Nature.com تي وڃڻ لاءِ توهان جي مهرباني. توهان جو برائوزر ورشن استعمال ڪري رهيا آهيو CSS لاءِ محدود سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو). ان دوران، مدد جاري رکڻ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ JavaScript جي ڏيکارينداسين.
انساني گٽ morphogenesis 3D epithelial microarchitecture ۽ spatial Organization جي crypt-villus خاصيتن کي قائم ڪري ٿو. هي منفرد ڍانچي گٽ هوميوسٽاسيس کي برقرار رکڻ جي ضرورت آهي ته اسٽيم سيل جي جڳهه کي بيسل ڪرپٽ ۾ exogenous microbial antigens ۽ انهن جي ميٽابولائٽس کان بچائيندو آهي. آنت جي mucosal مٿاڇري تي رڪاوٽ. ان ڪري، 3D اپيٿيليل ڍانچي کي ٻيهر ٺاهڻ ۾ ويٽرو گٽ ماڊلز جي تعمير لاءِ انتهائي اهم آهي. خاص طور تي، نامياتي mimetic گٽ-آن-اي-چپ آنت جي spontaneous 3D morphogenesis کي induce ڪري سگھي ٿو آنٽي جي 3D morphogenesis with intestinal enchanics and epithelological functioned a epitheler. ٻيهر پيدا ٿيندڙ پروٽوڪول هڪ مائڪرو فلائيڊڪ چپ تي گٽ ۾ آنت جي مورفوگنيسيس کي مضبوط ڪرڻ لاءِ ۽ گڏوگڏ هڪ ٽرانس ويل ايمبيڊڊ هائبرڊ چپ ۾. اسان تفصيلي طريقن کي بيان ڪريون ٿا ڊيوائس جي ٺهڻ لاءِ ، ڪيڪو-2 جي ڪلچرنگ يا آنت جي آرگنائيڊ اپيٿيليل سيلز جي پليٽ فارم ۾ مائڪرو فلوائيڊ 3 جي پليٽ فارم جي جوڙجڪ ۾. آهي، ۽ قائم ڪيل 3D ايپيٿيليا جي خاصيت ڪيترن ئي تصويرن جي طريقن کي استعمال ڪندي. هي پروٽوڪول 5 ڊي لاءِ بيسولٽرل فلوئڊ جي وهڪري کي ڪنٽرول ڪندي فنڪشنل گٽ مائڪرو آرڪيٽيڪچر جي بحالي حاصل ڪري ٿو. اسان جو ان ويٽرو مورفوگينيسس طريقو جسماني طور تي لاڳاپيل شيئر اسٽريس ۽ ميڪيڪل موشن کي استعمال ڪري ٿو ، جيڪو اسان جي موجوده سيل انجڻ يا ٻين پيچيده مشينن جي ضرورت ناهي. تجويز ڪيل پروٽوڪول بايوميڊيڪل ريسرچ ڪميونٽي لاءِ وسيع اثر پيدا ڪري سگھن ٿا، بائيو ميڊيڪل، ڪلينڪل، ۽ دواسازي جي ايپليڪيشنن لاءِ ويٽرو ۾ 3D آنتي اپتيليل پرت کي ٻيهر پيدا ڪرڻ جو طريقو مهيا ڪري.
تجربا اهو ظاهر ڪن ٿا ته آنت جي اپيٿيليل Caco-2 سيلز گٽ-آن-اي-چپ 1,2,3,4,5 يا بائليئر مائڪرو فلائيڊڪ ڊوائيسز 6,7 ۾ ڪلچر ٿيل 3D morphogenesis کان گذري سگهن ٿا ويٽرو ۾ بنيادي ميڪانيزم کي واضح سمجھڻ کان سواءِ. s ضروري آهي ۽ ويٽرو ۾ 3D epithelial morphogenesis induce ڪرڻ لاءِ ڪافي آهي، جنهن جو مظاهرو ڪيو ويو آهي Caco-2 ۽ مريض مان نڪتل آنتي آرگنائيز.Epithelial Cells جي تصديق ڪئي وئي. هن مطالعي ۾، اسان خاص طور تي هڪ طاقتور Wnt مخالف، Dickkopf-1 (DKK-1) جي سيل جي پيداوار ۽ ڪنسنٽريشن ورهائڻ تي ڌيان ڏنو، گٽ-آن-اي-چپ ۾ ۽ تبديل ٿيل مائڪرو فلوئڊڪ ڊوائيسز جن ۾ Transwell inserts شامل آهن، جنهن کي "هائبرڊ چئپونٽس جي اضافي طور تي Wnt چيپونسٽس" سڏيو ويندو آهي. -1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) on-chip گٽ مورفوگينيسس کي روڪي ٿو يا اڳڪٿي ٿيل 3D epithelial پرت کي خراب ڪري ٿو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ڪلچر دوران مخالف دٻاءُ intestinal morphogenesis لاءِ ذميوار آهي. ايليل انٽرفيس کي هٽائڻ يا گهٽ ۾ گهٽ برقرار رکڻ آهي بيسولٽرل کمپارٽمينٽ ۾ Wnt مخالفين جي سطح کي فعال فلشنگ ذريعي (مثال طور، گٽ-آن-اي-چپ يا هائبرڊ-آن-اي-چپ پليٽ فارمز ۾) يا ڊفيوژن .Basolateral ميڊيا (مثال طور، Transwell کان وڏي بيسولٽرل ويلز جي اندر داخل ٿئي ٿو).
هن پروٽوڪول ۾، اسان گٽ-آن-اي-چپ مائڪرو ڊيوائسز ۽ Transwell-insertable هائبرڊ چپس (قدم 1-5) کي ڪلچر ڪرڻ لاءِ هڪ تفصيلي طريقو مهيا ڪندا آهيون پوليڊيميٿيلسلوڪسين (PDMS) تي ٻڌل porous membranes (Steps 6A, 6A, 7mb, 7, 7) 6B, 7B, 8, 9) ۽ induced 3D morphogenesis in vitro (Step 10) . اسان پڻ سڃاڻپ ڪئي سيلولر ۽ ماليڪيولر خصوصيتن جو اشارو ٽشو-مخصوص هسٽوجنيسس ۽ نسب-انحصار سيلولر فرق کي لاڳو ڪندي ڪيترن ئي اميجنگ طريقن کي لاڳو ڪندي (قدم 11-24). 2 يا آنتي آرگنائيز، ٻن ڪلچر فارميٽ ۾ ٽيڪنيڪل تفصيلن سان گڏ، جنهن ۾ porous membranes جي مٿاڇري جي ترميم، 2D monolayers جي تخليق، ۽ intestinal biochemical and reproduction of biomechanical microenvironment.in vitro. To induce 3D morphogenesis from 2D epitholemorgenesis ڪلچر کي هٽايو ويو. وچولي ۾ ثقافت جي بيسولٽرل کمپارٽمينٽ ۾. آخر ۾، اسان هڪ ٻيهر پيدا ٿيندڙ 3D اپيٿيليل پرت جي افاديت جي نمائندگي فراهم ڪندا آهيون جيڪا نموني لاء استعمال ڪري سگهجي ٿي morphogen-انحصار epithelial واڌ، ڊگھائي ميزبان-مائڪروبيوم ڪو ڪلچرز، پيٿوجين انفڪشن، سوزش جي زخم، ۽ بارڊريپيٽي بيس، ايڪسائيڪس بيئريپيپيٽ. .اثر.
