Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان جيڪو برائوزر ورجن استعمال ڪري رهيا آهيو ان ۾ CSS لاءِ محدود سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو). ساڳئي وقت، مسلسل سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ ڏيکارينداسين.
انساني گٽ مورفوجينيسس 3D ايپيٿيليل مائڪرو آرڪيٽيڪچر ۽ اسپيشل آرگنائيزيشن جي ڪرپٽ-وِلس خاصيتن کي قائم ڪري ٿو. هي منفرد structure بيسل ڪرپٽ ۾ اسٽيم سيل نيچ کي خارجي مائڪروبيل اينٽيجنز ۽ انهن جي ميٽابولائٽس کان بچائيندي گٽ هوميوسٽاسس کي برقرار رکڻ لاءِ گهربل آهي. ان کان علاوه، آنڊن ويلي ۽ ڳرڻ وارو بلغم آنڊن جي ميوڪوسل مٿاڇري تي حفاظتي رڪاوٽ سان ڪم ڪندڙ طور تي مختلف ايپيٿيليل سيلز موجود آهن. تنهن ڪري، 3D ايپيٿيليل ڍانچي کي ٻيهر ٺاهڻ ان ويٽرو گٽ ماڊلز جي تعمير لاءِ اهم آهي. قابل ذڪر طور تي، نامياتي مائيميٽڪ گٽ-آن-اي-چپ آنڊن جي ايپيٿيليم جي خود بخود 3D مورفوجينيسس کي بهتر جسماني ڪمن ۽ بايو ميڪينڪس سان متاثر ڪري سگهي ٿو. هتي، اسان هڪ مائڪرو فلوئڊڪ چپ تي ۽ ٽرانس ويل ايمبيڊڊ هائبرڊ چپ ۾ گٽ ۾ آنڊن جي مورفوجينيسس کي مضبوط طور تي متاثر ڪرڻ لاءِ هڪ ريپروڊيوبل پروٽوڪول فراهم ڪندا آهيون. اسان ڊوائيس جي ٺهڻ، روايتي سيٽنگن ۾ ڪيڪو-2 يا آنڊن جي آرگنائيڊ ايپيٿيليل سيلز جي ڪلچرنگ ۽ گڏوگڏ مائڪرو فلوئڊڪ پليٽ فارم تي، 3D مورفوجينيسس جي شموليت، ۽ قائم ڪيل جي خاصيت لاءِ تفصيلي طريقا بيان ڪريون ٿا. 3D ايپيٿيليا ڪيترن ئي تصويري طريقن کي استعمال ڪندي. هي پروٽوڪول 5 ڏينهن لاءِ بيسولٽرل فلوئڊ فلو کي ڪنٽرول ڪندي فنڪشنل گٽ مائڪرو آرڪيٽيڪچر جي بحالي حاصل ڪري ٿو. اسان جو ان ويٽرو مورفوجينيسس طريقو جسماني طور تي لاڳاپيل شيئر اسٽريس ۽ ميڪيڪل حرڪت کي استعمال ڪري ٿو ۽ پيچيده سيل انجنيئرنگ يا هٿرادو جي ضرورت ناهي، جيڪا ٻين موجوده طريقن کي بهتر بڻائي سگهي ٿي. اسان تصور ڪريون ٿا ته اسان جو تجويز ڪيل پروٽوڪول بايوميڊيڪل ريسرچ ڪميونٽي لاءِ وسيع اثر رکي سگهي ٿو، بايوميڊيڪل، ڪلينڪل، ۽ دواسازي ايپليڪيشنن لاءِ ويٽرو ۾ 3D آنڊن جي ايپيٿيليل پرتن کي ٻيهر پيدا ڪرڻ جو طريقو مهيا ڪري ٿو.
تجربن مان ظاهر ٿئي ٿو ته آنڊن جي اپيٿيليل ڪيڪو-2 سيلز گٽ-آن-اي-چپ1,2,3,4,5 يا بائي ليئر مائڪرو فلوئڊڪ ڊوائيسز6,7 ۾ ڪلچر ڪيا ويا آهن، بنيادي ميڪانيزم جي واضح سمجھ کان سواءِ ويٽرو ۾ خود بخود 3D مورفوجنيسس مان گذري سگهن ٿا. اسان جي تازي مطالعي ۾، اسان ڏٺو ته ڪلچر ڊوائيسز مان بيسوليٽرلي طور تي لڪيل مورفوجن مخالفن کي هٽائڻ ضروري آهي ۽ ويٽرو ۾ 3D اپيٿيليل مورفوجنيسس کي وڌائڻ لاءِ ڪافي آهي، جيڪو ڪيڪو-2 ۽ مريض مان نڪتل آنڊن جي آرگنائيڊز پاران ڏيکاريو ويو آهي. اپيٿيليل سيلز جي تصديق ڪئي وئي. هن مطالعي ۾، اسان خاص طور تي گٽ-آن-اي-چپ ۽ تبديل ٿيل مائڪرو فلوئڊڪ ڊوائيسز ۾ هڪ طاقتور Wnt مخالف، ڊڪڪوپ-1 (DKK-1) جي سيل جي پيداوار ۽ ڪنسنٽريشن ورڇ تي ڌيان ڏنو، جنهن ۾ ٽرانس ويل انسرٽس شامل آهن، جنهن کي "هائبرڊ چپ" سڏيو ويندو آهي. اسان اهو ظاهر ڪريون ٿا ته آن-چپ گٽ ۾ خارجي Wnt مخالفن (جهڙوڪ DKK-1، Wnt ريپريسر 1، secreted frizzled-related protein 1، يا Soggy-1) جو اضافو مورفوجينيسس کي روڪي ٿو يا اڳ ۾ ٺهيل 3D ايپيٿيليل پرت کي خراب ڪري ٿو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ڪلچر دوران مخالف دٻاءُ ان ويٽرو ۾ آنڊن جي مورفوجينيسس لاءِ ذميوار آهي. تنهن ڪري، اپيٿيليل انٽرفيس تي مضبوط مورفوجينيسس حاصل ڪرڻ لاءِ هڪ عملي طريقو اهو آهي ته فعال فلشنگ (مثال طور، گٽ-آن-اي-چپ يا هائبرڊ-آن-اي-چپ پليٽ فارمن ۾) يا ڊفيوژن ذريعي بيسوليٽرل ڪمپارٽمينٽ ۾ Wnt مخالفن جي سطح کي هٽايو وڃي يا گهٽ ۾ گهٽ برقرار رکيو وڃي. بيسوليٽرل ميڊيا (مثال طور، ٽرانس ويل انسرٽس کان وڏي بيسوليٽرل ذخيرن ۾ کوهن ۾).
هن پروٽوڪول ۾، اسان گٽ-آن-اي-چپ مائڪرو ڊيوائسز ۽ ٽرانس ويل-انسرٽيبل هائبرڊ چپس (قدم 1-5) ٺاهڻ لاءِ هڪ تفصيلي طريقو مهيا ڪريون ٿا ته جيئن پولي ڊيميٿيل سلڪسين (PDMS) تي ٻڌل پورس جھليون (قدم 6A، 7A، 8، 9) يا ٽرانس ويل انسرٽس (قدم 6B، 7B، 8، 9) جي پاليسٽر جھليون ۽ انڊيوسڊ 3D مورفوجينيسس ان ويٽرو (قدم 10) تي آنڊن جي اپيٿيليل سيلز کي ڪلچر ڪري سگهجي. اسان ڪيترن ئي اميجنگ طريقن (قدم 11-24) کي لاڳو ڪندي ٽشو-مخصوص هسٽوجينيسس ۽ نسب تي منحصر سيلولر فرق جي نشاندهي ڪندڙ سيلولر ۽ ماليڪيولر خاصيتن جي سڃاڻپ ڪئي. اسان انساني آنڊن جي اپيٿيليل سيلز، جهڙوڪ ڪيڪو-2 يا آنڊن جي آرگنائيڊز، کي ٻن ڪلچر فارميٽ ۾ استعمال ڪندي مورفوجينيسس کي متاثر ڪريون ٿا جن ۾ ٽيڪنيڪل تفصيل شامل آهن جن ۾ پورس جھليون جي مٿاڇري جي تبديلي، 2D مونوليئرز جي تخليق، ۽ آنڊن جي بايو ڪيميڪل ۽ بايو ميڪينيڪل مائڪرو ماحول جي پيداوار شامل آهن. ان ويٽرو. 2D اپيٿيليل مونوليئرز مان 3D مورفوجينيسس کي متاثر ڪرڻ لاءِ، اسان مورفوجن کي هٽايو. ڪلچر جي بيسولٽرل ڪمپارٽمينٽ ۾ وچولي وهڪري ذريعي ٻنهي ڪلچر ٿيل شڪلن ۾ مخالف. آخرڪار، اسان هڪ ٻيهر پيدا ٿيندڙ 3D ايپيٿيليل پرت جي افاديت جي نمائندگي فراهم ڪريون ٿا جيڪو مورفوجن تي منحصر ايپيٿيليل واڌ، طول بلد ميزبان-مائڪروبائيوم ڪو-ڪلچر، پيٿوجن انفيڪشن، سوزش واري زخم، ايپيٿيليل رڪاوٽ جي خرابي، ۽ پروبائيوٽڪ تي ٻڌل علاج جي ماڊل لاءِ استعمال ٿي سگهي ٿو. مثال طور. اثر.
