Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Существует потребность в надежной системе in vitro, которая может точно воспроизвести физиологическую среду сердца для тестирования лекарств.Ограниченная доступность систем культивирования тканей сердца человека привела к неточным интерпретациям эффектов кардиологических препаратов.Здесь мы разработали модель культуры сердечной ткани (CTCM), которая электромеханически стимулирует срезы сердца и подвергается физиологическому растяжению во время систолической и диастолической фаз сердечного цикла.После 12 дней культивирования этот подход частично улучшал жизнеспособность срезов сердца, но не полностью сохранял их структурную целостность.Таким образом, после скрининга малых молекул мы обнаружили, что добавление 100 нМ трийодтиронина (Т3) и 1 мкМ дексаметазона (Dex) к нашей среде поддерживало микроструктуру срезов в течение 12 дней.В сочетании с лечением T3/Dex система CTCM поддерживала профили транскрипции, жизнеспособность, метаболическую активность и структурную целостность на том же уровне, что и свежая ткань сердца, в течение 12 дней.Кроме того, чрезмерное растяжение сердечной ткани в культуре индуцирует гипертрофическую сердечную передачу сигналов, подтверждая способность CTCM имитировать гипертрофические состояния, вызванные растяжением сердца.В заключение, CTCM может моделировать физиологию и патофизиологию сердца в культуре в течение длительных периодов времени, обеспечивая надежный скрининг лекарств.
Перед клиническими исследованиями необходимы надежные системы in vitro, которые могут точно воспроизводить физиологическую среду человеческого сердца.Такие системы должны имитировать измененное механическое растяжение, частоту сердечных сокращений и электрофизиологические свойства.Животные модели обычно используются в качестве платформы для скрининга физиологии сердца с ограниченной надежностью отражения эффектов лекарств в сердце человека1,2.В конечном счете, идеальная экспериментальная модель сердечной ткани (CTCM) представляет собой модель, которая является высокочувствительной и специфичной для различных терапевтических и фармакологических вмешательств, точно воспроизводя физиологию и патофизиологию человеческого сердца3.Отсутствие такой системы ограничивает открытие новых методов лечения сердечной недостаточности4,5 и привело к тому, что кардиотоксичность лекарств стала основной причиной ухода с рынка6.
За последнее десятилетие восемь несердечно-сосудистых препаратов были изъяты из клинического применения, поскольку они вызывают удлинение интервала QT, приводящее к желудочковым аритмиям и внезапной смерти7.Таким образом, возрастает потребность в надежных стратегиях доклинического скрининга для оценки кардиоваскулярной эффективности и токсичности.Недавнее использование индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (hiPS-CM), в скрининге лекарств и тестировании на токсичность обеспечивает частичное решение этой проблемы.Однако незрелый характер hiPS-CMs и отсутствие многоклеточной сложности сердечной ткани являются основными ограничениями этого метода.Недавние исследования показали, что это ограничение может быть частично преодолено с помощью раннего использования hiPS-CM для формирования гидрогелей сердечной ткани вскоре после начала спонтанных сокращений и постепенного увеличения электрической стимуляции с течением времени.Однако этим микротканям hiPS-CM не хватает зрелых электрофизиологических и сократительных свойств взрослого миокарда.Кроме того, сердечная ткань человека имеет более сложную структуру, состоящую из гетерогенной смеси различных типов клеток, в том числе эндотелиальных клеток, нейронов и стромальных фибробластов, связанных между собой специфическими наборами белков внеклеточного матрикса.Эта гетерогенность некардиомиоцитарных популяций11,12,13 в сердце взрослых млекопитающих является основным препятствием для моделирования сердечной ткани с использованием индивидуальных типов клеток.Эти основные ограничения подчеркивают важность разработки методов культивирования неповрежденной ткани миокарда в физиологических и патологических условиях.
Культивируемые тонкие (300 мкм) срезы человеческого сердца оказались многообещающей моделью интактного человеческого миокарда.Этот метод обеспечивает доступ к полной трехмерной многоклеточной системе, подобной ткани человеческого сердца.Однако до 2019 г. использование культивируемых срезов сердца ограничивалось короткой (24 ч) выживаемостью культуры.Это связано с рядом факторов, включая отсутствие физико-механического растяжения, поверхность раздела воздух-жидкость и использование простых сред, которые не удовлетворяют потребности сердечной ткани.В 2019 году несколько исследовательских групп продемонстрировали, что включение механических факторов в системы культивирования сердечной ткани может продлить жизнь культуры, улучшить экспрессию сердца и имитировать сердечную патологию.Два элегантных исследования 17 и 18 показывают, что одноосная механическая нагрузка оказывает положительное влияние на сердечный фенотип во время культивирования.Однако в этих исследованиях не использовалась динамическая трехмерная физико-механическая нагрузка сердечного цикла, поскольку секции сердца нагружались либо изометрическими растягивающими силами 17, либо линейной ауксотонической нагрузкой 18 .Эти методы растяжения тканей приводили к подавлению многих кардиальных генов или сверхэкспрессии генов, связанных с аномальной реакцией на растяжение.Примечательно, что Питулис и соавт.19 разработали динамическую ванну для культивирования срезов сердца для реконструкции сердечного цикла с использованием обратной связи датчика силы и приводов натяжения.Хотя эта система позволяет более точно моделировать сердечный цикл in vitro, сложность и низкая производительность метода ограничивают применение этой системы.Наша лаборатория недавно разработала упрощенную систему культивирования с использованием электрической стимуляции и оптимизированной среды для поддержания жизнеспособности срезов ткани сердца свиньи и человека в течение 6 дней20,21.
В текущей рукописи мы описываем модель культуры сердечной ткани (CTCM) с использованием срезов сердца свиньи, которая включает гуморальные сигналы для повторения трехмерной физиологии сердца и патофизиологического растяжения во время сердечного цикла.Этот CTCM может повысить точность доклинического прогнозирования лекарств до уровня, который ранее не достигался, путем создания экономичной сердечной системы со средней пропускной способностью, которая имитирует физиологию/патофизиологию сердца млекопитающих для доклинического тестирования лекарств.