اسان جو پروٽوڪول سائنسدانن جي وسيع رينج لاءِ ڪارآمد ثابت ٿي سگھي ٿو بنيادي (مثال طور، آنت جي ميوڪوسل حياتيات، اسٽيم سيل حياتيات، ۽ ترقياتي حياتيات) ۽ لاڳو ٿيل تحقيق (مثال طور، اڳڪٿين واري دوا جي جاچ، بيماري ماڊلنگ، ٽشو انجنيئرنگ، ۽ گيسٽرو اينٽرولوجي) وسيع اثر. ويٽرو ۾ آنت جو اپيٿيليم، اسان تصور ڪريون ٿا ته اسان جي ٽيڪنيڪل حڪمت عملي انهن سامعين تائين ورهائي سگهجي ٿي جيڪي آنت جي ترقي، ٻيهر پيدا ٿيڻ يا هوميوسٽاسيس دوران سيل سگنلنگ جي متحرڪات جو مطالعو ڪري رهيا آهن. ان کان علاوه، اسان جو پروٽوڪول مختلف انفڪشن ايجنٽ جهڙوڪ Norovirus 8، Severeon-Corravirus-2-Severe-Severe-Corovirus-Acpiratory Coronavirus-Severe-Severe-Acpirate- ium difficile, Salmonella Typhimurium 9 يا Vibrio cholerae.مرض جي پيچيدگي ۽ pathogenesis جا سامعين پڻ ڪارآمد آهن. آن-چپ گٽ مائڪرو فزيولوجي سسٽم جو استعمال شايد ڊگھي ڪو ڪلچر 10 ۽ بعد ۾ ميزبان دفاع جي تشخيص، مدافعتي ردعمل ۽ پيٽروجن سان لاڳاپيل زخم جي مرمت جي گيسٽرو انٽيسٽينل (GI) ۾ زخم جي مرمت جي اجازت ڏئي سگھي ٿي، گٿرو جي بيماري سان لاڳاپيل 11. s جي بيماري، ulcerative ڪولائٽس، پائوچائٽس، يا irritable bowel syndrome ان صورت ۾ ٿي سگهي ٿو جڏهن 3D اندرين اپيٿيليل پرتون تيار ڪيون وينديون آهن مريض جي 3D آنڊن جي اپيٿيليل تہن کي استعمال ڪندي، انهن بيمارين ۾ شامل آهن villous atrophy، crypt shortening، mucosal loss، or impairedelith-bar-celle-psychos. oids12,13. بيماري ماحول جي اعلي پيچيدگي کي بهتر نموني ڪرڻ لاء، پڙهندڙ شايد بيماري سان لاڳاپيل سيل جي قسمن کي شامل ڪرڻ تي غور ڪري سگھن ٿا، جهڙوڪ مريض پرديري بلڊ مونو نيوڪليئر سيلز (PBMCs)، ماڊل ۾ شامل ڪرڻ لاء 3D intestinal villus-crypt microarchitectures.ٽشو مخصوص مدافعتي سيلز، 5.
جيئن ته 3D ايپيٿيليل مائڪرو اسٽرڪچر کي سيڪشننگ جي عمل کان سواءِ فڪس ۽ ويزائلائيز ڪري سگهجي ٿو، اسپيشل ٽرانسڪرٽوميڪس ۽ هاءِ ريزوليوشن يا سپر ريزوليوشن اميجنگ تي ڪم ڪندڙ ناظرین شايد اسان جي نقشي ۾ دلچسپي رکن ٿا اسان جي جين ۽ پروٽينن جي اسپيٽيٽيمپورل ڊائنامڪس جي ايپيٿيليل نچس تي.ٽيڪنالاجي ۾ دلچسپي. مائڪروبيل يا مدافعتي محرڪن جو جواب. ان کان علاوه، ڊگھي ميزبان-مائڪروبيوم ڪراسسٽالڪ 10، 14 جيڪي گٽ هوميوسٽاسس کي هموار ڪن ٿا 3D آنت جي ميوڪوسل پرت ۾ مختلف مائڪروبيل نسلن، خاص طور تي مائڪروبيل ڪميونٽيز ۾، مائڪروبيل-ڪميونٽيز، خاص طور تي فيضي-ڪميونٽيز ۾ گڏيل ثقافت جي ذريعي 3D آنت جي ميوڪوسل پرت ۾ قائم ڪري سگهجي ٿو.پليٽ فارم ۾. هي طريقو خاص طور تي انهن سامعين لاءِ پرڪشش آهي جيڪي ميوڪوسل امونولوجي، گيسٽرو اينٽرولوجي، انساني مائڪرو بايوم، ڪلچرومڪس ۽ ڪلينڪل مائڪرو بائيالاجي جو مطالعو ڪري رهيا آهن جيڪي اڳ ۾ غير ڪلچر ٿيل گٽ مائڪرو بائيوٽا کي ليبارٽري ۾ پوکڻ چاهيندا آهن. جيڪڏهن اسان جي ان ويٽرو مورفوگينيسس پروٽوڪول کي ترتيب ڏئي سگهجي ٿو، اهڙي طرح سان ملٽي ڪلچر 4 ۾ اسڪيلبل 4 3 ۾ ملٽي ڪلچر 4. tes جيڪي مسلسل بيسولٽرل حصن کي ڀريندا آهن، پروٽوڪول انهن ترقي يافته فارماسيوٽيڪل، بايوميڊيڪل يا هاءِ-ٿرو پُٽ اسڪريننگ يا تصديق واري پليٽ فارمن کي پڻ ورهائي سگهجي ٿو جيڪي فوڊ انڊسٽري لاءِ آهن. اصول جي ثبوت جي طور تي، اسان تازو ڏيکاريو آهي هڪ ملٽي پلڪس هاءِ-ٿرو پُٽ سسٽم لاءِ فيزيبليٽي، هڪ کان وڌيڪ مرڪوز 2-اسڪيوليٽ 2 لاءِ ملٽي پلڪس هاءِ تھرو پُٽ سسٽم. -a-چپ پروڊڪٽس کي ڪمرشلائيز ڪيو ويو آهي 16,17,18. ان ڪري، اسان جي ان ويٽرو مورفوگنيسيس جي طريقي جي تصديق کي تيز ڪري سگهجي ٿو ۽ ممڪن طور تي ڪيترن ئي ريسرچ ليبارٽريز، صنعت يا حڪومتي ۽ ريگيوليٽري ايجنسين طرفان اختيار ڪيو ويو آهي ته جيئن ان ويٽرو گٽ مورفوگينيسس جي سيلولر ريپروگرامنگ کي سمجھڻ لاءِ بايوٽرو گٽ مورفوگينيسس جي ٽرانسپيٽڪس ۽ اميدوارن جي ٽرانزيڪشن جي سطح تي بايوٽرو مورفوگنيسيس جي ٽيسٽ ۽ ٽرانزيڪشن جي ٽيسٽن جي طور تي. 3D گٽ سروگيٽس استعمال ڪندي يا گٽ مورفوجنسي عمل جي پيداواري صلاحيت کي جانچڻ لاءِ ڪسٽم يا تجارتي آرگن-آن-اي-چپ ماڊل استعمال ڪندي.
انساني تعلق رکندڙ تجرباتي ماڊلز جو هڪ محدود تجربو آنڊن جي مورفيوجسس کي پڙهڻ لاء استعمال ڪيو ويو آهي، خاص طور تي، مورفيوجسسس ۾ 3D مورفوسسس، مورفسسسز جي بنياد تي، هوشيار. هڪ طور تي، ۽ اهم طور تي انساني ترقياتي عملن ۾ هڪ خاص طور تي بيان ڪيل 3D سسيريل اڏاوتن ۾ اسان جي ڪنهن به روايتي جامع اڏامن ۾ 3 ڊي ٽشوزيل اڏاوتن ۾ تمام گهڻو استعمال ڪيو ويو آهي ريڪين ۾ خفيق ڌار ڪيو ڌار ڌار يا مداخلت جي جواب ۾ ميمبرن (مثال طور، اندروني جبليز کي غير فعال ڪري سگهون ٿا (مثال طور تي ذلقيه ڪارروائي ڪري سگهندو آهي) آء ماء جي فطري ۾ اجازت ڏئي سگهي ٿو
ان کان علاوه اسان جي 3D آنڊن جي اپيٿيليل ڍانچي ٺاهڻ جي طريقن سان گڏ، ڪيترائي ان ويٽرو طريقا آهن. Intestinal organoid Culture هڪ جديد ترين ٽشو انجنيئرنگ ٽيڪنڪ آهي، جنهن تي ٻڌل آهي آنت جي اسٽيم سيلز جي پوکيءَ جي بنياد تي مخصوص مورفوجن حالتن ۾ 23,24,25. جڏهن ته، اڪثر ڪري استعمال ڪيو ويندو آهي 3D-3D يا co-host-Host-Host-Culture-Host-Host-Culture مشڪل آهي ڇاڪاڻ ته آنت جي ليمن آرگنائيڊ جي اندر بند ٿيل آهي ۽ ان ڪري، لومينل اجزاء جو تعارف جهڙوڪ مائڪروبيل سيلز يا خارجي اينٽيجنز محدود آهي.organoid lumens تائين پهچ کي microinjector،26,27 استعمال ڪندي بهتر ڪري سگهجي ٿو، پر هي طريقو ناگوار ۽ محنتي آهي ۽ ان کي انجام ڏيڻ لاءِ خاص علم جي ضرورت آهي. ان کان علاوه، جامد حالتن هيٺ هائيڊروجيل اسڪافلڊس ۾ رکيل روايتي آرگنائيز ڪلچر صحيح طور تي vivo biomechanics ۾ فعال ظاهر نه ڪندا آهن.
