Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.توھان استعمال ڪري رھيا آھيو برائوزر ورزن محدود CSS سپورٽ سان.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).اضافي طور تي، جاري مدد کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ ڏيکاريون ٿا.
هڪ ئي وقت ۾ ٽي سلائڊن جو ڪارسيل ڏيکاري ٿو.اڳيون ۽ اڳيون بٽڻ استعمال ڪريو ھڪڙي وقت ۾ ٽن سلائڊن ذريعي ھلڻ لاءِ، يا ھڪ وقت ۾ ٽن سلائڊن ذريعي ھلڻ لاءِ آخر ۾ سلائيڊر بٽڻ استعمال ڪريو.
رت جي دماغي رڪاوٽ ۽ رت جي دماغ جي رڪاوٽ بايوٿراپيٽڪ ايجنٽن کي مرڪزي نروس سسٽم ۾ پنهنجن مقصدن تائين پهچڻ کان روڪي ٿي، ان ڪري اعصابي بيمارين جي اثرائتي علاج ۾ رڪاوٽ پيدا ٿئي ٿي.Vivo ۾ ناول دماغ ٽرانسپورٽرز کي دريافت ڪرڻ لاء، اسان متعارف ڪرايو T7 فيج پيپٽائڊ لائبريري ۽ سيريل طور تي گڏ ڪيل رت ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ (CSF) استعمال ڪندي هڪ ڪنول ٿيل شعور وڏي تلاء جي ماڊل استعمال ڪندي.CSF ۾ چونڊ جي چئن دورن کان پوءِ مخصوص فيج کلون تمام گھڻيون ڪيون ويون.انفرادي اميدوار پيپٽائڊس جي جانچ CSF ۾ 1000-گنا افزودگي کان وڌيڪ ظاهر ڪيو.دماغ تائين پيپٽائڊ جي وچولي ترسيل جي حياتياتي سرگرمي جي تصديق ڪئي وئي 40٪ گھٽتائي جي سطح ۾ ايميلوڊ-β دماغي مايع ۾ BACE1 پيپٽائڊ انابيٽر استعمال ڪندي سڃاڻپ ٿيل ناول ٽرانزٽ پيپٽائڊ سان ڳنڍيل.انهن نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته پيپٽائڊس جن جي سڃاڻپ vivo phage چونڊ طريقن ۾ ٿي سگهي ٿي دماغ ۾ ميڪروموليڪولس جي سسٽماتي پهچائڻ لاءِ ڪارائتو گاڏيون هڪ علاج واري اثر سان.
سينٽرل نروس سسٽم (CNS) ھدف ٿيل علاج جي تحقيق ۾ خاص طور تي وڌيڪ ڌيان ڏنو ويو آھي سڃاتل دوائن ۽ ايجنٽن جي نشاندهي ڪرڻ تي جيڪي CNS ھدف ڪرڻ واري خاصيتن کي نمايان ڪن ٿا، انھن ميکانيزم کي دريافت ڪرڻ تي گھٽ ڪوشش سان جيڪي دماغ کي فعال دوائن جي ترسيل کي هلائيندا آھن.اهو هاڻي تبديل ٿيڻ شروع ٿي رهيو آهي جيئن دوا جي ترسيل، خاص طور تي وڏا ماليڪيول، جديد نيورو سائنس جي دوا جي ترقي جو هڪ لازمي حصو آهي.مرڪزي نروس سسٽم جو ماحول چڱيءَ طرح سان محفوظ ٿيل آهي cerebrovascular بيريئر سسٽم، جنهن ۾ رت جي دماغي رڪاوٽ (BBB) ​​۽ رت جي دماغي رڪاوٽ (BCBB) 1 شامل آهي، جنهن کي دماغ تائين دوائن جي پهچائڻ مشڪل بڻائي ٿي 1,2.اهو اندازو لڳايو ويو آهي ته تقريبن تمام وڏي ماليڪيول دوائون ۽ 98 سيڪڙو کان وڌيڪ ننڍيون ماليڪيول دوائون دماغ مان ختم ٿي وينديون آهن.انهي ڪري اهو تمام ضروري آهي ته نئين دماغي ٽرانسپورٽ سسٽم کي سڃاڻڻ لاء جيڪي CNS 4,5 تائين علاج واري دوائن جي موثر ۽ مخصوص ترسيل مهيا ڪن ٿا.بهرحال، BBB ۽ BCSFB پڻ دوا جي ترسيل لاءِ هڪ بهترين موقعو پيش ڪن ٿا جيئن اهي داخل ٿين ٿا ۽ دماغ جي سڀني اڏاوتن ۾ داخل ٿين ٿا ان جي وسيع ويسڪولچر ذريعي.اهڙيء طرح، دماغ تائين پهچائڻ جي غير جارحتي طريقن کي استعمال ڪرڻ لاء موجوده ڪوششون گهڻو ڪري ريپيٽر-ثالث ٽرانسپورٽ (PMT) جي ميکانيزم تي ٻڌل آهن endogenous BBB6 ريڪٽر استعمال ڪندي.Transferrin receptor pathway7,8 استعمال ڪندي تازي اهم پيش رفت جي باوجود، بهتر ملڪيتن سان نئين ترسيل نظام جي وڌيڪ ترقي جي ضرورت آهي.انهي جي پڇاڙيء ۾، اسان جو مقصد پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ڪرڻ هو جيڪو CSF ٽرانسپورٽ جي وچولي ڪرڻ جي قابل آهي، جيئن اهي اصول ۾ استعمال ڪري سگھجن ٿيون ميڪروموليولس کي CNS تائين پهچائڻ يا نئين ريڪٽر رستا کولڻ لاءِ.خاص طور تي، مخصوص ريڪٽرز ۽ سيريبروواسولر سسٽم جي ٽرانسپورٽرز (BBB ۽ BSCFB) بايوٿراپيٽڪ دوائن جي فعال ۽ مخصوص ترسيل لاءِ ممڪن حدف جي طور تي ڪم ڪري سگهن ٿا.Cerebrospinal fluid (CSF) choroid plexus (CS) جي ھڪڙي ڳجھي پيداوار آھي ۽ دماغ جي وچولي سيال سان سڌو رابطي ۾ آھي subarachnoid اسپيس ۽ ventricular space4 ذريعي.تازو اهو ڏيکاريو ويو آهي ته subarachnoid cerebrospinal fluid گهڻو ڪري دماغ جي interstitium ۾ ڦهلجي ٿو 9.اسان اميد رکون ٿا ته هن subarachnoid inflow tract يا سڌو BBB ذريعي استعمال ڪندي parenchymal اسپيس تائين.هن کي حاصل ڪرڻ لاء، اسان vivo phage چونڊ حڪمت عملي ۾ هڪ مضبوط عمل ڪيو آهي جيڪو مثالي طور تي انهن ٻن مختلف رستن مان منتقل ٿيل پيپٽائڊس کي سڃاڻي ٿو.
اسان ھاڻي بيان ڪريون ٿا ھڪڙي ترتيب وار ۾ vivo phage ڊسپلي اسڪريننگ جي طريقي سان CSF نموني سان گڏ ھاء تھرو پُٽ سيڪوئنسنگ (HTS) سان گڏ ابتدائي چونڊ رائونڊ کي مانيٽر ڪرڻ لاءِ اعليٰ لائبريري تنوع سان.رت جي آلودگي کان بچڻ لاءِ مستقل طور تي امپلانٽ ٿيل وڏي سيسٽرنا (سي ايم) ڪينولا سان شعوري چوٽن تي اسڪريننگ ڪئي وئي.خاص طور تي، هي نقطو ٻنهي دماغ جي ٽارگيٽنگ ۽ پيپٽائڊس کي چونڊيندو آهي ٽرانسپورٽ سرگرمي سان گڏ سيربروواسولر رڪاوٽ ۾.اسان T7 phages استعمال ڪيو انهن جي ننڍي سائيز (~ 60 nm) 10 جي ڪري ۽ تجويز ڪيو ته اهي vesicles جي نقل و حمل لاءِ موزون آهن جيڪي endothelial ۽/يا epithelial-medulla barrier جي transcellular ڪراسنگ جي اجازت ڏين ٿيون.پيننگ جي چار دورن کان پوء، فيج جي آبادي کي الڳ ڪيو ويو آهي مضبوط ڏيکاريندي vivo CSF ​​جي افزائش ۽ دماغي مائڪرو ويسل ايسوسيئيشن.خاص طور تي، اسان اسان جي نتيجن جي تصديق ڪرڻ جي قابل ٿي چڪا هئاسين ته ترجيح ڏني وئي ۽ ڪيميائي طور تي ٺهيل بهترين اميدوار پيپٽائڊس پروٽين جي سامان کي دماغي اسپينل سيال ۾ منتقل ڪرڻ جي قابل آهن.پهريون، سي اين ايس جي دواسازي اثرات قائم ڪيون ويون آهن هڪ معروف ٽرانزٽ پيپٽائڊ کي گڏ ڪرڻ سان BACE1 پيپٽائڊ جي هڪ رڪاوٽ سان.ان کان علاوه ڏيکاري ٿو ته vivo فنڪشنل اسڪريننگ حڪمت عملي ۾ ناول دماغ ٽرانسپورٽ پيپٽائڊس کي موثر پروٽين ڪارگو ڪيريئر جي طور تي سڃاڻپ ڪري سگھن ٿا، اسان کي اميد آهي ته ساڳئي فنڪشنل چونڊ طريقا پڻ ناول دماغ جي ٽرانسپورٽ رستن جي سڃاڻپ ۾ اهم ٿي ويندا.