Гемодинамические механические сигналы играют критическую роль в поддержании функции кардиомиоцитов in vitro 22,23,24.В текущей рукописи мы разработали CTCM (рис. 1а), который может имитировать сердечную среду взрослого человека, вызывая как электрическую, так и механическую стимуляцию на физиологических частотах (1,2 Гц, 72 удара в минуту).Чтобы избежать чрезмерного растяжения ткани во время диастолы, было использовано устройство 3D-печати для увеличения размера ткани на 25% (рис. 1б).Электрическая стимуляция, индуцированная системой C-PACE, начиналась за 100 мс до систолы с использованием системы сбора данных для полного воспроизведения сердечного цикла.В системе культивирования ткани используется программируемый пневматический привод (LB Engineering, Германия) для циклического расширения гибкой силиконовой мембраны, что вызывает расширение срезов сердца в верхней камере.Система была подключена к внешней воздушной магистрали через датчик давления, что позволяло точно регулировать давление (± 1 мм рт. ст.) и время (± 1 мс) (рис. 1в).
a Прикрепите срез ткани к опорному кольцу диаметром 7 мм, показанному синим цветом, внутри культуральной камеры устройства.Культуральная камера отделена от воздушной камеры тонкой гибкой силиконовой мембраной.Поместите прокладку между каждой камерой, чтобы предотвратить утечки.Крышка устройства содержит графитовые электроды, обеспечивающие электрическую стимуляцию.b Схематическое изображение устройства для больших тканей, направляющего кольца и опорного кольца.Срезы ткани (коричневые) помещаются на увеличенное устройство с направляющим кольцом, помещенным в канавку на внешнем крае устройства.Используя направитель, осторожно поместите опорное кольцо, покрытое тканевым акриловым клеем, над срезом сердечной ткани.c График, показывающий время электрической стимуляции в зависимости от давления в воздушной камере, управляемого программируемым пневматическим приводом (PPD).Устройство сбора данных использовалось для синхронизации электрической стимуляции с использованием датчиков давления.Когда давление в культуральной камере достигает установленного порога, импульсный сигнал отправляется на C-PACE-EM для запуска электрической стимуляции.d Изображение четырех CTCM, размещенных на полке инкубатора.К одному ППД через пневматический контур подключены четыре устройства, а в гемостатический клапан вставлены датчики давления для контроля давления в пневматическом контуре.Каждое устройство содержит шесть секций ткани.
Используя один пневматический привод, мы смогли управлять 4 устройствами CTCM, каждое из которых могло удерживать 6 срезов ткани (рис. 1г).В CTCM давление воздуха в воздушной камере преобразуется в синхронное давление в жидкостной камере и вызывает физиологическое расширение среза сердца (рис. 2а и дополнительный фильм 1).Оценка растяжения тканей при 80 мм рт.Искусство.показали растяжение участков ткани на 25% (рис. 2б).Было показано, что это процентное растяжение соответствует физиологической длине саркомера 2,2-2,3 мкм для нормальной сократительной способности сердечного отдела17,19,25.Движение тканей оценивали с использованием пользовательских настроек камеры (дополнительный рисунок 1).Амплитуда и скорость движения тканей (рис. 2в, г) соответствовали растяжению во время сердечного цикла и времени в систолу и диастолу (рис. 2б).Растяжение и скорость сердечной ткани при сокращении и расслаблении оставались постоянными в течение 12 дней в культуре (рис. 2е).Чтобы оценить влияние электрической стимуляции на сократимость во время культивирования, мы разработали метод определения активной деформации с использованием алгоритма затенения (дополнительная рис. 2a, b) и смогли различать деформации с электрической стимуляцией и без нее.Тот же срез сердца (рис. 2е).В подвижной области разреза (R6-9) напряжение при электростимуляции было на 20 % выше, чем при отсутствии электростимуляции, что свидетельствует о вкладе электростимуляции в сократительную функцию.
Репрезентативные следы давления в воздушной камере, давления в камере для жидкости и измерения движения ткани подтверждают, что давление в камере изменяет давление в камере для жидкости, вызывая соответствующее движение среза ткани.b Репрезентативные следы процентного растяжения (синие) срезов ткани, соответствующие процентному растяжению (оранжевые).c Измеренное движение среза сердца соответствует измеренной скорости движения.(d) Репрезентативные траектории циклического движения (синяя линия) и скорости (оранжевая пунктирная линия) в срезе сердца.e Количественная оценка времени цикла (n = 19 срезов на группу, от разных свиней), времени сокращения (n = 19 срезов на группу), времени расслабления (n = 19 срезов на группу, от разных свиней), движения тканей (n = 25).срезов)/группу от разных свиней), пиковую систолическую скорость (n = 24(D0), 25(D12) срезов/группу от разных свиней) и пиковую скорость релаксации (n=24(D0), 25(D12) срезов/группу от разных свиней).Двусторонний t-критерий Стьюдента не показал существенной разницы ни по одному параметру.f Репрезентативные следы анализа деформации срезов тканей с (красный) и без (синий) электрической стимуляцией, десять региональных областей срезов ткани из одного и того же среза.Нижние панели показывают количественную оценку процентной разницы в деформации в срезах тканей с электрической стимуляцией и без нее в десяти областях из разных срезов. (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, задействованы двусторонние t-критерии Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；***p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；***p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонних критериев Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.
В нашей предыдущей статической биомиметической системе культивирования срезов сердца [20, 21] мы поддерживали жизнеспособность, функцию и структурную целостность срезов сердца в течение 6 дней, применяя электрическую стимуляцию и оптимизируя состав среды.Однако уже через 10 дней эти цифры резко упали.Мы будем ссылаться на срезы, культивированные в нашей предыдущей статической биомиметической системе культивирования 20, 21 контрольных условиях (Ctrl), и мы будем использовать нашу ранее оптимизированную среду в качестве условий MC и культивирования при одновременной механической и электрической стимуляции (CTCM).называется .Во-первых, мы определили, что механической стимуляции без электрической стимуляции недостаточно для поддержания жизнеспособности тканей в течение 6 дней (дополнительная рис. 3a, b).Интересно, что при введении физико-механической и электростимуляции с помощью СТКМ жизнеспособность 12-суточных срезов сердца оставалась такой же, как и на свежих срезах сердца в условиях МС, но не в условиях Ctrl, как показал МТТ-анализ (рис. 1).3а).Это говорит о том, что механическая стимуляция и имитация сердечного цикла могут поддерживать жизнеспособность срезов ткани в два раза дольше, чем сообщалось в нашей предыдущей системе статической культуры.Однако оценка структурной целостности срезов тканей с помощью иммуномечения сердечного тропонина Т и коннексина 43 показала, что экспрессия коннексина 43 была значительно выше в тканях ТК на 12-й день, чем в контроле в тот же день.Однако однородная экспрессия коннексина 43 и формирование Z-диска полностью не поддерживались (рис. 3b).Мы используем структуру искусственного интеллекта (ИИ) для количественной оценки структурной целостности ткани26, конвейер глубокого обучения на основе изображений, основанный на окрашивании тропонина-Т и коннексина43, для автоматической количественной оценки структурной целостности и флуоресценции срезов сердца с точки зрения силы локализации.В этом методе используется сверточная нейронная сеть (CNN) и структура глубокого обучения для надежной количественной оценки структурной целостности сердечной ткани автоматизированным и беспристрастным способом, как описано в ссылке.26. Ткань MC показала улучшенное структурное сходство с 0-м днем ​​по сравнению со статическими контрольными срезами.Кроме того, окрашивание трихромом по Массону выявило значительно более низкий процент фиброза в условиях МС по сравнению с контрольными условиями на 12-й день культивирования (рис. 3с).В то время как CTCM повышала жизнеспособность срезов сердечной ткани на 12-й день до уровня, аналогичного таковому для свежей сердечной ткани, она существенно не улучшала структурную целостность срезов сердца.
гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности МТТ свежих срезов сердца (D0) или культуры срезов сердца в течение 12 дней либо в статической культуре (D12 контрольный), либо в СТСМ (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрольный), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, выполнен односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). Гистограмма показывает количественную оценку МТТ-жизнеспособности свежих срезов сердца (D0) или культуры срезов сердца в течение 12 дней либо в статической культуре (D12 Ctrl), либо в СТСМ (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl).гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности МТТ свежих срезов сердца (D0) или культуры срезов сердца в течение 12 дней либо в статической культуре (D12 контроль), либо в СТСМ (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль)), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)гистограмма, показывающая количественную оценку жизнеспособности МТТ в свежих срезах сердца (D0) или срезах сердца, культивируемых в течение 12 дней в статической культуре (D12 контроль) или СТСМ (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль)) , 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, односторонний тест ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl).b Тропонин-Т (зеленый), коннексин 43 (красный) и DAPI (синий) в свежевыделенных срезах сердца (D0) или срезах сердца, культивируемых в статических условиях (Ctrl) или условиях CTCM (MC) в течение 12 дней) репрезентативных изображений иммунофлуоресценции (пустая шкала = 100 мкм). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, выполняется однофакторный тест ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, выполняется однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная структурная оценка общей сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, составляется однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, выполнен односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl).n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, однофакторный анализ ANOVA; ***p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 контроль), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, однофакторный анализ ANOVA; ***p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний анализ ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу для каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p<0,0001 по сравнению с .D0 Для сравнения ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/групп от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу разных свиней, высокого одностороннего теста ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа от разных свиней, выполнен односторонний тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 мкм）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比） 。 C 用 массон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 мкм） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/групп, каждый от другой свиньи, протест против однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (пусто = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа; ### # p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl).Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.
Мы предположили, что добавление небольших молекул в культуральную среду может улучшить целостность кардиомиоцитов и уменьшить развитие фиброза во время культивирования CTCM.Поэтому мы провели скрининг малых молекул, используя наши статические контрольные культуры20,21, из-за небольшого количества искажающих факторов.Для этого скрининга были выбраны дексаметазон (Dex), трийодтиронин (T3) и SB431542 (SB).Эти небольшие молекулы ранее использовались в культурах hiPSC-CM для индукции созревания кардиомиоцитов за счет увеличения длины саркомера, Т-трубочек и скорости проводимости.Кроме того, известно, что как Dex (глюкокортикоид), так и SB подавляют воспаление29,30.Поэтому мы проверили, улучшит ли включение одной или комбинации этих небольших молекул структурную целостность срезов сердца.Для начального скрининга доза каждого соединения была выбрана на основе концентраций, обычно используемых в моделях клеточных культур (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 и 2,5 мкМ SB31).Через 12 дней культивирования комбинация T3 и Dex привела к оптимальной структурной целостности кардиомиоцитов и минимальному ремоделированию волокон (дополнительные рисунки 4 и 5).Кроме того, использование двойных или двойных этих концентраций T3 и Dex вызывало вредные эффекты по сравнению с нормальными концентрациями (дополнительная рис. 6a, b).
После первоначального скрининга мы провели прямое сравнение 4 условий культивирования (рис. 4а): Ctrl: срезы сердца, культивированные в нашей ранее описанной статической культуре с использованием нашей оптимизированной среды;20.21 TD: T3 и Ctrl s добавлены Dex в среду;MC: срезы сердца, культивированные в CTCM с использованием нашей ранее оптимизированной среды;и МТ: CTCM с добавлением в среду T3 и Dex.Через 12 сут культивирования жизнеспособность тканей МС и МТ оставалась такой же, как и в свежих тканях, оцененных методом МТТ (рис. 4б).Интересно, что добавление T3 и Dex к культурам Transwell (TD) не привело к значительному улучшению жизнеспособности по сравнению с условиями Ctrl, что указывает на важную роль механической стимуляции в поддержании жизнеспособности срезов сердца.
Схема экспериментального дизайна, изображающая четыре условия культивирования, использованные для оценки эффектов механической стимуляции и добавки T3/Dex на среду в течение 12 дней. b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, выполнен односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ## #p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, выполнен односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ## #p<0,001 по сравнению с D0 и **p<0,01 по сравнению с D12 (контроль). b Гистограмма показывает количество значений чувствительности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с самыми последними срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ## #p<0,001 по сравнению с D0 и **p<0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001, ###p < 0,001 与D0 相比，**p < 0,01与D12控制）。б 4 12 (Д12 МС) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с самыми последними срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,0 01 по сравнению с D0, **p<0,01 по сравнению с контролем D12). b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезов/группа, односторонний тест ANOVA; ####p<0,0001, ###p<0,001 по сравнению с D0, **p<0 0,01 по сравнению с контролем D12). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количество положительных потоков энергии через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с самыми последними срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, однонаправленный Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, выполнен односторонний тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001, 与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA测试；###p < 0,001, 与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количество положительных потоков глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с последними срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Анализ ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, были проведены односторонние тесты Were ANOVA, ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (контроль).d Графики анализа деформации свежих (синий), 12-дневный MC (зеленый) и 12-дневный MT (красный) тканей в десяти точках региональных срезов ткани (n = 4 среза/группа, односторонний тест ANOVA; существенных различий между группами не было).e График вулкана, показывающий дифференциальную экспрессию генов в свежих срезах сердца (D0) по сравнению с срезами сердца, культивируемыми в статических условиях (Ctrl) или в условиях МТ (МТ) в течение 10-12 дней.f Тепловая карта генов саркомеров для срезов сердца, культивируемых в каждом из условий культивирования.Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.
Метаболическая зависимость от переключения с окисления жирных кислот на гликолиз является отличительной чертой дедифференцировки кардиомиоцитов.Незрелые кардиомиоциты в основном используют глюкозу для производства АТФ и имеют гипопластические митохондрии с небольшим количеством крист5,32.Анализы утилизации глюкозы показали, что в условиях MC и MT утилизация глюкозы была аналогична таковой в тканях дня 0 (рис. 4c).Однако образцы Ctrl показали значительное увеличение утилизации глюкозы по сравнению со свежей тканью.Это указывает на то, что комбинация CTCM и T3/Dex повышает жизнеспособность тканей и сохраняет метаболический фенотип 12-дневных культивируемых срезов сердца.Кроме того, анализ деформации показал, что уровни деформации оставались такими же, как и в свежей ткани сердца, в течение 12 дней в условиях МТ и МС (рис. 4d).
Чтобы проанализировать общее влияние CTCM и T3/Dex на глобальный транскрипционный ландшафт ткани сердечного среза, мы выполнили РНКсек на срезах сердца из всех четырех различных условий культивирования (дополнительные данные 1).Интересно, что срезы МТ показали высокое транскрипционное сходство со свежей тканью сердца, причем только 16 дифференциально экспрессировались из 13 642 генов.Однако, как мы показали ранее, срезы Ctrl показали 1229 дифференциально экспрессированных генов через 10–12 дней в культуре (рис. 4д).Эти данные были подтверждены qRT-PCR генов сердца и фибробластов (дополнительная рис. 7a-c).Интересно, что секции Ctrl показали подавление генов сердечного и клеточного цикла и активацию программ воспалительных генов.Эти данные свидетельствуют о том, что дедифференцировка, которая обычно происходит после длительного культивирования, полностью ослабляется в условиях МТ (дополнительная рис. 8a, b).Тщательное изучение генов саркомеров показало, что только в условиях МТ сохраняются гены, кодирующие саркомер (рис. 4f) и ионный канал (дополнительная рис. 9), защищая их от подавления в условиях Ctrl, TD и MC.Эти данные демонстрируют, что при сочетании механической и гуморальной стимуляции (T3/Dex) транскриптом среза сердца может оставаться таким же, как и у свежих срезов сердца после 12 дней культивирования.