ٻيا طريقا جيڪي ڪيترن ئي تحقيقاتي گروپن پاران استعمال ڪيا ويا آهن انهن کي استعمال ڪرڻ لاء اڳواٽ 3D هائيڊروجيل اسڪافولڊس استعمال ڪندا آهن گٽ اپيٿيليل ڍانچي کي جيل جي سطح تي الڳ ٿيل انساني آنڊن جي سيلن کي ڪلچر ڪندي. vitro physiologically لاڳاپيل morphogen gradients سان، هڪ اعلي اسپيڪٽ ريشو قائم ڪري epithelial structure ۽ stroma-epithelial crosstalk by stromal cells in scaffold. تنهن هوندي به، prestructured scaffolds جي فطرت spontaneous morphogenetic process جي نمائش کي روڪي سگھي ٿي. اهو دٻاءُ آهي ته آنڊن جي سيلن کي مورفوجينيسس مان گذرڻ ۽ جسماني ڪارڪردگي حاصل ڪرڻ جي ضرورت آهي. هڪ ٻيو تازو مطالعو هڪ مائڪرو فلوئڊڪ پليٽ فارم ۾ هائيڊروجيل اسڪفولڊس استعمال ڪيو ۽ ليزر ايچنگ ٽيڪنڪ استعمال ڪندي پيٽرن واري آنٽي اپيٿيليل ڍانچي. جڏهن ته، هي ماڊل نه ته خود بخود مورفوگينياتي عملن کي ظاهر ڪري ٿو ۽ نه ئي گٽ ميڪانوبيولوجيڪل تحريڪن کي شامل ڪري ٿو. ساڳئي گروپ مان 3D پرنٽنگ ٽيڪنڪ ان قابل ٿي ويون آهن ته spontaneous مورفوگينيٽڪ پروسيسز سان گڏ ننڍي گٽ ٽيوبون ٺاهي سگهن. مختلف گٽ ڊي فلومينيڪس ماڊل جي وچ ۾ پيچيده ٺهڻ ​​جي باوجود، هن گٽ ڊي فلومين جي مختلف نمونن جي وچ ۾ پڻ. اضافي طور تي، ماڊل جي ڪارڪردگي محدود ٿي سگھي ٿي، خاص طور تي بايوپرنٽنگ جي عمل جي مڪمل ٿيڻ کان پوء، تجرباتي حالتن کي خراب ڪرڻ يا سيل کان سيل جي وچ ۾ رابطي کي. ان جي بدران، اسان جو تجويز ڪيل پروٽوڪول خود بخود گٽ مورفوجنسي، جسماني طور تي لاڳاپيل شيئر اسٽريس، بائيو ميڪنڪس جيڪي گٽ جي حرڪت کي نقل ڪن ٿا، پيچيدگي جي مائڪروسوولوجيڪل ۽ پيچيدگي جي مائڪروسولولوجيڪ رسائي جي گنجائش. ان ڪري، اسان جو ان ويٽرو 3D مورفوگينيسس پروٽوڪول شايد موجوده طريقن جي چيلنجز کي منهن ڏيڻ لاءِ هڪ مڪمل طريقه ڪار مهيا ڪري.
اسان جو پروٽوڪول مڪمل طور تي 3D epithelial morphogenesis تي مرڪوز آهي، ڪلچر ۾ صرف epithelial cells ۽ ٻيو ڪوبه قسم جي ڀرپاسي جي سيلز جهڙوڪ mesenchymal cells، endothelial cells، and immune cells. جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي، اسان جي پروٽوڪول جو بنيادي حصو آهي epithelial morphogenesis in induction of epithelial morphogenesis by the secreted babat morphogenesis. وچولي. جڏهن ته اسان جي گٽ-آن-اي-چپ ۽ هائبرڊ-آن-ا-چپ جي مضبوط ماڊلريٽي اسان کي اڻڄاتل 3D اپيٿيليل پرت کي ٻيهر ٺاهڻ جي اجازت ڏئي ٿي، اضافي حياتياتي پيچيدگيون جهڙوڪ ايپيٿيليل-ميسينچيمل تعامل 33,34، extracellular Matrix (ECM) ۾ موجود خاصيتون، اسان جي سيلز، سيلز 3، 3D ۾ اضافي خاصيتون شامل آهن. basal crypts ۾ niches وڌيڪ غور ڪيو وڃي ٿو. mesenchyme ۾ اسٽرومل سيلز (مثال طور، fibroblasts) ECM پروٽين جي پيداوار ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿا ۽ vivo35,37,38 ۾ intestinal morphogenesis جي ضابطي ۾. اسان جي ماڊل ۾ mesenchymal سيلز جو اضافو وڌايو ويو morphogenetics يا ڪيپيليليل پرت کي وڌايو. ) ماليڪيولر ٽرانسپورٽ کي منظم ڪرڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو 39 ۽ گٽ مائڪرو ماحوليات ۾ مدافعتي سيل ڀرتي 40. ان کان علاوه، ويسڪوليچر اجزاء جيڪي ٽشو ماڊل جي وچ ۾ ڳنڍي سگهجن ٿيون، هڪ لازمي شرط آهي جڏهن ٽشو ماڊل ٺاهيا ويا آهن ڪيترن ئي عضون جي رابطي کي ظاهر ڪرڻ لاء. ريزوليوشن.مريض مان نڪتل مدافعتي سيلون پڻ ضروري آهن ته اهي فطري مدافعتي ردعمل، اينٽيجن جي پيشڪش، پيدائشي موافقت مدافعتي ڪراسٽالڪ، ۽ آنت جي بيماري جي نقل ڪرڻ جي حوالي سان ٽشو-مخصوص مدافعت ڏيکاري.
هائيبرڊ چپس جو استعمال گٽ-آن-ا-چپ کان وڌيڪ سڌو آهي ڇو ته ڊوائيس سيٽ اپ آسان آهي ۽ Transwell inserts جو استعمال گٽ epithelium جي اسپيبل ڪلچر جي اجازت ڏئي ٿو. تنهن هوندي به، تجارتي طور تي موجود Transwell inserts with polyester membranes لچڪدار نه هوندا آهن ۽ peristaltic-like thersertyap جي نقل ڪرڻ واري جاءِ تي، وڌيڪ منتقلي واري جاءِ تي ٽرسويل انسرٽس کي نقل نه ڪري سگهندا آهن. d چپ apical پاسي تي بغير ڪنهن شيئر جي دٻاء سان گڏ رهي ٿي. واضح طور تي، apical compartment ۾ جامد خاصيتون گهڻو ڪري هائبرڊ چپس ۾ ڊگھي مدت جي بيڪٽيريا ڪو ڪلچر کي فعال ڪن ٿيون. جڏهن ته اسان ٽرانسيل انسرٽس ۾ 3D مورفوگينيسس کي مضبوط ڪري سگهون ٿا جڏهن استعمال ڪري سگهون ٿا. id وهڪري ممڪن ايپليڪيشنن لاءِ هائبرڊ چپ پليٽ فارمن جي فزيبلٽي کي محدود ڪري سگھي ٿي.
گٽ-آن-اي-چپ ۽ هائبرڊ-آن-ا-چپ ڪلچرز ۾ انساني ڪرپٽ-ويلس محور جي مڪمل پيماني تي تعميرات مڪمل طور تي قائم نه ڪيا ويا آهن. جيئن ته مورفوجنسي هڪ ايپيٿيليل مونوليئر کان شروع ٿئي ٿو، 3D مائڪرو آرڪيٽيڪچرز لازمي طور تي اسان جي آبادي جي ويجهڙائي ۾ مورفولوجيڪل خاصيت مهيا نه ڪندا آهن. مائيڪرو انجنيئر ٿيل 3D ايپيٿيليم ۾ بنيادي ڪرپٽ ڊومين، ڪرپٽ ۽ وائلس علائقن کي واضح طور تي مقرر نه ڪيو ويو هو. جيتوڻيڪ چپ تي مٿاهون مٿاهون چينل مائڪرو انجنيئر ٿيل ايپيٿيليم جي اوچائي کي وڌائي ٿو، وڌ ۾ وڌ اوچائي اڃا تائين محدود آهي ~ 300-400 تائين محدود آهي ~ 300-400 انساني عملن جي وڏي پيماني تي. es آهي ~ 135 µm ۽ ~ 400 µm، ترتيب سان، ۽ ننڍي آنڊن جي ويل جي اوچائي ~ 600 µm41 آهي.
