Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Люпин узколистный (NLL, Lupinus angustifolius L.) — бобовое растение, используемое для производства продуктов питания и улучшения почвы.Глобальная экспансия NLL как сельскохозяйственной культуры привлекла множество патогенных грибов, в том числе антракноз люпина, который вызывает разрушительное заболевание антракноз.Два аллеля, Lanr1 и AnMan, которые придают повышенную устойчивость, использовались в селекции NLL, но лежащие в их основе молекулярные механизмы остаются неизвестными.В этом исследовании маркеры Lanr1 и AnMan использовались для скрининга европейских образцов NLL.Тестирование вакцины в контролируемой среде подтвердило эффективность обоих устойчивых доноров.Дифференциальное профилирование экспрессии генов проводили на репрезентативных устойчивых и восприимчивых линиях.Устойчивость к антракнозу была связана со сверхэкспрессией терминов генной онтологии «GO:0006952 Защитный ответ», «GO:0055114 Редокс-процесс» и «GO:0015979 Фотосинтез».Кроме того, линия Lanr1(83A:476) показала быстрое значительное перепрограммирование транскриптома после инокуляции, в то время как другие линии показали задержку этого ответа примерно на 42 часа.Защитные реакции связаны с генами TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 белками, участвующими в патогенезе, белками переноса липидов, эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазой, белками клеточной стенки, богатыми глицином, и генами реактивного пути кислорода.Ранние ответы на 83A:476, включая осторожное подавление генов, связанных с фотосинтезом, совпали с успешной защитой во время фазы вегетативного роста биологии грибов, что позволяет предположить, что эффектор запускает иммунитет.Реакция Манделеопа замедляется, как и общее горизонтальное сопротивление.
Люпин узколистный (NLL, Lupinus angustifolius L.) представляет собой злак с высоким содержанием белка, происходящий из региона западного Средиземноморья1,2.В настоящее время выращивается как пищевая культура для животных и человека.Он также считается сидератом в системах севооборота из-за фиксации азота симбиотическими азотфиксирующими бактериями и общего улучшения структуры почвы.NLL претерпела быстрый процесс одомашнивания в прошлом веке и все еще находится под высоким давлением размножения3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.При широком культивировании НЛЛ сукцессия патогенных грибов осваивала новые сельскохозяйственные ниши и вызывала новые губительные болезни. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее заметным для фермеров и селекционеров люпина стало появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nir Энберг, Фейлер и Хагедорн13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Волосатый。1 наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Самые ранние сообщения об этом заболевании поступили из Бразилии и США, а типичные симптомы появились в 1912 и 1929 годах соответственно.Однако примерно через 30 лет возбудитель был обозначен как Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Targeted Morphology. и Х. Шренк. и Х. Шренк, .и Х. Шренк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。и Х. Шленк, .Предварительное фенотипирование болезней, проведенное в середине 20-го века, показало некоторую устойчивость у образцов NLL и желтого люпина (L. luteus L.), но все испытанные образцы белого люпина (L. albus L.) оказались высокочувствительными15,16.Исследования показали, что развитие антракноза связано с повышенными осадками (влажностью воздуха) и температурой (в диапазоне 12-28°С), что приводит к нарушению устойчивости к более высоким температурам17, 18. Фактически время, необходимое для прорастания конидий и начала заболевания, было в четыре раза короче при 24°С (4 часа), чем при 12°С (16 часов) в условиях повышенной влажности19.Таким образом, продолжающееся глобальное потепление привело к распространению антракноза.Тем не менее, заболевание наблюдалось во Франции (1982 г.) и Украине (1983 г.) как предвестник надвигающейся угрозы, но, по-видимому, в то время оно было проигнорировано люпиновой отраслью20,21.Несколько лет спустя это разрушительное заболевание распространилось по всему миру, а также поразило основные страны-производители люпина, такие как Австралия, Польша и Германия22,23,24.После вспышки антракноза в середине 1990-х годов обширный скрининг привел к выявлению нескольких резистентных доноров в образцах NLL19.Устойчивость NLL к антракнозу контролируется двумя отдельными доминантными аллелями, обнаруженными в разных источниках зародышевой плазмы: Lanr1 у сортов Tanjil и Wonga и AnMan у сортов.Mandalay 25, 26. Эти аллели дополняют молекулярные маркеры, которые поддерживают отбор устойчивой зародышевой плазмы в программах селекции25,26,27,28,29,30.Устойчивую селекционную линию 83A:476, несущую аллель Lanr1, скрещивали с восприимчивой дикой линией P27255 для получения популяции RIL, сегрегирующей по устойчивости к антракнозу, что позволило отнести локус Lanr1 к хромосоме NLL-1131, 32, 33. все три аллеля на одной хромосоме (NLL-11), но в разных позициях29,34,35.Однако из-за небольшого количества RIL и большого генетического расстояния между маркерами и соответствующими аллелями нельзя сделать надежных выводов о лежащих в их основе генах.С другой стороны, использование обратной генетики у люпинов затруднено из-за их очень низкого потенциала регенерации, что делает генетические манипуляции громоздкими37.
Разработка одомашненной зародышевой плазмы, несущей желаемый аллель в гомозиготном состоянии, такой как 83A:476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), открыла двери для изучения устойчивости к антракнозу перед лицом наличия противоположных комбинаций аллелей в диких популяциях.Возможности молекулярных механизмов.Сравните защитные реакции, генерируемые конкретными генотипами.В этом исследовании оценивали ранний ответ транскриптома NLL на вакцинацию C. lupini.Во-первых, европейская панель зародышевой плазмы NLL, содержащая 215 линий, была подвергнута скринингу с использованием молекулярных маркеров, которые маркируют аллели Lanr1 и AnMan.Затем было проведено фенотипирование антракноза на 50 линиях NLL, предварительно отобранных по молекулярным маркерам, в контролируемых условиях.На основании этих экспериментов четыре линии, отличающиеся устойчивостью к антракнозу и аллельным составом Lanr1/AnMan, были отобраны для дифференциального профилирования экспрессии генов защиты с использованием двух взаимодополняющих подходов: высокопроизводительного секвенирования РНК и количественной оценки ПЦР в реальном времени.