اسان جو پروٽوڪول بنيادي (مثال طور، آنڊن جي ميوڪوسل بائيولاجي، اسٽيم سيل بائيولاجي، ۽ ڊولپمينٽ بائيولاجي) ۽ اپلائيڊ ريسرچ (مثال طور، پري ڪلينڪل ڊرگ ٽيسٽنگ، بيماري ماڊلنگ، ٽشو انجنيئرنگ، ۽ گيسٽرو اينٽرولوجي) جي وسيع اثر ۾ سائنسدانن جي وسيع رينج لاءِ ڪارآمد ٿي سگهي ٿو. اسان جي پروٽوڪول جي پيداوار ۽ مضبوطي جي ڪري ته جيئن ان ويٽرو ۾ آنڊن جي ايپيٿيليم جي 3D مورفوجينيسس کي متاثر ڪري سگهجي، اسان تصور ڪريون ٿا ته اسان جي ٽيڪنيڪل حڪمت عملي آنڊن جي ترقي، بحالي يا هوميوسٽاسس دوران سيل سگنلنگ جي حرڪيات جو مطالعو ڪندڙ سامعين تائين پهچائي سگهجي ٿي. ان کان علاوه، اسان جو پروٽوڪول مختلف متعدي ايجنٽن جهڙوڪ نورووائرس 8، سيويور ايڪيوٽ ريسپائريٽري سنڊروم ڪورونا وائرس 2 (SARS-CoV-2)، ڪلوسٽريڊيم ڊفيسائل، سالمونلا ٽائيفيموريم 9 يا ويبريو ڪوليرا جي تحت انفيڪشن جي جاچ لاءِ مفيد آهي. بيماري جي پيٿولوجي ۽ پيٿوجينيسس جا سامعين پڻ مفيد آهن. آن-چپ گٽ مائڪرو فزيولوجي سسٽم جو استعمال ڊگھائي ڪو-ڪلچر 10 ۽ بعد ۾ گيسٽرو انٽيسٽينل (GI) ٽريڪٽ 11 ۾ ميزبان دفاع، مدافعتي ردعمل ۽ پيٿوجن سان لاڳاپيل زخم جي مرمت جي جائزي جي اجازت ڏئي سگھي ٿو. ليڪي گٽ سنڊروم، سيليڪ بيماري، ڪرون جي بيماري، السرٽيو ڪولائٽس، پائوچائٽس، يا چڙچڙ واري آنڊن جي سنڊروم سان لاڳاپيل ٻيون GI خرابيون جڏهن مريض جي 3D آنڊن جي ايپيٿيليل پرتن کي استعمال ڪندي 3D آنڊن جي ايپيٿيليل پرتن کي تيار ڪيو ويندو آهي، انهن بيمارين ۾ ويلس ايٽروفي، ڪرپٽ شارٽننگ، ميوڪوسل نقصان، يا خراب ٿيل ايپيٿيليل رڪاوٽ شامل آهن. بايوپسي يا اسٽيم سيل مان نڪتل آنڊن جي آرگنائيڊس 12,13. بيماري جي ماحول جي اعلي پيچيدگي کي بهتر نموني ڪرڻ لاءِ، پڙهندڙ بيماري سان لاڳاپيل سيل قسمن، جهڙوڪ مريض پردي جي رت جي مونو نيوڪليئر سيلز (PBMCs) کي 3D آنڊن جي ويلس-ڪرپٽ مائڪرو آرڪيٽيڪچرز تي مشتمل ماڊلز ۾ شامل ڪرڻ تي غور ڪري سگهن ٿا. ٽشو-مخصوص مدافعتي سيلز، 5.
جيئن ته 3D ايپيٿيليل مائڪرو اسٽرڪچر کي سيڪشننگ جي عمل کان سواءِ درست ۽ تصور ڪري سگهجي ٿو، اسپيشل ٽرانسڪرپٽوميڪس ۽ هاءِ ريزوليوشن يا سپر ريزوليوشن اميجنگ تي ڪم ڪندڙ ناظرین شايد ايپيٿيليل نيچز تي جينز ۽ پروٽين جي اسپيٽيوٽيمپورل ڊائنامڪس جي اسان جي ميپنگ ۾ دلچسپي رکن ٿا. ٽيڪنالاجي ۾ دلچسپي. مائڪروبيل يا مدافعتي محرڪن جو جواب. وڌيڪ، ڊگھائي ميزبان-مائڪروبائيوم ڪراس ٽالڪ 10، 14 جيڪي گٽ هوميوسٽاسس کي هم آهنگ ڪن ٿا، 3D آنٽيل ميوڪوسل پرت ۾ مختلف مائڪروبيل نسلن، مائڪروبيل برادرين يا فيڪل مائڪروبيوٽا کي گڏ ڪلچر ڪندي قائم ڪري سگهجي ٿو، خاص طور تي گٽ-آن-اي-چپ ۾. پليٽ فارم ۾. هي طريقو خاص طور تي ليبارٽري ۾ اڳ ۾ غير ثقافتي گٽ مائڪروبائيوما، ڪلچرومڪس ۽ ڪلينڪل مائڪروبائيولوجي جو مطالعو ڪندڙ سامعين لاءِ پرڪشش آهي جيڪي اڳ ۾ غير ثقافتي گٽ مائڪروبائيوٽا کي پوکڻ جي ڪوشش ڪري رهيا آهن. جيڪڏهن اسان جي ان ويٽرو مورفوجينيسس پروٽوڪول کي اسڪيلبل ڪلچر فارميٽ سان ترتيب ڏئي سگهجي ٿو، جهڙوڪ 24، 96 يا 384 ويل پليٽن ۾ ملٽي ويل انسرٽس جيڪي مسلسل بيسوليٽرل ڪمپارٽمينٽس کي ڀريندا آهن، پروٽوڪول کي انهن ماڻهن تائين پڻ پهچائي سگهجي ٿو جيڪي دواسازي، بايو ميڊيڪل يا فوڊ انڊسٽري لاءِ هاءِ ٿرو پُٽ اسڪريننگ يا تصديق پليٽ فارم ٺاهي رهيا آهن. اصول جي ثبوت جي طور تي، اسان تازو ئي هڪ ملٽي پلڪس هاءِ ٿرو پُٽ مورفوجينيسس سسٽم جي فزيبلٽي جو مظاهرو ڪيو آهي جيڪو 24 ويل پليٽ فارميٽ تائين اسڪيلبل آهي. ان کان علاوه، گھڻن آرگن-آن-اي-چپ پراڊڪٽس کي ڪمرشلائيز ڪيو ويو آهي 16,17,18. تنهن ڪري، اسان جي ان ويٽرو مورفوجينيسس طريقي جي تصديق کي تيز ڪري سگهجي ٿو ۽ ممڪن طور تي ڪيترن ئي ريسرچ ليبارٽريز، صنعت يا حڪومت ۽ ريگيوليٽري ايجنسين پاران ان ويٽرو گٽ مورفوجينيسس جي سيلولر ري پروگرامنگ کي سمجهڻ لاءِ ٽرانسڪرپٽوميڪ سطح تي ٽيسٽ ڪرڻ لاءِ اختيار ڪري سگهجي ٿو. دوائون يا بايوٿراپيوٽڪس دوا جي اميدوارن جي جذب ۽ نقل و حمل جو جائزو 3D گٽ سروگيٽس استعمال ڪندي يا ڪسٽم يا ڪمرشل آرگن-آن-اي-چپ ماڊل استعمال ڪندي گٽ مورفوجينيسس عمل جي ٻيهر پيداوار جو جائزو وٺڻ لاءِ ڪيو ويو.
آنڊن جي اپيٿيليل مورفوجينيسس جي مطالعي لاءِ محدود تعداد ۾ انساني لاڳاپيل تجرباتي ماڊل استعمال ڪيا ويا آهن، خاص طور تي ويٽرو ۾ 3D مورفوجينيسس کي متاثر ڪرڻ لاءِ لاڳو ٿيندڙ پروٽوڪول جي کوٽ جي ڪري. حقيقت ۾، گٽ مورفوجينيسس بابت موجوده ڄاڻ جو گهڻو حصو جانورن جي مطالعي تي ٻڌل آهي (مثال طور، زيبرا فش 20، چوٿون 21 يا ڪڪڙ 22). بهرحال، اهي محنت ۽ قيمت وارا آهن، اخلاقي طور تي قابل اعتراض ٿي سگهن ٿا، ۽ سڀ کان اهم، انساني ترقي جي عملن کي صحيح طور تي طئي نٿا ڪن. اهي ماڊل پڻ انهن جي صلاحيت ۾ تمام محدود آهن ته انهن کي هڪ گھڻ طرفي اسڪيلبل انداز ۾ آزمايو وڃي. تنهن ڪري، ويٽرو ۾ 3D ٽشو ڍانچي کي ٻيهر پيدا ڪرڻ لاءِ اسان جو پروٽوڪول وييو جانورن جي ماڊلز ۽ ٻين روايتي جامد 2D سيل ڪلچر ماڊلز ۾ بهتر ڪارڪردگي ڏيکاري ٿو. جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي، 3D اپيٿيليل ڍانچي کي استعمال ڪندي اسان کي مختلف ميوڪوسل يا مدافعتي محرکن جي جواب ۾ ڪرپٽ-وِلس محور ۾ مختلف سيلز جي مقامي لوڪلائيزيشن کي جانچڻ جي اجازت ڏني وئي آهي. 3D اپيٿيليل پرتون مطالعي لاءِ هڪ جاءِ فراهم ڪري سگهن ٿيون ته مائڪروبيل سيلز ميزبان عنصرن جي جواب ۾ مقامي نچ ۽ ماحولياتي ارتقا ٺاهڻ لاءِ ڪيئن مقابلو ڪن ٿا (مثال طور، اندروني بمقابله ٻاهرين بلغم پرتون، رطوبت) IgA ۽ antimicrobial peptides). ان کان علاوه، 3D epithelial morphology اسان کي اهو سمجهڻ جي اجازت ڏئي سگهي ٿي ته گٽ مائڪروبيوٽا پنهنجي برادرين کي ڪيئن ٺاهيندو آهي ۽ هم آهنگي سان مائڪروبيل ميٽابولائٽس (مثال طور، شارٽ چين فيٽي ايسڊ) پيدا ڪندو آهي جيڪي بيسل ڪرپٽس ۾ سيلولر تنظيم ۽ اسٽيم سيل نيچز کي شڪل ڏيندا آهن. اهي خاصيتون صرف تڏهن ڏيکاري سگهجن ٿيون جڏهن 3D epithelial پرتون ويٽرو ۾ قائم ٿين ٿيون.
3D آنڊن جي اپيٿيليل ڍانچي ٺاهڻ جي اسان جي طريقي کان علاوه، ڪيترائي ان ويٽرو طريقا آهن. آنڊن جي آرگنائيڊ ڪلچر هڪ جديد ٽشو انجنيئرنگ ٽيڪنڪ آهي جيڪا مخصوص مورفوجن حالتن 23,24,25 تحت آنڊن جي اسٽيم سيلز جي پوک تي ٻڌل آهي. بهرحال، ٽرانسپورٽ تجزيو يا ميزبان-مائڪروبائيوم ڪو-ڪلچرز لاءِ 3D آرگنائيڊ ماڊلز جو استعمال اڪثر چئلينجنگ هوندو آهي ڇاڪاڻ ته آنڊن جو ليمن آرگنائيڊ اندر بند هوندو آهي ۽ تنهن ڪري، مائڪروبيل سيلز يا ايڪسوجينس اينٽيجنز جهڙن لومينل حصن جو تعارف محدود هوندو آهي. مائڪرو انجيڪٽر استعمال ڪندي آرگنائيڊ ليمن تائين رسائي کي بهتر بڻائي سگهجي ٿو، 26,27 پر هي طريقو ناگوار ۽ محنت طلب آهي ۽ ان کي انجام ڏيڻ لاءِ خاص علم جي ضرورت آهي. ان کان علاوه، جامد حالتن ۾ هائيڊروجيل اسڪافولڊس ۾ رکيل روايتي آرگنائيڊ ڪلچر صحيح طور تي فعال ان ويوو بايو ميڪينڪس کي ظاهر نٿا ڪن.