تصويرن جي نقطي نظر کان، 3D مائڪرو آرڪيٽيڪچر جي صورتحال ۾ سپر ريزوليوشن اميجنگ هڪ چپ تي گٽ تائين محدود ٿي سگهي ٿي، ڇاڪاڻ ته مقصدي لينس کان اپيٿيليل پرت تائين گهربل ڪم ڪندڙ فاصلو ڪجهه ملي ميٽرن جي ترتيب تي آهي. هن مسئلي کي ختم ڪرڻ لاء، هڪ پري مقصد جي ضرورت آهي. ان کان علاوه اعلي سطحي سيڪشن کي تيار ڪرڻ لاء اعلي اسپيگنگ جي تياري لاء. PDMS. ان کان علاوه، جيئن ته چپ تي گٽ جي پرت-ب-پرت مائڪرو فيبريڪيشن ۾ هر پرت جي وچ ۾ مستقل چپپڻ شامل آهي، اهو انتهائي مشڪل آهي ته اپر پرت کي کولڻ يا هٽائڻ لاء اپيٿيليل پرت جي سطح جي ساخت کي جانچڻ لاء. مثال طور، اسڪيننگ اليڪٽران مائڪروسکوپ (SEM) استعمال ڪندي.
PDMS جي هائيڊروفوبڪيت هڪ محدود عنصر رهيو آهي مائڪرو فلائيڊڪ بنيادن تي مطالعي ۾ هائڊرو فوبڪ ننڍن ماليڪيولن سان معاملو ڪرڻ ۾، ڇاڪاڻ ته PDMS غير خاص طور تي اهڙن هائيڊروفوبڪ ماليڪيولز کي جذب ڪري سگهي ٿو. PDMS جي متبادل کي ٻين پوليميرڪ مواد سان سمجهي سگهجي ٿو. متبادل طور تي، PDMS يا پوليٿيلڪ 2 جي سطح جي تبديلي سان ene glycol) 43 ) هائيڊروفوبڪ ماليڪيولز جي جذب کي گھٽ ڪرڻ لاءِ سمجهي سگهجي ٿو.
آخرڪار، اسان جو طريقو اعليٰ-ٿروپيٽ اسڪريننگ يا ”هڪ-سائيز-فٽ-آل“ استعمال ڪندڙ-دوست تجرباتي پليٽ فارم مهيا ڪرڻ جي لحاظ کان بهتر نموني نه ڪيو ويو آهي. موجوده پروٽوڪول لاءِ هڪ سرنج پمپ في مائڪرو ڊيوائس جي ضرورت آهي، جيڪو CO2 انڪيوبيٽر ۾ جاءِ وٺي ٿو ۽ وڏي پيماني تي تجربن کي روڪي ٿو. هن حد کي خاص طور تي بهتر ڪري سگهجي ٿو. ، يا 384-سٺو سوراخ داخل ڪن ٿا جيڪي مسلسل ڀرڻ ۽ بيسولٽرل ميڊيا کي ختم ڪرڻ جي اجازت ڏين ٿا).
ويٽرو ۾ انساني آنڊن جي epithelium جي 3D مورفوگينيسس کي وڌائڻ لاءِ، اسان هڪ مائڪرو فلوئڊڪ چپ آنٽي ڊيوائس استعمال ڪئي جنهن ۾ ٻه متوازي مائڪرو چينلز ۽ وچ ۾ هڪ لچڪدار پورس جھلي شامل آهي هڪ لومين ڪيپليري انٽرفيس ٺاهڻ لاءِ. اسان پڻ هڪ واحد چينل جي استعمال جو مظاهرو ڪريون ٿا جيڪو مسلسل مائڪرو فلوائيڊ ڊوائيس فراهم ڪري ٿو. Transwell inserts تي وڌيل پولرائيز اپيٿيليل پرت. ٻنهي پليٽ فارمن ۾، مختلف انساني آنڊن جي اپيٿيليل سيلز جي مورفوجنسي کي ظاهر ڪري سگهجي ٿو ته وهڪري جي هدايتي ڦيرڦار کي لاڳو ڪري سگهجي ٿو ته جيئن بيسولٽرل کمپارٽمينٽ مان مورفوجن مخالفين کي هٽايو وڃي. سڄو تجرباتي طريقو (شڪل 1) پنجن حصن تي مشتمل آهي. چپ (قدم 1-5؛ باڪس 1)، (ii) اندرين اپتيليل سيلز جي تياري (Caco-2 سيلز) يا انساني آنڊن جي آرگنائيز؛باڪس 2-5)، (iii) آنت جي چپس يا هائبرڊ چپس تي آنڊن جي epithelial سيلز جو ڪلچر (مرحلا 6-9)، (iv) ويٽرو ۾ 3D مورفوگينيسس جي شموليت (مرحلي 10) ۽ (v) 3D epithelial ڪنٽرول کي خاص ڪرڻ لاءِ (v) 3D epithelial ڪنٽرول هيٺ ڏنل مناسب گروپ 1-2-اسٽيڪٽ (Forderly مناسب گروپس ڪنٽرول) epithelial morphogenesis کي مقامي، عارضي، مشروط، يا طريقيڪار ڪنٽرولن جي مقابلي ۾ ويٽرو مورفوگينيسس جي اثرائتي کي درست ڪرڻ لاءِ ڊزائين ڪيو ويو.
اسان ٻه مختلف ڪلچر پليٽ فارم استعمال ڪيا آهن: گٽ-آن-اي-چپ سڌي چينلن سان يا غير لڪير ڪنوولٽيڊ چينلز، يا هائبرڊ چپس جن ۾ ٽرانس ويل (TW) شامل آهن هڪ microfluidic ڊوائيس ۾، ٺاهيل جيئن باڪس 1 ۾ بيان ڪيو ويو آهي، ۽ قدم 1 -5. ”ڊيوائس فيبريڪيشن“ ڏيکاري ٿو بنيادي قدمن ۾ هڪ هوسٽن پيپليمين يا انچيپپليمين ٺاهڻ ۾. lial Cells” هن پروٽوڪول ۾ استعمال ڪيل سيل جي ماخذ (Caco-2 يا انساني آنڊن جي عضون) ۽ ڪلچر جي طريقيڪار جي وضاحت ڪري ٿي. ”ان ويٽرو مورفوگينيسس“ مجموعي مرحلن کي ظاهر ڪري ٿو جنهن ۾ Caco-2 يا آرگنائيز مان نڪتل اپيٿيليل سيلز آنٽي جي چپ تي ڪلچر ڪيا ويا آهن يا ٽرانسويل انسرٽ آف مورفوجين ڊي جي انٽريشن ۽ ان جي پٺيان. هڪ خاصيت واري اپيٿيليل ڍانچي جي ٺهڻ. پروگرام اسٽيپ نمبر يا باڪس نمبر هر تير جي هيٺان ڏيکاريل آهي. ايپليڪيشن مثال مهيا ڪري ٿي ته ڪيئن قائم آنٽي اپيٿيليل پرت استعمال ڪري سگھجن ٿيون، مثال طور، سيل جي فرق جي خاصيت ۾، گٽ فزيولوجي اڀياس، ميزبان-مائڪروبائيوم ايڪو سسٽم جي قيام، ۽ بيماري ماڊلنگ ۾ "فلوئنس-ميڊيڪل" ڏيکاري ٿو. actin ۽ MUC2 گٽ چپ تي ٺاهيل 3D Caco-2 epithelial پرت ۾ ظاهر ڪيو ويو آهي. MUC2 سگنلنگ گوبلٽ سيلز ۾ موجود آهي ۽ بلغم جي مٿاڇري مان ڳريل بلغم ۾ موجود آهي. گٽ فزيالوجي ۾ فلورسنٽ تصويرون ڏيکارين ٿيون ته بلغم کي داغ جي ذريعي پيدا ڪيو ويو آهي سيلڪ ايسڊ ۽ اين-ايڪسيميليسائيٽيگلوسينٽيگرم استعمال ڪندي. in. ”ميزبان-مائڪروب ڪو-ڪلچرز“ ۾ ٻه اوورليپنگ تصويرون هڪ چپ تي گٽ ۾ نمائندي ميزبان-مائڪروبيوم ڪو ڪلچرز ڏيکاري ٿي. کاٻي پينل E. coli جي گڏيل ڪلچر کي ظاهر ڪري ٿو سبز فلورسنٽ پروٽين (GFP) سان مائڪرو انجنيئر ٿيل 3D Caco-2 سان. 3D Caco-2 epithelial سيلز، بعد ۾ immunofluorescence staining with F-actin (red) ۽ nuclei (blue) . بيمارين جي ماڊلنگ بيڪٽريريل اينٽيجنز (مثال طور، lipopolysaccharide) سان گڏ فزيولوجيڪل چيلنج تحت گٽ سوزش چپس ۾ صحت مند بمقابله leaky gut (مثال طور، lipopolysaccharide) ۽ پي ايم سي بي سي، ايل پي ايم سي، ۽سائو) Caco-2 سيلز هڪ 3D ايپيٿيليل پرت قائم ڪرڻ لاءِ ڪلچر ڪيا ويا. اسڪيل بار، 50 µm. هيٺئين قطار ۾ تصويرون: "سيلز جو فرق" حوالن جي اجازت سان ترتيب ڏنل.2.آڪسفورڊ يونيورسٽي پريس؛Ref.5 کان اجازت سان ٻيهر پيش ڪيو ويو.NAS؛"ميزبان-مائڪروب ڪو-ڪلچر" ref.3 جي اجازت سان ترتيب ڏنل.NAS؛"ڊيز ماڊلنگ" جي حوالي سان اجازت سان ترتيب ڏنل.5.NAS.