Эти транскрипционные данные подтверждаются тем фактом, что структурная целостность кардиомиоцитов в срезах сердца лучше всего сохраняется в условиях МТ в течение 12 дней, как показано интактным и локализованным коннексином 43 (Fig. 5a).Кроме того, фиброз в срезах сердца в условиях МТ был значительно уменьшен по сравнению с контрольной группой и аналогичен свежим срезам сердца (рис. 5б).Эти данные демонстрируют, что комбинация механической стимуляции и лечения T3/Dex эффективно сохраняет сердечную структуру в срезах сердца в культуре.
a Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения тропонина-Т (зеленый), коннексина 43 (красный) и DAPI (синий) в свежевыделенных срезах сердца (D0) или культивируемых в течение 12 дней во всех четырех условиях культивирования срезов сердца (масштабная линейка = 100 мкм).). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структуры целостности тканей сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с использованием искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполнен однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p <0,05 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或***p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с использованием искусственного интеллекта у разных свиней (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группа) с односторонним тестом ANOVA;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная полоса = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001, или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная полоса = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001, или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масса (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных разных тестов свиней, высокой односторонней оценки ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групп от разных свиней, выполненный однофакторный дисперсионный анализ; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 или ****p <0,00 01 по сравнению с D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 мкм）（n = 10（D0, D12 Ctrl, D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 массон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 мкм） （n = 10 （d0 、 d12 c trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组,进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001, 或***p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / групп, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней в группе, один метод ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 или ****p <0,0001 по сравнению до D12 Ctrl).Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.
Наконец, способность CTCM имитировать гипертрофию сердца оценивали по увеличению растяжения сердечной ткани.В CTCM пиковое давление в воздушной камере увеличилось с 80 мм рт.ст. до 80 мм рт.ст.Искусство.(нормальное растяжение) до 140 мм рт.ст.(рис. 6а).Это соответствует увеличению растяжения на 32% (рис. 6b), которое ранее было показано как соответствующее процентное растяжение, необходимое для срезов сердца для достижения длины саркомера, аналогичной наблюдаемой при гипертрофии.Растяжение и скорость сердечной ткани во время сокращения и расслабления оставались постоянными в течение шести дней культивирования (рис. 6в).Сердечная ткань из условий MT подвергалась нормальному растяжению (MT (Normal)) или условиям перерастяжения (MT (OS)) в течение шести дней.Уже через четыре дня в культуре гипертрофический биомаркер NT-ProBNP был значительно повышен в среде в условиях МТ (ОС) по сравнению с МТ (нормальными) условиями (рис. 7а).Кроме того, через шесть дней культивирования размер клеток в МТ (ОС) (рис. 7б) значительно увеличился по сравнению со срезами МТ сердца (норма).Кроме того, ядерная транслокация NFATC4 была значительно увеличена в перерастянутых тканях (рис. 7в).Эти результаты показывают прогрессивное развитие патологического ремоделирования после гиперрастяжения и подтверждают концепцию, согласно которой устройство CTCM можно использовать в качестве платформы для изучения передачи сигналов сердечной гипертрофии, вызванной растяжением.
Репрезентативные следы давления в воздушной камере, давления в камере для жидкости и измерения движения ткани подтверждают, что давление в камере изменяет давление в камере для жидкости, вызывая соответствующее движение среза ткани.b Репрезентативные кривые процента растяжения и скорости растяжения для нормально растянутых (оранжевые) и перерастянутых (синие) участков ткани.c Гистограмма, показывающая время цикла (n = 19 срезов на группу, от разных свиней), время сокращения (n = 18-19 срезов на группу, от разных свиней), время релаксации (n = 19 срезов на группу, от разных свиней)), амплитуду движения ткани (n = 14 срезов на группу, от разных свиней), пиковую систолическую скорость (n = 14 срезов на группу, от разных свиней) и максимальную скорость расслабления (n = 14 (D0), 1 5 (D6) ) срезов/групп) от разных свиней), двусторонний t-критерий Стьюдента не показал существенной разницы ни по одному параметру, что указывает на то, что эти параметры оставались постоянными в течение 6 дней культивирования при перенапряжении.Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.
гистограмма Количественное определение концентрации NT-ProBNP в культуральной среде из срезов сердца, культивируемых в условиях нормального растяжения (норма) или перенапряжения (OS) МТ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) срезов/группу от разных свиней, выполняется двухсторонний ANOVA; **p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). гистограмма Количественное определение концентрации NT-ProBNP в культуральной среде из срезов сердца, культивированных в условиях МТ при нормальном растяжении (норма) или перенапряжении (ОС) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) срезов/группу от разных свиней, выполняется двухсторонний ANOVA; **p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением).Количественная гистограмма концентрации NT-ProBNP в культуральной среде из срезов сердца, культивируемых в условиях нормального растяжения МТ (норма) или перерастяжения (ОС) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4).MTOS) срезов/группу от разных свиней, проведен двухфакторный дисперсионный анализ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным лечением). **p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) ，p < 0,01）。 a Количественная оценка концентрации NT-ProBNP в срезах сердца, культивируемых в условиях нормального растяжения (норма) или перенапряжения (OS) МТ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, D4 MTOS) из разных источников. ; **по сравнению с нормальным растяжением, p < 0,01).гистограмма Количественная оценка концентраций NT-ProBNP в срезах сердца, культивируемых в условиях нормального растяжения МТ (норма) или перерастяжения (ОС) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) и D4 MTOS) срезов/группу от разных свиней, двусторонний дисперсионный анализ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным лечением). **p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группа из 10 разных срезов от разных свиней, выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественной оценки размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размеров клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два-рассчитанных хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным ростом). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и AZP (слева), и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 различных срезов от разных свиней, был проведен двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным штаммом). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，***p < 0,0001）。 b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных калькареином-T и WGA (слева) и размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 из 10 различных срезов (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t-тест；по сравнению с нормальным растяжением，***p<0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественной оценки размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группы, двусторонние критерии Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным воздействием). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и AZP (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 разных срезов от разных свиней) Клетки/группа, двусторонний критерий Стьюдента t;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным штаммом). c Репрезентативные изображения для 0-го и 6-го дня срезов сердца MTOS, иммуномаркированных для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезы/группа от разных свиней, двусторонний t-критерий Стьюдента; * p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней, выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; * p <0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядрах кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней, высокий двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца на 0-й и 6-й дни MTOS, иммуномеченые для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядре кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней) выполняли двусторонний t-критерий Стьюдента;*р < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Репрезентативные изображения срезов сердца с иммуномечением кальканина-Т и NFATC4 (0, 6, MTOS) и NFATC4 из различных ядер клеток NFATC4 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)).生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественной оценки транслокации NFATC4 в ядрах КМ от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, двуххвостый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественной оценки транслокации NFATC4 в ядре CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезы / группа, двусторонний t-критерий Стьюдента; * p <0,05).Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.