Скрининг набора гермоплазмы NLL (N = 215) с маркерами Lanr1 (Anseq3 и Anseq4) и AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) показал, что только одна линия (95726, близ Саламанки-b) амплифицирует аллель «резистентности» по всем маркерам, в то время как «Наличие «чувствительных» аллелей» выявило долю всех маркеров в 158 (~73,5%) строк.13 линий продуцировали два «устойчивых» аллеля маркера Lanr1 и 8 линий продуцировали «устойчивые» аллели Lanr1.маркер.Аллель «резистентности» маркера AnMan (дополнительная таблица S1).Две линии были гетерозиготными по маркеру Anseq3 и одна гетерозиготными по маркеру AnManM1.42 линии (19,5%) несли противоположные фазы аллелей Anseq3 и Anseq4, что свидетельствует о высокой частоте рекомбинации между этими двумя локусами.Фенотипы антракноза в контролируемых условиях (дополнительная таблица S2) выявили изменчивость устойчивости тестируемых генотипов, что отразилось на степени тяжести антракноза.Различия в средних баллах варьировались от 1,8 (умеренно устойчивые) до 6,9 (чувствительные), а различия в весе растений варьировались от 0,62 (чувствительные) до 4,45 г (устойчивые). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для оценки тяжести заболевания, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P <0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P <0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, P <0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, проявлениями в двух рецидивах эксперимента (0,51 для степени тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растений, P < 0,0001), а также между двумя двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Значимая корреляция была обнаружена между значениями, наблюдаемыми в двух повторах опыта (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, P <0,0001) 0,0001).P = 0,00017, 植0,61, P < 0,0001, 0,59, 0,77, P < 0,0001).0,5 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась корреляция между значениями, проявлениями в двух повторностях (оценка тяжести заболеваний 0,51, P = 0,00017 и масса растений 0,61, P <0,0001), и между множеством значений параметров (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Типичные симптомы, наблюдаемые у восприимчивых растений, включают изгиб и скручивание стебля, напоминающие структуру «пастуший лук», за которыми следуют овальные поражения с оранжевыми/розовыми спорозоитами (дополнительный рисунок 1).Австралийские образцы, несущие гены Lanr1 (83A:476 и Tanjil) и AnMan (Mandelup), обладают умеренной устойчивостью, 0,0331 и 0,0036).Некоторые линии, которые также несут «резистентные» аллели Lanr1 и/или AnMan, проявляют симптомы заболевания.
Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «устойчивого» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяция B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и не имеет значения для веса). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «устойчивого» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяция B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и не имеет значения для веса). Интересно, что несколько особей NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, имеют высокий уровень стойкости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для массы показателей), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растений) и популяции B-549/79b (значение ение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «устойчивого» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяция B-549/79b (значение P <0,0001 для оценка и не имеет значения для веса).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值<0.0001，重量不显着）。 Интересно, что некоторые системы NLL, не имеющие каких-либо «антигенных» маркеров, проявляют высокую горизонтальную устойчивость (эквивалентно генам Lanr1 или AnMan или выше), такие как Boregine (оба параметра P < 0,0001), Bojar (значение P < 0,0001, масса растения 0,001) и штамм B-549/79b (значение P < 0,0001, масса незначима). Интересно, что некоторые линии NLL, требующие каких-либо маркерных аллелей «резистентности», имеют высокие уровни антракнозу (сравнимые или более высокие, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для общих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растений 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0 ,0001, масса незначима). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые с генотипами Lanr1 или AnMan или выше), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (значение P <0,0001, масса растения). не существенно).Это явление предполагает возможность нового генетического источника устойчивости, объясняя наблюдаемое отсутствие корреляции между маркерными генотипами и фенотипами болезни (значения P от ~0,42 до ~0,98).Таким образом, тест Колмогорова-Смирнова показал, что данные по устойчивости к антракнозу были примерно нормально распределены по баллам (P-значения 0,25 и 0,11) и растительной массе (P-значения 0,47 и 0,55), что позволяет предположить, что задействовано больше аллелей, чем Lanr1 и AnMan.
По результатам скрининга устойчивости к антракнозу для транскриптомного анализа были отобраны 4 линии: 83A:476, Boregine, Mandelup и Population 22660. Эти линии были повторно протестированы на устойчивость к сибирской язве в экспериментах по инокуляции методом секвенирования РНК при условии, что они были такими же, как и в предыдущем тесте.Значения баллов были следующими: Борегин (1,71 ± 1,39), 83А: 476 (2,09 ± 1,38), Манделуп (3,82 ± 1,42) и население 22660 (6,11 ± 1,29).
Протокол Illumina NovaSeq 6000 достиг в среднем 40,5 пар Mread на образец (от 29,7 до 54,4 Mread) (дополнительная таблица S3).Баллы выравнивания в эталонной последовательности варьировались от 75,5% до 88,6%.Средняя корреляция данных подсчета прочтений между экспериментальными вариантами между биологическими повторностями колебалась от 0,812 до 0,997 (в среднем 0,959). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявили экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов требуют незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее <5).Таким образом, количество генов, считающихся выраженными (базовое среднее ≥ 5) во время эксперимента, составило 27 468 (78,1%) (дополнительная таблица S4).
С первого момента времени все линии НЛЛ реагировали на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) репрограммированием транскриптома (табл. 1), однако между линиями наблюдались существенные различия.Так, линия устойчивости 83A:476 (несущая ген Lanr1) показала значительное перепрограммирование транскриптома в первый момент времени (6 hpi) с 31-69-кратным увеличением числа изолированных повышающих и понижающих генов по сравнению с другими временными точками в этот момент времени.Кроме того, этот пик был кратковременным, так как экспрессия лишь нескольких генов оставалась значительно измененной во второй момент времени (12 hpi).Интересно, что Boregine, который также показал высокий уровень устойчивости в тесте на трансплантацию, не подвергался столь массовому перепрограммированию транскрипции в ходе эксперимента.Однако количество дифференциально экспрессируемых генов (DEG) было одинаковым для Boregine и 83A: 476 при 12 HPI.Как у Манделупа, так и у популяции 22660 были обнаружены пики ДЭГ в последний момент времени (48 л/с), что указывает на относительную задержку защитных реакций.