ٻئي گٽ-آن-چپ ۽ هائبرڊ چپس PDMS ريپليڪس استعمال ڪندي ٺاهيا ويا جيڪي سلڪون مولڊز مان نرم ليٿوگرافي 1,44 ذريعي ٺاهيا ويا ۽ SU-8 سان نموني ٺاهيا ويا. هر چپ ۾ مائڪرو چينلز جي ڊيزائن کي هائيڊروڊائينامڪس تي غور ڪندي طئي ڪيو ويو آهي جهڙوڪ شيئر اسٽريس ۽ هائيڊروڊائنا 1.2-ايڪس اينيمڪس. ڊيٽا Fig. 1a)، جنهن ۾ ٻه جڙيل متوازي سڌي مائڪرو چينلز شامل آهن، هڪ پيچيده گٽ-آن-اي-چپ ۾ ترقي ڪئي آهي (وڌايو ويو ڊيٽا تصوير. 1b) جنهن ۾ شامل آهي وکر مائڪرو چينلز جو هڪ جوڙو شامل ڪرڻ لاء وڌايو ويو فلو رهائش واري وقت، غير لائنر فلو نمونن، ۽ ملٽي ايڪس اينڪس سيلز ڪلچرڊ 2 (ڊبليو-ايڪس اينيمڪس ڪلچرڊ-ڊبليو-ايڪس اينڪس). وڌيڪ پيچيده گٽ بائيو ميڪنڪس کي ٻيهر ٺاهڻ جي ضرورت آهي، پيچيده گٽ-آن-اي-چپس کي چونڊيو وڃي ٿو. اسان اهو ظاهر ڪيو آهي ته ٺهڪندڙ گٽ چپ پڻ ساڳئي وقت واري فريم ۾ 3D مورفوگينيسس کي مضبوط ڪري ٿو، اصل گٽ چپ جي مقابلي ۾ اپيٿيليل ترقي جي ساڳئي درجي سان، بغير ڪنهن به قسم جي ڪلچرڊ ۽ ڪلچرڊ سيل ۾ ڪلچرڊ ۽ لڪير جي ٽائيپ جي لاء. چپ گٽ ڊزائينز هڪ ٻئي سان مٽائي سگهجن ٿيون. PDMS ريپليڪس سلڪون مولڊز تي SU-8 نمونن سان ٺهڪي اچي ٿي جن کي ڊولڊنگ کان پوءِ ناڪاري خاصيتون مهيا ڪيون ويون آهن (تصوير.2a) چپ تي گٽ کي ٺاھڻ لاء، تيار ڪيل مٿئين PDMS پرت کي ترتيب سان ھڪڙي porous PDMS فلم سان ڳنڍيو ويو ۽ پوء ھيٺئين PDMS پرت سان اڻڄاتل بانڊنگ ذريعي ھڪڙي ڪرونا ٽريٽر (Fig. 2b-f) استعمال ڪندي ٺاھيو ويو. ھائبرڊ چپس کي ٺاھڻ لاء، مائيڪرو ڊي فلوڊس ٺاھيو ويو. idic ڊوائيسز جيڪي Transwell داخل ڪري سگھن ٿيون (تصوير 2h ۽ توسيع ٿيل ڊيٽا تصوير. 2). بانڊنگ جو عمل PDMS ريپليڪا ۽ گلاس جي سطحن کي آڪسيجن پلازما يا ڪورونا علاج سان علاج ڪندي انجام ڏنو ويندو آھي. مائيڪرو ٺاھيل ڊوائيس جي نسبندي کان پوءِ ڊوائيس سان جڙيل سلڪون سيٽنگ ٽيوب کي تيار ڪيو ويو ھو. هيليم (شڪل 2g).
الف، SU-8 نمونن واري سلڪون مولڊز مان PDMS حصن جي تياري جو اسڪيميڪ مثال. اڻ سڌريل PDMS حل کي سلکان مولڊ (بائیں) تي لڳايو ويو، 60 °C (وچولي) تي علاج ڪيو ويو ۽ (ساڄي) تي ٺهرايو ويو. ڊاهيل PDMS کي ٽڪرن ۾ ڪٽيو ويو ۽ PDMS کي وڌيڪ استعمال ڪرڻ لاءِ، فوٽوگرافڪ پرت استعمال ڪرڻ لاءِ PDMS کي صاف ڪيو ويو. PDMS porous membrane.d کي ٺاهڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ سلڪون مولڊ، اپر ۽ لوئر PDMS حصن جي تصويرن جو هڪ سلسلو ۽ گڏ ٿيل آن-چپ انٽيسٽينل ڊيوائس. يعني، مٿئين، جھلي، ۽ هيٺين PDMS حصن جي ترتيب جي اسڪيميٽ. هر پرت کي پلاٽميٽڪ يا پلاسبونڪ علاج سان بي ترتيب ٿيل آهي. ut-on-a-chip device with superimposed convoluted microchannels and vacuum chambers.g، مائيڪرو فلوئڊڪ سيل ڪلچر لاءِ گٽ-آن-اي-چپ جو سيٽ اپ. هڪ چپ تي ٺهيل گٽ هڪ سليڪون ٽيوب ۽ سرنج سان گڏ ٿيل هڪ ڍڪ تي رکيل هئي. ڊيوائس تي ليپ 5 جي ڊيوائس تي رکيل هئي. سليڪون tube.h کي بند ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي، هائبرڊ چپس ٺاهڻ جي بصري تصويرن ۽ هائبرڊ چپس کي استعمال ڪندي 3D مورفوگينيسس. ٽرانس ويل انسرٽس کي آزاد طور تي ڪلچر لاءِ تيار ڪيو ويو 2D monolayers of intestinal epithelial cells 2D monolayers of intestinal epithelial cell in hybrid chip inserted 3D morphogenesis. Transwell insert.Scale bar تي قائم ڪيل سيل پرت جي هيٺان مائڪرو چينلز ذريعي، 1 cm.h ريفرنس جي اجازت سان ٻيهر ڇپيل.4.ايلسويئر.
هن پروٽوڪول ۾، Caco-2 سيل لائن ۽ آنت جي عضون کي epithelial ذريعن (Fig. 3a) طور استعمال ڪيو ويو. ٻنهي قسمن جي سيلن کي آزاد طور تي ڪلچر ڪيو ويو (باڪس 2 ۽ باڪس 5) ۽ استعمال ڪيو ويو ECM-coated microchannels of on-chip gut or Transwell inserts.جڏهن ته سيلز جي ڪلچر 5-9 سيلز (Caco-2) ۾ ڪلچرل ڪلچر (Caco-2) سيلز ڪلچر 5. T-flasks ۾ (Passages 10 ۽ 50 جي وچ ۾) ٽريپسنائيزيشن فلوئڊ (باڪس 2) ذريعي الڳ ٿيل سيل معطلي تيار ڪرڻ لاءِ ڪتب آندو ويو آهي. انساني آنڊن جي عضون کي آنٽي جي بايوپسي يا جراحي ريسيڪشن مان ميٽريگل اسڪافولڊ ڊومس ۾ ڪلچر ڪيو ويو 24-مائيڪروسنائيزيشن کي سپورٽ ڪرڻ لاءِ. جيئن ته Wnt، R-spondin، ۽ Noggin) ۽ ترقي جا عنصر تيار ڪيا ويا جيئن ته باڪس 3 ۾ بيان ڪيو ويو آهي هر ٻئي ڏينهن تيستائين مڪمل ڪيو ويو جيستائين آرگنائيز قطر ۾ ~ 500 µm تائين وڌي ويا. مڪمل طور تي وڌيل آرگنائيز حاصل ڪيا ويندا آهن ۽ انهن کي هڪ خاني ۾ ورهايو ويندو آهي گٽ تي ٻج لاءِ يا ٽرانس ويل داخل ڪيو ويو آهي. ٽائيپ 12,13 (مثال طور ulcerative colitis، Crohn جي بيماري، Colorectal ڪينسر، يا عام ڊونر)، زخم جي سائيٽ (مثال طور، زخم بمقابله غير زخم واري علائقي) ۽ پيٽ ۾ گيسٽرو انٽيسٽينل مقام (مثال طور، duodenum، jejunum، ileum، cecum، colon، or rectum) اسان هڪ انڪولولوڊڪس يا انڪولولوڊڪسنگ لاء مهيا ڪندا آهيون. عام طور تي ننڍي آنت جي عضون جي ڀيٽ ۾ مورفوگين ​​جي اعلي مقدار جي ضرورت هوندي آهي.