Трансляционные сердечно-сосудистые исследования требуют клеточных моделей, которые точно воспроизводят сердечную среду.В этом исследовании было разработано и охарактеризовано устройство CTCM, которое может стимулировать ультратонкие срезы сердца.Система CTCM включает физиологически синхронизированную электромеханическую стимуляцию и обогащение жидкости T3 и Dex.Когда срезы сердца свиньи подвергались воздействию этих факторов, их жизнеспособность, структурная целостность, метаболическая активность и экспрессия транскрипции оставались такими же, как и в свежей сердечной ткани после 12 дней культивирования.Кроме того, чрезмерное растяжение сердечной ткани может вызвать гипертрофию сердца, вызванную перерастяжением.В целом, эти результаты подтверждают критическую роль физиологических условий культивирования в поддержании нормального сердечного фенотипа и обеспечивают платформу для скрининга лекарств.
Многие факторы способствуют созданию оптимальной среды для функционирования и выживания кардиомиоцитов.Наиболее очевидные из этих факторов связаны с (1) межклеточными взаимодействиями, (2) электромеханической стимуляцией, (3) гуморальными факторами и (4) метаболическими субстратами.Физиологические межклеточные взаимодействия требуют сложных трехмерных сетей множества типов клеток, поддерживаемых внеклеточным матриксом.Такие сложные клеточные взаимодействия трудно реконструировать in vitro путем совместного культивирования отдельных типов клеток, но их можно легко осуществить, используя органотипическую природу срезов сердца.
Механическое растяжение и электрическая стимуляция кардиомиоцитов имеют решающее значение для поддержания сердечного фенотипа33,34,35.В то время как механическая стимуляция широко использовалась для кондиционирования и созревания hiPSC-CM, в нескольких элегантных исследованиях недавно была предпринята попытка механической стимуляции срезов сердца в культуре с использованием одноосной нагрузки.Эти исследования показывают, что двумерная одноосная механическая нагрузка оказывает положительное влияние на фенотип сердца во время культивирования.В этих исследованиях секции сердца либо нагружались изометрическими растягивающими силами17, линейной ауксотонической нагрузкой18, либо сердечный цикл воссоздавался с использованием обратной связи преобразователя силы и приводов напряжения.Однако в этих методах используется одноосное растяжение ткани без оптимизации окружающей среды, что приводит к подавлению многих кардиальных генов или сверхэкспрессии генов, связанных с аномальной реакцией на растяжение.Описанный здесь СТСМ обеспечивает трехмерный электромеханический стимул, который имитирует естественный сердечный цикл с точки зрения времени цикла и физиологического растяжения (растяжение 25%, систола 40%, диастола 60% и 72 удара в минуту).Хотя одной этой трехмерной механической стимуляции недостаточно для поддержания целостности ткани, для адекватного поддержания жизнеспособности, функции и целостности ткани необходима комбинация гуморальной и механической стимуляции с использованием T3/Dex.
Гуморальные факторы играют важную роль в модулировании фенотипа сердца взрослого человека.Это было подчеркнуто в исследованиях HiPS-CM, в которых T3 и Dex добавляли в культуральную среду для ускорения созревания клеток.T3 может влиять на транспорт аминокислот, сахаров и кальция через клеточные мембраны36.Кроме того, Т3 способствует экспрессии MHC-α и подавлению MHC-β, способствуя образованию быстро сокращающихся миофибрилл в зрелых кардиомиоцитах по сравнению с медленно сокращающимися миофибриллами у плода CM.Дефицит Т3 у пациентов с гипотиреозом приводит к потере миофибриллярных тяжей и снижению скорости развития тонуса37.Dex действует на глюкокортикоидные рецепторы и, как было показано, увеличивает сократительную способность миокарда в изолированном перфузируемом сердце;38 считается, что это улучшение связано с влиянием на вход, обусловленный отложениями кальция (SOCE) 39,40.Кроме того, Dex связывается с его рецепторами, вызывая широкий внутриклеточный ответ, который подавляет иммунную функцию и воспаление30.
Наши результаты показывают, что физическая механическая стимуляция (МС) улучшила общую производительность культуры по сравнению с Ctrl, но не смогла сохранить жизнеспособность, структурную целостность и сердечную экспрессию в течение 12 дней в культуре.По сравнению с Ctrl добавление T3 и Dex к культурам CTCM (MT) улучшало жизнеспособность и сохраняло сходные профили транскрипции, структурную целостность и метаболическую активность со свежей тканью сердца в течение 12 дней.Кроме того, контролируя степень растяжения ткани, с помощью STCM была создана модель гипертрофии сердца, вызванная перерастяжением, что иллюстрирует универсальность системы STCM.Следует отметить, что хотя ремоделирование сердца и фиброз обычно затрагивают интактные органы, чьи циркулирующие клетки могут обеспечивать соответствующие цитокины, а также фагоцитоз и другие факторы ремоделирования, секции сердца все же могут имитировать фиброзный процесс в ответ на стресс и травму.в миофибробласты.Это было ранее оценено в этой модели сердечного среза.Следует отметить, что параметры CTCM можно модулировать, изменяя давление/электрическую амплитуду и частоту, чтобы имитировать многие состояния, такие как тахикардия, брадикардия и механическая поддержка кровообращения (механическое разгруженное сердце).Это делает систему средней пропускной способностью для тестирования на наркотики.Способность CTCM моделировать гипертрофию сердца, вызванную перенапряжением, прокладывает путь для тестирования этой системы для персонализированной терапии.В заключение, настоящее исследование демонстрирует, что механическое растяжение и гуморальная стимуляция имеют решающее значение для поддержания культуры срезов сердечной ткани.
Хотя представленные здесь данные свидетельствуют о том, что CTCM является очень многообещающей платформой для моделирования интактного миокарда, этот метод культуры имеет некоторые ограничения.Основным ограничением культуры CTCM является то, что она создает непрерывные динамические механические нагрузки на срезы, что исключает возможность активного мониторинга сокращений срезов сердца во время каждого цикла.Кроме того, из-за небольшого размера срезов сердца (7 мм) возможность оценки систолической функции вне культуральных систем с использованием традиционных датчиков силы ограничена.В текущей рукописи мы частично преодолеваем это ограничение, оценивая оптическое напряжение как показатель сократительной функции.Однако это ограничение потребует дальнейшей работы и может быть устранено в будущем путем внедрения методов оптического мониторинга функции срезов сердца в культуре, таких как оптическое картирование с использованием кальция и чувствительных к напряжению красителей.Еще одним ограничением CTCM является то, что рабочая модель не манипулирует физиологическим стрессом (преднагрузка и постнагрузка).В CTCM давление индуцировали в противоположных направлениях, чтобы воспроизвести 25% физиологического растяжения в диастолу (полное растяжение) и систолу (длительность сокращения во время электрической стимуляции) в очень больших тканях.Это ограничение должно быть устранено в будущих конструкциях CTCM за счет адекватного давления на сердечную ткань с обеих сторон и применения точных соотношений давление-объем, которые возникают в камерах сердца.