ڪيترن ئي ريسرچ گروپن پاران استعمال ڪيل ٻيا طريقا جيل جي مٿاڇري تي الڳ ٿيل انساني آنڊن جي سيلن کي ڪلچر ڪندي گٽ جي اپيٿيليل ڍانچي جي نقل ڪرڻ لاءِ پري اسٽرڪچرڊ 3D هائيڊروجيل اسڪافولڊس استعمال ڪن ٿا. 3D-پرنٽ ٿيل، مائڪرو ملڊ، يا لٿوگرافڪ طور تي ٺهيل مولڊ استعمال ڪندي هائيڊروجيل اسڪافولڊس ٺاهيو. هي طريقو جسماني طور تي لاڳاپيل مورفوجن گريڊينٽ سان ويٽرو ۾ الڳ ٿيل اپيٿيليل سيلز جي خود منظم ترتيب کي ڏيکاري ٿو، اسڪافولڊ ۾ اسٽرومل سيلز کي شامل ڪندي هڪ اعلي اسپيڪٽ ريشو ايپيٿيليل ڍانچي ۽ اسٽروما-ايپيٿيليل ڪراس ٽالڪ قائم ڪري ٿو. بهرحال، پري اسٽرڪچرڊ اسڪافولڊس جي نوعيت خود بخود مورفوجينيٽڪ عمل جي نمائش کي روڪي سگھي ٿي. اهي ماڊل متحرڪ لومينل يا انٽرسٽيشل وهڪري پڻ فراهم نه ڪندا آهن، فلوئڊ شيئر اسٽريس جي کوٽ هوندي آهي جيڪا آنڊن جي سيلز کي مورفوجينيسس مان گذرڻ ۽ جسماني ڪم حاصل ڪرڻ جي ضرورت هوندي آهي. هڪ ٻي تازي مطالعي ۾ هائيڊروجيل اسڪافولڊس کي مائڪرو فلوئڊڪ پليٽ فارم ۽ پيٽرن ٿيل آنڊن جي اپيٿيليل ڍانچي ۾ ليزر-ايچنگ ٽيڪنڪ استعمال ڪندي استعمال ڪيو ويو. ماؤس آنڊن جي آرگنائيڊز آنڊن جي ٽيوبلر ڍانچي ٺاهڻ لاءِ ايچ ٿيل نمونن جي پيروي ڪندا آهن، ۽ انٽرا لومينل فلوئڊ وهڪري کي مائڪرو فلوئڊڪس استعمال ڪندي ٻيهر ترتيب ڏئي سگهجي ٿو. ماڊيول. بهرحال، هي ماڊل نه ته خود بخود مورفوجينيٽڪ عملن کي ظاهر ڪري ٿو ۽ نه ئي گٽ ميڪانوبائيولوجيڪل حرڪتون شامل ڪري ٿو. ساڳئي گروپ مان 3D پرنٽنگ ٽيڪنڪون خود بخود مورفوجينيٽڪ عملن سان ننڍڙا گٽ ٽيوب ٺاهڻ جي قابل هيون. ٽيوب اندر مختلف گٽ حصن جي پيچيده ٺهڻ ​​جي باوجود، هن ماڊل ۾ لومينل فلوئڊ فلو ۽ ميڪيڪل ڊيفارميشن جي به کوٽ آهي. اضافي طور تي، ماڊل آپريبلٽي محدود ٿي سگهي ٿي، خاص طور تي بايو پرنٽنگ جي عمل جي مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، تجرباتي حالتن يا سيل کان سيل رابطي کي پريشان ڪري ٿي. ان جي بدران، اسان جو تجويز ڪيل پروٽوڪول خود بخود گٽ مورفوجينيٽڪ، جسماني طور تي لاڳاپيل شيئر اسٽريس، بايو ميڪينڪس مهيا ڪري ٿو جيڪي گٽ جي حرڪت جي نقل ڪن ٿا، آزاد اپيڪل ۽ بيسولٽرل ڪمپارٽمينٽس جي رسائي، ۽ ماڊيولرٽي جي پيچيده حياتياتي مائڪرو ماحول جي ٻيهر تخليق. تنهن ڪري، اسان جو ان ويٽرو 3D مورفوجينيٽڪ پروٽوڪول موجوده طريقن جي چئلينجن کي منهن ڏيڻ لاءِ هڪ مڪمل طريقو فراهم ڪري سگهي ٿو.
اسان جو پروٽوڪول مڪمل طور تي 3D ايپيٿيليل مورفوجينيسس تي مرکوز آهي، جنهن ۾ ڪلچر ۾ صرف ايپيٿيليل سيلز آهن ۽ ٻين قسمن جي آس پاس جي سيلز جهڙوڪ ميسينچيمل سيلز، اينڊوٿيليل سيلز، ۽ مدافعتي سيلز شامل نه آهن. جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي، اسان جي پروٽوڪول جو بنيادي مقصد متعارف ڪرايل ميڊيم جي بيسولٽرل پاسي تي لڪيل مورفوجن انبيٽرز کي هٽائي ايپيٿيليل مورفوجينيسس جو انڊڪشن آهي. جڏهن ته اسان جي گٽ-آن-اي-چپ ۽ هائبرڊ-آن-اي-چپ جي مضبوط ماڊيولرٽي اسان کي انڊوليٽنگ 3D ايپيٿيليل پرت کي ٻيهر ٺاهڻ جي اجازت ڏئي ٿي، اضافي حياتياتي پيچيدگيون جهڙوڪ ايپيٿيليل-ميسينچيمل انٽراڪشن 33,34، ايڪسٽرا سيلولر ميٽرڪس (ECM) جمع 35 ۽، اسان جي ماڊل ۾، ڪرپٽ-وِلس خاصيتون جيڪي بيسل ڪرپٽس ۾ اسٽيم سيل نيچز کي پهچائين ٿيون، انهن تي وڌيڪ غور ڪيو وڃي ٿو. ميسينچيم ۾ اسٽرومل سيلز (مثال طور، فائبروبلاسٽ) ECM پروٽين جي پيداوار ۽ وييو ۾ آنڊن جي مورفوجينيسس جي ضابطي ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿا35,37,38. اسان جي ماڊل ۾ ميسينچيمل سيلز جي اضافي کي وڌايو ويو مورفوجينيٽڪ عمل ۽ سيل اٽيچمينٽ ڪارڪردگي. اينڊوٿيليل پرت (يعني، ڪيپليئرز يا لففيٽڪس) آنڊن جي مائڪرو ماحول ۾ ماليڪيولر ٽرانسپورٽ 39 ۽ مدافعتي سيل جي ڀرتي 40 کي منظم ڪرڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿي. ان کان علاوه، ويسڪوليچر جزا جيڪي ٽشو ماڊلز جي وچ ۾ ڳنڍيل ٿي سگهن ٿا هڪ شرط آهن جڏهن ٽشو ماڊلز کي ملٽي آرگن انٽراڪشن جو مظاهرو ڪرڻ لاءِ ٺاهيو ويندو آهي. تنهن ڪري، اينڊوٿيليل سيلز کي عضون جي سطح جي ريزوليوشن سان وڌيڪ صحيح جسماني خاصيتن کي ماڊل ڪرڻ لاءِ شامل ڪرڻ جي ضرورت پوندي. مريض مان نڪتل مدافعتي سيلز آنڊن جي بيماري جي نقل ڪرڻ جي حوالي سان فطري مدافعتي ردعمل، اينٽيجن پيشڪش، فطري موافقت مدافعتي ڪراس ٽالڪ، ۽ ٽشو مخصوص مدافعت کي ظاهر ڪرڻ لاءِ پڻ ضروري آهن.
هائبرڊ چپس جو استعمال گٽ-آن-اي-چپ جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ سڌو آهي ڇاڪاڻ ته ڊوائيس سيٽ اپ آسان آهي ۽ ٽرانس ويل انسرٽس جو استعمال گٽ ايپيٿيليم جي اسڪيلبل ڪلچر جي اجازت ڏئي ٿو. تنهن هوندي به، پاليسٽر جھلي سان تجارتي طور تي دستياب ٽرانس ويل انسرٽس لچڪدار نه آهن ۽ پيرسٽالٽڪ جهڙين حرڪتن کي نقل نٿا ڪري سگهن. وڌيڪ، هائبرڊ چپ ۾ رکيل ٽرانس ويل انسرٽ جو اپيڪل ڪمپارٽمينٽ اپيڪل پاسي تي ڪنهن به شيئر اسٽريس سان بيٺل رهيو. واضح طور تي، اپيڪل ڪمپارٽمينٽ ۾ جامد خاصيتون هائبرڊ چپس ۾ ڊگهي مدت جي بيڪٽيريا ڪو ڪلچر کي گهٽ ۾ گهٽ فعال ڪن ٿيون. جڏهن ته اسان هائبرڊ چپس استعمال ڪندي ٽرانس ويل انسرٽس ۾ مضبوطيءَ سان 3D مورفوجينيسس کي متاثر ڪري سگهون ٿا، جسماني طور تي لاڳاپيل بايو ميڪينڪس ۽ اپيڪل فلوئڊ فلو جي گهٽتائي امڪاني ايپليڪيشنن لاءِ هائبرڊ چپ پليٽ فارمن جي فزيبلٽي کي محدود ڪري سگهي ٿي.
