как в неподвижных фазах типа полистирола вокруг него образуется относительно толстый полимерный слой. В типичном эксперименте пористость колонки рассчитывается как:
На рисунке 7A,B показаны колонка PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) и колонка Ascentis Express RP-Amide (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм), использующие те же условия элюирования (т. е. 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA). ) графика Ван-Деемтера. Выбранные пептидные смеси (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) были приготовлены в 20 мкл/мин. Минимальная скорость потока для обеих колонок составляет 800 мкл/мин. Минимальные значения HETP при оптимальной скорости потока (80 мкл/мин) для колонки PMP и колонки Ascentis Express RP-Amide составили 2,6 мкм и 3,9 мкм соответственно. Значения HETP указывают на то, что эффективность разделения колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) намного лучше, чем у коммерчески доступной колонки Ascentis Express RP-Amide (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм). График Ван-Деемтера на рис. 7(A) показывает, что уменьшение Значение N при увеличении потока не является значимым по сравнению с нашим предыдущим исследованием. Более высокая эффективность разделения колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) по сравнению с колонкой Ascentis Express RP-Amide основана на улучшениях в форме частиц, размере и сложных процедурах упаковки колонки, используемых в текущей работе34.
(A) График Ван-Деемтера (зависимость ВЭТП от линейной скорости подвижной фазы), полученный с использованием колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) в 60/40 ACN/H2O с 0,1% TFA. (B) График Ван-Деемтера (зависимость ВЭТП от линейной скорости подвижной фазы), полученный с использованием колонки Ascentis Express RP-Amide (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) в 60/40 ACN/H2O с 0,1% TFA.
Была подготовлена ​​и оценена полярно-встроенная неподвижная фаза из полистирола для разделения синтетических пептидных смесей и трипсиновых гидролизатов человеческого сывороточного альбумина (HAS) в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматографические характеристики колонок PMP для пептидных смесей превосходны по эффективности разделения и разрешению. Улучшенные характеристики разделения колонок PMP обусловлены рядом причин, таких как размер частиц и размер пор частиц кремнезема, контролируемый синтез неподвижной фазы и сложная упаковка колонки. Помимо высокой эффективности разделения, еще одним преимуществом этой неподвижной фазы является низкое обратное давление колонки при высоких скоростях потока. Колонки PMP демонстрируют хорошую воспроизводимость и могут использоваться для анализа пептидных смесей и трипсинового гидролиза различных белков. Мы намерены использовать эту колонку для разделения натуральных продуктов, биологически активных соединений из лекарственных растений и грибковых экстрактов в жидкостной хроматографии. В будущем колонки PMP также будут оценены для разделения белков и моноклональных антител.
Филд, Дж. К., Эуэрби, М. Р., Лау, Дж., Тёгерсен, Х. и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Часть I: Разработка протокола характеристики колонки. Журнал хроматографии. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. и др. Улучшенные активные пептиды, предназначенные для лечения инфекционных заболеваний. Биотехнология. Расширенная. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. и Хрещатиский, М. Синтетические терапевтические пептиды: наука и рынок.Открытие лекарств.15 (1-2) сегодня, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сье, Ф., Смит, Р.Д. и Шен, И. Усовершенствованная протеомная жидкостная хроматография. Журнал хроматографии. A 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. и др. Усовершенствованная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия позволяет включать широконаправленную метаболомику и протеомику. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. и Солсбери, Дж.Дж. Роль УВЭЖХ в разработке лекарственных препаратов. Журнал сентябрьских исследований, 30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. и Клаузен, А.М. Фундаментальные и практические аспекты жидкостной хроматографии сверхвысокого давления для быстрого разделения. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Врен, С.А. и Челищев, П. Применение сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии при разработке лекарственных препаратов. Журнал хроматографии. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. и др. Монолитные макропористые гидрогели, приготовленные из эмульсий типа «масло в воде» с высокой внутренней фазой для эффективной очистки энтеровирусов. Химический журнал Великобритании. 401, 126051 (2020).
Ши, И., Сян, Р., Хорват, К. и Уилкинс, Дж. А. Роль жидкостной хроматографии в протеомике. Журнал хроматографии. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вейтей, Ж.-Л. и Гийарм, Д. Новые тенденции в области разделения терапевтических пептидов и белков методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии: теория и применение. Журнал фармации. Биомедицинская наука. 69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, А.Е. и Геблер, Дж.К. Двумерное разделение пептидов с использованием системы ОФ-ОФ-ВЭЖХ с использованием различных значений pH в первом и втором измерениях разделения. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. и др. Были исследованы характеристики массопереноса и кинетические характеристики высокоэффективных хроматографических колонок, заполненных полностью и поверхностно пористыми частицами C18 размером менее 2 мкм. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. и др. Последние тенденции и аналитические проблемы в выделении, идентификации и валидации растительных биоактивных пептидов. анус. биологический анус. Химия. 410 (15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж. Б. и др. Протеомный ландшафт царства жизни. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, К. и др. Последующая обработка терапевтических пептидов с помощью препаративной жидкостной хроматографии. Молекула (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Ян, И. и Гэн, Х. Смешанная хроматография и ее применение к биополимерам. Журнал хроматографии. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.-Y. и Сан, Y. Лиганды для хроматографии белков смешанного режима: принцип, характеристика и дизайн. Журнал биотехнологии. 144(1), 3-11 (2009).