Ремоделирование, вызванное перерастяжением, о котором сообщается в этой рукописи, ограничивается имитацией сигналов гипертрофического гиперрастяжения.Таким образом, эта модель может помочь в изучении индуцированной растяжением гипертрофической передачи сигналов без необходимости использования гуморальных или нервных факторов (которые не существуют в этой системе).Необходимы дальнейшие исследования для увеличения множественности CTCM, например, совместное культивирование с иммунными клетками, циркулирующими плазменными гуморальными факторами и иннервацией при совместном культивировании с нейрональными клетками улучшит возможности моделирования заболеваний с помощью CTCM.
В этом исследовании использовали тринадцать свиней.Все процедуры с животными проводились в соответствии с установленными правилами и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Луисвилля.Дугу аорты пережимали и сердце перфузировали 1 л стерильной кардиоплегии (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 ЕД/мл гепарина, рН до 7,4); сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. сердца хранятся в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердце в ледяной кардиоплегии в транспортной лаборатории на льду, обычно <10 мин. Держите сердца на льду кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин.
Устройство CTCM было разработано в программе автоматизированного проектирования (САПР) SolidWorks.Культуральные камеры, перегородки и воздушные камеры изготовлены из прозрачного акрилового пластика с ЧПУ.Опорное кольцо диаметром 7 мм изготовлено из полиэтилена высокой плотности (ПЭВП) в центре и имеет канавку для уплотнительного кольца для размещения силиконового уплотнительного кольца, используемого для герметизации среды под ним.Тонкая кремнеземная мембрана отделяет культуральную камеру от разделительной пластины.Силиконовая мембрана вырезается лазером из силиконового листа толщиной 0,02 дюйма и имеет твердость 35А.Нижняя и верхняя силиконовые прокладки вырезаны лазером из силиконового листа толщиной 1/16 дюйма и имеют твердость 50А.Винты и барашковые гайки из нержавеющей стали 316L используются для крепления блока и создания воздухонепроницаемого уплотнения.
Специальная печатная плата (PCB) предназначена для интеграции с системой C-PACE-EM.Гнезда разъема швейцарской машины на печатной плате соединены с графитовыми электродами с помощью посеребренных медных проводов и бронзовых винтов 0-60, ввинченных в электроды.Печатная плата помещается в крышку 3D-принтера.
Устройство CTCM управляется программируемым пневматическим приводом (PPD), который создает контролируемое циркуляторное давление, аналогичное сердечному циклу.По мере того, как давление внутри воздушной камеры увеличивается, гибкая силиконовая мембрана расширяется вверх, заталкивая среду под участок ткани.Затем область ткани будет растягиваться за счет этого изгнания жидкости, имитируя физиологическое расширение сердца во время диастолы.На пике релаксации через графитовые электроды применяли электрическую стимуляцию, которая снижала давление в воздушной камере и вызывала сокращение участков тканей.Внутри трубы находится гемостатический клапан с датчиком давления для определения давления в воздушной системе.Давление, измеряемое датчиком давления, подается на коллектор данных, подключенный к ноутбуку.Это позволяет осуществлять непрерывный контроль давления внутри газовой камеры.Когда было достигнуто максимальное давление в камере (стандартное 80 мм рт.ст., 140 мм рт.ст. OS), устройству сбора данных было приказано отправить сигнал в систему C-PACE-EM для генерации двухфазного сигнала напряжения в течение 2 мс, установленного на 4 В.
Были получены срезы сердца и условия культивирования в 6 лунках были выполнены следующим образом: Перенесли собранные сердца из сосуда для переноса в лоток, содержащий холодную (4°С) кардиоплегию.Левый желудочек изолировали стерильным лезвием и разрезали на кусочки по 1-2 см3.Эти блоки ткани прикрепляли к тканевым подложкам с помощью тканевого клея и помещали в ванну для тканей с вибрирующим микротомом, содержащую раствор Тирода и непрерывно оксигенируемый (3 г/л 2,3-бутандионмонооксима (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкозы (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М раствора), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М раствора), до 1 л ddH2O).Вибрационный микротом был настроен на резку срезов толщиной 300 мкм с частотой 80 Гц, амплитудой горизонтальной вибрации 2 мм и скоростью продвижения 0,03 мм/с.Баню с тканями окружали льдом, чтобы раствор оставался прохладным, а температуру поддерживали на уровне 4°C.Перенесите срезы тканей из ванны микротома в инкубационную ванну, содержащую постоянно насыщенный кислородом раствор Tyrode на льду, пока не будет получено достаточно секций для одной культуральной пластины.Для трансвелловых культур срезы тканей прикрепляли к стерильным полиуретановым подложкам шириной 6 мм и помещали в 6 мл оптимизированной среды (среда 199, 1x добавка ITS, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-щелочной и 2X антибиотик-противогрибковый).Электрическую стимуляцию (10 В, частота 1,2 Гц) применяли к срезам ткани через C-Pace.Для условий TD свежий T3 и Dex добавляли в количестве 100 нМ и 1 мкМ при каждой смене среды.Среду насыщают кислородом перед заменой 3 раза в сутки.Срезы тканей культивировали в термостате при 37°С и 5% СО2.
Для культур CTCM срезы тканей помещали на изготовленный по индивидуальному заказу 3D-принтер в чашку Петри, содержащую модифицированный раствор Тирода.Устройство предназначено для увеличения размера среза сердца на 25% от площади опорного кольца.Это делается для того, чтобы срезы сердца не растягивались после переноса из раствора Тирода в среду и во время диастолы.С помощью гистоакрилового клея срезы толщиной 300 мкм фиксировали на опорном кольце диаметром 7 мм.После прикрепления срезов ткани к опорному кольцу отрежьте лишние срезы ткани и поместите прикрепленные срезы ткани обратно в ванну с раствором Tyrode на льду (4°C) до тех пор, пока не будет подготовлено достаточное количество срезов для одного устройства.Общее время обработки для всех устройств не должно превышать 2 часов.После того, как 6 срезов ткани были прикреплены к их опорным кольцам, было собрано устройство CTCM.Культуральную камеру CTCM предварительно заполняют 21 мл преоксигенированной среды.Перенесите срезы ткани в камеру для культивирования и осторожно удалите все пузырьки воздуха с помощью пипетки.Затем срез ткани направляется в отверстие и аккуратно прижимается к месту.Наконец, поместите колпачок электрода на устройство и перенесите устройство в инкубатор.Затем подключите CTCM к воздушной трубке и системе C-PACE-EM.Пневматический привод открывается, а воздушный клапан открывает CTCM.Система C-PACE-EM была настроена на подачу 4 В с частотой 1,2 Гц во время двухфазной стимуляции в течение 2 мс.Среду меняли дважды в день, а электроды меняли один раз в день, чтобы избежать накопления графита на электродах.При необходимости срезы тканей можно извлечь из лунок для культивирования, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, которые могли попасть под них.Для условий обработки МТ T3/Dex добавляли в свежем виде при каждой смене среды с 100 нМ T3 и 1 мкМ Dex.Устройства СТСМ культивировали в инкубаторе при 37°C и 5% CO2.