پليٽ فارمنگ يونٽس (PFU) جي بنياد تي، فيج پيڪنگنگ جي قدم کان پوء، بي ترتيب واري 12-مير لڪير T7 فيج پيپٽائڊس جي لائبريري تقريبن 109 جي تنوع سان ٺهيل ۽ ٺاهي وئي (ڏسو مواد ۽ طريقا).اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته اسان احتياط سان تجزيو ڪيو هن لائبريري کان اڳ vivo panning ۾.تبديل ٿيل پرائمر ٺاهيل ايمپليڪن استعمال ڪندي فيج لائبريري جي نمونن جي پي سي آر ايمپليڪشن جيڪي سڌو سنئون HTS تي لاڳو ٿين ٿيون (ضمني تصوير 1a).جي ڪري a) HTS11 ترتيب واري غلطيون، ب) پرائمر جي معيار تي اثر (NNK) 1-12، ۽ ج) اسٽينڊ بائي لائبريري ۾ وائلڊ-قسم (wt) فيج (سڪيلٽن انسرٽس) جي موجودگي، صرف تصديق ٿيل ترتيب واري معلومات کي ڪڍڻ لاءِ هڪ تسلسل فلٽرنگ جو طريقو لاڳو ڪيو ويو.اهي فلٽر قدم سڀني HTS ترتيب واري لائبريرين تي لاڳو ٿين ٿا.معياري لائبريريءَ لاءِ، ڪل 233,868 ريڊس حاصل ڪيا ويا، جن مان 39٪ فلٽر معيار پاس ڪيا ويا ۽ لائبريري تجزيو ۽ ايندڙ دورن جي چونڊ لاءِ استعمال ڪيا ويا (ضمني شڪل 1c-e).ريڊز بنيادي طور تي 3 بنيادي جوڑوں جي ڊيگهه ۾ گھڻا ھئا جن جي چوٽي 36 نيوڪليوٽائڊس تي ھئي (ضمني شڪل 1c)، لائبريري ڊيزائن (NNK) 1-12 جي تصديق ڪندي.خاص طور تي، تقريبن 11٪ لائبريري جي ميمبرن ۾ 12-dimensional وائلڊ-قسم (wt) ريڪ بون PAGISRELVDKL داخل ڪيو ويو، ۽ تقريبن اڌ جي ترتيب (49٪) شامل ڪرڻ يا حذف ڪرڻ تي مشتمل آهي.لائبريري جي HTS لائبريري ۾ پيپٽائڊس جي اعلي تنوع جي تصديق ڪئي: 81٪ کان وڌيڪ پيپٽائڊ جي ترتيبن مان صرف هڪ ڀيرو مليا ويا ۽ صرف 1.5٪ ≥4 نقلن ۾ واقع ٿيا (ضمني تصوير. 2a).امينو اسيدز جي فريڪوئنسيز (aa) ريپرٽائر ۾ سڀني 12 پوزيشنن تي چڱيءَ طرح سان تعلق رکي ٿي، ڊيجنريٽ NKK ريپرٽوائر (ضمني تصوير 2b) پاران پيدا ڪيل ڪوڊن جي تعداد لاءِ متوقع تعدد سان.انهن داخلن پاران انڪوڊ ٿيل aa باقيات جي مشاهدي جي تعدد چڱيءَ طرح ڳڻپيوڪر تعدد (r = 0.893) (ضمني تصوير 2c) سان لاڳاپيل آهي.انجيڪشن لاءِ فيج لائبرري جي تياري ۾ شامل آهن واڌ ۽ ختم ڪرڻ جا مرحلا endotoxin.اهو اڳ ۾ ڏيکاريو ويو آهي ممڪن طور تي فيج لائبريرين جي تنوع کي گهٽائڻ لاءِ 12,13.تنهن ڪري، اسان ترتيب ڏني هڪ پليٽ-ايمپليفائيڊ فيج لائبريري جنهن کي ختم ڪيو ويو هو اينڊوٽوڪسين ختم ڪرڻ ۽ ان جي مقابلي ۾ اصل لائبريري سان AA جي تعدد جو اندازو لڳائڻ لاء.هڪ مضبوط تعلق (r = 0.995) اصل تلاءَ ۽ وسيع ۽ صاف ٿيل تلاءَ جي وچ ۾ ڏٺو ويو (ضمني شڪل 2d)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته T7 فيج استعمال ڪندي پليٽن تي وڌايل ڪلون جي وچ ۾ مقابلو وڏي تعصب جو سبب نه بڻيو.هي مقابلو هر لائبريريءَ ۾ ٽرپيپٽائيڊ نقشن جي تعدد تي مبني آهي، ڇاڪاڻ ته لائبريرين جي تنوع (~ 109) کي مڪمل طور تي پڪڙي نٿو سگهجي جيتوڻيڪ HTS سان.هر پوزيشن تي aa جي فريڪئنسي تجزيي ظاهر ڪئي ته داخل ٿيل ريپرٽويئر جي آخري ٽن پوزيشن ۾ هڪ ننڍڙي پوزيشن تي منحصر تعصب (ضمني تصوير. 2e).نتيجي ۾، اسان ان نتيجي تي پهتاسين ته لائبريريءَ جو معيار ۽ تنوع قابل قبول هو ۽ چونڊ جي ڪيترن ئي دورن جي وچ ۾ فيج لائبريرين کي وڌائڻ ۽ تيار ڪرڻ جي ڪري تنوع ۾ صرف معمولي تبديليون ڏسڻ ۾ آيون.
سيريل دماغي اسپائنل فلوئڊ سيمپلنگ سرجري طور تي ڪينولا کي سي ايم جي شعوري چوڪن ۾ امپلانٽ ڪندي انجام ڏئي سگھجي ٿو T7 فيج جي سڃاڻپ کي آسان ڪرڻ لاءِ intravenously (iv) BBB ۽/يا BCSFB (Fig. 1a-b) ذريعي.اسان ٻه آزاد چونڊ هٿيار (هٿيار A ۽ B) استعمال ڪيا آهن پهرين ٽن دورن ۾ vivo جي چونڊ (Fig. 1c).اسان تدريجي طور تي چونڊ جي سختي کي وڌايو، چونڊ جي پهرين ٽن دورن ۾ متعارف ٿيل فيج جي مجموعي مقدار کي گھٽائي.پيننگ جي چوٿين دور لاءِ، اسان شاخن A ۽ B جا نمونا گڏ ڪيا ۽ ٽي اضافي آزاد چونڊون ڪيون.هن ماڊل ۾ T7 فيج جي ذرڙن جي vivo خاصيتن جو مطالعو ڪرڻ لاءِ، وائلڊ ٽائپ فيج (PAGISRELVDKL ماسٽر انسرٽ) کي چوڪن ۾ داخل ڪيو ويو دم جي رڳ ذريعي.cerebrospinal fluid ۽ رت مان مختلف وقتن جي پوائنٽن تي مرحلن جي بحالي ڏيکاري ٿي ته نسبتا ننڍڙن T7 icosahedral phages کي رت جي خاني مان تيزيءَ سان صاف ڪرڻ وارو مرحلو هوندو هو (ضمني شڪل 3).ترتيب ڏنل ٽائيٽرز جي بنياد تي ۽ چوٽن جي رت جي مقدار، اسان حساب ڪيو ته صرف تقريبا 1٪ wt.مقرر ڪيل دوز مان phage رت ۾ ڳولهيو ويو 10 منٽ انجڻ کان پوء.ھن ابتدائي تيزيءَ جي گھٽتائي کان پوءِ، ھڪ سستي پرائمري ڪليئرنس ماپ ڪئي وئي 27.7 منٽ جي اڌ-زندگيءَ سان.خاص طور تي، صرف تمام ٿورڙا فيجز CSF خاني مان حاصل ڪيا ويا، سي ايس ايف خاني ۾ جهنگلي قسم جي فيج لڏپلاڻ لاء گهٽ پس منظر جي نشاندهي ڪن ٿا (ضمني شڪل 3).سراسري طور تي، رت ۾ T7 فيج جا صرف 1 x 10-3٪ ٽائيٽرز ۽ 4 x 10-8٪ شروعاتي طور تي متاثر ٿيل فيجز سڄي نموني جي مدت (0-250 منٽ) دوران دماغي اسپينل فلوئڊ ۾ ڳوليا ويا.خاص طور تي، اڌ-زندگي (25.7 منٽ) جهنگلي قسم جي فيج جي دماغي اسپائنل سيال ۾ ساڳي هئي جيڪا رت ۾ ڏٺو ويو آهي.اهي ڊيٽا ظاھر ڪن ٿا ته رت کان CSF خاني کي ڌار ڪرڻ واري رڪاوٽ CM-cannulated rats ۾ برقرار آھي، جيڪا فيج لائبرري جي vivo جي چونڊ ۾ ڪلون کي سڃاڻڻ جي اجازت ڏئي ٿي جيڪي آساني سان رت مان سي ايس ايف جي دٻي ۾ منتقل ڪيا ويا آھن.
(الف) هڪ وڏي تلاءَ مان دماغي اسپائنل فلوئڊ (CSF) کي ٻيهر نموني ڏيڻ لاءِ هڪ طريقو ترتيب ڏيڻ.(b) ڊراگرام ڏيکاري ٿو سيلولر مقام جي مرڪزي نروس سسٽم (CNS) جي رڪاوٽ ۽ چونڊ حڪمت عملي پيپٽائڊس کي سڃاڻڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو جيڪي رت جي دماغ جي رڪاوٽ (BBB) ​​۽ رت جي دماغ جي رڪاوٽ کي پار ڪن ٿا.(c) vivo phage ڊسپلي اسڪريننگ فلو چارٽ ۾.چونڊ جي هر دور ۾، فيجز (تير جي اندر جانورن جي سڃاڻپ ڪندڙ) کي اندروني طور تي انجيل ڪيو ويو.چونڊ جي چوٿين دور تائين ٻه آزاد متبادل شاخون (A، B) الڳ الڳ رکيون وينديون آهن.چونڊ رائونڊ 3 ۽ 4 لاءِ، سي ايس ايف مان نڪتل هر فيج ڪلون دستي طور تي ترتيب ڏنل هئي.(d) T7 پيپٽائڊ لائبريري (2 x 1012 phages/جانور) جي اندروني انجيڪشن کان پوءِ ٻن ڪننول ٿيل چوٽن ۾ چونڊ جي پهرين دور دوران رت (ڳاڙهي حلقن) ۽ دماغي مادو (سائي ٽڪنڊيز) کان الڳ ٿيل Phage جا Kinetics.بليو اسڪوائر رت ۾ فيج جي سراسري ابتدائي ڪنسنٽريشن کي ظاھر ڪري ٿو، انجيڪشن ٿيل فيج جي مقدار مان ڳڻيو ويو آھي، رت جي ڪل مقدار کي مدنظر رکندي.ڪارو چوڪون رت جي فيج ڪنسنٽريشن مان نڪتل y لائن جي چوڪ جي نقطي کي ظاهر ڪن ٿيون.(e,f) پيش ڪريو لاڳاپا تعدد ۽ تقسيم جي سڀني ممڪن اوورليپنگ ٽرپپٽائڊ نقشن جي پيپٽائڊ ۾ مليا.1000 پڙهڻين ۾ مليل نقشن جو تعداد ڏيکاريل آهي.خاص طور تي (p <0.001) بهتر ڪيل نقشا ڳاڙهي نقطن سان نشان لڳل آهن.(e) باضابطه اسڪرپٽ پلاٽ انجيڪشن ٿيل لائبريري جي ٽرپپٽائيڊ موٽف جي لاڳاپي فريڪوئنسي جو مقابلو ڪندي رت مان نڪتل فيج سان جانورن #1.1 ۽ #1.2.(f) رت ۽ دماغي مايع ۾ الڳ ٿيل جانورن جي فاج ٽرپيپٽائيڊ نقشن #1.1 ۽ #1.2 جي لاڳاپن جي تعدد جي نسبت سان لاڳاپيل اسڪرپٽ پلاٽ.(g، h) رت ۾ افزودگي واري فيج جي تسلسل ID جي نمائندگي (g) بمقابله انجيل ٿيل لائبريري ۽ CSF (h) بمقابله رت ۾ ڦهليل فيج ٻنهي جانورن ۾ vivo جي چونڊ جي هڪ دور کان پوء.ھڪڙي اکر جي ڪوڊ جي ماپ اشارو ڪري ٿي ته ڪيترا ڀيرا اھو امينو اسيد ان پوزيشن تي ٿئي ٿو.سائو = پولر، جامني = غير جانبدار، نيرو = بنيادي، ڳاڙهو = تيزابي ۽ ڪارو = هائيڊروفوبڪ امينو اسيد.شڪل 1a، b ايڊورڊ يوريچ پاران ٺهيل ۽ ٺاهي وئي هئي.