Поскольку 83A:476 подвергся массивному репрограммированию транскриптома в ответ на C. lupini при 6 HPI по сравнению со всеми другими линиями, ~ 91% DEG, наблюдаемых в этот момент времени, были специфичными для линии (Fig. 1).Тем не менее, было некоторое совпадение ранних ответов между исследуемыми линиями, так как 68,5%, 50,9% и 52,6% DEG у Boregine, Mandelup и популяции 22660, соответственно, перекрывались с таковыми, обнаруженными у 83A:476 в определенные моменты времени.Однако эти ДЭГ составляют лишь небольшую долю (0,97–1,70%) всех ДЭГ, обнаруженных в настоящее время с использованием 83A:476.Кроме того, 11 DEG из всех линий в это время были когерентными (дополнительные таблицы S4-S6), включая общие компоненты защитных реакций растений: белок-переносчик липидов (TanjilG_32225), фермент эндоглюкан-1,3-β-глюкозид (TanjilG_23384), два индуцируемых стрессом белка, таких как SAM22 (TanjilG_31528 и TanjilG_31531). ), основной латексный белок (TanjilG_32352) и два богатых глицином структурных белка клеточной стенки (TanjilG_19701 и TanjilG_19702).Также наблюдалось относительно высокое перекрывание транскриптомных ответов между 83A:476 и Boregine при 24 HPI (всего 16-38% DEG) и между Mandelup и Population 22660 при 48 HPI (всего 14-20% DEG).
Диаграмма Венна, показывающая количество дифференциально экспрессируемых генов (DEG) в линиях узколистного люпина (NLL), инокулированных Colletotrichum lupini (штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, 1999 г.).Были проанализированы линии NLL: 83A:476 (устойчивые, несущие аллель Lanr1), Boregine (устойчивые, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивые, несущие аллель AnMan) и популяция 22660 (очень восприимчивые).Аббревиатура hpi означает часы после вакцинации.Нулевые значения были удалены для упрощения графика.
Набор сверхэкспрессированных генов при 6 hpi был проанализирован на наличие канонических доменов гена R (дополнительная таблица S7).Это исследование выявило индукцию транскриптома генов классической устойчивости к болезням с доменами NBS-LRR только в 83A:476.Этот набор состоял из одного гена TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), пяти генов CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 и tanjilg_16162), четырех NBS-LR, Tanjilg_16162 и четырех NBS-LRRE (tanjilg_1). 6162), а также четыре NBS-Lrr (tanjilg_16162) и четыре NBS-LRR (TANJILG_16162).Все эти гены имеют канонические домены, расположенные в консервативных последовательностях.В дополнение к генам домена NBS-LRR несколько киназ RLL были активированы при 6 hpi, а именно одна у Boregine (TanjilG_19877), две у Mandelup (TanjilG_07141 и TanjilG_19877) и в популяции 22660 (TanjilG_09014 и TanjilG_10361) и две у 83A 27:4 76.
Гены со значительно измененной экспрессией в ответ на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) были подвергнуты анализу обогащения Gene Ontology (GO) (дополнительная таблица S8). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). наиболее часто усиленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой воспринимаемостью (значение P <0,001) (рис. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × происхождение) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Наиболее репрезентативным термином биологического процесса является «GO:0006952 защитная реакция», который появляется в 6 из 16 (时间×线) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (图2). наиболее часто выраженным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой воспринимаемостью (значение P <0,001) (рис. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2).Этот термин был чрезмерно представлен в двух моментах времени в 83A: 476 и Boregine (6 и 24 л.с. на дюйм) и в один момент времени в Mandelup и Population 22660 (12 и 6 л.с. на дюйм соответственно).Это ожидаемый результат, подчеркивающий противогрибковый ответ устойчивых линий.Кроме того, 83A:476 реагировал на C. lupini, быстро индуцируя гены, связанные с окислительным взрывом, представленным термином «окислительно-восстановительный процесс GO:0055114», что указывает на специфический защитный ответ, в то время как Boregine выявлял специфические защитные ответы, связанные с термином «GO».:0006950 Реакция на стресс».Популяция 22660 активировала реакцию горизонтальной резистентности с участием вторичных метаболитов, выделив избыточное количество терминов «GO:0016104 Процесс биосинтеза тритерпенов» и «GO:0006722 Процесс метаболизма тритерпенов» (оба термина принадлежат к одному и тому же набору генов), принимая во внимание результаты анализа обогащения терминов GO, стабильность реакции Манделупа находилась между Boregine и Population 22660. Кроме того, ранняя реакция 83A: 476 (6 л.с.) и замедленная реакция Mandelup and Population 22660 включают термин GO:0015979 «фотосинтез» и другие родственные биологические процессы.
Термины онтологии генов биопроцессов, выбранные в аннотации дифференциально экспрессируемых генов при транскриптомных ответах люпина узколистного (NLL), инокулированного сибиреязвенным люпином (штамм Col-08, полученный с люпиновых полей в Верженице, Польша, в 1999 г.), сильно преувеличены.Были проанализированы линии NLL: 83A:476 (устойчивые, несущие гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивые, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивые, несущие гомозиготный аллель AnMan) и популяция 22660 (восприимчивые).
Поскольку это исследование было направлено на выявление генов, которые способствуют устойчивости к антракнозу, гены, отнесенные к терминам GO «GO: 0006952 Защитные реакции» и «GO: 0055114 Редокс-процессы», были проанализированы с отсечкой, поскольку исходное значение означает ≥ 30 по крайней мере с одной линией.× момент времени, объединяющий статистически значимые значения log2 (кратное изменение).Количество генов, отвечающих этим критериям, составило 65 для GO:0006952 и 524 для GO:0055114.
83A:476 выявили два пика DEG, аннотированные термином GO:0006952, первый с 6 генами на дюйм (64 гена, повышающая и понижающая регуляция), а второй с 24 генами на дюйм (15 генов, только повышающая регуляция).Boregine также показал, что GO:0006952 достигает пика в тот же момент времени, но с меньшим количеством DEG (11 и 8) и предпочтительной активацией.Mandeloop показал два пика GO:0006952 при 12 и 48 HPI, оба несли 12 генов (первый с активирующими генами, а второй только с супрессорными генами), в то время как популяция 22660 при 6 HPI (13 генов) имела большее преобладание пика увеличения.регулирование.Следует отметить, что 96,4% GO:0006952 DEG в этих пиках имели один и тот же тип ответа (вверх или вниз), что указывает на значительное перекрытие защитных ответов, несмотря на различия в количестве задействованных генов.Самая большая группа последовательностей, связанных с термином GO:0006952, кодирует белок 22, связанный с голоданием, стрессом (SAM22-подобный), который принадлежит к кладе белков класса 10, ассоциированных с патогенезом (PR-10), и латексу основного белка.аналогичный (MLP-подобный) белок) белок (рис. 3).Две группы отличались характером экспрессии и направлением реакции.Гены, кодирующие SAM22-подобные белки, демонстрировали постоянную и значительную индукцию в ранние моменты времени (6 или 12 hpi) и, как правило, не реагировали в конце эксперимента (48 hpi), в то время как MLP-подобные белки демонстрировали координацию при 6 hpi.л.с.83A:476 и Mandelup при 48 л.с./дюйм, почти все другие точки данных не реагировали.Кроме того, различия в профилях экспрессии генов SAM22-подобных белков сопровождались наблюдаемой изменчивостью устойчивости к антракнозу, поскольку более устойчивые линии имели больше временных точек, значительно индуцирующих эти гены, чем более восприимчивые гены.Другой LlR18A/B-подобный ген PR-10 показал очень сходный паттерн экспрессии с геном SAM22-подобного белка.