a، گٽ چپ ۾ گٽ مورفوجنسي جي شموليت لاءِ ڪم فلو. Caco-2 انساني آنڊن جي ايپيٿيليم ۽ آنت جي عضون کي هن پروٽوڪول ۾ استعمال ڪيو ويو آهي 3D morphogenesis کي ظاهر ڪرڻ لاءِ. الڳ ٿيل اپيٿيليل سيلز تيار ڪيل گٽ-آن-اي-چچ سيلز ۾ سيڊ ڪيا ويا آهن (جڙيل گٽ-آن-اي-چچ ڊيوائسز) ۽ سيپ سيزٽ تيار ڪيل آهن. ) PDMS porous membrane ڏانھن ڏينھن 0 (D0) تي، apical (AP) جو وهڪرو شروع ڪيو ويندو آھي ۽ پھرين 2 ڏينھن تائين برقرار رکيو ويندو آھي (flow, AP, D0-D2) .Basolateral (BL) وهڪري پڻ شروع ڪئي ويندي آھي سائڪلڪ اسٽريچنگ موشنز سان گڏ (stretch, flow, AP ۽ BL) جڏهن مڪمل ٿئي ٿي ته 2 مھينن ۾ ٺھيل آھي. مائيڪرو فلوئڊڪ ڪلچر جي 5 ڏينهن کان پوءِ پاڻمرادو ڳاڙهي رنگ (morphogenesis, D5) فيز برعڪس تصويرون ڏيکارين ٿيون Caco-2 سيلز جي نمائندي مورفولوجي کي هر تجرباتي قدم يا ٽائم پوائنٽ تي (بار گراف، 100 µm). چار اسڪيمي ڊاگرامس ڏيکارين ٿا لاڳاپيل ڪيسڪيڊس جي ظاھر ڪن ٿا آرمرفوجينيس جي ساڄي طرف جي ڊيوٽي اسڪيڊس جي ظاھر ڪن ٿا. fluid flow.b، SEM تصوير قائم ڪيل 3D Caco-2 epithelium جي مٿاڇري جي ٽوپولوجي کي ڏيکاريندي (کاٻي). ان سيٽ کي نمايان ڪرڻ واري وڏي ايراضي (سفيد ڊيش ٿيل باڪس) 3D Caco-2 پرت (ساڄي) تي ٻيهر پيدا ٿيل مائڪروويلي ڏيکاري ٿي. c، قائم ڪيل Caco-2 جي افقي سامهون وارو نظارو، لڳاتار ڪلاڊ-2 لابيلڊ (FB-1-2) بارڊر (Forizontal frontal view) -actin (سائي) ۽ nuclei (نيرو) Immunofluorescence confocal visualization of epithelial cells on intestinal chips. وچين اسڪيميٽ ڏانهن اشارو ڪندي تير هر هڪ ڪنفوڪل ڏيک لاءِ مرڪزي جهاز جي جڳهه کي ظاهر ڪن ٿا. 13. انسيٽ (مٿي ساڄي) مهيا ڪيل تصوير جي اعلي ميگنيفڪيشن کي ڏيکاري ٿو. يعني، گٽ ۾ قائم ڪيل organoid 3D epithelium جو DIC photomicrograph 7.f تي ورتو ويو، اوورليڊ امونو فلوروسينس تصويرون اسٽيم سيلز لاءِ مارڪر ڏيکاريندي (LGR5;magenta)، گوبلٽ سيلز (MUC2؛ سائو)، F-actin (گري) ۽ nuclei (syan) گٽ چپس تي 3 ڏينهن تائين وڌيا ويا، ترتيب سان (کاٻي) ۽ 13-ڏينهن (وچولي) آرگنائيز ايپيٿيليل پرت تي. پڻ ڏسو توسيع ٿيل ڊيٽا تصوير 3، جيڪو اشارو ڪندي LGR5 جي سگنل کي ظاهر ڪري ٿو. ڪلچر جي ڏينهن 13 تي CellMask ڊائي (ساڄي) سان پلازما جھلي کي داغ ڏيڻ سان چپ تي گٽ ۾ قائم ڪيل 3D آرگنائيڊ ايپيٿيليم جو ايٿيليل مائڪرو اسٽريچر (ساڄي) آهي. اسڪيل بار 50 μm آهي جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو وڃي.b حوالن جي اجازت سان ٻيهر ڇپيل.آڪسفورڊ يونيورسٽي پريس؛c حوالي جي اجازت سان ترتيب ڏنل.2.آڪسفورڊ يونيورسٽي پريس؛e ۽ f حوالي سان اجازت سان ترتيب ڏنل.12 تحت Creative Commons License CC BY 4.0.
هڪ چپ تي گٽ ۾، ڪامياب ECM ڪوٽنگ لاءِ PDMS پورس جھلي جي هائيڊروفوبڪ مٿاڇري کي تبديل ڪرڻ ضروري آهي. هن پروٽوڪول ۾، اسان PDMS جھلي جي هائيڊروفوبيڪٽي کي تبديل ڪرڻ لاءِ ٻه مختلف طريقا لاڳو ڪريون ٿا. ڪلچرنگ Caco-2 لاءِ، مٿاڇري جي چالو ڪرڻ لاءِ PDMS porous membrane جي مٿاڇري کي UV/Suhophob جي سطح تي ايڪٽيويٽ ڪيو ويو. ECM کي کوٽ ڪريو ۽ Caco-2 سيلز کي PDMS جھلي سان ڳنڍيو. جيتوڻيڪ، organoid epithelium جي microfluidic ڪلچر کي ڪيميائي بنياد تي سطح جي فنڪشنلائيزيشن جي ضرورت آهي ته ECM پروٽين جي موثر ذخيرو حاصل ڪرڻ لاء پوليٿيلينيمين (PEI) ۽ گلوٽارالڊيهائيڊ کي ترتيب سان لاڳو ڪرڻ سان PDMS مٿاڇري تي ECM ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس ايم ايس کي ڍڪايو. مٿاڇري ۽ پوءِ الڳ ٿيل آرگنائيڊ ايپيٿيليم ۾ داخل ڪيو وڃي ٿو. سيلن کي ڳنڍڻ کان پوءِ، مائڪرو فلوئڊڪ سيل ڪلچر صرف وچولي کي مٿئين مائڪرو چينل ۾ پرفيوز ڪرڻ سان شروع ٿئي ٿو جيستائين سيلز مڪمل monolayer ٺاهيندا آهن، جڏهن ته هيٺيون مائڪرو چينل جامد حالتن کي برقرار رکي ٿو. سطح جي چالو ڪرڻ لاءِ هي بهتر طريقو ۽ ECM ڪوٽنگ کي اي پي ايموفائيم ڊيوڊيم يا 3 تي منسلڪ ڪرڻ جي قابل بڻائي ٿو. PDMS سطح.