اسان هڪ فيج پيپٽائڊ لائبريري کي ٻن سي ايم اوزار جي چوٽين ۾ داخل ڪيو (ڪليڊس A ۽ B) ۽ cerebrospinal fluid ۽ رت (Figure 1d) کان الڳ ٿيل فيج.لائبريريءَ جي ابتدائي تيزيءَ سان صاف ڪرڻ جهنگلي قسم جي فيج جي مقابلي ۾ گهٽ واضح هئي.ٻنهي جانورن ۾ انجيل ٿيل لائبريري جي اڌ زندگي رت ۾ 24.8 منٽ هئي، جهنگلي قسم جي فيج وانگر، ۽ سي ايس ايف ۾ 38.5 منٽ.هر جانور مان رت ۽ دماغي اسپائنل فلائيڊ فيج جا نمونا HTS جي تابع ڪيا ويا ۽ سڀني سڃاڻپ ٿيل پيپٽائڊس جو تجزيو ڪيو ويو هڪ مختصر ٽرپپائيڊ موف جي موجودگي لاءِ.Tripeptide motifs چونڊيا ويا ڇاڪاڻ ته اهي ڍانچي جي ٺهڻ ۽ peptide-پروٽين جي وچ ۾ رابطي لاء گهٽ ۾ گهٽ بنياد مهيا ڪن ٿا 14,15.اسان انجيڪٽ ٿيل فيج لائبريري ۽ ٻنهي جانورن جي رت مان نڪتل کلون جي وچ ۾ نقشن جي ورڇ ۾ هڪ سٺو تعلق مليو آهي (تصوير 1e).انگن اکرن مان ظاهر ٿئي ٿو ته لائبريري جي جوڙجڪ صرف رت جي خاني ۾ ٿوري گهڻي بهتري آهي.امينو اسيد جي تعدد ۽ اتفاق جي ترتيبن کي وڌيڪ تجزيو ڪيو ويو هر پوزيشن تي Weblogo16 سافٽ ويئر جي موافقت استعمال ڪندي.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته اسان رت جي گليسين جي باقيات ۾ هڪ مضبوط افزودگي مليا (تصوير 1g).جڏهن رت جو مقابلو CSF مان چونڊيل ڪلونن سان ڪيو ويو، مضبوط چونڊ ۽ نقشن جي ڪجهه خارج ڪرڻ جو مشاهدو ڪيو ويو (تصوير 1f)، ۽ ڪجهه امينو اسيد ترجيحي طور تي 12-ميمبرن (تصوير 1h) ۾ اڳ ۾ مقرر ڪيل پوزيشن تي موجود هئا.خاص طور تي، انفرادي جانورن ۾ خاص طور تي cerebrospinal fluid ۾ فرق آهي، جڏهن ته ٻنهي جانورن ۾ رت جي گليسائن جي افزائش جو مشاهدو ڪيو ويو (ضمني تصوير. 4a-j).جانورن #1.1 ۽ #1.2 جي cerebrospinal سيال ۾ ترتيب واري ڊيٽا جي سخت فلٽرنگ کان پوء، مجموعي طور تي 964 ۽ 420 منفرد 12-مير پيپٽائڊس حاصل ڪيا ويا (ضمني تصوير. 1d-e).الڳ ٿيل فيج ڪلون کي وڌايو ويو ۽ وييو جي چونڊ جي ٻئي دور جي تابع ڪيو ويو.چونڊ جي ٻئي دور مان ڪڍيا ويا فيج هر جانور ۾ HTS جي تابع هئا ۽ سڀني سڃاڻپ ٿيل پيپٽائڊس کي استعمال ڪيو ويو ان پٽ جي طور تي هڪ نقشي جي سڃاڻپ پروگرام ۾ ٽرپپٽائڊ نقشن جي موجودگي جو تجزيو ڪرڻ لاءِ (تصوير 2a, b, ef).CSF مان حاصل ڪيل فيج جي پهرين چڪر جي مقابلي ۾، اسان شاخن A ۽ B (Fig. 2) ۾ CSF ۾ ڪيترن ئي نقشن جي وڌيڪ چونڊ ۽ ختم ڪرڻ جو مشاهدو ڪيو.هڪ نيٽ ورڪ جي سڃاڻپ الورورٿم لاڳو ڪيو ويو اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا اهي مختلف نمونن جي نمائندگي ڪن ٿا مسلسل تسلسل جي.هڪ واضح هڪجهڙائي 12-dimensional ترتيبن جي وچ ۾ CSF پاران متبادل ڪليڊ A (Fig. 2c، d) ۽ ڪليڊ B (Fig. 2g، h) ۾ نظر آئي.هر شاخ ۾ گڏ ڪيل تجزيي 12-مير پيپٽائڊس لاءِ مختلف سليڪشن پروفائلز کي ظاهر ڪيو (ضمني شڪل 5c،d) ۽ CSF/بلڊ ٽائيٽر تناسب ۾ اضافو وقت سان گڏ پولڊ ڪلونز لاءِ چونڊ جي ٻئي دور کان پوءِ چونڊ جي پهرين دور جي مقابلي ۾ (ضمني شڪل 5e).).
cerebrospinal fluid ۾ motifs ۽ peptides جي افزودگي ٻن لڳاتار راؤنڈز جي in vivo فنڪشنل فيج ڊسپلي جي چونڊ.
سڀ cerebrospinal fluid Phages هر جانور جي پهرئين دور مان هٿ ڪيا ويا (جانور #1.1 ۽ #1.2) گڏ ڪيا ويا، وڌايو ويو، HT-sequenced ۽ گڏ ڪيا ويا (2 x 1010 phages/ animal) 2 SM cannulated rats (#1.1 → #).2.1 ۽ 2.2، 1.2 → 2.3 ۽ 2.4).(a,b,e,f) پهرين ۽ ٻئي سليڪشن راؤنڊن ۾ سڀ CSF مان نڪتل مرحلن جي ٽرپپٽائڊ نقشن جي لاڳاپي فريڪوئنسي جي نسبت سان واسطو رکندڙ اسڪرپٽ پلاٽ.نسبتي تعدد ۽ شڪلن جي تقسيم سڀني ممڪن اوورليپنگ ٽرپيپٽائڊس جي نمائندگي ڪري ٿي جيڪا ٻنهي رخن ۾ پيپٽائڊس ۾ ملي ٿي.1000 پڙهڻين ۾ مليل نقشن جو تعداد ڏيکاريل آهي.نقشا جيڪي خاص طور تي (p <0.001) چونڊيا ويا يا ھڪڙي مقابلي واري لائبرري ۾ خارج ٿيل آھن انھن کي ڳاڙھي نقطن سان نمايان ڪيو ويو آھي.(c, d, g, h) سڀني CSF سان مالا مال 12 امينو اسيد ڊگھي تسلسل جي تسلسل علامت (لوگو) جي نمائندگي vivo جي چونڊ ۾ 2 ۽ 1 جي راؤنڊ تي ٻڌل.ھڪڙي اکر جي ڪوڊ جي ماپ اشارو ڪري ٿي ته ڪيترا ڀيرا اھو امينو اسيد ان پوزيشن تي ٿئي ٿو.علامت (لوگو) جي نمائندگي ڪرڻ لاءِ، انفرادي جانورن مان نڪرندڙ CSF ترتيبن جي فريڪوئنسي جو مقابلو ڪيو ويو آهي ٻن چونڊ راؤنڊن جي وچ ۾ ۽ ٻئي دور ۾ بهتر ڪيل ترتيب ڏيکاريا ويا آهن: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ۽ (h) #1.2–#2.(c، d) جانورن ۾ ڏنل پوزيشن تي سڀ کان وڌيڪ افزودگي امينو اسيد.2.1 ۽ نمبر.2.2 يا (g، h) جانورن ۾ نمبر.2.3 ۽ نمبر.2.4 رنگ ۾ ڏيکاريا ويا آهن.سائو = پولر، جامني = غير جانبدار، نيرو = بنيادي، ڳاڙهو = تيزابي ۽ ڪارو = هائيڊروفوبڪ امينو اسيد.
چونڊ جي ٽئين دور کان پوءِ، اسان 124 منفرد پيپٽائڊ ترتيبن (#3.1 ۽ #3.2) جي سڃاڻپ ڪئي 332 CSF-ٻيهر ٺھيل فيج ڪلون مان ٻن جانورن کان الڳ ٿيل (ضمني تصوير 6a).تسلسل LGSVS (18.7٪) جو سڀ کان وڌيڪ لاڳاپو تناسب هو، جنهن جي پٺيان جهنگلي قسم جي داخل ٿيل PAGISRELVDKL (8.2٪)، MRWFFSHASQGR (3٪)، DVAKVS (3٪)، TWLFSLG (2.2٪)، ۽ SARGSWREIVSLS (2.2٪).آخري چوٿين دور ۾، اسان ٽن الڳ جانورن مان ٻن آزاد چونڊيل شاخن کي گڏ ڪيو (Fig. 1c).CSF مان حاصل ڪيل 925 sequenced phage clones مان، چوٿين دور ۾ اسان 64 منفرد peptide sequences (Supplementary Fig. 6b) ڏٺا، جن مان وائلڊ قسم جي فيج جو لاڳاپو تناسب 0.8٪ تائين گھٽجي ويو.چوٿين دور ۾ سڀ کان وڌيڪ عام CSF ڪلون هئا LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18٪)، LGSVS (17٪)، GFVRFRLSNTR (14٪)، KVAWRVFSLFWK (7٪)، SVHGV (5٪)، GRPQKINGARVC (3.6٪)، GRPQKINGARVC (3.6٪)، %DSSRL2) ۽.%)).منتخب ٿيل پيپٽائڊس جي ڊگھي رينج لائبريري جي پرائمر ۾ نيوڪليوٽائيڊ داخل ڪرڻ/حذف ڪرڻ يا وقت کان اڳ واري اسٽاپ ڪوڊن جي ڪري آهي جڏهن NNK لائبريري ڊيزائن لاءِ ڊيجنريٽ ڪوڊون استعمال ڪندي.وقت کان اڳ اسٽاپ ڪوڊون ننڍا پيپٽائڊس ٺاهيندا آهن ۽ چونڊيا ويندا آهن ڇاڪاڻ ته انهن ۾ سازگار AA نقشو هوندو آهي.ڊگھي پيپٽائڊس جي نتيجي ۾ ٿي سگھي ٿي مصنوعي لئبريري جي پرائمر ۾ داخل ڪرڻ / حذف ڪرڻ.هي پوزيشن ٺاهيل اسٽاپ ڪوڊن کي فريم کان ٻاهر رکي ٿو ۽ ان کي پڙهي ٿو جيستائين هڪ نئون اسٽاپ ڪوڊون نازل نه ٿئي.عام طور تي، اسان انپٽ ڊيٽا کي نموني آئوٽ پُٽ ڊيٽا سان ڀيٽڻ سان سڀني چار چونڊ رائونڊ لاءِ افزودگي جا عنصر ڳڻيا.اسڪريننگ جي پهرئين دور لاءِ، اسان استعمال ڪيو وائلڊ ٽائيپ فيج ٽائيٽرز کي غير مخصوص پس منظر جي حوالي سان.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، پهرين CSF چڪر ۾ منفي فيز جي چونڊ ڏاڍي مضبوط هئي، پر رت ۾ نه (Fig. 3a)، جو شايد پيپٽائيڊ لائبريري جي اڪثر ميمبرن جي CSF خاني ۾ غير فعال ڦهلائڻ جي گهٽ امڪان جي ڪري ٿي سگهي ٿي يا لاڳاپا فيجز وڌيڪ موثر طريقي سان برقرار رکيا ويندا آهن يا بيڪٽيريا جي ڀيٽ ۾ رت جي وهڪري مان هٽائي ويندا آهن.بهرحال، پيننگ جي ٻئي دور ۾، CSF ۾ مرحلن جي مضبوط چونڊ ٻنهي ڪليڊن ۾ مشاهدو ڪيو ويو، اهو تجويز ڪيو ويو آهي ته پوئين دور پيپٽائڊس ڏيکاريندڙ مرحلن ۾ بهتر ڪيو ويو آهي جيڪي CSF جي اپٽيڪ کي فروغ ڏين ٿا (Fig. 3a).ٻيهر، اهم رت جي واڌاري کان سواء.ٽئين ۽ چوٿين دورن ۾ پڻ، فيج کلون خاص طور تي CSF ۾ بهتر ٿي ويا.چونڊ جي آخري ٻن دورن جي وچ ۾ هر منفرد پيپٽائڊ تسلسل جي نسبتي تعدد جو مقابلو ڪندي، اسان اهو محسوس ڪيو ته چونڊ جي چوٿين دور ۾ ترتيبون اڃا به وڌيڪ ڀرپور هيون (تصوير 3b).مجموعي طور تي 931 ٽرپيپٽائڊ نقشا ڪڍيا ويا آھن سڀني 64 منفرد پيپٽائڊ ترتيبن مان ٻنهي پيپٽائڊ اورينٽيشنز کي استعمال ڪندي.چوٿين دور ۾ سڀ کان وڌيڪ بهتر ڪيل نقشا وڌيڪ ويجهڙائي سان جانچيا ويا انهن جي افزودگي پروفائلز لاءِ سڀني دورن ۾ انجيل ٿيل لائبريري جي مقابلي ۾ (ڪٽ آف: 10٪ افزودگي) (ضمني تصوير 6c).چونڊ جي عام نمونن مان ظاهر ٿئي ٿو ته اڪثر اڀياس ڪيل مقصد ٻنهي چونڊ شاخن جي سڀني پوئين دورن ۾ بهتر ٿي ويا.بهرحال، ڪجهه نقشا (مثال طور SGL، VSG، LGS GSV) بنيادي طور تي متبادل ڪليڊ A مان هئا، جڏهن ته ٻيا (مثال طور FGW، RTN، WGF، NTR) متبادل ڪليڊ B ۾ بهتر ڪيا ويا.