Выявлены основные компоненты термина биологического процесса «GO:0006952 Defense Response» и паттерны экспрессии генов-кандидатов аллелей Lanr1 и AnMan.Шкала Log2 представляет значения log2 (кратность изменения) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина, Виженица, Польша, 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями в один и тот же момент времени.Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивые, несущие гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивые, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивые, несущие гомозиготный аллель AnMan) и Population 22660 (восприимчивые).
Кроме того, были оценены профили экспрессии генов-кандидатов RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) (рис. 3).Ген TanjilG_05042 показал значительный ответ (активацию) при 83A:476 только в первой временной точке (6 hpi), в то время как TanjilG_12861 был значимым в Mandeloop только в двух временных точках: 6 hpi (понижающая регуляция) и 24 hpi (6 hpi).С.).регулируемый)).
Наиболее сверхэкспрессированными генами в термине GO:0055114 «редокс-процесс» были гены, кодирующие белки цитохрома Р450 и пероксидазу (рис. 4).Для образцов, выделенных из 83A:476 при 6 HPI, максимальные или минимальные значения log2 (кратность изменения) (для 86,6% генов) обычно наблюдались между инокулированными и контрольными растениями, что подчеркивает высокую реакцию этого генотипа на инокуляцию пола.83A:476 показал наиболее значимый GO: 0055114 DEG при 6 hpi (503 гена), в то время как остальные линии при 48 hpi (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 генов; и Population 22660, 78 генов)).В большинстве генов семейства GO:0055114 наблюдались два типа ответов на вакцинацию (активация и ингибирование).Интересно, что до 97,6% DEG, идентифицированных для термина GO: 0055114 у Mandelupe в возрасте 48 л.В Boregine и Population 22660 эта конвергенция ниже и составляет 51,6% и 75,6% соответственно.
Выявлены закономерности экспрессии основных компонентов термина биологического процесса «GO:0055114 Redox process».Шкала Log2 представляет значения log2 (кратность изменения) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина, Виженица, Польша, 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями в один и тот же момент времени.Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивые, несущие гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивые, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивые, несущие гомозиготный аллель AnMan) и Population 22660 (восприимчивые).
83A:476 Транскриптомные ответы на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) также включали скоординированное замалчивание генов, приписываемое термину GO:0015979 «фотосинтез» и другие родственные биологические процессы (фиг. 5).Этот набор GO:0015979 DEG содержал 105 генов, которые были значительно репрессированы при 6 HPI в 83A:476.В этом подмножестве 37 генов также были подавлены у Mandelup при 48 HPI и 35 в тот же момент времени в популяции 22660, включая 19 DEG, общих для обоих генотипов.Никакие DEG, связанные с термином GO: 0015979, не были значительно активированы в любой комбинации (строка x время).
Выявлены закономерности проявления основных компонентов термина биологического процесса «ГО:0015979 Фотосинтез».Шкала Log2 представляет значения log2 (кратность изменения) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина, Виженица, Польша, 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями в один и тот же момент времени.Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивые, несущие гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивые, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивые, несущие гомозиготный аллель AnMan) и Population 22660 (восприимчивые).
Основываясь на результатах анализа дифференциальной экспрессии и предположительно участвующих в защитных реакциях против патогенных грибков, этот набор из семи генов был выбран для количественной оценки профилей экспрессии с помощью ПЦР в реальном времени (дополнительная таблица S9).
Предполагаемый ген белка TanjilG_10657 был значительно индуцирован во всех изученных линиях и временных точках по сравнению с контрольными (имитирующими) растениями (дополнительные таблицы S10, S11).Кроме того, профиль экспрессии TanjilG_10657 показал тенденцию к увеличению в ходе эксперимента для всех линий.Популяция 22660 показала наибольшую чувствительность TanjilG_10657 к инокуляции с 114-кратной активацией и самым высоким относительным уровнем экспрессии (4,4 ± 0,4) при 24 HPI (рис. 6а).Ген белка PR10 LlR18A TanjilG_27015 также показал активацию во всех линиях и временных точках со статистической значимостью в большинстве точек данных (рис. 6b).Подобно TanjilG_10657, самый высокий относительный уровень экспрессии TanjilG_27015 наблюдался в инокулированной популяции 22660 при 24 HPI (19,5 ± 2,4).Ген кислой эндохитиназы TanjilG_04706 значительно активировался во всех линиях и во все моменты времени, за исключением Boregine 6 hpi (рис. 6c).Он сильно индуцировался в первую временную точку (6 HPI) у 83А:476 (в 10,5 раза) и умеренно возрастал у остальных линий (в 6,6-7,5 раза).В ходе эксперимента экспрессия TanjilG_04706 оставалась на близких уровнях у 83A:476 и Boregine, тогда как у Mandelup и Population 22660 она значительно повышалась, достигая относительно высоких значений (5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5 соответственно).Эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазоподобный ген TanjilG_23384 показал высокую активацию в первые два момента времени (6 и 12 hpi) во всех линиях, кроме популяции 22660 (рис. 6г).Самые высокие относительные уровни экспрессии TanjilG_23384 наблюдались во второй момент времени (12 hpi) у Mandelup (2,7 ± 0,3) и 83A:476 (1,5 ± 0,1).При 24 HPI экспрессия TanjilG_23384 была относительно низкой во всех исследованных линиях (от 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профили экспрессии выбранных генов (ag), выявленные с помощью количественной ПЦР.Цифры 6, 12 и 24 обозначают часы после вакцинации.Гены LanDExH7 и LanTUB6 использовали для нормализации, а LanTUB6 использовали для межсерийной калибровки.Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение, основанное на трех биологических повторах, каждый из которых представляет собой среднее значение трех технических повторов. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (* значение P <0,05, ** значение P ≤ 0,01, *** значение P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (* значение P <0,05, ** значение P ≤ 0,01, *** значение P ≤ 0,001). Статистическая чувствительность поражений в местах экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина вженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) поражениями растений над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P <0,05, ** значение P ≤ 0,01, *** значение P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达（*P≤0,05, **P≤0,01, ***P≤0,001).接种 （colletotrichum lupini ，color-08 株 ，1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Статистически значимые различия в экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженицах, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (*P-значение <0,05, **P-значение ≤0,01, ***P-значение ≤0,001).Были проанализированы линии NLL: 83A:476 (устойчивые, несущие гомозиготный аллель Lanr1), Mandelup (умеренно устойчивые, несущие гомозиготный аллель AnMan), Boregine (устойчивые, неизвестный генетический фон) и популяция 22660 (восприимчивые).