Transwell ڪلچر کي سيل جي ٻج کان اڳ ECM ڪوٽنگ جي ضرورت هوندي آهي.تنهن هوندي به، Transwell ڪلچرز porous inserts جي مٿاڇري کي چالو ڪرڻ لاءِ پيچيده علاج جي قدمن جي ضرورت نه هوندي آهي. Transwell inserts تي Caco-2 سيلن کي وڌائڻ لاءِ، porous inserts تي ECM ڪوٽنگ جدا ٿيل Caco-2 سيلز جي منسلڪ کي تيز ڪري ٿي (<1 ڪلاڪ) ۽ تنگ جنڪشن بيئرر ٺاھڻ (<1-2 ڪلچر تي ٽرانزولڊ انسرٽس يا ڪلچر تي <1-2 ڪلچر ڏنا ويا آھن). ECM-coated inserts، جھلي جي مٿاڇري سان ڳنڍيل آهن (<3 h) ۽ برقرار رکيا وڃن جيستائين آرگنائيز هڪ مڪمل monolayer ٺاهيندا آهن رڪاوٽ جي سالميت سان .Transwell ڪلچر کي 24-سٺي پليٽن ۾ هائبرڊ چپس جي استعمال کان سواء پرفارم ڪيو ويندو آهي.
vitro 3D morphogenesis ۾ fluid flow کي لاڳو ڪرڻ سان شروع ڪري سگهجي ٿو هڪ قائم ٿيل epithelial layer جي basolateral spect ڏانهن. هڪ چپ تي گٽ ۾، epithelial morphogenesis شروع ٿيو جڏهن وچولي کي مٿئين ۽ هيٺين microchannels ۾ perfused ڪيو ويو (Fig. 3a،). ڊائريڪشنل secreted morphogen inhibitors جي مسلسل هٽائڻ لاءِ ڪمپارٽمينٽ. porous membranes تي جڪڙيل سيلن کي ڪافي غذائي ۽ سيرم مهيا ڪرڻ ۽ luminal shear stress پيدا ڪرڻ لاءِ، اسان عام طور تي هڪ چپ تي گٽ ۾ ٻٽي وهڪري کي لاڳو ڪندا آهيون. هائبرڊ چپس ۾، Transwell inserts insert the epelithyps شامل هئا. وچولي کي microchannel ذريعي porous Transwell insert جي basolateral پاسي تي لاڳو ڪيو ويو. Intestinal morphogenesis ٻنهي ڪلچر پليٽ فارمن ۾ basolateral وهڪري جي شروعات کان 3-5 ڏينهن بعد ٿي.
مائڪروجنلجيڪل جون خاصيتون جا مظاهرين جون خاصيتون جيڪي مختلف تصوراتي طريقن کي لاڳو ڪري سگهجن ٿيون، ان کان علاوه مختلف تصوراتي رنگن، ياداشت جي برعڪس آئي ليڊيز پسمن ۽ پالئیےسٹر فلمن جي نظرياتي شفافيت تي، ٻنهي گيٽس آن يا هائبرڊ چپ پلاٽز جي ضرورت آهي. هڪ)، بعد ۾ ٽريٽن ايڪس 100 ۽ 2٪ (WT / vt-Vavumlans)، بائيزين تي ڀاڙيندڙن، مختلف خصلتن تي. پريمن تي ڀاڙيندڙن کي نشانو بڻايو ويندو آهي. يا ته نيوڪيوس کي نشانو بڻائڻ (مثال طور، 6-ڊامڊينو -2-phynyn-2-phyline) يا f-phyins pultins- plicece placelys pulciates.1، "سيل فرق" ۽ "گٽ فزيالوجي")، مائڪروبيل سيلز جي بي ترتيب نوآبادي (Fig. 1، "ميزبان-مائڪروب ڪو ڪلچر")، مدافعتي سيلز جي ڀرتي (تصوير 1، 'ڊيزيز ماڊلنگ') يا 3D epithelial ۽ modify 3D epithelial fhenic modifying. مٿيون پرت کي هيٺين مائڪرو چينل جي پرت کان الڳ ڪرڻ لاءِ چپ تي گٽ، جيئن ريف ۾ بيان ڪيو ويو آهي. جيئن تصوير 2 ۾ ڏيکاريل آهي، 3D ايپيٿيليل مورفولوجي سان گڏوگڏ apical برش جي بارڊر تي microvilli کي SEM (Fig. 3b) ذريعي تصور ڪري سگهجي ٿو. فرق جي نشانين جو اظهار هن واحد RCRNA-Cassing-In-Sec-in-Cassing ذريعي ڪري سگهجي ٿو. گٽ چپس يا هائبرڊ چپس ۾ پيدا ٿيندڙ اپيٿيليل سيلز جون 3D پرتون ٽرپسنائيزيشن ذريعي حاصل ڪيون وينديون آهن ۽ پوءِ ماليڪيولر يا جينياتي تجزيي لاءِ استعمال ٿينديون آهن.
a، هڪ هائيبرڊ چپ ۾ آنت جي مورفوجنسي جي شموليت لاءِ ڪم جو فلو. Caco-2 ۽ آنت جي آرگنائيز هن پروٽوڪول ۾ استعمال ڪيا ويا آهن ته جيئن 3D morphogenesis کي هڪ هائيبرڊ چپ پليٽ فارم ۾ ڏيکاريو وڃي. جدا ٿيل اپيٿيليل سيلز تيار ڪيا ويا آهن (Transwell اڳواٽ داخل ٿيل سيلز ڏسڻ لاءِ). Transwell inserts ۾ polyester membranes، سڀني سيلن کي جامد حالتن (TW ڪلچر) جي تحت ڪلچر ڪيو ويو. 7 ڏينهن کان پوء، هڪ واحد Transwell داخل ڪيو ويو جنهن ۾ 2D monolayer epithelial cells شامل هئا، هڪ هائيبرڊ چپ ۾ ضم ڪيو ويو ته هڪ basolateral وهڪري (Flow, BL) متعارف ڪرايو ويو، جنهن جي نتيجي ۾ آخرڪار هڪ micromoresphogene epithelial 3 جي نسل تي مشتمل آهي. هر تجرباتي قدم يا وقت جي نقطي تي عام ڊونر (C103 لڪير) کان نڪتل انساني عضون جي اپيٿيليل سيلز جي مورفولوجيڪل خصوصيتن کي ڏيکاريندي. مٿين پرت ۾ اسڪيميٽڪس هر قدم لاءِ تجرباتي تشڪيل کي واضع ڪري ٿو. بي، هائيبرڊ چپس (بائیں اسڪيميٽ) وٺي سگھي ٿو 3D کان وٺي سگھي ٿو 3D کان وٺي سگھي ٿو مائيڪرو-ڊونر سيلز جي اپيٿيليل سيلز جي نظر ثاني يا 3D کان وٺي مختلف Z پوزيشن تي (مٿين، وچين، ۽ هيٺيون؛ڏسو صحيح اسڪيميٽ ۽ لاڳاپيل ڊاٽ ٿيل لائينون).واضح مورفولوجي خاصيتون ڏيکاريا ويا. F-actin (cyan)، nucleus (grey)c، fluorescence confocal micrographs (3D angled view) organoid-derived epithelial cells Culture in static Transwell (TW; inset within white dashed box) بمقابلہ هائبرڊ ڪامپوڪلس ڊي (3D angled view). ترتيب سان. 2D عمودي ڪراس-ڪٽ نظرن جو هڪ جوڙو (مٿي ساڄي ڪنڊ ۾ نصب؛ "XZ") پڻ ڏيکاريو 2D ۽ 3D خاصيتون. اسڪيل بار، 100 µm.c حوالن جي اجازت سان ٻيهر ڇپيل.4.ايلسويئر.
ڪنٽرول هڪ ئي سيلز (Caco-2 يا آنت جي آرگنائيڊ ايپيٿيليل سيلز) کي ڪلچر ڪندي تيار ڪري سگھجن ٿا، روايتي جامد ڪلچر جي حالتن ۾ ٻه-dimensional monolayers ۾. خاص طور تي، غذائيت جي گھٽتائي جو نتيجو ٿي سگهي ٿو مائڪرو چينلز جي محدود مقدار جي گنجائش جي ڪري (يعني ~ 4 µL). basolateral وهڪري جي درخواست کان پوء به مقابلو ڪري سگهجي ٿو.
نرم ليٿوگرافي جو عمل صاف ڪمري ۾ ٿيڻ گهرجي. چپ تي هر پرت (مٿين ۽ هيٺان پرت ۽ جھلي) ۽ هائبرڊ چپس لاءِ، مختلف فوٽو ماسڪ استعمال ڪيا ويا ۽ الڳ سلڪون ويفرز تي ٺاهيا ويا، ڇاڪاڻ ته مائڪرو چينلز جي اوچائي مختلف هئي. مٿين ۽ هيٺين جي ٽارگيٽ جي اوچائي ۽ مائيڪرو چينلز جي 5µ0µ0p0µ0p. m، ترتيب سان. هائبرڊ چپ جي چينل جي ٽارگيٽ جي اوچائي 200 µm آهي.
هڪ 3 انچ سلڪون ويفر کي ڊش ۾ ايسٽون سان گڏ رکو. پليٽ کي 30 سيڪنڊن لاءِ نرميءَ سان گھمايو، پوءِ ويفر کي هوا ۾ خشڪ ڪريو. ويفر کي IPA سان پليٽ ۾ منتقل ڪريو، پوءِ پليٽ کي 30 سيڪنڊن لاءِ صاف ڪريو.