CSF جي CSF ٽرانسپورٽ جي تصديق CSF-enriched phage-displayed peptides and biotinylated leader peptides conjugated to streptavidin payloads.
(a) ڳڻپيوڪر تناسب سڀني چار رائونڊ (R1-R4) جي بنياد تي انجيل (انپٽ = I) فيج (PFU) ٽائيٽرز ۽ مقرر ڪيل CSF فيج ٽائيٽرز (آئوٽ = O).گذريل ٽن دورن (R2-R4) لاءِ افزودگي جا عنصر حساب ڪيا ويا اڳئين دور جي مقابلي ۾ ۽ پھريون دور (R1) وزن جي ڊيٽا سان.کليل بار دماغي اسپائنل فلوئڊ آهن، شيڊ ٿيل بار پلازما آهن.(***p <0.001، شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ جي بنياد تي).(b) سڀ کان گھڻا گھڻا فيج پيپٽائڊس جي فهرست، انھن جي نسبتي تناسب جي مطابق CSF ۾ گڏ ڪيل سڀني مرحلن جي چونڊ کان پوءِ.ڇهه سڀ کان وڌيڪ عام فيج کلون رنگ ۾ نمايان ٿيل آهن، انگن ۽ انهن جي افزائش عنصرن جي وچ ۾ 3 ۽ 4 جي چونڊ (انسيٽس).(c،d) ڇھ سڀ کان وڌيڪ افزائش ٿيل فيج کلون، خالي پيج ۽ پيرنيٽل فيج پيپٽائڊ لائبريريون گول 4 کان انفرادي طور تي CSF نموني نموني ۾ تجزيو ڪيو ويو.سي ايس ايف ۽ رت جا نمونا گڏ ڪيا ويا اشارو وقت جي پوائنٽن تي.(c) برابر مقدار ۾ 6 اميدوار فيج کلون (2 x 1010 فيجز/جانور)، خالي ڦڙا (#1779) (2 x 1010 فيجز/جانور) ۽ اسٽاڪ فيج پيپٽائڊ لائبرريون (2 x 1012 فيجز/جانور) انجيڪشن لڳايو وڃي ٿو گهٽ ۾ گهٽ 3 CM ذريعي جانور جي دم کي الڳ ڪري سگهجي ٿو.CSF pharmacokinetics of ھر انجيڪشن ٿيل phage clone ۽ phage peptide library وقت سان گڏ ڏيکاريل آھي.(d) ڏيکاري ٿو سراسري CSF/رت جو تناسب سڀني بحال ٿيل فيجز/ايم ايل لاءِ نموني جي وقت تي.(e) چار مصنوعي ليڊر پيپٽائڊس ۽ هڪ ڇڪيل ڪنٽرول بايوٽين سان ان جي اين ٽرمينس (ٽيٽرامر ڊسپلي) ذريعي اسٽريپٽاوڊين سان ڳنڍيو ويو جنهن کان پوءِ انجيڪشن (ٽيل وين iv، 10 ملي گرام اسٽريپٽاوڊين/ڪلوگرام).گھٽ ۾ گھٽ ٽي intubated rats (N = 3).).سي ايس ايف جا نمونا گڏ ڪيل وقت جي پوائنٽن تي گڏ ڪيا ويا ۽ سي ايس ايف اينٽي اسٽريپٽاوڊين ELISA (nd = نه مليل) پاران اسٽريپٽاوڊين جي مقدار کي ماپ ڪيو ويو.(*p <0.05، **p <0.01، ***p <0.001، ANOVA ٽيسٽ جي بنياد تي).(f) امينو اسيد جي ترتيب جي مقابلي ۾ سڀ کان وڌيڪ افزوده ٿيل فيج پيپٽائڊ ڪلون #2002 (جامني) ٻين چونڊيل فيج پيپٽائڊ ڪلونن سان چوٿين دور جي چونڊ.هڪجهڙا ۽ ملندڙ امينو اسيد جا ٽڪرا رنگ-ڪوڊ ٿيل آهن.
چوٿين دور ۾ سڀني ترقي يافته مرحلن مان (Fig. 3b)، ڇهه اميدوار ڪلونز CSF نموني جي ماڊل ۾ وڌيڪ انفرادي تجزيي لاء چونڊيا ويا.برابر مقدار ۾ ڇهه اميدوار فيج، خالي پيج (ڪو به داخل نه ڪيو ويو) ۽ پروفيج پيپٽائڊ لائبريرين کي ٽن کنيل ٿيل سي ايم جانورن ۾ انجيڪشن ڪيو ويو، ۽ فارماڪوڪينيٽڪس CSF (Fig. 3c) ۽ رت (ضمني شڪل 7) assays ۾ مقرر ڪيا ويا.سڀني فيج ڪلونز کي نشانو بڻايو ويو CSF ڪمارٽمينٽ کي 10-1000 ڀيرا وڌيڪ سطح تي خالي ڪنٽرول فيج جي ڀيٽ ۾ (#1779).مثال طور، ڪلون # 2020 ۽ # 2077 ڪنٽرول فيج جي ڀيٽ ۾ 1000 ڀيرا وڌيڪ CSF ٽائيٽرز هئا.هر چونڊيل پيپٽائڊ جو pharmacokinetic پروفائيل مختلف آهي، پر انهن سڀني کي هڪ اعلي CSF هومنگ جي صلاحيت آهي.اسان ڪلون #1903 ۽ #2011 لاءِ وقت سان گڏ مسلسل گهٽتائي جو مشاهدو ڪيو، جڏهن ته ڪلون #2077، #2002 ۽ #2009 لاءِ پهرين 10 منٽن دوران اضافو ٿي سگهي ٿو فعال ٽرانسپورٽ جي نشاندهي ڪئي وڃي پر تصديق ٿيڻ جي ضرورت آهي.ڪلون #2020، #2002، ۽ #2077 اعليٰ سطح تي مستحڪم ٿيا، جڏهن ته ڪلون #2009 جي CSF ڪنسنٽريشن شروعاتي واڌ کان پوءِ آهستي آهستي گهٽجي وئي.اسان وري هر CSF اميدوار جي نسبتي تعدد کي ان جي رت جي ڪنسنٽريشن سان ڀيٽيو (تصوير 3d).هر CSF اميدوار جو مطلب ٽائيٽل جو تعلق ان جي رت جي ٽائيٽر سان سڀني نموني جي وقتن ۾ ڏيکاريو ويو آهي ته ڇهن اميدوارن مان ٽي خاص طور تي رت جي CSF ۾ بهتري ڪئي وئي هئي.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته ڪلون #2077 رت جي استحڪام کي وڌيڪ ڏيکاريو (ضمني شڪل 7).ان ڳالهه جي تصديق ڪرڻ لاءِ ته پيپٽائيڊس پاڻ کي فعال طور تي فيج ذرڙن کان سواءِ ٻين سامان کي CSF خاني ۾ منتقل ڪرڻ جي قابل آهن، اسان N-terminus تي بايوٽين سان نڪتل چار ليڊر پيپٽائيڊس کي گڏ ڪيو جتي پيپٽائيڊس فيج ذرڙي سان ڳنڍجن ٿا.Biotinylated peptides (نمبر 2002, 2009, 2020 ۽ 2077) streptavidin (SA) سان ملائي ملٽيميرڪ فارم حاصل ڪرڻ لاءِ ڪجهه حد تائين فيج جاميٽري کي نقل ڪيو ويو.هي فارميٽ اسان کي رت ۽ دماغي اسپائنل سيال ۾ SA نمائش کي ماپڻ جي اجازت پڻ ڏني آهي جيئن ڪارگو ٽرانسپورٽنگ پروٽين پيپٽائڊس.خاص طور تي، فيج ڊيٽا اڪثر ڪري ٿي سگهي ٿي جڏهن مصنوعي پيپٽائڊس هن SA-conjugated فارميٽ ۾ منظم ڪيا ويا (تصوير 3e).ڇڪيل پيپٽائڊس کي 48 ڪلاڪن اندر اڻڄاتل سطحن سان گهٽ ابتدائي نمائش ۽ تيز CSF ڪليئرنس هئي.CSF خلا ۾ هنن پيپٽائڊ فيج ڪلونز جي ترسيل رستن ۾ بصيرت حاصل ڪرڻ لاءِ، اسان انفرادي فيج پيپٽائيڊ هٽس جي مقامي ڪرڻ جو تجزيو ڪيو immunohistochemistry (IHC) استعمال ڪندي فيج ذرات کي سڌي طرح معلوم ڪرڻ لاءِ 1 ڪلاڪ vivo ۾ intravenous injection کان پوءِ.خاص طور تي، ڪلون # 2002، # 2077، ۽ # 2009 دماغ جي ڪيپليئرز ۾ مضبوط داغ جي ذريعي ڳولي سگھجي ٿو، جڏهن ته ڪنٽرول فيج (#1779) ۽ ڪلون # 2020 نه مليا ويا (ضمني شڪل 8).اهو مشورو ڏئي ٿو ته اهي پيپٽائڊس دماغ تي اثر انداز ڪرڻ ۾ مدد ڪن ٿيون خاص طور تي بي بي بي کي پار ڪندي.وڌيڪ تفصيلي تجزيي جي ضرورت آھي ھن مفروضي کي جانچڻ لاءِ، جيئن BSCFB جو رستو پڻ شامل ٿي سگھي ٿو.جڏهن ٻين چونڊيل پيپٽائڊس سان سڀ کان وڌيڪ افزائش ٿيل کلون (#2002) جي امينو اسيد جي ترتيب جو مقابلو ڪيو ويو، اهو نوٽ ڪيو ويو ته انهن مان ڪجهه هڪ جهڙيون امينو اسيد ايڪسٽينشنون آهن، جيڪي شايد هڪ جهڙي ٽرانسپورٽ ميڪانيزم جي نشاندهي ڪن ٿيون (Fig. 3f).
ان جي منفرد پلازما پروفائل جي ڪري ۽ وقت سان گڏ CSF ۾ اهم واڌارو، فيج ڊسپلي ڪلون #2077 وڌيڪ 48-ڪلاڪن جي عرصي دوران وڌيڪ دريافت ڪيو ويو ۽ مسلسل SA سطحن (Fig. 4a) سان تعلق رکندڙ CSF ۾ تيز اضافو کي ٻيهر پيدا ڪرڻ جي قابل ٿي ويو.ٻين سڃاڻپ ٿيل فيج ڪلونز جي حوالي سان، #2077 دماغ جي ڪيپليئرز لاء سخت داغ ۽ ڪيپيلري مارڪر ليڪن سان گڏ اهم ڪلوڪولائيزيشن ڏيکاريا ويا جڏهن اعلي ريزوليوشن تي ڏٺو ويو ۽ ممڪن طور تي پيرنچيمل اسپيس ۾ ڪجهه داغ (شڪل 4b).تحقيق ڪرڻ لاءِ ته ڇا پيپٽائڊ جي وچولي فارماسولوجيڪل اثرات CNS ۾ حاصل ڪري سگھجن ٿا، اسان ھڪڙو تجربو ڪيو جنھن ۾ بائيوٽينيلڊ ورزن جا i) #2077 ٽرانزٽ پيپٽائڊ ۽ ii) بي اي سي اي 1 انبيٽر پيپٽائڊ کي SA سان ٻن مختلف نسبتن تي ملايو ويو.ھڪڙي ميلاپ لاءِ اسان صرف BACE1 پيپٽائڊ انبيٽر استعمال ڪيو ۽ ٻئي لاءِ اسان استعمال ڪيو 1:3 تناسب جو BACE1 پيپٽائڊ انبيٽر جو #2077 پيپٽائڊ.ٻنهي نمونن کي اندروني طور تي منظم ڪيو ويو ۽ رت ۽ دماغي مايع جي سطح بيٽا-اميلوڊ پيپٽائڊ 40 (Abeta40) جي وقت سان ماپ ڪئي وئي.Abeta40 CSF ۾ ماپيو ويو جيئن اهو BACE1 جي نمائش کي ظاهر ڪري ٿو دماغ جي پيرنچيما ۾.جيئن توقع ڪئي وئي، ٻنهي ڪمپليڪسز Abeta40 جي رت جي سطح کي خاص طور تي گھٽائي ڇڏيو (Fig. 4c، d).جڏهن ته، صرف نمونن تي مشتمل آهي پيپٽائڊ نمبر.2077 ۽ BACE1 پيپٽائڊ جو هڪ روڪيندڙ SA سان ٺهڪندڙ Abeta40 ۾ دماغي اسپائنل سيال (Fig. 4c) ۾ اهم گهٽتائي جو سبب بڻيو.ڊيٽا ڏيکاري ٿو ته peptide no.2077 60 kDa SA پروٽين کي CNS ۾ منتقل ڪرڻ جي قابل آهي ۽ BACE1 پيپٽائڊ جي SA-conjugated inhibitors سان فارماسولوجيڪل اثرات کي پڻ متاثر ڪري ٿو.