Ген-кандидат TanjilG_05042 в локусе Lanr1 показал заметно отличающийся от профилей экспрессии профиль, полученный в исследованиях RNA-seq (Fig. 6e).Значительная активация этого гена наблюдалась у Mandelup и популяции 22660 (до 39,7 и 11,7 раза соответственно), что приводило к относительно высоким уровням экспрессии (до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3 соответственно).83A:476 также выявил некоторую повышенную регуляцию гена TanjilG_05042 (до 3,8 раза), однако достигнутые относительные уровни экспрессии (0,044 ± 0,002) были более чем в 30 раз ниже, чем уровни, наблюдаемые у Mandelup и популяции 22660.анализ с помощью qPCR показал значительные различия в уровнях экспрессии между генотипами в ложно вакцинированных (контрольных) вариантах, достигая 58-кратной разницы между популяциями 22660 и 83A:476, а также между популяциями 22660 и 22660. Двукратная разница была достигнута между Boregine и Mandalup.
Ген-кандидат в локусе AnMan, TanjilG_12861, активировался в ответ на вакцинацию у 83A:476 и Mandelup, был нейтральным в популяции 22660 и подавлялся у Boregine (рис. 6f).Относительная экспрессия гена TanjilG_12861 была наибольшей у инокулированного 83А: 476 (0,14±0,01).Ген белка теплового шока I класса массой 17,4 кДа TanjilG_05080 HSP17.4 показал более низкие относительные уровни экспрессии во всех исследованных штаммах и временных точках (рис. 6g).Самое высокое значение наблюдалось при 24 HPI в популяции 22660 (0,14 ± 0,02, восьмикратное увеличение в ответ на вакцинацию).
Сравнение профилей экспрессии генов (рис. 7) выявило высокую корреляцию между TanjilG_10657 и четырьмя другими генами: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) и TanjilG_04706 (r = 0,79).Такие результаты могут указывать на совместную регуляцию этих генов во время защитных реакций.Гены TanjilG_12861 и TanjilG_23384 показали разные профили экспрессии с более низкими значениями коэффициента корреляции Пирсона (от 0,08 до 0,43 и от -0,19 до 0,28 соответственно) по сравнению с другими генами.
Корреляции между профилями экспрессии генов выявляли с помощью количественной ПЦР.Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивые, несущие гомозиготный аллель Lanr1), Mandelup (умеренно устойчивые, несущие гомозиготный аллель AnMan), Boregine (устойчивые, генетический фон неизвестен) и Population 22660 (восприимчивые).Были рассчитаны три временных момента (через 6, 12 и 24 часа после инокуляции), включая инокулированные (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольные (ложно инокулированные) растения.Шкала показывает значение коэффициента корреляции Пирсона.
Основываясь на данных, полученных при 6 лошадиных силах на дюйм, WGCNA был выполнен на 9981 DEG, идентифицированном путем сравнения инокулированных и контрольных растений, чтобы сосредоточиться на ранних защитных реакциях (дополнительная таблица S12).Было обнаружено 22 генных модуля (кластера) с коррелированными (положительными или отрицательными) профилями экспрессии между генотипами и экспериментальными вариантами. В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В средней степени выраженности заболеваний гепатиты проявляются в форме 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 (в вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако эта тенденция была сильнее у контрольных растений).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> население 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровне заболевания страдают в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660 (однако в популяции эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений).Вакцинация привела к усилению экспрессии генов, особенно в модулях 18, 19, 14, 6 и 1 (в порядке убывания эффекта), отрицательной регуляции (например, модули 9 и 20) или с нейтральными эффектами (например, модулям 11, 22, 8 и 13).Анализ обогащения терминов GO (дополнительная таблица S13) выявил «GO: 0006952 Защитные реакции» для инокулированного модуля (18) с максимальной активацией, включая гены, проанализированные с помощью количественной ПЦР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015), а также многие инокулированные модули фотосинтеза с наибольшим подавлением (9).Концентратор модуля 18 (рис. 8) был идентифицирован как ген TanjilG_26536, кодирующий PR-10-подобный белок LlR18B, а концентратор модуля 9 был идентифицирован как ген TanjilG_28955, кодирующий белок PsbQ фотосистемы II.Кандидатный ген устойчивости к антракнозу Lanr1, TanjilG_05042, был обнаружен в модуле 22 (рис. 9) и связан с терминами «GO:0044260 Клеточные макромолекулярные метаболические процессы» и «GO:0006355 Регуляция транскрипции, шаблонирование ДНК», несущими концентратор TanjilG_01212.ген кодирует фактор транскрипции теплового стресса A-4a (HSFA4a).
Взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов модулей с чрезмерно представленными терминами биологического процесса «GO: 0006952 Защитные ответы».Лигирование было упрощено, чтобы выделить четыре гена, проанализированные с помощью количественной ПЦР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов модуля с чрезмерно представленным термином биологического процесса «GO: 0006355: Регуляция транскрипции, шаблонирование ДНК» и несущего кандидатный ген устойчивости к антракнозу Lanr1 TanjilG_05042.Лигирование было упрощено для выделения гена TanjilG_05042 и центрального гена TanjilG_01212.
Скрининг на устойчивость к антракнозу, проведенный в Австралии, показал, что большинство ранее выпущенных сортов были восприимчивы;Kalya, Coromup и Mandelup были описаны как умеренно устойчивые, тогда как Wonga, Tanjil и 83A:476 были описаны как высокоустойчивые26,27,31.имели один и тот же аллель устойчивости, обозначенный Lanr1, а Коромап и Манделуп имели другой аллель, обозначенный AnMan10, 26, 39, в то время как Калья передал другой аллель., Ланр2.Скрининг на устойчивость к антракнозу в Германии привел к идентификации устойчивой линии Bo7212 с аллелем-кандидатом, отличным от Lanr1, обозначенным как LanrBo36.