هڪ پرانها حل (هائيڊروجن پر آڪسائيڊ جو مرکب ۽ مرڪوز سلفورڪ ايسڊ، 1:3 (وول/وول)) اختياري طور استعمال ڪري سگهجي ٿو ته جيئن سلڪون ويفر جي مٿاڇري مان نامياتي باقيات کي وڌ کان وڌ ختم ڪري سگهجي.
Piranha محلول انتهائي corrosive آهي ۽ گرمي پيدا ڪري ٿو. اضافي حفاظتي احتياط ضروري آهي. فضول جي نيڪال لاء، حل کي ٿڌو ڪرڻ جي اجازت ڏيو ۽ صاف، سڪل فضول ڪنٽينر ۾ منتقل ڪريو. ثانوي ڪنٽينر استعمال ڪريو ۽ فضول ڪنٽينرز کي صحيح طور تي ليبل ڪريو. مھرباني ڪري وڌيڪ تفصيلي طريقيڪار لاء سهولت جي حفاظت جي ھدايتن تي عمل ڪريو.
ويفرز کي 200 ڊگري سينٽي گريڊ جي گرم پليٽ تي 10 منٽ لاءِ رکي ڊيھائيڊريٽ ڪريو. ڊي ھائيڊريشن کان پوءِ، ويفر کي پنج دفعا ھوا ۾ ڇڪيو وڃي ٿو ته جيئن ٿڌو ٿئي.
~ 10 گرام photoresist SU-8 2100 کي صاف ٿيل سلڪون ويفر جي مرڪز تي وجھو. ڦوٽو ريسٽ کي ويفر تي برابر پکيڙڻ لاءِ ٽائيزر استعمال ڪريو. ڪڏھن ڪڏھن ويفر کي 65 ڊگري سينٽي گريڊ واري گرم پليٽ تي رکو ته جيئن ڦوٽو ريزسٽ کي گھٽ چپڪي ۽ پکڙجڻ ۾ آسان ٿئي. سڌو سنئون پيفليٽ تي نه رکو.
SU-8 کي اسپن ڪوٽنگ هلائڻ سان ويفر تي هڪجهڙائي سان ورهايو ويو. 5-10 s لاءِ SU-8 جي ايندڙ گردش کي 500 rpm تي 100 rpm/s جي تيزيءَ سان پروپيگٽ ڪرڻ لاءِ پروگرام ڪريو. 200 µm ٿلهي پيٽرننگ لاءِ مکيه اسپن کي سيٽ ڪريو (a µm 5 µm ٿلهي پيٽرننگ يا حاصل ڪريو aµ0m5، 1 µm5 ڪنگ چپ تي گٽ جي مٿئين پرت لاءِ 500 µm اوچائي؛ هيٺ ڏسو ”نازڪ قدم“) 1,200 rpm تي 300 rpm/s 30 سيڪنڊن جي تيز رفتار تي مقرر ڪريو.
مکيه اسپن جي رفتار سلڪون ويفر تي SU-8 نموني جي ٽارگيٽ ٿلهي جي مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿي.
چپ تي گٽ جي مٿئين پرت لاءِ 500 µm جي اوچائي جو SU-8 نمونو ٺاھڻ لاءِ، ھن دٻي جي اسپين ڪوٽنگ ۽ نرم بيڪ مرحلا (قدم 7 ۽ 8) کي ترتيب وار ورجايو ويو (ڏسو قدم 9) 250 µm جا ٻه پرت پيدا ڪرڻ لاءِ، ھڪڙو ٿلهو پرت جيڪو UV1 ۾ شامل ٿي سگھي ٿو. 500 µm اونچائي هڪ پرت ٺاهيندي.
SU-8 ڪوٽيڊ ويفرز کي نرم بيڪ ڪريو احتياط سان گرم پليٽ تي 65 °C تي 5 منٽ لاءِ، پوءِ سيٽنگ کي 95 °C تي تبديل ڪريو ۽ اضافي 40 منٽ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو.
مٿئين مائڪرو چينل ۾ SU-8 نموني جي 500 μm جي اوچائي حاصل ڪرڻ لاءِ، ٻه 250 μm ٿلها SU-8 پرت پيدا ڪرڻ لاءِ قدم 7 ۽ 8 کي ورجايو.
UV ماسڪ Aligner استعمال ڪندي، ٺاهيندڙن جي هدايتن مطابق هڪ ليمپ ٽيسٽ انجام ڏيو ته جيئن ويفر جي نمائش جي وقت جو اندازو لڳايو وڃي.
نمائش جي وقت جو تعين ڪرڻ کان پوء، فوٽو ماسڪ کي UV ماسڪ الائنر جي ماسڪ هولڊر تي رکو ۽ فوٽو ماسڪ کي SU-8 ڪوٽيڊ ويفر تي رکو.
ڦوٽو ماسڪ جي ڇپيل مٿاڇري کي سڌو سنئون سلڪون ويفر جي SU-8 ڪوٽيڊ پاسي تي رکو ته جيئن UV پکيڙ کي گهٽ ۾ گهٽ ڪري سگهجي.
SU-8 ڪوٽيڊ ويفر ۽ ڦوٽو ماسڪ کي عمودي طور تي 260 mJ/cm2 جي UV لائيٽ کي اڳواٽ مقرر وقت لاءِ بي نقاب ڪريو (ڏسو ھن دٻي جو مرحلو 10).
UV جي نمائش کان پوءِ، SU-8-ڪوٽيڊ سلڪون ويفرز کي 65°C تي 5 منٽ ۽ 95°C تي 15 منٽ لاءِ هر گرم پليٽ تي پڪو ڪيو ويو ته جيئن 200 μm جي اوچائي سان نمونن کي ٺاهيو وڃي. 95 °C تي 30 منٽ جي فابريائيٽ سان 5µ00 منٽ جي اوچائي سان پوسٽ بيڪ وقت وڌايو.
ڊولپر کي شيشي جي ڊش ۾ وڌو ويندو آهي، ۽ پڪل ويفر ڊش ۾ رکيل هوندو آهي. SU-8 ڊولپر جو مقدار مختلف ٿي سگهي ٿو شيشي جي پليٽ جي ماپ جي لحاظ سان. پڪ ڪريو ته ڪافي SU-8 ڊولپر استعمال ڪريو مڪمل طور تي اڻ کليل SU-8 کي هٽائڻ لاءِ. مثال طور، جڏهن 150 ملي ميٽر قطر استعمال ڪريو ٿا. 25 منٽن لاء ٺهيل ڪڏهن ڪڏهن نرم گردش سان.
ترقي يافته مولڊ کي ~ 10 mL تازي ڊولپر سان ڌوئي پوءِ IPA سان حل کي پائپيٽ استعمال ڪندي اسپري ڪيو.
ويفر کي پلازما ڪلينر ۾ رکو ۽ 1.5 منٽ لاءِ آڪسيجن پلازما (ماحول جي گئس، ٽارگيٽ پريشر 1 × 10−5 Torr، پاور 125 W) جي سامهون رکو.
ويفر کي ويڪيوم ڊيسيڪيٽر ۾ رکي شيشي جي سلائيڊ اندر. ويفرز ۽ سلائيڊس کي پاسي ۾ رکي سگھجن ٿا. جيڪڏھن ويڪيوم ڊيسيڪيٽر کي پليٽ ذريعي ڪيترن ئي تہن ۾ ورهايو ويو آھي، سلائيڊ کي ھيٺئين چيمبر ۾ ۽ ويفرز کي مٿئين چيمبر ۾ رکو fluorooctyl) silane حل شيشي جي سلائيڊ تي ۽ سائلينائيزيشن لاء ويڪيوم لاڳو ڪريو.
منجمد ڪيل Caco-2 سيلز جي هڪ شيشي کي 37°C جي پاڻيءَ جي غسل ۾ اڇليو، پوءِ گل ٿيل سيلن کي T75 فلاسڪ ۾ منتقل ڪريو جنهن ۾ 15 mL 37°C اڳي گرم ڪيل Caco-2 ميڊيم هجي.
Caco-2 سيلز کي ~90% سنگم تي پاس ڪرڻ لاءِ، پهريون گرم Caco-2 ميڊيم، PBS، ۽ 0.25% trypsin/1 mM EDTA 37°C پاڻيءَ جي غسل ۾.
ويڪيوم اسپريشن ذريعي وچولي کي اسپريٽ ڪريو. سيلز کي ٻه ڀيرا 5 ملي ايل گرم پي بي ايس سان ڌوئي ويڪيوم اسپريشن کي ورجائي ۽ تازو پي بي ايس شامل ڪري.