(a) ڪلونل انجيڪشن (2 × 10 phages/جانور) T7 phage جو CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) ۽ اڻڄاتل ڪنٽرول فيج (#1779) جي گھٽ ۾ گھٽ ٽن CM-intubated rats ۾ ڊگھي مدي واري فارماسوڪائنيٽ پروفائلز ڏيکاريندي.(b) phage-injected rats (2 × 10 10 phages/جانور) ۾ نمائندي ڪارٽيڪل مائڪرو ويسلز جي ڪنفوڪل خوردبيني تصوير جيڪا پيپٽائڊ #2077 ۽ ويسلس (ليڪٽين) جي انسداد کي ڏيکاريندي.اهي فيج ڪلون 3 چوڪن کي ڏنا ويا ۽ پرفيوشن کان پهريان 1 ڪلاڪ تائين گردش ڪرڻ جي اجازت ڏني وئي.دماغن کي سيڪشن ڪيو ويو ۽ پولي ڪلونل FITC-ليبل ٿيل اينٽي باڊيز سان T7 فيج ڪيپسڊ جي خلاف داغ ڪيو ويو.پرفيوشن ۽ بعد ۾ ٺهڻ کان ڏهه منٽ اڳ، DyLight594-labeled lectin intravenously ڏني وئي.فلورسنٽ تصويرون ڏيکارين ٿيون ليڪن داغ (ڳاڙهي) جي لومينل پاسي جي مائڪرو ويسلز ۽ فيجز (سائي) جي ليمن ۾ ڪيپيلريز ۽ پريواسڪولر دماغي ٽشو.اسڪيل بار 10 µm سان ملندو آهي.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide اڪيلي يا بايوٽينيليٽيڊ ٽرانزٽ پيپٽائڊ #2077 سان گڏ streptavidin سان ملائي وئي جنهن کان پوءِ گهٽ ۾ گهٽ ٽي CM rats (10 mg streptavidin/kg) جي intravenous انجيڪشن.Aβ40 ۾ BACE1 peptide inhibitor-ثالث گھٽتائي ماپ ڪئي وئي Aβ1-40 ELISA ۾ رت ۾ (ڳاڙھو) ۽ دماغي اسپينل سيال (نارنگي) اشارو وقت جي پوائنٽن تي.بهتر وضاحت لاءِ، گراف تي 100٪ جي ماپ تي ڊاٽ ٿيل لڪير ٺهيل آهي.(c) رت ۾ Aβ40 ۾ فيصد گھٽتائي (لال ٽڪنڊيز) ۽ cerebrospinal fluid (نارنگي ٽڪنڊيز) ۾ 3:1 جي تناسب ۾ ٽرانزٽ پيپٽائڊ #2077 ۽ BACE1 inhibitory peptide سان علاج ٿيل اسٽريپٽاوڊين سان.(d) رت ۾ في سيڪڙو گهٽتائي Aβ40 (ڳاڙهي حلقن) ۽ چوهڙن جي دماغي مايع (نارنگي حلقن) جو علاج streptavidin سان ڪيو ويو صرف BACE1 inhibitory peptide سان.ڪنٽرول ۾ Aβ ڪنسنٽريشن 420 pg/ml (معياري انحراف = 101 pg/ml).
بايوميڊيڪل ريسرچ17 جي ڪيترن ئي علائقن ۾ فيج ڊسپلي ڪاميابي سان لاڳو ڪئي وئي آهي.اهو طريقو استعمال ڪيو ويو آهي وييو ويسولر تنوع جي مطالعي ۾ 18,19 ۽ انهي سان گڏ مطالعي کي نشانو بڻائيندڙ دماغي برتن 20,21,22,23,24,25,26.هن مطالعي ۾، اسان هن چونڊ جي طريقي جي درخواست کي وڌايو نه رڳو پيپٽائڊس جي سڌي سڃاڻپ کي نشانو بڻائيندڙ دماغي ويڪريز، پر پڻ اميدوارن جي دريافت ڪرڻ لاء فعال ٽرانسپورٽ ملڪيت سان گڏ رت جي دماغ جي رڪاوٽ کي پار ڪرڻ لاء.اسان هاڻي بيان ڪريون ٿا هڪ ان وييو چونڊ جي طريقيڪار ۾ سي ايم intubated rats ۾ ۽ ان جي صلاحيت کي CSF هومنگ پراپرٽيز سان پيپٽائڊس کي سڃاڻڻ لاءِ.12-mer random peptides جي لائبريري کي ڏيکاريندڙ T7 فيج استعمال ڪندي، اسان اهو ڏيکارڻ جي قابل ٿي چڪا آهيون ته T7 فيج ڪافي ننڍو آهي (تقريبن 60 nm قطر ۾) 10 کي بلڊ-برين بيريئر سان ٺهڪندڙ ڪيو وڃي، ان ڪري سڌو سنئون رت جي دماغي رڪاوٽ يا ڪوروڊس کي پار ڪري ٿو.اسان ڏٺو آهي ته سي ايم ايف جي فصلن مان ڪڻڪ ٿيل سي ايم جي چوٽن مان حاصل ڪرڻ هڪ چڱي طرح ڪنٽرول ۾ ويوو فنڪشنل اسڪريننگ جي طريقي سان هئي، ۽ اهو ڪڍيو ويو فيج نه رڳو ويسڪوليچر جي پابند آهي پر رت جي دماغ جي رڪاوٽ ۾ ٽرانسپورٽر جي طور تي پڻ ڪم ڪيو.ان کان علاوه، گڏ ڪرڻ سان گڏ رت گڏ ڪرڻ ۽ CSF ۽ رت مان نڪتل مرحلن تي HTS لاڳو ڪرڻ سان، اسان تصديق ڪئي ته اسان جي CSF جو انتخاب رت جي افزودگي يا فٽنيس کان متاثر نه ڪيو ويو انتخاب جي دورن جي وچ ۾ توسيع لاءِ.تنهن هوندي، رت جو دڙو چونڊ عمل جو حصو آهي، ڇاڪاڻ ته CSF جي دٻي تائين پهچڻ جي قابل مرحلن کي لازمي طور تي زنده رهڻ گهرجي ۽ رت جي وهڪري ۾ گردش ڪرڻ گهرجي ڪافي وقت تائين دماغ ۾ پاڻ کي بهتر ڪرڻ لاءِ.خام HTS ڊيٽا مان قابل اعتماد ترتيب واري معلومات کي ڪڍڻ لاء، اسان تجزيي جي ڪم جي فلو ۾ پليٽ فارم جي مخصوص ترتيب واري غلطي کي ترتيب ڏيڻ لاء فلٽر لاڳو ڪيو.اسڪريننگ جي طريقي ۾ ڪائناتي پيٽرولز کي شامل ڪرڻ سان، اسان رت جي 24، 27، 28 ۾ جهنگلي قسم جي T7 phages (t½ ~ 28 min) جي تيز دواسازي جي تصديق ڪئي ۽ پڻ ان جي اڌ زندگي cerebrospinal fluid (t½ ~ 26 منٽ) في منٽ ۾ طئي ڪئي.رت ۽ CSF ۾ هڪجهڙي فارماڪوڪائنٽڪ پروفائلز جي باوجود، CSF ۾ صرف 0.001% رت جي ڪنسنٽريشن فزيءَ جي ڳولها ٿي سگهي ٿي، جيڪا ظاهر ڪري ٿي ته وائلڊ-قسم T7 فيج جي گهٽ پس منظر جي متحرڪ رت جي دماغي رڪاوٽ جي پار.هي ڪم چونڊ جي پهرين دور جي اهميت کي اجاگر ڪري ٿو جڏهن vivo پيننگ حڪمت عملين ۾ استعمال ڪيو وڃي، خاص طور تي فيج سسٽم لاءِ جيڪي تيزيءَ سان گردش مان صاف ٿين ٿا، جيئن ڪجھ ڪلون سي اين ايس ڪمپارٽمينٽ تائين پهچي سگھن ٿا.اهڙيءَ طرح، پهرئين دور ۾، لائبريريءَ جي تنوع ۾ گهٽتائي تمام وڏي هئي، ڇاڪاڻ ته هن انتهائي سخت CSF ماڊل ۾ صرف هڪ محدود تعداد ۾ ڪلون گڏ ڪيا ويا.هن vivo پيننگ حڪمت عملي ۾ ڪيترائي چونڊ مرحلا شامل آهن جيئن ته CSF خاني ۾ فعال جمع، رت جي خاني ۾ ڪلون بقا، ۽ پهرين 10 منٽن اندر رت مان T7 فيج ڪلون کي تيزيءَ سان هٽائڻ (تصوير 1d ۽ ضمني شڪل 4M).).اهڙيء طرح، پهرين دور کان پوء، CSF ۾ مختلف فيج کلون جي سڃاڻپ ڪئي وئي، جيتوڻيڪ ساڳيو ابتدائي تلاء انفرادي جانورن لاء استعمال ڪيو ويو.اهو مشورو ڏئي ٿو ته ذريعن جي لائبريرين لاء ڪيترن ئي سخت چونڊ قدمن جي وڏي تعداد ۾ لائبريري ميمبرن جي نتيجي ۾ تنوع ۾ هڪ اهم گهٽتائي آهي.تنهن ڪري، بي ترتيب واقعا ابتدائي چونڊ عمل جو هڪ لازمي حصو بڻجي ويندا، نتيجن کي تمام گهڻو متاثر ڪندا.امڪان اهو آهي ته اصل لائبريريءَ ۾ موجود ڪيترن ئي ڪلونن ۾ CSF جي افزودگيءَ جي هڪجهڙائي هئي.جيتوڻيڪ، ساڳئي تجرباتي حالتن جي تحت، چونڊ نتيجا مختلف ٿي سگهن ٿا ڇاڪاڻ ته ابتدائي پول ۾ هر خاص ڪلون جي ننڍڙي تعداد جي ڪري.