Наше исследование выявило очень низкую частоту (около 6%) аллеля Lanr1 в тестируемой гермоплазме.Это наблюдение согласуется с результатами скрининга восточноевропейской гермоплазмы с использованием маркеров Anseq3 и Anseq4, которые показали, что аллель Lanr1 присутствует только у двух белорусских линий.Это говорит о том, что аллель Lanr1 еще не широко используется местными селекционными программами, в отличие от Австралии, где он является одним из ключевых аллелей для разведения с использованием маркеров.Это может быть связано с более низким уровнем устойчивости, обеспечиваемым аллелем Lanr1 в европейских полевых условиях, по сравнению с австралийским отчетом.Кроме того, исследования антракноза в районах с большим количеством осадков в Австралии показали, что реакции устойчивости, опосредованные аллелем Lanr1, могут быть неэффективными в погодных условиях, благоприятствующих росту и быстрому развитию патогена19,42.Фактически, в настоящем исследовании некоторые симптомы антракноза также наблюдались у генотипов, несущих аллель Lanr1, что позволяет предположить, что резистентность может исчезнуть при оптимальных условиях для развития C. lupini.Кроме того, возможны ложноположительные интерпретации присутствия маркеров Anseq3 и Anseq4, которые находятся примерно в 1 cM от локуса Lanr1 28,30,43 .
Наше исследование показало, что 83A:476, несущий аллель Lanr1, отвечал на инокуляцию C. lupini масштабным перепрограммированием транскриптома в первый анализируемый момент времени (6 hpi), в то время как у Mandelup, несущего аллель AnMan, транскриптомные ответы наблюдались значительно позже.(от 24 до 48 л.с.).Эти временные вариации защитных реакций связаны с различиями в симптомах заболевания, что подчеркивает важность раннего распознавания патогена для успешного ответа на резистентность.Чтобы заразить ткань растения, споры сибирской язвы должны пройти несколько стадий развития на поверхности хозяина, включая прорастание, деление клеток и образование апрессория.Придаток представляет собой инфекционную структуру, которая прикрепляется к поверхности хозяина и облегчает проникновение в ткани хозяина.Так, у спор С. gloeosporioides в экстракте гороха наблюдалось первое деление ядра через 75—90 мин инкубации, образование зародышевой трубки через 90—120 мин и подавление через 4 часа 45 .Манго C. gloeosporioides показал более 40% конидиального прорастания через 3 часа инкубации и около 20% образования апрессоров через 4 часа.Связанный с вирулентностью ген CAP20 C. gloeosporioides показал транскрипционную активность в эпифитобразующих конидиях после 3,5 ч инкубации в поверхностном воске авокадо с высокими концентрациями белка CAP20 через 4 ч 46 мин.Точно так же активность генов биосинтеза меланина у C. trifolii индуцировалась в течение 2-часовой инкубации с последующим образованием апрессория через 1 час.Исследования тканей листа показали, что у клубники, инокулированной C. acutatum, первая супрессия наблюдается при 8 л.с.в значительной степени соответствует временной шкале Colletotrichum spp.инфекционный процесс.Быстрые защитные реакции на 83A:476 предполагают участие в этой линии генов устойчивости растений и иммунитета, запускаемого эффекторами (ETI), в то время как отсроченные ответы Mandelup подтверждают гипотезу микроассоциированного иммунитета, запускаемого молекулярным паттерном (MTI) 50. Ранние ответы на 83A: 476 и Mandelup.Частичное перекрытие между повышающими или понижающими регуляциями генами при отсроченном ответе также поддерживает эту концепцию, поскольку ETI часто считается ускоренным и усиленным ответом MTI, который достигает кульминации в запрограммированной гибели клеток в месте инфекции, известном как анафилактический шок 51,52 .
Большинство генов, отнесенных к чрезмерно представленному термину Gene Ontology GO:0006952 «Defense Response», являются 11 гомологами индуцированного стрессом белка сообщения 22 натощак (похожего на SAM22) и семи основных белков, подобных латексу (MLP).-подобные белки 31, 34, 43 и 423 показали сходство последовательностей.SAM22-подобные гены показали значительную активацию, которая длилась дольше, показывая повышенный уровень устойчивости к антракнозу (83A:476 и Boregine).Однако MLP-подобные гены подавлялись только в линиях, несущих аллель устойчивости-кандидата (83A:476/Lanr1 при 6 hpi и Mandelup/AnMan при 24 hpi).Следует отметить, что все идентифицированные SAM22-подобные гомологи происходят из кластера генов, охватывающего примерно 105 т.п.н., тогда как MLP-подобные гены происходят из отдельных областей генома.Скоординированная активация таких SAM22-подобных генов была также обнаружена в нашем предыдущем исследовании устойчивости NLL к инокуляции Diaporthetoxica, что позволяет предположить, что они участвуют в горизонтальных компонентах защитного ответа.Этот вывод также подтверждается сообщениями о положительном ответе SAM22-подобных генов на повреждение или лечение салициловой кислотой, грибковыми индукторами или перекисью водорода.
Было показано, что MLP-подобные гены реагируют на различные абиотические и биотические стрессы, включая бактериальные, вирусные и патогенные грибковые инфекции у многих видов растений55.Направленность реакции на определенные взаимодействия между растениями и патогенами колебалась от сильно возрастающей (например, при заражении хлопчатника Verticillium dahliae) до значительно уменьшающейся (т. е. после заражения яблони Alternaria spp.)56,57.Значительное подавление MLP-подобного гена 423 наблюдалось во время защиты авокадо от инфекции F. niger и во время заражения яблони Botryosphaeria berengeriana f.Сп.piricola и Alternaria alternata являются патотипами яблони58,59.Кроме того, каллусы яблони со сверхэкспрессией MLP-подобного гена 423 имели более низкую экспрессию генов, связанных с устойчивостью, и были более восприимчивы к грибковой инфекции59.Вслед за Fusarium oxysporum f MLP-подобный ген 423 также был подавлен в устойчивой зародышевой плазме обыкновенной фасоли.Сп.Заражение фасоли 60.