گٽ-آن-اي-چپ ۽ هائبرڊ-آن-اي-چپ ڪلچرن ۾ انساني ڪرپٽ-وِليس محور جي مڪمل پيماني تي تعمير نو مڪمل طور تي قائم نه ڪئي وئي آهي. جيئن ته مورفوجينيسس هڪ اپيٿيليل مونوليئر کان شروع ٿئي ٿو، 3D مائڪرو آرڪيٽيڪچر ضروري طور تي وييو ۾ ڪرپٽ سان مورفولوجيڪل مماثلت فراهم نٿا ڪن. جيتوڻيڪ اسان مائڪرو انجنيئرڊ 3D ايپيٿيليم ۾ بيسل ڪرپٽ ڊومين جي ويجهو وڌندڙ سيل آبادي جي خاصيت ڪئي، ڪرپٽ ۽ ويلوس علائقن کي واضح طور تي حد بندي نه ڪئي وئي. جيتوڻيڪ چپ تي اعليٰ اپر چينل مائڪرو انجنيئرڊ ايپيٿيليم جي اوچائي کي وڌائين ٿا، وڌ ۾ وڌ اوچائي اڃا تائين ~300-400 µm تائين محدود آهي. ننڍي ۽ وڏي آنڊن ۾ انساني آنڊن جي ڪرپٽ جي اصل کوٽائي ترتيب وار ~135 µm ۽ ~400 µm آهي، ۽ ننڍي آنڊن جي وِلي جي اوچائي ~600 µm41 آهي.
تصويري نقطي نظر کان، 3D مائڪرو آرڪيٽيڪچرز جي ان سيٽو سپر ريزوليوشن تصويرنگ چپ تي گٽ تائين محدود ٿي سگهي ٿي، ڇاڪاڻ ته آبجيڪٽو لينس کان ايپيٿيليل پرت تائين گهربل ڪم ڪندڙ فاصلو ڪجهه ملي ميٽرن جي ترتيب تي آهي. هن مسئلي کي حل ڪرڻ لاءِ، هڪ پري مقصد جي ضرورت پئجي سگهي ٿي. ان کان علاوه، تصويري نموني جي تياري لاءِ پتلي حصا ٺاهڻ PDMS جي اعلي لچڪ جي ڪري چئلينجنگ آهي. ان کان علاوه، جيئن ته چپ تي گٽ جي پرت-بائي-پرت مائڪرو فيبريڪيشن ۾ هر پرت جي وچ ۾ مستقل چپڪ شامل آهي، اپيٿيليل پرت جي مٿاڇري جي جوڙجڪ کي جانچڻ لاءِ مٿئين پرت کي کولڻ يا هٽائڻ انتهائي چئلينجنگ آهي. مثال طور، اسڪيننگ اليڪٽران مائڪروسڪوپ (SEM) استعمال ڪندي.
هائيڊروفوبڪ ننڍن ماليڪيولن سان لاڳاپيل مائڪرو فلوئڊڪ تي ٻڌل مطالعي ۾ PDMS جي هائيڊروفوبيسيٽي هڪ محدود عنصر رهي آهي، ڇاڪاڻ ته PDMS غير خاص طور تي اهڙن هائيڊروفوبڪ ماليڪيولن کي جذب ڪري سگهي ٿو. PDMS جي متبادل کي ٻين پوليمرڪ مواد سان سمجهي سگهجي ٿو. متبادل طور تي، PDMS جي مٿاڇري جي ترميم (مثال طور، لپوفيلڪ مواد 42 يا پولي (ايٿيلين گلائڪول) 43 سان ڪوٽنگ) کي هائيڊروفوبڪ ماليڪيولن جي جذب کي گهٽائڻ لاءِ سمجهي سگهجي ٿو.
آخرڪار، اسان جو طريقو هڪ اعليٰ-ٿرو پُٽ اسڪريننگ يا "هڪ-سائيز-فٽ-سڀ" استعمال ڪندڙ-دوست تجرباتي پليٽ فارم مهيا ڪرڻ جي لحاظ کان چڱي طرح بيان نه ڪيو ويو آهي. موجوده پروٽوڪول کي هر مائڪرو ڊيوائس ۾ هڪ سرنج پمپ جي ضرورت آهي، جيڪو CO2 انڪيوبيٽر ۾ جاءِ وٺندو آهي ۽ وڏي پيماني تي تجربن کي روڪيندو آهي. هن حد کي جديد ڪلچر فارميٽ جي اسڪيل ايبلٽي ذريعي خاص طور تي بهتر بڻائي سگهجي ٿو (مثال طور، 24-ويل، 96-ويل، يا 384-ويل پورس انسرٽس جيڪي مسلسل ٻيهر ڀرڻ ۽ بيسوليٽرل ميڊيا کي هٽائڻ جي اجازت ڏين ٿا).
انساني آنڊن جي ايپيٿيليم جي 3D مورفوجينيسس کي ويٽرو ۾ آڻڻ لاءِ، اسان هڪ مائڪرو فلوئڊڪ چپ آنڊن ڊيوائس استعمال ڪيو جنهن ۾ ٻه متوازي مائڪرو چينل ۽ وچ ۾ هڪ لچڪدار پورس جھلي شامل هئي ته جيئن هڪ لومن-ڪيپليري انٽرفيس ٺاهي سگهجي. اسان هڪ سنگل چينل مائڪرو فلوئڊڪ ڊيوائس (هڪ هائبرڊ چپ) جي استعمال جو پڻ مظاهرو ڪريون ٿا جيڪو ٽرانس ويل انسرٽس تي پوکيل پولرائزڊ ايپيٿيليل پرتن جي هيٺان مسلسل بيسوليٽرل وهڪري فراهم ڪري ٿو. ٻنهي پليٽ فارمن ۾، مختلف انساني آنڊن جي ايپيٿيليل سيلز جي مورفوجينيسس کي بيسوليٽرل ڪمپارٽمينٽ مان مورفوجن مخالفن کي هٽائڻ لاءِ وهڪري جي هدايتي هٿرادو کي لاڳو ڪندي ڏيکاري سگهجي ٿو. سڄو تجرباتي طريقو (شڪل 1) پنج حصن تي مشتمل آهي: (i) گٽ چپ يا ٽرانس ويل انسرٽيبل هائبرڊ چپ جو مائڪرو فيبريڪيشن (قدم 1-5؛ باڪس 1)، (ii) آنڊن جي ايپيٿيليل سيلز (ڪيڪو-2 سيلز) يا انساني آنڊن جي آرگنائيڊز جي تياري؛ باڪس 2-5)، (iii) آنڊن جي چپس يا هائبرڊ چپس تي آنڊن جي اپيٿيليل سيلز جو ڪلچر (قدم 6-9)، (iv) 3D اپيٿيليل مائڪرو اسٽرڪچر (قدم 11-24) کي نمايان ڪرڻ لاءِ ويٽرو ۾ 3D مورفوجينيسس (قدم 10) ۽ (v) جي شموليت. آخرڪار، هڪ مناسب ڪنٽرول گروپ (هيٺ وڌيڪ بحث ڪيو ويو آهي) اپيٿيليل مورفوجينيسس کي اسپيشل، ٽمپورل، مشروط، يا طريقيڪار ڪنٽرولن سان ڀيٽ ڪندي ان ويٽرو مورفوجينيسس جي اثرائتي کي درست ڪرڻ لاءِ ٺاهيو ويو.
اسان ٻه مختلف ڪلچر پليٽ فارم استعمال ڪيا: سڌي چينلن سان گٽ-آن-اي-چپ يا غير لڪير ڪنووليٽيڊ چينل، يا هائبرڊ چپس جن ۾ ٽرانس ويل (TW) انسرٽس هڪ مائڪرو فلوئڊڪ ڊيوائس ۾ شامل آهن، جيئن باڪس 1 ۽ قدم 1 -5 ۾ بيان ڪيو ويو آهي. "ڊيوائس فيبريڪيشن" هڪ سنگل چپ يا هائبرڊ چپ ٺاهڻ ۾ مکيه قدم ڏيکاري ٿو. "انساني آنڊن جي ايپيٿيليل سيلز جي ثقافت" هن پروٽوڪول ۾ استعمال ٿيندڙ سيل سورس (ڪيڪو-2 يا انساني آنڊن جي آرگنائيڊز) ۽ ڪلچر جي طريقيڪار جي وضاحت ڪري ٿي. "ان ويٽرو مورفوجينيسس" مجموعي قدم ڏيکاري ٿو جنهن ۾ ڪيڪو-2 يا آرگنائيڊ مان نڪتل ايپيٿيليل سيلز کي آنڊن جي چپ تي يا هائبرڊ چپ جي ٽرانس ويل انسرٽس تي ڪلچر ڪيو ويندو آهي، جنهن کان پوءِ 3D مورفوجينيسس جي شموليت ۽ هڪ خاص ايپيٿيليل ڍانچي جي ٺهڻ. پروگرام جو قدم نمبر يا باڪس نمبر هر تير جي هيٺان ڏيکاريل آهي. ايپليڪيشن مثال فراهم ڪري ٿي ته ڪيئن قائم ٿيل آنڊن جي ايپيٿيليل پرتن کي استعمال ڪري سگهجي ٿو، مثال طور، سيل جي فرق جي خاصيت، گٽ فزيالوجي مطالعي، ميزبان-مائڪروبائيوم ايڪو سسٽم جي قيام، ۽ بيماري ماڊلنگ ۾. امونو فلوروسينس تصويرون "سيل ڊفرنٽيئيشن" ۾ گٽ چپ تي پيدا ٿيندڙ 3D ڪيڪو-2 ايپيٿيليل پرت ۾ ظاهر ڪيل نيوڪلئي، ايف-ايڪٽين ۽ ايم يو سي 2 ڏيکاري ٿو. ايم يو سي 2 سگنلنگ گوبلٽ سيلز ۽ ميوڪوسل سطحن مان نڪرندڙ بلغم ۾ موجود آهي. گٽ فزيالوجي ۾ فلوروسينٽ تصويرون ڏيکارين ٿيون ته فلوروسينٽ ڪڻڪ جي جراثيم اگلوٽينن استعمال ڪندي سيالڪ ايسڊ ۽ اين-ايسٽيلگلوڪوسامين جي باقيات لاءِ اسٽيننگ ذريعي پيدا ٿيندڙ بلغم. "هسٽ-مائڪروب ڪو-ڪلچرز" ۾ ٻه اوورليپنگ تصويرون هڪ چپ تي گٽ ۾ نمائندي ميزبان-مائڪروبيوم ڪو-ڪلچرز ڏيکارين ٿيون. کاٻي پينل اي ڪولي جي ڪو-ڪلچر کي ڏيکاري ٿو جيڪو مائڪرو انجنيئر ٿيل 3D ڪيڪو-2 ايپيٿيليل سيلز سان سائي فلوروسينٽ پروٽين (GFP) جو اظهار ڪري ٿو. ساڄي پينل GFP اي ڪولي جي مقامي ڪرڻ کي ڏيکاري ٿو جيڪو 3D ڪيڪو-2 ايپيٿيليل سيلز سان گڏ ڪلچر ڪيو ويو آهي، ان کان پوءِ ايف-ايڪٽين (ڳاڙهو) ۽ نيوڪلئي (نيرو) سان امونو فلوروسينس اسٽيننگ. بيماري جي ماڊلنگ بيڪٽيريا اينٽيجنز (مثال طور، لپوپوليساڪرائڊ، ايل پي ايس) ۽ مدافعتي سان جسماني چئلينج تحت گٽ سوزش چپس ۾ صحتمند بمقابله ليڪي گٽ کي ظاهر ڪري ٿي. سيلز (مثال طور، PBMC؛ سائو). ڪيڪو-2 سيلز کي 3D ايپيٿيليل پرت قائم ڪرڻ لاءِ ڪلچر ڪيو ويو. اسڪيل بار، 50 µm. هيٺئين قطار ۾ تصويرون: "سيلز جو فرق" حوالي جي اجازت سان ترتيب ڏنل.2. آڪسفورڊ يونيورسٽي پريس؛ حوالي جي اجازت سان ٻيهر پيدا ڪيو ويو.5. NAS؛ "هسٽ-مائڪروب ڪو-ڪلچر" حوالي جي اجازت سان ترتيب ڏنل.3. NAS؛ "بيماري ماڊلنگ" حوالي جي اجازت سان ترتيب ڏنل.5. NAS.