CSF ۾ بهتر ڪيل نقشا رت ۾ انهن کان مختلف آهن.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، اسان انفرادي جانورن جي رت ۾ گليڪين-امير پيپٽائڊس جي پهرين شفٽ کي نوٽ ڪيو.(Fig. 1g، Supplementary Figs. 4e، 4f).گليسائن پيپٽائڊس تي مشتمل Phage وڌيڪ مستحڪم ٿي سگهي ٿو ۽ گردش کان ٻاهر نڪرڻ جو امڪان گهٽ هجي.بهرحال، اهي گليسائن سان مالا مال پيپٽائڊس دماغي اسپائنل فلوئڊ جي نمونن ۾ نه مليا آهن، اهو تجويز ڪيو ويو آهي ته ٺهيل لائبريريون ٻن مختلف چونڊ مرحلن مان گذريون آهن: هڪ رت ۾ ۽ ٻيو دماغي اسپائنل سيال ۾ جمع ٿيڻ جي اجازت.چونڊ جي چوٿين دور جي نتيجي ۾ CSF-تيز ٿيل کلون وڏي پيماني تي آزمايا ويا آهن.تقريبن سڀئي انفرادي طور تي آزمائشي کلون جي تصديق ڪئي وئي هئي ته خالي ڪنٽرول فيج جي مقابلي ۾ سي ايس ايف ۾ بهتري.ھڪڙو پيپٽائڊ ھٽ (#2077) وڌيڪ تفصيل سان جانچيو ويو.اهو ٻين هٽن (شڪل 3d ۽ ضمني شڪل 7) جي مقابلي ۾ هڪ ڊگهو پلازما اڌ-زندگي ڏيکاري ٿو، ۽ دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، هن پيپٽائڊ ۾ سي-ٽرمينس تي هڪ سيسٽين جي باقي رهي ٿي.اهو تازو ڏيکاريو ويو آهي ته پيپٽائڊس ۾ سيسٽين جو اضافو البمن 29 سان پابند ڪندي انهن جي دواسازي جي ملڪيت کي بهتر ڪري سگهي ٿو.اهو في الحال اڻڄاتل آهي peptide #2077 ۽ وڌيڪ مطالعي جي ضرورت آهي.ڪجهه پيپٽائڊس ڏيکاريا ويانس-انحصار ۾ CSF افزودگي (ڊيٽا نه ڏيکاريل آهي)، جيڪو شايد T7 ڪئپسڊ جي ڏيکاريل سطح جي جاميٽري سان لاڳاپيل هجي.T7 سسٽم جيڪو اسان استعمال ڪيو اهو ڏيکاريو ويو 5-15 ڪاپيون هر پيپٽائڊ في فيج ذرات جي.IHC پرفارم ڪيو ويو اميدوار ليڊ فيج ڪلونن تي داخل ڪيو ويو انجيڪشن ذريعي رت جي دماغي پرانتڪس ۾ (ضمني تصوير 8).ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته گهٽ ۾ گهٽ ٽي ڪلون (نمبر 2002، نمبر 2009 ۽ نمبر 2077) بي بي بي سان رابطو ڪيو.اهو طئي ٿيڻو آهي ته ڇا هي BBB رابطي جي نتيجي ۾ CSF جي جمع ٿيڻ يا انهن ڪلون جي حرڪت سڌو BCSFB ڏانهن.خاص طور تي، اسان ڏيکاريون ٿا ته چونڊيل پيپٽائڊس انهن جي سي ايس ايف جي ٽرانسپورٽ جي صلاحيت کي برقرار رکندو آهي جڏهن مصنوعي ۽ پروٽين جي سامان تي پابند آهي.اين-ٽرمينل بايوٽينيليٽ پيپٽائڊس جو SA کي پابند ڪرڻ لازمي طور تي حاصل ڪيل نتيجن کي ورجائي ٿو انهن جي لاڳاپيل فيج ڪلون سان رت ۽ دماغي اسپائنل سيال (تصوير 3e).آخر ۾، اسان ڏيکاريون ٿا ته ليڊ پيپٽائڊ #2077 دماغي عمل کي فروغ ڏيڻ جي قابل آهي BACE1 جي بايوٽينيليٽ پيپٽائڊ انابيٽر جي دماغي عمل کي SA سان ملائي، سي اين ايس ۾ واضح فارماڪوڊائنامڪ اثرات پيدا ڪري ٿي CSF ۾ Abeta40 جي سطح کي خاص طور تي گھٽائيندي (Fig. 4).اسان ڊيٽابيس ۾ ڪنهن به homologues جي سڃاڻپ ڪرڻ کان قاصر هئاسين هڪ پيپٽائڊ ترتيب homology جي ڳولا ڪندي سڀني هٽن جي.اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته T7 لائبريري جي سائيز لڳ ڀڳ 109 آهي، جڏهن ته 12-mers لاء نظرياتي لائبريري سائيز 4 x 1015 آهي. تنهن ڪري، اسان صرف 12-mer peptide لائبريري جي تنوع واري جڳهه جو هڪ ننڍڙو حصو چونڊيو آهي، جنهن جو مطلب اهو ٿي سگهي ٿو ته وڌيڪ بهتر ڪيل جڳهه جي سڃاڻپ ڪري سگهجي ٿي.فرضي طور تي، اسان کي انهن پيپٽائڊس جو ڪو به قدرتي هومولوگ نه مليو آهي ان جو هڪ سبب اهو ٿي سگهي ٿو ته ارتقاءَ دوران دماغ ۾ ڪجهه پيپٽائڊ شڪلين جي غير ڪنٽرول ٿيل داخلا کي روڪڻ لاءِ خارج ڪيو وڃي.
گڏجي گڏ ڪيو ويو، اسان جا نتيجا مستقبل جي ڪم لاء هڪ بنياد فراهم ڪن ٿا ۽ وڌيڪ تفصيل سان vivo ۾ cerebrovascular رڪاوٽ جي ٽرانسپورٽ سسٽم کي سڃاڻڻ ۽ خاص ڪرڻ لاء.هن طريقي جو بنيادي سيٽ اپ هڪ فنڪشنل چونڊ حڪمت عملي تي مبني آهي جيڪو نه رڳو ڪلون جي سڃاڻپ ڪري ٿو دماغي ويسڪولر پابند ملڪيت سان، پر هڪ نازڪ قدم پڻ شامل آهي جنهن ۾ ڪامياب ڪلونز کي سي اين ايس جي ڪمري ۾ vivo ۾ حياتياتي رڪاوٽون پار ڪرڻ لاء اندروني سرگرمي شامل آهي.انهن پيپٽائڊس جي نقل و حمل جي ميکانيزم کي واضح ڪرڻ ۽ دماغي علائقي سان مخصوص مائڪرو ويسڪوليچر سان پابند ڪرڻ لاءِ انهن جي ترجيح کي واضح ڪرڻ آهي.اهو شايد BBB ۽ ريڪٽرز جي ٽرانسپورٽ لاء نئين رستن جي دريافت کي ڏسجي.اسان اميد رکون ٿا ته سڃاڻپ ٿيل پيپٽائڊس سڌو سنئون سربروويسولر ريڪٽرز تي پابند ڪري سگھن ٿا يا BBB يا BCSFB ذريعي منتقل ٿيل ligands کي گردش ڪري سگھن ٿا.هن ڪم ۾ دريافت ڪيل CSF ٽرانسپورٽ سرگرمي سان پيپٽائڊ ویکٹر وڌيڪ تحقيق ڪئي ويندي.اسان هن وقت تحقيق ڪري رهيا آهيون دماغ جي خاصيتن جي انهن پيپٽائڊس جي BBB ۽ / يا BCSFB کي پار ڪرڻ جي صلاحيت لاءِ.اهي نيون پيپٽائڊس نون ريڪٽرز يا رستا جي امڪاني دريافت لاءِ انتهائي قيمتي اوزار هوندا ۽ نئين انتهائي موثر پليٽ فارمز جي ترقيءَ لاءِ ميڪروموليڪولس، جهڙوڪ حياتيات، دماغ تائين پهچائڻ لاءِ.
اڳئين بيان ڪيل طريقي جي ترميم کي استعمال ڪندي وڏي سيرنا (سي ايم) کي ڪينيوليٽ ڪريو.Anesthetized Wistar rats (200-350 g) هڪ اسٽيريوٽڪسڪ اپريٽس تي نصب ڪيا ويا ۽ هڪ وچين چيرا کي ڍڪيل ۽ aseptically تيار ڪيل کوپڙي جي مٿان ٺاهيو ويو کوپڙي کي بي نقاب ڪرڻ لاء.مٿئين سيش جي علائقي ۾ ٻه سوراخ ڪر ۽ سوراخ ۾ فڪسنگ اسڪرو کي تيز ڪريو.سي ايم ۾ اسٽينلیس اسٽيل ڪينولا جي اسٽيريوٽيڪڪ هدايتن لاءِ پسمانده اوسيپيٽل ڪرسٽ ۾ هڪ اضافي سوراخ ڪيو ويو.ڪينولا جي چوڌاري ڏندن جي سيمينٽ کي لاڳو ڪريو ۽ اسڪرو سان محفوظ ڪريو.ڦوٽو-ڪورنگ ۽ سيمينٽ جي سخت ٿيڻ کان پوء، چمڙي جي زخم کي 4/0 supramid سيون سان بند ڪيو ويو.ڪينولا جي مناسب جڳھ جي تصديق ڪئي وئي آھي cerebrospinal fluid (CSF) جي spontaneous leakage.اسٽيريوٽڪسڪ اپريٽس مان چوٿين کي هٽايو، مناسب پوسٽ آپريٽو سنڀال ۽ درد جي انتظام حاصل ڪريو، ۽ ان کي گهٽ ۾ گهٽ هڪ هفتي تائين بحال ڪرڻ جي اجازت ڏيو جيستائين رت جي نشانين جي دماغي مايع ۾ مشاهدو ڪيو وڃي.Wistar rats (Crl:WI/Han) چارلس درياء (فرانس) مان حاصل ڪيا ويا.سڀئي چوٿون مخصوص پيجنجن کان پاڪ حالتن ۾ رکيا ويا.سڀني جانورن جا تجربا سٽي آف باسل، سوئٽزرلينڊ جي ويٽرنري آفيس پاران منظور ڪيا ويا، ۽ جانورن جي لائسنس نمبر 2474 (Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat ۾ علاج ڪندڙ اميدوارن جي سطح جي ماپ ڪندي فعال دماغي ٽرانسپورٽ جي تشخيص) جي مطابق ڪيا ويا.
نرميءَ سان چوهيءَ کي هوش ۾ رکو سي ايم ڪينولا هٿ ۾.Datura کي ڪئنولا مان هٽايو ۽ 10 µl spontaneously وهندڙ دماغي اسپائنل سيال گڏ ڪريو.جيئن ته ڪينولا جي patency آخرڪار سمجھوتو ڪيو ويو، صرف واضح cerebrospinal سيال نموني سان گڏ رت جي آلودگي يا بي رنگ ٿيڻ جو ڪو ثبوت نه هن مطالعي ۾ شامل ڪيو ويو.متوازي طور تي، دم جي چوٽي تي لڳ ڀڳ 10-20 μl رت کي هيپرين (Sigma-Aldrich) سان ٽيوب ۾ داخل ڪيو ويو.CSF ۽ رت مختلف وقتن تي گڏ ڪيا ويا T7 فيج جي اندروني انجڻ کان پوء.تقريبن 5-10 μl سيال جي هر CSF نموني کي گڏ ڪرڻ کان اڳ رد ڪيو ويو، جيڪو ڪيٿيٽر جي مئل حجم سان ملندو آهي.