Другими членами семейства PR-10, идентифицированными в нашем исследовании RNA-seq, были гены LlR18A и LlR18B в ответ на активацию, а также активация (1 ген) или деактивация (3 гена) гена белка-переносчика липидов DIR1..Кроме того, WGCNA выделяет ген LlR18B в качестве хаба в этом модуле, который очень чувствителен к вакцинации и несет несколько генов защитного ответа.Гены LlR18A и LlR18B индуцировались в листьях желтого люпина в ответ на патогенные бактерии, а также в стеблях NLL после инокуляции D. toxica, в то время как гомолог этих генов риса, RSOsPR10, быстро индуцировался грибковой инфекцией, предположительно вовлеченной в сигнальный путь жасмоновой кислоты. появление системной приобретенной резистентности (SAR).При развитии защитных реакций белок DIR1 транспортируется из очага инфекции через флоэму для индукции САР в отдаленных органах.Интересно, что ген TanjilG_02313 DIR1 был значительно индуцирован в первый момент времени в линиях 84A:476 и популяции 22660, но устойчивость к антракнозу успешно развилась только в линии 84A:476.Это может свидетельствовать о некоторой субфункционализации гена DIR1 в NLL, так как остальные три гомолога реагировали на инокуляцию только в линии 83A:476 при 6 hpi, и этот ответ был направлен вниз.
В нашем исследовании наиболее распространенными компонентами, соответствующими биологическому процессу, называемому «окислительно-восстановительный процесс GO:0055114», были белок цитохрома Р450, пероксидаза, 9S-/13S-липоксигеназа линолевой кислоты и оксидаза 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты.Кроме того, наша WGCNA определяет гомолог HSFA4a как узел, несущий модули, такие как ген-кандидат устойчивости Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a является компонентом редокс-зависимой регуляции ядерной транскрипции у растений.
Белки цитохрома Р450 представляют собой оксидоредуктазы, катализирующие НАДФН и/или О2-зависимые реакции гидроксилирования в первичном и вторичном метаболизме, включая метаболизм ксенобиотиков, а также гормонов, жирных кислот, стеролов, компонентов клеточной стенки, биополимеров и биосинтез защитных соединений 69. В нашем исследовании вариабельность функции цитохрома Р450 растений была снижена с -10,6 log2 (кратное изменение) до 5,7. из-за большого количества измененных гомологов (37) и различий в паттернах ответов между конкретными генами, отражающих восходящую ревизию..Использование только данных RNA-seq для выяснения предполагаемой биологической функции генов NLL в таком большом надсемействе белков было бы весьма спекулятивным.Однако стоит отметить, что некоторые гены цитохрома Р450 связаны с повышенной устойчивостью к патогенным грибкам или бактериям, включая вклад в аллергические реакции69,70,71.
Пероксидазы класса III представляют собой многофункциональные ферменты растений, участвующие в широком спектре метаболических процессов во время роста и развития растений, а также в ответ на стрессы окружающей среды, такие как засоление, засуха, высокая интенсивность света и атака патогенов72.Пероксидазы участвуют во взаимодействии нескольких видов растений с Anthracis, включая Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,74,75,76.Ответ очень быстрый, иногда даже при 4 HPI, до того, как гриб проникнет в ткань растения73.Ген пероксидазы также реагировал на инокуляцию NLL D. toxica.В дополнение к их типичным функциям по регулированию окислительного взрыва или устранению окислительного стресса пероксидазы могут препятствовать росту патогенов, создавая физические барьеры, основанные на укреплении клеточной стенки во время лигнификации, субъединицы или поперечного связывания определенных соединений.Эта функция может быть приписана in silico гену TanjilG_03329, кодирующему предполагаемую формирующую лигнин анион-пероксидазу, которая была значительно усилена в нашем исследовании в устойчивой линии 83A:476 при 6 HPI, но не в других штаммах и временных точках, которые не реагировали.
9S-/13S-липоксигеназа линолевой кислоты является первой стадией окислительного пути биосинтеза липидов78.Продукты этого пути выполняют множество функций в защите растений, включая укрепление клеточной стенки за счет образования отложений каллозы и пектина и регуляцию окислительного стресса за счет производства активных форм кислорода79,80,81,82,83.В настоящем исследовании экспрессия 9S-/13S-липоксигеназы линолевой кислоты была изменена у всех штаммов, но в восприимчивой популяции 22660 в разные моменты времени преобладала апрегуляция, а у штаммов, несущих устойчивый Lanr1 и аллель AnMan, это подчеркивает диверсификацию оксилипинового слоя в протективных сибиреязвенных реакциях между этими генотипами.
Гомолог 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатоксидазы (АСО) значительно активировался (9 генов) или подавлялся (2 гена) при инокуляции люпином.За двумя исключениями, все эти реакции происходили при 6 л.с.в 83А:476.Ферментативная реакция, опосредованная белками ACO, является стадией, ограничивающей скорость образования этилена, и поэтому строго регулируется84.Этилен представляет собой растительный гормон, который играет различные роли в регуляции развития растений и реакции на абиотические и биотические стрессовые условия.Индукция транскрипции ACO и активация сигнального пути этилена участвуют в повышении устойчивости риса к гемибиотрофному грибу oryzae oryzae за счет регуляции продукции активных форм кислорода и фитоалексинов.Очень похожий процесс инфицирования листьев, обнаруженный между M. oryzae и C. lupini88,89, на фоне значительного усиления гомологов ACO в линии 83A:476, о котором сообщалось в этом исследовании, смещает возможность придания устойчивости к NLL антракнозу Ethylene в качестве сигнального центрального шага в молекулярных путях.
В настоящем исследовании крупномасштабное подавление многих генов, связанных с фотосинтезом, наблюдалось при 6 HPI у 83A:476 и при 48 HPI у Mandeloop и популяции 22660.Степень и прогрессирование этих изменений пропорциональны уровню.В этом эксперименте наблюдалась устойчивость к антракнозу.Недавно сообщалось о сильной и ранней репрессии транскриптов, связанных с фотосинтезом, в нескольких моделях взаимодействий растений и патогенов, включая патогенные бактерии и грибы.Поспешность (от 2 HPI в некоторых взаимодействиях) и глобальное подавление генов, связанных с фотосинтезом, в ответ на инфекцию могут запускать иммунитет растений, основанный на развертывании активных форм кислорода и их взаимодействии с путем салициловой кислоты для опосредования аллергических реакций 90,94.