گٽ-آن-چپ ۽ هائبرڊ چپس ٻئي PDMS نقلن کي استعمال ڪندي ٺاهيا ويا هئا جيڪي نرم ليٿوگرافي 1,44 ذريعي سلڪون مولڊز مان ڊمولڊ ڪيا ويا هئا ۽ SU-8 سان نموني ڪيا ويا هئا. هر چپ ۾ مائڪرو چينلز جي ڊيزائن هائيڊروڊائنامڪس جهڙوڪ شيئر اسٽريس ۽ هائيڊروڊائنامڪ پريشر 1,4,12 تي غور ڪندي طئي ڪئي وئي آهي. اصل گٽ-آن-اي-چپ ڊيزائن (وڌايل ڊيٽا تصوير 1a)، جنهن ۾ ٻه جڪسٽاپوز ٿيل متوازي سڌي مائڪرو چينلز شامل هئا، هڪ پيچيده گٽ-آن-اي-چپ (وڌايل ڊيٽا تصوير 1b) ۾ ترقي ڪئي آهي جنهن ۾ وکر مائڪرو چينلز جو هڪ جوڙو شامل آهي ته جيئن وڌندڙ فلوئڊ رهائش جو وقت، غير لڪير وارو وهڪرو نمونو، ۽ ڪلچر ٿيل سيلز جي ملٽي ايڪسيل ڊيفارميشن (شڪل 2a-f) 12. جڏهن وڌيڪ پيچيده گٽ بايو ميڪينڪس کي ٻيهر ٺاهڻ جي ضرورت آهي، پيچيده گٽ-آن-اي-چپس چونڊي سگهجن ٿا. اسان اهو ظاهر ڪيو آهي ته ڪنوولٽڊ گٽ-چپ پڻ مضبوطي سان 3D مورفوجينيسس کي ساڳئي وقت جي فريم ۾ اپيٿيليل واڌ جي ساڳئي درجي سان متاثر ڪري ٿو. اصل گٽ-چپ جي مقابلي ۾، ڪلچر ٿيل سيل جي قسم کان سواءِ. تنهن ڪري، 3D مورفوجينيسس کي وڌائڻ لاءِ، لڪير ۽ پيچيده آن-چپ گٽ ڊيزائن مٽائي سگهجن ٿا. SU-8 نمونن سان سلڪون مولڊ تي علاج ٿيل PDMS نقل ڊيمولڊنگ کان پوءِ منفي خاصيتون مهيا ڪيون (شڪل 2a). چپ تي گٽ کي ٺاهڻ لاءِ، تيار ڪيل مٿئين PDMS پرت کي ترتيب وار هڪ پورس PDMS فلم سان ڳنڍيو ويو ۽ پوءِ ڪورونا ٽريٽر (شڪل 2b-f) استعمال ڪندي ناقابل واپسي بانڊنگ ذريعي هيٺين PDMS پرت سان ترتيب ڏنو ويو. هائبرڊ چپس ٺاهڻ لاءِ، علاج ٿيل PDMS نقلن کي شيشي جي سلائيڊن سان ڳنڍيو ويو ته جيئن سنگل چينل مائڪرو فلوئڊڪ ڊوائيسز ٺاهي سگهجن جيڪي ٽرانس ويل انسرٽس کي ترتيب ڏئي سگهن (شڪل 2h ۽ وڌايل ڊيٽا شڪل 2). بانڊنگ جو عمل PDMS نقل ۽ شيشي جي مٿاڇري کي آڪسيجن پلازما يا ڪورونا علاج سان علاج ڪندي ڪيو ويندو آهي. سلڪون ٽيوب سان ڳنڍيل مائڪرو فيبريڪٽيڊ ڊيوائس جي نسبندي کان پوءِ، ڊوائيس سيٽ اپ آنت جي ايپيٿيليم جي 3D مورفوجينيسس انجام ڏيڻ لاءِ تيار هو (شڪل 2g).
الف، SU-8 نموني واري سلڪون مولڊ مان PDMS حصن جي تياري جو اسڪيميٽڪ مثال. غير علاج ٿيل PDMS محلول کي سلڪون مولڊ (کاٻي) تي اڇلايو ويو، 60 °C (وچ) تي علاج ڪيو ويو ۽ ڊيمولڊ ڪيو ويو (ساڄي). ڊيمولڊ ٿيل PDMS کي ٽڪرن ۾ ڪٽيو ويو ۽ وڌيڪ استعمال لاءِ صاف ڪيو ويو. ب، PDMS مٿئين پرت کي تيار ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ سلڪون مولڊ جي تصوير. ج، PDMS پورس جھلي کي ٺاهڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ سلڪون مولڊ جي تصوير. ڊ، مٿئين ۽ هيٺين PDMS حصن جي تصويرن جو هڪ سلسلو ۽ گڏ ٿيل آن-چپ آنٽيل ڊيوائس. اي، مٿئين، جھلي، ۽ هيٺين PDMS حصن جي ترتيب جو اسڪيميٽڪ. هر پرت پلازما يا ڪورونا علاج ذريعي ناقابل واپسي طور تي ڳنڍيل آهي. ف، سپر امپوزڊ ڪنووليوٽڊ مائڪرو چينلز ۽ ويڪيوم چيمبرز سان ٺهيل گٽ-آن-اي-چپ ڊيوائس جو اسڪيميٽڪ. مثال طور، مائڪرو فلوئڊڪ سيل ڪلچر لاءِ گٽ-آن-اي-چپ جو سيٽ اپ. سلڪون ٽيوب ۽ سرنج سان گڏ ٿيل چپ تي ٺهيل گٽ کي ڪور سلپ تي رکيو ويو. چپ ڊيوائس تي رکيو ويو پروسيسنگ لاءِ 150 ملي ميٽر پيٽري ڊش جو ڍڪ. بائنڊر سلڪون ٽيوب کي بند ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. ايڇ، هائبرڊ چپ جي ٺاھڻ جا بصري سنيپ شاٽ ۽ هائبرڊ چپس استعمال ڪندي 3D مورفوجينيسس. آنڊن جي ايپيٿيليل سيلز جي 2D مونوليئرز کي ڪلچر ڪرڻ لاءِ آزاد طور تي تيار ڪيل ٽرانس ويل انسرٽس کي آنڊن جي 3D مورفوجينيسس کي متاثر ڪرڻ لاءِ هائبرڊ چپ ۾ داخل ڪيو ويو. ميڊيم کي ٽرانس ويل انسرٽ تي قائم ڪيل سيل پرت جي هيٺان مائڪرو چينلز ذريعي پرفيوز ڪيو ويندو آهي. اسڪيل بار، 1 سينٽي ميٽر. ايڇ ريفرنس جي اجازت سان ٻيهر ڇپيل. 4. ايلسويئر.
هن پروٽوڪول ۾، ڪيڪو-2 سيل لائن ۽ آنٽيسٽل آرگنائيڊز کي ايپيٿيليل ذريعن طور استعمال ڪيو ويو (شڪل 3a). ٻنهي قسمن جي سيلز کي آزاد طور تي ڪلچر ڪيو ويو (باڪس 2 ۽ باڪس 5) ۽ آن-چپ گٽ يا ٽرانس ويل انسرٽس جي ECM-ڪوٽيڊ مائڪرو چينلز کي سيڊ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. جڏهن سيلز سنگم هوندا آهن (> فلاسڪس ۾ 95٪ ڪوريج)، ٽي-فلاسڪس ۾ معمول طور تي ڪلچر ٿيل ڪيڪو-2 سيلز (پيسيجز 10 ۽ 50 جي وچ ۾) ٽرپسينائيزيشن فلوئڊ (باڪس 2) ذريعي الڳ ٿيل سيل سسپنشن تيار ڪرڻ لاءِ ڪٽايا ويندا آهن. آنڊن جي بايوپسي يا سرجري ريسيڪشن مان انساني آنڊن جي آرگنائيڊز کي ميٽريگل اسڪافولڊ ڊوم ۾ 24 ويل پليٽن ۾ ڪلچر ڪيو ويو ته جيئن ساختي مائڪرو ماحول کي سهارو ڏئي سگهجي. ضروري مورفوجنز (جهڙوڪ Wnt، R-اسپونڊين، ۽ نوگين) تي مشتمل وچولي ۽ باڪس 3 ۾ بيان ڪيل واڌ جي عنصرن کي هر ٻئي ڏينهن تي پورو ڪيو ويو جيستائين آرگنائيڊز قطر ۾ ~500 µm تائين نه وڌيا. مڪمل طور تي پوکيل آرگنائيڊز کي ڪٽايو ويندو آهي ۽ هڪ چپ تي گٽ يا ٽرانس ويل انسرٽس تي ٻج پوکڻ لاءِ سنگل سيلز ۾ ورهايل (باڪس 5). جيئن اسان اڳ ۾ رپورٽ ڪئي آهي، ان کي بيماري جي قسم 12,13 (مثال طور، السرٽيو ڪولائٽس، ڪرون جي بيماري، ڪولوريڪٽل ڪينسر، يا عام ڊونر)، زخم جي جڳهه (مثال طور، زخم بمقابله غير زخم واري علائقي) ۽ پيٽ ۾ گيسٽرو انٽيسٽينل مقام (مثال طور، ڊيوڊينم، جيجنم، آئيليم، سيڪم، ڪولون، يا ريڪٽم) جي مطابق فرق ڪري سگهجي ٿو. اسان باڪس 5 ۾ ڪولونڪ آرگنائيڊز (ڪولائيڊز) کي ڪلچر ڪرڻ لاءِ هڪ بهتر پروٽوڪول فراهم ڪندا آهيون جن کي عام طور تي ننڍي آنڊن جي آرگنائيڊز جي ڀيٽ ۾ مورفوجن جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن جي ضرورت هوندي آهي.