لائبريريون ٺاهيا ويا T7Select 10-3b ویکٹر استعمال ڪندي جيئن T7Select سسٽم مينوئل ۾ بيان ڪيو ويو آهي (Novagen, Rosenberg et al., Innovations 6, 1-6, 1996).مختصر طور تي، هڪ بي ترتيب 12-مير ڊي اين اي داخل ڪيو ويو هيٺ ڏنل شڪل ۾:
NNK ڪوڊون استعمال ڪيو ويو ڊبل اسٽاپ ڪوڊن کان بچڻ لاءِ ۽ داخل ڪرڻ ۾ امينو اسيد اوور ايڪسپريشن.N هر نيوڪليوٽائيڊ جو هڪ دستي طور تي مخلوط برابري وارو تناسب آهي، ۽ K هڪ دستي طور تي مخلوط برابر برابر تناسب آهي ايڊينائن ۽ سائٽوسين نيوڪليوٽائڊس جو.37 ڊگري سينٽي گريڊ تي 3 ڪلاڪن لاءِ ڪلينو بفر (نيو انگلينڊ بائولابس) ۾ dNTP (Novagen) ۽ Klenow enzyme (New England Biolabs) سان وڌيڪ انڪيوبيشن ذريعي سنگل اسٽرينڊ ٿيل علائقن کي ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي ۾ تبديل ڪيو ويو.رد عمل کان پوء، EtOH ورهاڱي جي ذريعي ڊبل اسٽينڊ ڊي اين اي هٿ ڪيو ويو.نتيجو ڪندڙ ڊي اين اي پابندي اينزيمز EcoRI ۽ HindIII (ٻنهي کان Roche) سان هضم ڪيو ويو.صاف ٿيل ۽ صاف ٿيل (QIAquick، Qiagen) insert (T4 ligase، New England Biolabs) پوءِ 10B ڪيپسڊ جين جي امينو ايسڊ 348 کان پوءِ پري-ڪليوڊ T7 ویکٹر ۾ فريم ۾ لڪيٽ ڪيو ويو.ويٽرو پيڪنگنگ کان 18 ڪلاڪ اڳ لئگيشن ردعمل 16 ° C. تي پکڙيل هئا.ويٽرو ۾ فيج پيڪنگنگ T7Select 10-3b ڪلوننگ کٽ (Novagen) سان فراهم ڪيل هدايتن جي مطابق ڪئي وئي ۽ پيڪنگنگ حل کي هڪ ڀيرو وڌايو ويو ليسس تائين Escherichia coli (BLT5615، Novagen).ليسيٽس کي گليسرول جي اسٽاڪ حل جي طور تي -80 ° C. تي سينٽرفيوز، ٽائيٽل ۽ منجمد ڪيو ويو.
454/Roche-amplicon فيوزن پرائمر استعمال ڪندي برٿ يا پليٽ ۾ فاج متغير علائقن جي سڌي PCR ايمپليفڪيشن.فارورڊ فيوزن پرائمر ۾ متغير علائقي (NNK) 12 (ٽيمپليٽ-مخصوص)، GS FLX ٽائيٽينيم اڊاپٽر A، ۽ چار بيس لائبريري ڪيئي تسلسل (TCAG) (ضمني شڪل 1a):
ريورس فيوزن پرائمر ۾ پڻ بايوٽين شامل آهي جيڪو ڪيپچر بيڊز سان جڙيل آهي ۽ GS FLX ٽائيٽينيم اڊاپٽر B ايمولشن پي سي آر دوران ڪلونل ايمپليفڪيشن لاءِ گهربل آهي:
amplicons وري 454 GS-FLX Titanium پروٽوڪول جي مطابق 454 / Roche pyrosequencing جي تابع ڪيا ويا.دستي سنجر جي ترتيب لاءِ (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)، T7 phage DNA کي PCR پاران وڌايو ويو ۽ ھيٺين پرائمر جوڑوں سان ترتيب ڏنو ويو:
روچ فاسٽ اسٽارٽ ڊي اين اي پوليميرس کٽ (ڪاروڪار جي هدايتن جي مطابق) استعمال ڪندي انفرادي تختي مان داخل ٿيل پي سي آر ايمپليفڪيشن جي تابع ڪيا ويا.گرم شروع ڪريو (10 منٽ 95 ° C تي) ۽ 35 بوسٽ سائيڪل (50 s 95 ° C تي، 1 منٽ 50 ° C تي، ۽ 1 منٽ 72 ° C تي).
لائبريرين مان فيج، وائلڊ قسم جي فيج، CSF ۽ رت کان بچيل فيج، يا انفرادي ڪلون Escherichia coli BL5615 ۾ TB برٿ (Sigma Aldrich) ۾ يا 500 cm2 ڊشز (Thermo Scientific) ۾ 4 ڪلاڪ 37 درجا سينٽي گريڊ تائين وڌايو ويو.پليٽن مان Phage ڪڍيا ويا آھن پليٽن کي Tris-EDTA بفر (Fluka Analytical) سان ڌوئي يا sterile pipette tips سان تختيون گڏ ڪري.Phage ڪلچر سپرنيٽنٽ يا ايڪسٽريشن بفر کان الڳ ڪيو ويو پوليٿيلين گلائڪول (PEG 8000) ورن جي ھڪڙي گول سان (Promega) ۽ ٽريس-EDTA بفر ۾ بحال ڪيو ويو.
انٽرا وينس (IV) انجيڪشن (500 μl/جانور) کان اڳ اينٽوٽوڪسين هٽائڻ واري موتي (Miltenyi Biotec) کي استعمال ڪندي انڊيٽوڪسين هٽائڻ جي 2-3 راؤنڈز کي وڌايو ويو.پهرين دور ۾، 2 × 1012 مرحلن کي متعارف ڪرايو ويو؛سيڪنڊ ۾، 2 × 1010 مرحلن؛ٽئين ۽ چوٿين چونڊ رائونڊ ۾، 2 × 109 فيز في جانور.CSF ۾ فيج جو مواد ۽ رت جا نمونا گڏ ڪيل وقت جي پوائنٽن تي گڏ ڪيا ويا تختي جي ڳڻپ جي ذريعي ٺاھيندڙ جي هدايتن جي مطابق (T7Select System Manual).فيج جي چونڊ جاري ڪيل لائبريرين جي تللي جي انجينشن جي غير معياري انجينز جي تعصب جي انجڻ يا بعد ۾ شامل ڪيو ويو آهي.ان ويوو پيننگ جا ڪل چار رائونڊ ڪيا ويا جن ۾ ٻن چونڊيل شاخن کي الڳ الڳ ذخيرو ڪيو ويو ۽ چونڊ جي پهرين ٽن دورن ۾ تجزيو ڪيو ويو.چونڊ جي پهرين ٻن دورن مان CSF مان نڪتل سڀ فيج داخل ڪيا ويا 454/Roche pyrosequencing جي تابع، جڏهن ته چونڊ جي آخري ٻن دورن مان CSF مان نڪتل سڀئي کلون دستي طور تي ترتيب ڏنل هئا.چونڊ جي پهرين دور کان سڀئي رت جا ڦڙا پڻ 454 / روچ پيروسيڪينسنگ جي تابع هئا.فيج ڪلون جي انجيڪشن لاءِ، چونڊيل فيز کي E. coli (BL5615) ۾ 500 سينٽي ميٽر 2 پليٽن تي 37 ° سي تي 4 ڪلاڪن تائين وڌايو ويو.انفرادي طور تي چونڊيل ۽ دستي طور تي ترتيب ڏنل ڪلون ٽي بي وچولي ۾ پروپيگنڊا ڪيا ويا.فيج ڪڍڻ کان پوءِ، اينٽوٽوڪسين کي صاف ڪرڻ ۽ ختم ڪرڻ (جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي)، 2×1010 فيجز/جانور 300 μl ۾ هڪ دم جي رڳ ۾ نس جي ذريعي داخل ڪيا ويا.
ترتيب واري ڊيٽا جي اڳڀرائي ۽ معيار جي فلٽرنگ.Raw 454/Roche ڊيٽا کي تبديل ڪيو ويو بائنري معياري اسٽريم ميپ فارميٽ (sff) مان هڪ Pearson human readable format (fasta) ۾ وينڊر سافٽ ويئر استعمال ڪندي.وڌيڪ پروسيسنگ نيوڪليوٽائڊ جي ترتيب کي استعمال ڪندي ڪيو ويو مالڪي سي پروگرامن ۽ اسڪرپٽس (غير جاري ٿيل سافٽ ويئر پيڪيج) جيئن هيٺ بيان ڪيو ويو آهي.پرائمري ڊيٽا جي تجزيي ۾ سخت ملٽي اسٽيج فلٽرنگ طريقا شامل آهن.To filter out reads that did not contain a valid 12mer insert DNA sequence, the reads were sequentially aligned to start label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) and background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) using the global Needleman-Wunsch test.ترتيب ڏيڻ جي اجازت ڏئي ٿي 2 متضاد في الائنمينٽ 31 تائين.تنهن ڪري، بغير شروع ۽ اسٽاپ ٽيگ جي پڙهڻ ۽ پس منظر داخل ڪرڻ تي مشتمل پڙهڻ، يعني، ترتيب ڏيڻ جيڪي بي ترتيبن جي اجازت ڏنل تعداد کان وڌيڪ آهن، لائبريري مان هٽايو ويو.باقي پڙهڻ لاءِ، N-mer DNA جو سلسلو شروع جي نشان کان وڌندو ۽ ختم ٿيڻ کان اڳ اسٽاپ مارڪ کي اصل پڙهڻ واري ترتيب مان ڪڍيو ويو ۽ وڌيڪ پروسيس ڪيو ويو (هاڻي ان کان پوءِ ”داخل“ طور حوالو ڏنو ويو).داخل ڪرڻ جي ترجمي کان پوء، پرائمر جي 5′ آخر ۾ پهرين اسٽاپ ڪوڊون کان پوء حصو داخل ٿيڻ کان هٽايو ويو آهي.ان کان علاوه، پرائمر جي 3′ پڇاڙيءَ ۾ نامڪمل ڪوڊونز جي ڪري نيوڪليوٽائڊس پڻ ختم ٿي ويون.صرف پس منظر جي ترتيبن تي مشتمل داخلن کي خارج ڪرڻ لاء، امينو ايسڊ جي نموني سان شروع ٿيندڙ ترجمو ٿيل داخلات "PAG" پڻ ختم ڪيا ويا.لئبرري مان 3 امينو اسيد کان گھٽ جي ترجمي کان پوءِ واري لمبائي سان پيپٽائيڊس کي هٽايو ويو.آخرڪار، داخل ڪرڻ جي تلاء ۾ بيڪارگي کي هٽايو ۽ هر منفرد داخل ڪرڻ جي تعدد جو اندازو لڳايو.ھن تجزيي جي نتيجن ۾ شامل آھن نيوڪليوٽائيڊ جي ترتيبن جي ھڪڙي فهرست (انسرٽس) ۽ انھن جي (پڙھڻ) تعدد (ضمني انگ اکر 1c ۽ 2).
گروپ N-mer DNA inserts by sequence sequence: 454/Roche-specific sequencing errors (جهڙوڪ homopolymer extensions sequencing سان مسئلا) کي ختم ڪرڻ ۽ گهٽ اهم redundancies کي هٽائڻ لاءِ، اڳ فلٽر ٿيل N-mer DNA sequence inserts (inserts) هڪجهڙائي سان ترتيب ڏنل آهن.داخل ڪرڻ (2 غير مماثل بنيادن تائين اجازت ڏني وئي) ھڪڙو ورجائيندڙ الورورٿم استعمال ڪندي ھيٺ ڏنل بيان ڪيو ويو آھي: داخلائون پھريون ترتيب ڏنل آھن انھن جي تعدد (مٿي کان گھٽ کان گھٽ)، ۽ جيڪڏھن اھي ساڳيا آھن، انھن جي ثانوي ترتيب سان ڊگھائي (ڊگھي کان ننڍو) ).اهڙيء طرح، سڀ کان وڌيڪ بار بار ۽ سڀ کان ڊگهو داخل ٿيڻ پهريون "گروپ" جي وضاحت ڪن ٿا.گروپ جي تعدد کي سيٽ ڪيو ويو آهي اهم تعدد تي.ان کان پوء، ترتيب ڏنل فهرست ۾ باقي هر داخل ٿيڻ جي ڪوشش ڪئي وئي ته گروپ ۾ شامل ڪيو وڃي گڏيل طور تي Needleman-Wunsch alignment.جيڪڏهن هڪ ترتيب ۾ بي ترتيبين، داخل ڪرڻ، يا حذف ڪرڻ جو تعداد 2 جي حد کان وڌيڪ نه آهي، هڪ داخلا گروپ ۾ شامل ڪئي وئي آهي، ۽ مجموعي طور تي گروپ جي تعدد کي وڌايو ويندو آهي ته ڪيترا ڀيرا شامل ڪيو ويو.هڪ گروپ ۾ شامل ڪيل داخلون استعمال ٿيل طور نشان لڳل آھن ۽ وڌيڪ پروسيسنگ کان خارج ٿيل آھن.جيڪڏهن داخل ٿيڻ جي ترتيب اڳ ۾ ئي موجود گروپ ۾ شامل نه ٿي ڪري سگھجي، داخل ڪرڻ جي ترتيب کي استعمال ڪيو ويندو آھي ھڪڙو نئون گروپ ٺاھڻ لاءِ مناسب داخل ڪرڻ جي تعدد سان ۽ نشان لڳل طور استعمال ڪيو ويو آھي.ورجائي ختم ٿي ويندي آهي جڏهن هر داخل ٿيڻ جي ترتيب يا ته نئين گروپ ٺاهڻ لاء استعمال ڪيو ويو آهي يا اڳ ۾ ئي موجود گروپ ۾ شامل ٿي سگهي ٿو.سڀ کان پوء، نيوڪليوٽيڊس تي مشتمل گروپ ٿيل داخلون آخرڪار پيپٽائڊ ترتيبن (پيپٽائڊ لائبريري) ۾ ترجمو ڪيا ويا آهن.ھن تجزيي جو نتيجو آھي داخلن جو ھڪڙو سيٽ ۽ انھن سان لاڳاپيل تعدد جيڪي مسلسل پڙھڻ جو تعداد ٺاھي ٿو (ضمني تصوير 2).