Для получения растянутых траекторий срезов сердца была разработана специальная система камер.Зеркальная камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) использовалась с макрообъективом Navitar Zoom 7000 18–108 мм (Navitar, Сан-Франциско, Калифорния).Визуализацию проводили при комнатной температуре после замены среды на свежую.Камера расположена под углом 51°, а видео записывается со скоростью 30 кадров в секунду.Во-первых, программное обеспечение с открытым исходным кодом (MUSCLEMOTION43) использовалось с Image-J для количественной оценки движения срезов сердца.Маска была создана с использованием MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) для определения областей интереса для срезов бьющегося сердца, чтобы избежать шума.Сегментированные вручную маски применяются ко всем изображениям в последовательности кадров, а затем передаются подключаемому модулю MUSCLEMOTION.Muscle Motion использует среднюю интенсивность пикселей в каждом кадре для количественной оценки его движения относительно эталонного кадра.Данные регистрировались, фильтровались и использовались для количественной оценки времени цикла и оценки растяжения тканей во время сердечного цикла.Записанное видео подвергалось постобработке с использованием нуль-фазового цифрового фильтра первого порядка.Для количественной оценки растяжения ткани (от пика к пику) был выполнен анализ пика к пику, чтобы различать пики и впадины в записанном сигнале.Кроме того, удаление тренда выполняется с использованием полинома 6-го порядка для устранения дрейфа сигнала.Программный код был разработан в MATLAB для определения глобального движения ткани, времени цикла, времени релаксации и времени сокращения (код дополнительной программы 44).
Для анализа деформации, используя те же видеоролики, созданные для оценки механического растяжения, мы сначала проследили два изображения, представляющие пики движения (самую высокую (верхнюю) и самую низкую (нижнюю) точки движения) в соответствии с программным обеспечением MUSCLEMOTION.Затем мы сегментировали области ткани и применили алгоритм затенения к сегментированной ткани (дополнительная рис. 2a).Затем сегментированная ткань была разделена на десять подповерхностей, и напряжение на каждой поверхности было рассчитано с использованием следующего уравнения: деформация = (Sup-Sdown)/Sdown, где Sup и Sdown — это расстояния формы от верхней и нижней теней ткани соответственно (дополнительный рис. 2b).
Срезы сердца фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 48 часов.Фиксированные ткани обезвоживали в 10% и 20% сахарозе в течение 1 ч, затем в 30% сахарозе в течение ночи.Затем срезы заливали компаундом с оптимальной температурой резания (компаунд ОСТ) и постепенно замораживали в ванне с изопентаном/сухим льдом.Храните встраивающие блоки OCT при температуре -80 градусов по Цельсию до разделения.Предметные стекла готовили в виде срезов толщиной 8 мкм.
Чтобы удалить ОКТ из срезов сердца, нагрейте слайды на нагревательном блоке при 95 ° С в течение 5 мин.Добавьте 1 мл PBS на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, затем пропитайте срезы, установив 0,1% Triton-X в PBS на 15 минут при комнатной температуре.Для предотвращения связывания неспецифических антител с образцом на предметные стекла добавляют 1 мл 3% раствора БСА и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.Затем BSA удаляли, а предметные стекла промывали PBS.Отметьте каждый образец карандашом.Первичные антитела (разведенные 1:200 в 1% БСА) (коннексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) и тропонин-Т (Thermo Scientific; #MA5-12960) добавляли в течение 90 минут, затем вторичные антитела (разбавленные 1:200 в 1% БСА) против мышиной Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), против кролика Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) в течение дополнительных 90 минут. Промыли 3 раза PBS. Чтобы отличить окрашивание мишени от фона, мы использовали только вторичное антитело в качестве контроля. Наконец, добавляли краситель для ядер DAPI и предметные стекла помещали в прибор vectashield (Vector Laboratories) и закрывали лаком для ногтей (х-кратное увеличение) и под микроскоп Keyence с 40-кратным увеличением.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) в концентрации 5 мкг/мл в PBS использовали для окрашивания WGA и наносили на фиксированные срезы на 30 минут при комнатной температуре.Затем предметные стекла промывали PBS, к каждому предметному стеклу добавляли суданскую чернь и инкубировали в течение 30 минут.Затем предметные стекла промывали PBS и добавляли среду для заливки vectashield.Слайды визуализировали на микроскопе Keyence при 40-кратном увеличении.
ОКТ удаляли из образцов, как описано выше.После удаления OCT погрузите слайды в раствор Буэна на ночь.Затем предметные стекла промывали дистиллированной водой в течение 1 часа, а затем помещали в раствор фуксина алоэ-кислоты Bibrich на 10 минут.Затем предметные стекла промывали дистиллированной водой и помещали в раствор 5% фосфомолибдена/5% фосфорно-вольфрамовой кислоты на 10 минут.Не промывая, перенесите слайды непосредственно в раствор анилинового синего на 15 минут.Затем предметные стекла промывали дистиллированной водой и помещали в 1% раствор уксусной кислоты на 2 мин.Предметные стекла сушили в 200 н этаноле и переносили в ксилол.Окрашенные препараты визуализировали с помощью микроскопа Keyence с объективом 10x.Процент площади фиброза определяли количественно с помощью программного обеспечения Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталожный номер V13154, в соответствии с протоколом производителя с некоторыми изменениями.В частности, для обеспечения однородного размера ткани при МТТ-анализе использовали хирургический пуансон диаметром 6 мм.Ткани индивидуально высевали в лунки 12-луночного планшета, содержащего субстрат МТТ, в соответствии с протоколом производителя.Срезы инкубируют при 37°С в течение 3 часов, и живая ткань метаболизирует субстрат МТТ с образованием соединения формазана пурпурного цвета.Замените раствор МТТ 1 мл ДМСО и инкубируйте при 37 ° C в течение 15 минут, чтобы извлечь пурпурный формазан из срезов сердца.Образцы разбавляли 1:10 в ДМСО в 96-луночных планшетах с прозрачным дном и измеряли интенсивность пурпурного окрашивания при 570 нм с использованием планшет-ридера Cytation (BioTek).Показания нормализовали к массе каждого среза сердца.
Среду для срезов сердца заменяли средой, содержащей 1 мкКи/мл [5-3H]-глюкозы (Moravek Biochemicals, Бреа, Калифорния, США) для анализа утилизации глюкозы, как описано ранее.Через 4 часа инкубации добавьте 100 мкл среды в открытую микроцентрифужную пробирку, содержащую 100 мкл 0,2 N HCl.Затем пробирку помещали в сцинтилляционную пробирку, содержащую 500 мкл dH2O, для испарения [3H]2O в течение 72 часов при 37°C.Затем извлеките микроцентрифужную пробирку из сцинтилляционной пробирки и добавьте 10 мл сцинтилляционной жидкости.Сцинтилляционный подсчет проводили с использованием жидкостного сцинтилляционного анализатора Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Мериден, Коннектикут, США).Затем рассчитывали утилизацию глюкозы с учетом удельной активности [5-3H]-глюкозы, неполного равновесия и фона, разбавления [5-3H]-до немеченой глюкозы и эффективности сцинтилляционного счетчика.Данные нормированы на массу отделов сердца.