a، گٽ چپ ۾ گٽ مورفوجينيسس جي شموليت لاءِ ڪم جو وهڪرو. هن پروٽوڪول ۾ ڪيڪو-2 انساني آنڊن جي ايپيٿيليم ۽ آنڊن جي آرگنائيڊز کي 3D مورفوجينيسس جو مظاهرو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو آهي. الڳ ٿيل اپيٿيليل سيلز کي تيار ڪيل گٽ-آن-اي-چپ ڊيوائس (چپ تيار ڪرڻ) ۾ سيڊ ڪيو ويو. هڪ ڀيرو سيلز کي سيڊ ڪيو ويندو آهي (سيڊ ڪيو ويندو آهي) ۽ ڏينهن 0 (D0) تي PDMS پورس جھلي سان ڳنڍيل (منسلڪ) ڪيو ويندو آهي، اپيڪل (AP) وهڪري کي پهرين 2 ڏينهن (وهڪري، AP، D0-D2) لاءِ شروع ڪيو ويندو آهي ۽ برقرار رکيو ويندو آهي. جڏهن هڪ مڪمل 2D مونوليئر ٺهي ويندو آهي ته بيسوليٽرل (BL) وهڪري کي سائيڪلڪ اسٽريچنگ موشنز (اسٽريچ، فلو، AP ۽ BL) سان گڏ شروع ڪيو ويندو آهي. آنڊن جي 3D مورفوجينيسس 5 ڏينهن جي مائڪرو فلوئڊڪ ڪلچر (مورفوجينيسس، D5) کان پوءِ خود بخود ٿيو. مرحلي جي برعڪس تصويرون هر تجرباتي قدم يا وقت جي نقطي تي ڪيڪو-2 سيلز جي نمائندگي ڪندڙ مورفولوجي ڏيکارين ٿيون (مٿيون). چار اسڪيميٽڪ ڊاگرام گٽ مورفوجينيسس جي لاڳاپيل ڪيسڪيڊس کي بيان ڪن ٿا (مٿيون) ساڄي پاسي). اسڪيميٽڪ ۾ ڊش ٿيل تير سيال جي وهڪري جي هدايت جي نمائندگي ڪن ٿا. ب، SEM تصوير قائم ٿيل 3D ڪيڪو-2 ايپيٿيليم (کاٻي پاسي) جي مٿاڇري جي ٽوپولوجي ڏيکاري ٿي. وڌايل علائقي (اڇو ڊيش ٿيل باڪس) کي اجاگر ڪندڙ انسيٽ 3D ڪيڪو-2 پرت (ساڄي پاسي) تي ٻيهر پيدا ٿيل مائڪروويلي ڏيکاري ٿو. ج، قائم ٿيل ڪيڪو-2 3D، ڪلاڊين (ZO-1، ڳاڙهو) ۽ مسلسل برش بارڊر جھلين جو افقي سامهون وارو نظارو آنڊن جي چپس تي ايپيٿيليئل سيلز جو ايف-ايڪٽين (سائي) ۽ نيوڪلئي (نيرو) امونو فلوروسينس ڪنفوڪل ويزوئلائيزيشن ليبل ٿيل آهي. وچين اسڪيميٽڪ ڏانهن اشارو ڪندڙ تير هر ڪنفوڪل وييو لاءِ فوڪل جهاز جي جڳهه کي ظاهر ڪن ٿا. د، ڏينهن 3، 7، 9، 11، ۽ 13 تي فيز ڪنٽراسٽ مائڪروسڪوپي ذريعي حاصل ڪيل چپ تي ڪلچر ڪيل آرگنائيڊز ۾ مورفولوجيڪل تبديلين جو وقت ڪورس. انسيٽ (مٿي ساڄي پاسي) مهيا ڪيل تصوير جي اعلي ميگنيفڪيشن ڏيکاري ٿو. اي، ڏينهن 7 ​​تي ورتل سلائس تي گٽ ۾ قائم آرگنائيڊ 3D ايپيٿيليم جو DIC فوٽو مائڪروگراف، اوورليڊ اميونو فلوروسينس تصويرون جيڪي اسٽيم سيلز (LGR5؛ ميجنٽا)، گوبلٽ سيلز (MUC2؛ سائو)، F-actin (گرين) ۽ نيوڪلئي (سائين) لاءِ مارڪر ڏيکارين ٿيون جيڪي 3 ڏينهن تائين گٽ چپس تي وڌيا آهن، ترتيب وار (کاٻي) ۽ 13 ڏينهن (وچولي) آرگنائيڊز ايپيٿيليل پرت تي. وڌايل ڊيٽا شڪل 3 پڻ ڏسو، جيڪو MUC2 سگنلنگ کان سواءِ LGR5 سگنلنگ کي نمايان ڪري ٿو. فلوروسينس تصويرون ڪلچر جي 13 هين ڏينهن تي سيل ماسڪ ڊائي (ساڄي) سان پلازما جھلي کي داغ ڏيڻ سان گٽ ۾ قائم 3D آرگنائيڊ ايپيٿيليل جي ايپيٿيليل مائڪرو اسٽرڪچر (ساڄي) ڏيکارينديون آهن. اسڪيل بار 50 μm آهي جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو وڃي.b حوالي سان اجازت سان ٻيهر ڇپيل.2. آڪسفورڊ يونيورسٽي پريس؛ c حوالي سان اجازت سان ترتيب ڏنل.2. آڪسفورڊ يونيورسٽي پريس؛ e ۽ f حوالي سان اجازت سان ترتيب ڏنل.12 ڪريٽو ڪامنز لائسنس CC BY 4.0 تحت.
هڪ چپ تي گٽ ۾، ڪامياب ECM ڪوٽنگ لاءِ PDMS پورس جھلي جي هائيڊروفوبڪ مٿاڇري کي تبديل ڪرڻ ضروري آهي. هن پروٽوڪول ۾، اسان PDMS جھلي جي هائيڊروفوبڪٽي کي تبديل ڪرڻ لاءِ ٻه مختلف طريقا لاڳو ڪندا آهيون. Caco-2 سيلز کي ڪلچر ڪرڻ لاءِ، صرف UV/اوزون علاج ذريعي مٿاڇري جي چالو ڪرڻ PDMS مٿاڇري جي هائيڊروفوبڪٽي کي گهٽائڻ، ECM کي ڪوٽ ڪرڻ ۽ Caco-2 سيلز کي PDMS جھلي سان ڳنڍڻ لاءِ ڪافي هو. بهرحال، آرگنائيڊ ايپيٿيليم جي مائڪرو فلوئڊڪ ڪلچر کي ڪيميائي بنيادن تي مٿاڇري جي فنڪشنلائيزيشن جي ضرورت آهي ته جيئن ECM پروٽين کي ترتيب وار طور تي PDMS مائڪرو چينلز تي پوليٿيلينيمين (PEI) ۽ گلوٽارالڊيهائيڊ لاڳو ڪندي موثر جمع حاصل ڪري سگهجي. مٿاڇري جي ترميم کان پوءِ، ECM پروٽين کي فنڪشنلائيزڊ PDMS مٿاڇري کي ڍڪڻ لاءِ جمع ڪيو ويو ۽ پوءِ الڳ ٿيل آرگنائيڊ ايپيٿيليم ۾ متعارف ڪرايو ويو. سيلز جي ڳنڍڻ کان پوءِ، مائڪرو فلوئڊڪ سيل ڪلچر صرف وچولي کي مٿئين مائڪرو چينل ۾ پرفيوز ڪندي شروع ٿئي ٿو جيستائين سيلز هڪ مڪمل مونوليئر نه ٺاهين، جڏهن ته هيٺيون مائڪرو چينل جامد حالتون برقرار رکي ٿو. مٿاڇري جي چالو ڪرڻ ۽ ECM ڪوٽنگ لاءِ هي بهتر طريقو آرگنائيڊ ايپيٿيليم جي ڳنڍڻ کي متحرڪ ڪرڻ جي قابل بڻائي ٿو. PDMS جي مٿاڇري تي 3D مورفوجينيسس.
ٽرانس ويل ڪلچرز کي سيل سيڊنگ کان اڳ ECM ڪوٽنگ جي ضرورت هوندي آهي؛ جڏهن ته، ٽرانس ويل ڪلچرز کي پورس انسرٽس جي مٿاڇري کي چالو ڪرڻ لاءِ پيچيده پريٽريٽمينٽ مرحلن جي ضرورت ناهي. ٽرانس ويل انسرٽس تي ڪيڪو-2 سيلز کي وڌائڻ لاءِ، پورس انسرٽس تي ECM ڪوٽنگ الڳ ٿيل ڪيڪو-2 سيلز (<1 ڪلاڪ) ۽ تنگ جنڪشن رڪاوٽ جي ٺهڻ (<1-2 ڏينهن) جي ڳنڍڻ کي تيز ڪري ٿي. ٽرانس ويل انسرٽس تي ڪلچر آرگنائيڊز لاءِ، الڳ ٿيل آرگنائيڊز کي ECM-ڪوٽيڊ انسرٽس تي سيڊ ڪيو ويندو آهي، جھلي جي مٿاڇري سان ڳنڍيل هوندو آهي (<3 ڪلاڪ) ۽ برقرار رکيو ويندو آهي جيستائين آرگنائيڊز رڪاوٽ جي سالميت سان هڪ مڪمل مونوليئر نه ٺاهيندا آهن. ٽرانس ويل ڪلچرز کي هائبرڊ چپس جي استعمال کان سواءِ 24-ويل پليٽن ۾ ڪيو ويندو آهي.