В заключение, механизмы защитного ответа, предложенные для наиболее резистентной линии (83A:476), включают быстрое распознавание патогена геном R (предположительно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и опосредованную аллергической реакцией передачу сигналов салициловой кислотой и этиленом с последующим установлением SAR дальнего действия.действие поддерживается белком DIR-1.Следует отметить, что биотрофический период инфекции C. lupini очень короткий (примерно 2 дня), за которым следует некротический рост95.Переход между этими стадиями может быть связан с некрозом и экспрессией этилен-индуцируемых белков, которые действуют как триггеры реакций гиперчувствительности у растений-хозяев.Таким образом, временное окно для успешного отлова C. lupini на биотрофной стадии очень узкое.Перепрограммирование генов, связанных с окислительно-восстановительным потенциалом и фотосинтезом, наблюдаемое у 83A:476 при 6 hpi, согласуется с развитием гиф грибов и предвещает развитие успешного защитного ответа на биотрофной стадии.Транскриптомные ответы Mandelup и популяции 22660 могут быть слишком отсроченными, чтобы захватить грибок перед переключением на некротический рост, однако Mandelup может быть более эффективным, чем популяция 22660, поскольку относительно быстрая регуляция белка PR-10 способствует горизонтальной резистентности.
ETI, управляемый каноническим геном R, по-видимому, является обычным механизмом устойчивости фасоли к антракнозу.Таким образом, у модельного бобового растения Medicago truncatula устойчивость к антракнозу обеспечивается геном RCT1, членом класса генов R растений TIR-NBS-LRR97.Этот ген также придает люцерне устойчивость к антракнозу широкого спектра действия при переносе на восприимчивые растения.У фасоли обыкновенной (P. vulgaris) к настоящему времени идентифицировано более двух десятков генов устойчивости к антракнозу.Некоторые из этих генов находятся в регионах, где отсутствуют какие-либо канонические гены R, однако многие другие расположены на краях хромосом, несущих кластер генов NBS-LRR, включая TIR-NBS-LRRs99.Полногеномное исследование SSR также подтвердило связь гена NBS-LRR с устойчивостью к антракнозу у фасоли обыкновенной.Канонический ген R был также обнаружен в геномной области, несущей основной локус устойчивости к антракнозу у люпина белого 101.
В нашей работе показано, что реакция немедленной резистентности, активируемая на ранней стадии заражения растений (желательно не позднее 12 hpi), эффективно защищает люпин узколистный от антракноза, вызываемого патогенным грибом Collelotrichum lupini.Используя высокопроизводительное секвенирование, мы продемонстрировали дифференциальные профили экспрессии генов устойчивости к антракнозу в растениях NLL, опосредованных генами устойчивости Lanr1 и AnMan.Успешная защита включает в себя тщательное конструирование генов белков, участвующих в окислительно-восстановительном процессе, фотосинтезе и патогенезе, в течение нескольких часов после первого контакта растения с патогеном.Подобные защитные реакции, но отсроченные во времени, гораздо менее эффективны для защиты растений от болезней.Устойчивость к сибирской язве, опосредованная геном Lanr1, напоминает типичную быструю реакцию гена R (иммунитет, запускаемый эффектором), в то время как ген AnMan, скорее всего, обеспечивает горизонтальную реакцию (иммунитет, запускаемый молекулярным паттерном, ассоциированным с микробами), обеспечивая умеренный уровень устойчивости.
215 линий NLL, использованных для скрининга маркеров антракноза, состояли из 74 культурных сортов, 60 линий, полученных в результате скрещивания или селекции, 5 мутантов и 76 диких или исходных зародышевых плазм.Линии прибыли из 17 стран, в основном из Польши (58), Испании (47), Германии (27), Австралии (26), России (19), Белоруссии (7), Италии (5) и других линий.из 10 стран.Набор также включает эталонные устойчивые линии: 83A:476, Tanjil, Wonga, несущие аллель Lanr1, и Mandelup, несущие аллель AnMan.Линии были получены из Европейской базы данных генетических ресурсов люпина, поддерживаемой Poznań Plant Breeding Ltd., Вятрово, Польша (дополнительная таблица S1).
Растения выращивали в контролируемых условиях (фотопериод 16 часов, температура 25°С днем ​​и 18°С ночью).Были проанализированы две биологические повторности.ДНК выделяли из трехнедельных листьев с использованием набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с протоколом.Качество и концентрацию выделенной ДНК оценивали спектрофотометрическими методами (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Маркер AnManM1, маркирующий ген устойчивости к антракнозу AnMan (полученный от сорта Mandelup), и маркеры Anseq3 и Anseq4, фланкирующие ген Lanr1 (полученный от сорта Tanjil), были проанализированы 11, 26, 28.Гомозиготы по устойчивому аллелю оценивались как «1», восприимчивые — как «0», а гетерозиготы — как 0,5.
На основании результатов скрининга на маркеры AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и наличия семян для заключительных последующих экспериментов было отобрано 50 линий NLL для фенотипирования устойчивости к антракнозу.Анализ проводили в двух повторностях в управляемой компьютером теплице с 14-часовым фотопериодом при диапазоне температур 22°С днем ​​и 19°С ночью.Семена царапают (срезая семенную оболочку на противоположной стороне зародыша острым лезвием) перед посевом, чтобы предотвратить состояние покоя семян из-за слишком твердой семенной оболочки и обеспечить равномерное прорастание.Растения выращивали в горшках (11 × 11 × 21 см) со стерильной почвой (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польша).Инокуляцию проводили штаммом Colletotrichum lupini Col-08, выращенным в 1999 г. из стеблей растений люпина узколистного, выращенных на поле в Верженице, Великопольское (52° 27′ 42″ с.ш., 17° 04′ 05″ в.д.).Получите площадь.Изоляты культивировали в среде SNA при 20°С под черным светом в течение 21 дня для индуцирования спорообразования.Через четыре недели после посева, когда растения достигли стадии 4-6 листьев, инокуляцию проводили путем опрыскивания суспензией конидий в концентрации 0,5·106 конидий на мл.После инокуляции растения выдерживали в темноте в течение суток при влажности около 98% и температуре 25°С для облегчения прорастания конидий и процесса заражения.Затем растения выращивали при 14-часовом фотопериоде при 22°C днем/19°C ночью и влажности 70%.Оценка болезни проводилась через 22 дня после инокуляции и варьировалась от 0 (иммунный) до 9 (очень восприимчивый) в зависимости от наличия или отсутствия некротических поражений на стеблях и листьях.Кроме того, после подсчета очков измеряли массу растений.Связи между маркерными генотипами и фенотипами болезни рассчитывали как точечные двухпоследовательные корреляции (отсутствие гетерозиготных маркеров в наборе линий для анализа фенотипа устойчивости к антракнозу).