После гомогенизации ткани в тризоле РНК выделяли из срезов сердца с помощью набора Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 в соответствии с протоколом производителя.Подготовку библиотеки РНКсек, секвенирование и анализ данных проводили следующим образом:
1 мкг РНК на образец использовали в качестве исходного материала для приготовления библиотеки РНК.Библиотеки секвенирования были созданы с использованием набора для подготовки библиотеки РНК NEBNext UltraTM для Illumina (NEB, США) в соответствии с рекомендациями производителя, и индексные коды были добавлены к последовательностям атрибутов для каждого образца.Вкратце, мРНК очищали от тотальной РНК с использованием магнитных шариков, прикрепленных поли-Т-олигонуклеотидами.Фрагментацию проводят с использованием двухвалентных катионов при высокой температуре в реакционном буфере синтеза первой цепи NEBNext (5X).кДНК первой цепи синтезировали с использованием случайных гексамерных праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV (РНКаза H-).Затем синтезируют кДНК второй цепи с использованием ДНК-полимеразы I и РНКазы H. Оставшиеся выступы превращаются в тупые концы под действием экзонуклеазной/полимеразной активности.После аденилирования 3'-конца фрагмента ДНК к нему прикрепляют NEBNext Adapter со структурой петли-шпильки, чтобы подготовить его к гибридизации.Для отбора фрагментов кДНК предпочтительна длина 150-200 п.н.фрагменты библиотеки очищали с помощью системы AMPure XP (Beckman Coulter, Беверли, США).Затем использовали 3 мкл USER Enzyme (NEB, США) с кДНК выбранного размера, лигированной адаптером, в течение 15 минут при 37°C, а затем в течение 5 минут при 95°C перед ПЦР.Затем проводили ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Phusion High-Fidelity, универсальных праймеров для ПЦР и праймеров Index (X).Наконец, продукты ПЦР очищали (система AMPure XP) и оценивали качество библиотеки на системе Agilent Bioanalyzer 2100.Затем библиотеку кДНК секвенировали с использованием секвенатора Novaseq.Необработанные файлы изображений от Illumina были преобразованы в необработанные чтения с помощью CASAVA Base Calling.Необработанные данные хранятся в файлах формата FASTQ(fq), которые содержат последовательности чтения и соответствующие базовые качества.Выберите HISAT2, чтобы сопоставить отфильтрованные чтения секвенирования с эталонным геномом Sscrofa11.1.В целом, HISAT2 поддерживает геномы любого размера, в том числе геномы размером более 4 миллиардов оснований, и для большинства параметров установлены значения по умолчанию.Прочтения сплайсинга из данных RNA Seq можно эффективно выровнять с помощью HISAT2, самой быстрой системы, доступной в настоящее время, с такой же или большей точностью, чем любой другой метод.
Обилие транскриптов напрямую отражает уровень экспрессии генов.Уровни экспрессии генов оцениваются по обилию транскриптов (подсчет секвенирования), связанных с геномом или экзонами.Количество прочтений пропорционально уровням экспрессии генов, длине гена и глубине секвенирования.Рассчитывали FPKM (фрагменты на тысячу пар оснований транскрипта, секвенированного на миллион пар оснований) и определяли P-значения дифференциальной экспрессии с использованием пакета DESeq2.Затем мы рассчитали частоту ложных открытий (FDR) для каждого значения P, используя метод Бенджамини-Хохберга9 на основе встроенной R-функции «p.adjust».
РНК, выделенную из срезов сердца, превращали в кДНК в концентрации 200 нг/мкл с использованием смеси SuperScript IV Vilo Master от Thermo (Thermo, каталожный номер 11756050).Количественную ОТ-ПЦР проводили с использованием 384-луночного прозрачного реакционного планшета Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, кат. № 4483319) и микроамперного оптического клея (Thermo, кат. № 4311971).Реакционная смесь состояла из 5 мкл Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, № по каталогу 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer и 3,5 мкл H2O, смешанных на лунку.Были проведены стандартные циклы количественной ПЦР, и значения CT были измерены с использованием прибора Applied Biosystems Quantstudio 5 для ПЦР в реальном времени (384-луночный модуль; продукт № A28135).Праймеры Taqman были приобретены у Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Значения CT всех образцов были нормализованы к гену домашнего хозяйства GAPDH.
Высвобождение NT-ProBNP в среде оценивали с использованием набора NT-ProBNP (свинья) (кат. № MBS2086979, MyBioSource) в соответствии с протоколом производителя.Вкратце, в каждую лунку дважды добавляли по 250 мкл каждого образца и стандарта.Сразу же после добавления образца добавьте в каждую лунку по 50 мкл реагента А для анализа.Аккуратно встряхните пластину и заклейте герметиком.Затем планшеты инкубировали при 37°С в течение 1 часа.Затем аспирируйте раствор и промойте лунки 4 раза 350 мкл промывочного раствора 1X, каждый раз инкубируя промывочный раствор в течение 1-2 минут.Затем добавьте по 100 мкл реагента для анализа В на лунку и запечатайте герметиком для планшетов.Планшет осторожно встряхивали и инкубировали при 37°С в течение 30 минут.Аспирируйте раствор и промойте лунки 5 раз 350 мкл промывочного раствора 1X.Добавьте по 90 мкл раствора субстрата в каждую лунку и запечатайте планшет.Инкубируйте планшет при 37°C в течение 10-20 минут.Добавьте в каждую лунку по 50 мкл стоп-раствора.Планшет сразу же измеряли, используя планшет-ридер Cytation (BioTek), настроенный на 450 нм.
Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Был проведен анализ мощности для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Расчет мощности был выполнен для выбора размеров группы, обеспечивающей >80% мощности для выявления 10% абсолютного изменения параметра с 5% частоты ошибок типа I. Был проведен анализ мощности для выбора размеров групп, которые обеспечили бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с частотой ошибок I типа 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера, который наблюдался бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров группы и 5% частоты ошибок типа I. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра и 5% частоты ошибок типа I.Срезы тканей отбирали случайным образом перед экспериментом.Все анализы были слепыми, и образцы расшифровывались только после того, как были проанализированы все данные.Программное обеспечение GraphPad Prism (Сан-Диего, Калифорния) использовалось для выполнения всех статистических анализов. Для всех статистических данных p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Для всей статистики p-значения были оценены значимыми значениями <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения были оценены значимыми значениями <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05.Двусторонний t-критерий Стьюдента был выполнен для данных только с 2 сравнениями.Для определения значимости между несколькими группами использовали односторонний или двусторонний ANOVA.При выполнении апостериорных тестов применялась поправка Тьюки для учета множественных сравнений.Данные РНКсек имеют особые статистические соображения при расчете FDR и p.adjust, как описано в разделе «Методы».
Для получения дополнительной информации о дизайне исследования см. реферат Отчета об исследованиях природы, связанный с этой статьей.