ان ويٽرو 3D مورفوجينيسس هڪ قائم ٿيل ايپيٿيليل پرت جي بيسوليٽرل پهلو تي فلوئڊ فلو لاڳو ڪندي شروع ڪري سگهجي ٿو. هڪ چپ تي گٽ ۾، ايپيٿيليل مورفوجينيسس تڏهن شروع ٿيو جڏهن ميڊيم کي مٿئين ۽ هيٺين مائڪرو چينلز ۾ پرفيوز ڪيو ويو (شڪل 3a). جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي، هدايتي لڪيل مورفوجين انبيٽرز کي مسلسل هٽائڻ لاءِ انفيريئر (بيسوليٽرل) ڪمپارٽمينٽ ۾ فلوئڊ فلو متعارف ڪرائڻ ضروري آهي. پورس جھلي تي ٻڌل سيلز کي ڪافي غذائي اجزا ۽ سيرم فراهم ڪرڻ ۽ لومينل شيئر اسٽريس پيدا ڪرڻ لاءِ، اسان عام طور تي چپ تي گٽ ۾ ڊبل فلو لاڳو ڪندا آهيون. هائبرڊ چپس ۾، ايپيٿيليل مونوليئرز تي مشتمل ٽرانس ويل انسرٽس هائبرڊ چپس ۾ داخل ڪيا ويا. پوءِ، ميڊيم کي مائڪرو چينل ذريعي پورس ٽرانس ويل انسرٽ جي بيسوليٽرل پاسي هيٺ لاڳو ڪيو ويو. آنڊن جي مورفوجينيسس ٻنهي ڪلچر پليٽ فارمن ۾ بيسوليٽرل وهڪري جي شروعات کان 3-5 ڏينهن بعد ٿيو.
مائڪرو انجنيئر ٿيل 3D ايپيٿيليل پرتن جي مورفولوجيڪل خاصيتن جو تجزيو مختلف اميجنگ طريقن کي لاڳو ڪندي ڪري سگهجي ٿو، جن ۾ فيز ڪنٽراسٽ مائڪروسڪوپي، ڊفرنشل انٽرفيرنس ڪنٽراسٽ (DIC) مائڪروسڪوپي، SEM، يا اميونو فلوروسينس ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي (شڪل 3 ۽ 4) شامل آهن. فيز ڪنٽراسٽ يا DIC اميجنگ ڪلچر دوران ڪنهن به وقت آساني سان ڪري سگهجي ٿو ته جيئن 3D ايپيٿيليل پرتن جي شڪل ۽ پروٽروشن جي نگراني ڪري سگهجي. PDMS ۽ پاليسٽر فلمن جي آپٽيڪل شفافيت جي ڪري، گٽ-آن-اي-چپ ۽ هائبرڊ چپ پليٽ فارم ٻئي ڊوائيس جي سيڪشننگ يا ڌار ڪرڻ جي ضرورت کان سواءِ حقيقي وقت ۾ اميجنگ فراهم ڪري سگهن ٿا. جڏهن اميونو فلوروسينس اميجنگ (شڪل 1، 3c، f ۽ 4b، c) انجام ڏئي رهيا آهن، سيلز کي عام طور تي 4٪ (wt/vol) پيرافارمالڊيهائيڊ (PFA) سان مقرر ڪيو ويندو آهي، جنهن کان پوءِ ٽرائٽن X-100 ۽ 2٪ (wt/vol) ) بوائن سيرم البومين (BSA)، ترتيب سان. سيل جي قسم تي منحصر ڪري، مختلف فڪسيٽيو، پرميبلائيزر، ۽ بلاڪنگ ايجنٽ ٿي سگهن ٿا. استعمال ٿيل. نسب تي منحصر سيل يا علائقي جي نشانن کي نشانو بڻائڻ واري پرائمري اينٽي باڊيز چپ تي سيٽو ۾ متحرڪ سيلز کي اجاگر ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيون وينديون آهن، ان کان پوءِ سيڪنڊري اينٽي باڊيز سان گڏ هڪ ڪائونٽر اسٽين ڊائي سان گڏ جيڪو نيوڪليس (مثال طور، 4′،6-ڊائامڊينو-2-فينائلين) انڊول، DAPI) يا F-actin (مثال طور، فلوروسينٽلي ليبل ٿيل فيلوڊين) کي نشانو بڻائيندو آهي. فلوروسينس تي ٻڌل لائيو اميجنگ پڻ سيٽو ۾ بلغم جي پيداوار کي ڳولڻ لاءِ ڪري سگهجي ٿو (شڪل 1، "سيل فرق" ۽ "گٽ فزيالوجي")، مائڪروبيل سيلز جي بي ترتيب ڪالونائيزيشن (شڪل 1، "ميزبان-مائڪروب ڪو ڪلچر")، مدافعتي سيلز جي ڀرتي (شڪل 1، 'بيماري ماڊلنگ') يا 3D ايپيٿيليل مورفولوجي (شڪل 3c، f ۽ 4b، c). جڏهن چپ تي گٽ کي تبديل ڪندي هيٺين مائڪرو چينل پرت کان مٿئين پرت کي الڳ ڪرڻ لاءِ، جيئن ريف ۾ بيان ڪيو ويو آهي. جيئن تصوير 2 ۾ ڏيکاريل آهي، 3D ايپيٿيليل مورفولوجي ۽ گڏوگڏ ايپيڪل برش بارڊر تي مائڪروولي SEM (شڪل 3b) ذريعي تصور ڪيو وڃي. فرق جي نشانن جي اظهار جو اندازو مقداري PCR5 يا سنگل سيل آر اين اي سيڪوئنسنگ ذريعي لڳائي سگهجي ٿو. هن صورت ۾، گٽ چپس يا هائبرڊ چپس ۾ پوکيل ايپيٿيليل سيلز جي 3D پرتن کي ٽرپسينائيزيشن ذريعي حاصل ڪيو ويندو آهي ۽ پوءِ ماليڪيولر يا جينياتي تجزيي لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي.
الف، هائبرڊ چپ ۾ آنڊن جي مورفوجينيسس جي شموليت لاءِ ڪم جو وهڪرو. هن پروٽوڪول ۾ ڪيڪو-2 ۽ آنڊن جي آرگنائيڊز کي هائبرڊ چپ پليٽ فارم ۾ 3D مورفوجينيسس جو مظاهرو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو آهي. الڳ ٿيل ايپيٿيليل سيلز کي تيار ڪيل ٽرانس ويل انسرٽس ۾ سيڊ ڪيو ويو (TW تيار؛ هيٺ ڏنل شڪل ڏسو). هڪ ڀيرو سيلز کي سيڊ ڪيو ويو (سيڊ ڪيو ويو) ۽ ٽرانس ويل انسرٽس ۾ پاليسٽر جھلي سان ڳنڍيو ويو، سڀني سيلز کي جامد حالتن (TW ڪلچر) هيٺ ڪلچر ڪيو ويو. 7 ڏينهن کان پوءِ، هڪ واحد ٽرانس ويل انسرٽ جنهن ۾ ايپيٿيليل سيلز جو 2D مونوليئر شامل هو هڪ هائبرڊ چپ ۾ ضم ڪيو ويو ته جيئن هڪ بيسوليٽرل فلو (فلو، BL) متعارف ڪرايو وڃي، جيڪو آخرڪار 3D ايپيٿيليل پرت (مورفوجينيسس) جي نسل جو سبب بڻيو. فيز ڪنٽراسٽ مائڪروگرافس هر تجرباتي قدم يا وقت جي نقطي تي عام ڊونر (C103 لائن) چڙهندڙ ڪولون مان نڪتل انساني عضون جي ايپيٿيليل سيلز جي مورفولوجيڪل خاصيتون ڏيکارين ٿا. مٿين پرتن ۾ اسڪيميٽڪس هر قدم لاءِ تجرباتي ترتيب کي بيان ڪن ٿا. ب، هائبرڊ چپس (کاٻي اسڪيميٽ) مٿي-هيٺ ڪنفوڪل سان آرگنائيڊ ايپيٿيليل سيلز جي 3D مورفوجينيسس جو سبب بڻجي سگهن ٿا. مختلف Z پوزيشنن تي ورتل مائڪروسڪوپي نظارا (مٿي، وچ، ۽ هيٺيون؛ ساڄي اسڪيميٽڪ ۽ لاڳاپيل ڊاٽ ٿيل لائينون ڏسو). واضح مورفولوجيڪل خاصيتون ڏيکاريون. F-actin (cyan)، nucleus (gray).c، جامد ٽرانس ويل (TW؛ اڇو ڊيش ٿيل باڪس اندر داخل) بمقابلہ هائبرڊ چپ (سڀ کان وڏو مڪمل شاٽ) ۾ ڪلچر ڪيل آرگنائيڊ مان نڪتل ايپيٿيليل سيلز جا فلوروسينس ڪنفوڪل مائڪروگرافس (3D زاويه وارو نظارو) 2D بمقابلہ 3D مورفولوجي جو مقابلو ڪندي، ترتيب وار. 2D عمودي ڪراس ڪٽ نظارن جو هڪ جوڙو (مٿي ساڄي ڪنڊ ۾ داخل؛ "XZ") پڻ 2D ۽ 3D خاصيتون ڏيکاري ٿو. اسڪيل بار، 100 µm.c حوالي جي اجازت سان ٻيهر ڇپيل.4. ايلسويئر.
روايتي جامد ڪلچر جي حالتن هيٺ ساڳين سيلز (ڪيڪو-2 يا آنڊن جي آرگنائيڊ ايپيٿيليل سيلز) کي ٻہ طرفي مونوليئرز ۾ ڪلچر ڪندي ڪنٽرول تيار ڪري سگهجن ٿا. خاص طور تي، غذائيت جي گھٽتائي مائڪرو چينلز جي محدود حجم گنجائش جي ڪري ٿي سگهي ٿي (يعني اصل گٽ-چپ ڊيزائن تي مٿين چينل ۾ ~4 µL). تنهن ڪري، بيسوليٽرل وهڪري جي درخواست کان اڳ ۽ بعد ۾ ايپيٿيليل مورفولوجي جو مقابلو پڻ ڪري سگهجي ٿو.
نرم ليٿوگرافي جو عمل صاف ڪمري ۾ ڪيو وڃي. چپ تي هر پرت (مٿين ۽ هيٺين پرتن ۽ جھليون) ۽ هائبرڊ چپس لاءِ، مختلف فوٽو ماسڪ استعمال ڪيا ويا ۽ الڳ الڳ سلڪون ويفرز تي ٺاهيا ويا ڇاڪاڻ ته مائڪرو چينلز جي اوچائي مختلف هئي. چپ تي گٽ جي مٿئين ۽ هيٺين مائڪرو چينلز جي ٽارگيٽ اوچائي ترتيب وار 500 µm ۽ 200 µm آهي. هائبرڊ چپ جي چينل جي ٽارگيٽ اوچائي 200 µm آهي.
ايسٽون سان گڏ هڪ ڊش ۾ 3 انچ سلڪون ويفر رکو. پليٽ کي 30 سيڪنڊن لاءِ نرميءَ سان گھمايو، پوءِ ويفر کي هوا ۾ خشڪ ڪريو. ويفر کي IPA سان پليٽ ۾ منتقل ڪريو، پوءِ پليٽ کي صاف ڪرڻ لاءِ 30 سيڪنڊن لاءِ گھمايو.
سلڪون ويفر جي مٿاڇري تان نامياتي باقيات کي ختم ڪرڻ لاءِ اختياري طور تي هڪ پرانها محلول (هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ ۽ مرڪوز سلفورڪ ايسڊ جو مرکب، 1:3 (vol/vol)) استعمال ڪري سگهجي ٿو.
پيرانها محلول انتهائي خراب ڪندڙ آهي ۽ گرمي پيدا ڪري ٿو. اضافي حفاظتي احتياط ضروري آهن. فضول جي نيڪال لاءِ، محلول کي ٿڌو ٿيڻ ڏيو ۽ صاف، سڪل فضول ڪنٽينر ۾ منتقل ڪريو. ثانوي ڪنٽينر استعمال ڪريو ۽ فضول ڪنٽينر کي صحيح طرح سان ليبل ڪريو. وڌيڪ تفصيلي طريقيڪار لاءِ مهرباني ڪري سهولت جي حفاظتي هدايتن تي عمل ڪريو.
ويفرز کي 200 °C جي گرم پليٽ تي 10 منٽن لاءِ رکي ڊيهائيڊريٽ ڪريو. ڊيهائيڊريشن کان پوءِ، ويفر کي ٿڌو ڪرڻ لاءِ هوا ۾ پنج ڀيرا هلايو ويو.
صاف ڪيل سلڪون ويفر جي مرڪز تي ~10 گرام فوٽوريزسٽ SU-8 2100 وجھو. فوٽوريزسٽ کي ويفر تي هڪجهڙائي سان پکيڙڻ لاءِ ٽوئيزر استعمال ڪريو. ڪڏهن ڪڏهن ويفر کي 65°C جي گرم پليٽ تي رکو ته جيئن فوٽوريزسٽ گهٽ چپچپا ۽ پکڙجڻ ۾ آسان ٿئي. ويفر کي سڌو سنئون گرم پليٽ تي نه رکو.
SU-8 کي اسپن ڪوٽنگ هلائي ويفر تي هڪجهڙائي سان ورهايو ويو. SU-8 جي ايندڙ گردش کي 5-10 سيڪنڊن لاءِ پروگرام ڪريو ته جيئن 500 rpm تي 100 rpm/s جي تيز رفتاري سان پروپيگٽ ڪري سگهجي. 1,500 rpm تي 200 µm ٿولهه جي نموني لاءِ مکيه اسپن کي سيٽ ڪريو، يا 250 µm ٿولهه حاصل ڪريو (چپ تي گٽ جي مٿئين پرت لاءِ 500 µm اوچائي ٺاهڻ؛ هيٺ "نازڪ قدم" ڏسو) 1,200 rpm تي 30 سيڪنڊن ۾ 300 rpm/s جي تيز رفتاري تي سيٽ ڪريو.
مکيه گھمڻ جي رفتار کي سلڪون ويفر تي SU-8 نموني جي ٽارگيٽ ٿلهي جي مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿو.
چپ تي گٽ جي مٿئين پرت لاءِ 500 µm اوچائي جا SU-8 نمونا ٺاهڻ لاءِ، هن باڪس جي اسپن ڪوٽنگ ۽ نرم بيڪ مرحلن (قدم 7 ۽ 8) کي ترتيب وار ورجايو ويو (قدم 9 ڏسو) ته جيئن 250 µm جون ٻه پرتون پيدا ٿين. SU-8 جي هڪ ٿلهي پرت، جنهن کي هن باڪس جي قدم 12 ۾ UV نمائش ذريعي پرت ڪري سگهجي ٿو ۽ شامل ڪري سگهجي ٿو، هڪ پرت 500 µm اوچي ٺاهيندي.
SU-8 ڪوٽيڊ ويفرز کي نرم بيڪ ڪريو، احتياط سان ويفرز کي گرم پليٽ تي 65 °C تي 5 منٽن لاءِ رکي، پوءِ سيٽنگ کي 95 °C تي تبديل ڪريو ۽ اضافي 40 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو.
مٿئين مائڪرو چينل ۾ SU-8 نموني جي 500 μm اوچائي حاصل ڪرڻ لاءِ، ٻه 250 μm ٿلها SU-8 پرتون ٺاهڻ لاءِ قدم 7 ۽ 8 کي ورجايو.
يو وي ماسڪ الائنر استعمال ڪندي، ويفر جي نمائش جي وقت جو حساب ڪرڻ لاءِ ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق ليمپ ٽيسٽ ڪريو. (ايڪسپوزر ٽائيم، ايم ايس) = (ايڪسپوزر ڊوز، ايم جي/سي ايم 2)/(ليمپ پاور، ايم ڊبليو/سي ايم 2).
نمائش جو وقت طئي ڪرڻ کان پوءِ، فوٽو ماسڪ کي يو وي ماسڪ الائنر جي ماسڪ هولڊر تي رکو ۽ فوٽو ماسڪ کي SU-8 ڪوٽيڊ ويفر تي رکو.
فوٽو ماسڪ جي پرنٽ ٿيل مٿاڇري کي سڌو سنئون سلڪون ويفر جي SU-8 ڪوٽيڊ پاسي تي رکو ته جيئن UV جي ڦهلاءَ کي گهٽ ۾ گهٽ ڪري سگهجي.
اڳواٽ مقرر ٿيل نمائش وقت لاءِ SU-8 ڪوٽيڊ ويفر ۽ فوٽو ماسڪ کي عمودي طور تي 260 mJ/cm2 UV روشني تي بي نقاب ڪريو (هن باڪس جو قدم 10 ڏسو).
يو وي جي نمائش کان پوءِ، SU-8-ڪوٽيڊ سلڪون ويفرز کي هر گرم پليٽ تي 65°C تي 5 منٽن لاءِ ۽ 95°C تي 15 منٽن لاءِ بيڪ ڪيو ويو ته جيئن 200 μm جي اوچائي سان نمونا ٺاهي سگهجن. 500 μm جي اوچائي سان نمونن ٺاهڻ لاءِ 95°C تي پوسٽ بيڪ وقت کي 30 منٽن تائين وڌايو.
ڊولپر کي شيشي جي ٿانو ۾ وجھو ويندو آهي، ۽ پڪل ويفر کي ٿانو ۾ رکيو ويندو آهي. SU-8 ڊولپر جو مقدار شيشي جي پليٽ جي سائيز جي لحاظ کان مختلف ٿي سگھي ٿو. پڪ ڪريو ته ڪافي SU-8 ڊولپر استعمال ڪريو ته جيئن اڻ کليل SU-8 کي مڪمل طور تي هٽايو وڃي. مثال طور، جڏهن 1 ليٽر جي گنجائش سان 150 ملي ميٽر قطر جي شيشي جي ٿانو استعمال ڪيو وڃي، ته ~300 ايم ايل SU-8 ڊولپر استعمال ڪريو. ڪڏهن ڪڏهن نرم گردش سان 25 منٽن لاءِ مولڊ کي ترقي ڪريو.
ترقي يافته مولڊ کي ~10 ايم ايل تازي ڊولپر سان ڌوئو ۽ پوءِ پائيپٽ استعمال ڪندي محلول کي اسپري ڪندي IPA ڪريو.
ويفر کي پلازما ڪلينر ۾ رکو ۽ 1.5 منٽ لاءِ آڪسيجن پلازما (وايومانس گيس، ٽارگيٽ پريشر 1 × 10−5 ٽور، پاور 125 ڊبليو) جي سامهون رکو.
ويفر کي ويڪيوم ڊيسيڪيٽر ۾ رکو جنهن جي اندر شيشي جي سلائيڊ هجي. ويفر ۽ سلائيڊ کي پاسي سان رکي سگهجي ٿو. جيڪڏهن ويڪيوم ڊيسيڪيٽر کي پليٽ ذريعي ڪيترن ئي تہن ۾ ورهايو ويو آهي، ته سلائيڊ کي هيٺين چيمبر ۾ ۽ ويفر کي مٿين چيمبر ۾ رکو. 100 μL ٽرائڪلورو (1H، 1H، 2H، 2H-پرفلوورو آڪٽيل) سائلين محلول کي شيشي جي سلائيڊ تي ڇڏيو ۽ سائلينائيزيشن لاءِ ويڪيوم لڳايو.
منجمد ڪيڪو-2 سيلز جي هڪ شيشي کي 37°C پاڻي جي غسل ۾ ڳاريو، پوءِ پگھريل سيلز کي T75 فلاسڪ ۾ منتقل ڪريو جنهن ۾ 15 ايم ايل 37°C اڳ گرم ڪيل ڪيڪو-2 ميڊيم هجي.
ڪيڪو-2 سيلز کي ~90٪ سنگم تي منتقل ڪرڻ لاءِ، پهريان ڪيڪو-2 ميڊيم، پي بي ايس، ۽ 0.25٪ ٽرپسن/1 ايم ايم اي ڊي ٽي اي کي 37 ° سي پاڻي جي غسل ۾ گرم ڪريو.
ويڪيوم اسپيريشن ذريعي ميڊيم کي ايسپيريٽ ڪريو. سيلز کي ٻه ڀيرا 5 ايم ايل گرم پي بي ايس سان ڌوئي ويڪيوم اسپيريشن کي ورجائي ۽ تازو پي بي ايس شامل ڪريو.