Motif Generation: منفرد پيپٽائڊس جي فهرست جي بنياد تي، هڪ لائبريري ٺاهي وئي جنهن ۾ سڀني ممڪن امينو ايسڊ نمونن (aa) هيٺ ڏيکاريل آهي.ڊگھائي 3 جو هر ممڪن نمونو پيپٽائيڊ مان ڪڍيو ويو ۽ ان جو انوکو نمونو شامل ڪيو ويو ان سان گڏ هڪ عام نقشي لائبريري سان گڏ سڀني نمونن (ٽريپٽائڊس) تي مشتمل آهي.انتهائي ورجائيندڙ نقشن جون لائبريريون ترتيب ڏنيون ويون ۽ بيڪارگي کي هٽايو ويو.ان کان پوء، هر ٽرپپٽائڊ لاء motif لائبريري ۾، اسان ان جي موجودگي لاء لائبريري ۾ ڪمپيوٽر جي اوزار استعمال ڪندي چيڪ ڪيو.انهي صورت ۾، پيپٽائڊ جي فريکوئنسي جنهن ۾ مليل موٽف ٽرپيپٽائڊ شامل ڪيو ويو آهي ۽ موٽف لائبريري ۾ موٽف کي لڳايو ويو آهي ("موٽيف جو تعداد").motif جي نسل جو نتيجو هڪ ٻه-dimensional صف آهي جنهن ۾ ٽريپٽائڊس (موٽيفز) جي سڀني واقعن ۽ انهن جي لاڳاپيل قدرن تي مشتمل آهي، جيڪي ترتيب وار پڙهڻ جو تعداد آهن جنهن جي نتيجي ۾ لاڳاپيل نقشو جڏهن پڙهڻ کي فلٽر، گروپ ۽ ترجمو ڪيو ويندو آهي.Metrics جيئن مٿي تفصيل سان بيان ڪيو ويو آهي.
نقشن جي تعداد کي عام ڪرڻ ۽ لاڳاپيل اسڪرپٽ پلاٽ: هر نموني لاء نقشن جو تعداد استعمال ڪندي عام ڪيو ويو
جتي ni آهي پڙهڻ جو تعداد جنهن ۾ موضوع i.اهڙيء طرح، vi نموني ۾ نموني تي مشتمل پڙهڻ (يا پيپٽائڊس) جي فيصد تعدد جي نمائندگي ڪري ٿو.P-values ​​for non-ormalized number of motifs جو حساب ڪيو ويو فشر جي صحيح ٽيسٽ استعمال ڪندي.مقصدن جي تعداد جي correlograms جي حوالي سان، Spearman جي لاڳاپن کي حساب ڪيو ويو R.
پيپٽائيڊ لائبريري ۾ هر پوزيشن تي امينو اسيد جي مواد کي ڏسڻ لاءِ، ويب لوگوگرامس 32، 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ٺاهيا ويا.پهرين، 12-مير پيپٽائڊ جي هر پوزيشن تي امينو اسيد جو مواد 20 × 12 ميٽرڪس ۾ ذخيرو ٿيل آهي.پوءِ، 1000 پيپٽائڊس جو هڪ سيٽ جنهن ۾ هر پوزيشن تي هڪجهڙو لاڳاپو امينو ايسڊ مواد شامل هوندو آهي فاسٽا-سيڪوئنس فارميٽ ۾ تيار ڪيو ويندو آهي ۽ ويب-لوگو 3 کي انپٽ طور مهيا ڪيو ويندو آهي، جيڪو هر پوزيشن تي لاڳاپو امينو ايسڊ مواد جي گرافڪ نمائندگي ٺاهي ٿو.هڪ ڏنل peptide لائبريري لاء.گھڻائي واري ڊيٽا سيٽن کي ڏسڻ لاءِ، گرمي جا نقشا ٺاھيا ويا ھڪ اندروني طور تي ترقي يافته اوزار استعمال ڪندي R (biosHeatmap، ھڪڙو اڃا تائين جاري ٿيل R پيڪيج).گرميءَ جي نقشن ۾ پيش ڪيل ڊينڊروگرامس وارڊ جي ڪلاسيڪل ڪلستر واري طريقي سان ايڪليڊين فاصلي جي ميٽرڪ سان ڳڻيا ويا.موٽف اسڪورنگ ڊيٽا جي شمارياتي تجزيي لاءِ، فشر جي درست ٽيسٽ کي استعمال ڪندي غير معمولي اسڪورنگ لاءِ پي ويلز ڳڻيا ويا.شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ يا ANOVA استعمال ڪندي ٻين ڊيٽا سيٽن لاءِ P-قدر R ۾ ڳڻيا ويا.
منتخب ٿيل فيج ڪلون ۽ فيجز بغير داخل ٿيڻ جي دم جي رڳ (2×1010 فيجز/جانور ۾ 300 μl PBS) ذريعي داخل ڪيا ويا.پرفيوشن کان ڏهه منٽ اڳ ۽ ان کان پوءِ فيڪسيشن، ساڳين جانورن کي 100 μl DyLight594-ليبل ٿيل ليڪن (Vector Laboratories Inc., DL-1177) سان گڏ انجڻ ذريعي داخل ڪيو ويو.فيج انجيڪشن کان 60 منٽ پوءِ، چوڪن کي دل جي ذريعي 50 ml PBS ۽ 50 ml 4% PFA/PBS سان گڏ ڪيو ويو.دماغ جا نمونا اضافي طور تي 4٪ PFA/PBS ۾ رات جو مقرر ڪيا ويا ۽ 30٪ sucrose ۾ رات جو 4 ° C تي.او سي ٽي مرکب ۾ نمونا منجمد ٿيل آهن.منجمد نمونن جو Immunohistochemical تجزيو 30 µm cryosections تي ڪمري جي حرارت تي ڪيو ويو 1٪ BSA سان بلاڪ ڪيو ويو ۽ T7 phage (Novus NB 600-376A) جي خلاف پولي ڪلونل FITC-ليبل ٿيل اينٽي باڊيز سان 4 °C تي ڪيو ويو.رات جو incubate.آخرڪار، سيڪشن کي 3 ڀيرا PBS سان ڌوئي ويا ۽ هڪ ڪنفوڪل ليزر خوردبيني (Leica TCS SP5) سان جانچيو ويو.
سڀ پيپٽائڊس جيڪي گھٽ ۾ گھٽ 98٪ جي خالصيت سان گڏ GenScript USA پاران ٺھيل آھن، بايوٽينيليٽ ٿيل ۽ لائوفيلائزڊ.بايوٽين اين ٽرمينس تي اضافي ٽرپل گليسين اسپيسر ذريعي پابند آهي.ماس اسپيڪٽروميٽري استعمال ڪندي سڀ پيپٽائيڊس چيڪ ڪريو.
Streptavidin (Sigma S0677) بايوٽينيليٽ پيپٽائڊ جي 5-گنا برابري واري اضافي سان، بايوٽينيلڊ BACE1 انابيٽري پيپٽائڊ، يا بايوٽينيلڊ BACE1 انابيٽري پيپٽائيڊ جو هڪ ميلاپ (3:1 تناسب) ۽ BACE1 inhibitory peptide in SO5DM-5DM0 %1 inhibitory peptide سان ملايو ويو.انجڻ کان اڳ ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ.Streptavidin-conjugated peptides 10 mg/kg جي هڪ دوز تي دماغي غار سان چوهڙن جي دم واري رڳن مان هڪ ۾ داخل ڪيا ويا.
streptavidin-peptide ڪمپليڪس جي ڪنسنٽريشن ELISA پاران جائزو ورتو ويو.Nunc Maxisorp microtiter پليٽس (Sigma) رات جو 4 ° C تي 1.5 μg/ml ماؤس اينٽي اسٽريپٽاوڊين اينٽي باڊي سان گڏ ڪيو ويو (Thermo, MA1-20011).بلاڪ ڪرڻ کان پوءِ (بلاڪنگ بفر: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ڪمري جي گرمي پد تي 2 ڪلاڪن تائين، پليٽ کي 0.05% Tween-20/PBS (واش بفر) سان ڌوئي پوءِ 3 پلا فلو سان گڏ بلاڪ ڪيو ويو ۽ ٻئين ڊيو ايف سي ايس سان گڏ ڪيو ويو. لسما 1:10,000، CSF 1:115).ان کان پوءِ پليٽ کي رات جو 4 ° C تي ڳولهي اينٽي باڊي (1 μg/ml، anti-streptavidin-HRP، Novus NB120-7239) سان لڳايو ويو.ٽن ڌوئڻ جي قدمن کان پوء، اسٽريپٽاوڊين کي 20 منٽ تائين TMB سبسٽٽ حل (Roche) ۾ انڪيوبيشن ذريعي معلوم ڪيو ويو.1M H2SO4 سان رنگ جي ترقي کي روڪڻ کان پوء، 450 nm تي جذب کي ماپ ڪريو.
streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor ڪمپليڪس جي ڪارڪردگي جو جائزو ورتو ويو Aβ (1-40) ELISA پاران ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول جي مطابق (وڪو، 294-64701).مختصر طور تي، CSF جا نمونا معياري ڊيلوئنٽ (1:23) ۾ ملائي ويا ۽ 4 ° C تي رات جو 96-Well پليٽن ۾ BNT77 ڪيپچر اينٽي باڊي سان گڏ ٿيل هئا.ڌوئڻ جي پنجن مرحلن کان پوءِ، HRP-conjugated BA27 اينٽي باڊي شامل ڪئي وئي ۽ 2 ڪلاڪن لاءِ 4 ° C. تي انڪيوبيو ويو، ان کان پوءِ پنج ڌوئڻ جا قدم.Aβ (1-40) 30 منٽن تائين ڪمري جي حرارت تي TMB حل ۾ انڪيوبيشن ذريعي معلوم ڪيو ويو.اسٽاپ حل سان رنگ جي ترقي کي روڪيو ويو آهي، 450 nm تي جذب کي ماپ ڪريو.Aβ(1-40) ELISA کان اڳ پلازما جا نمونا مضبوط مرحلن جي نڪرڻ جي تابع هئا.پلازما 0.2٪ DEA (Sigma) ۾ 96-سٺي پليٽن ۾ شامل ڪيو ويو ۽ 30 منٽن لاء ڪمري جي حرارت تي incubated.SPE پليٽس (Oasis, 186000679) کي مسلسل پاڻي ۽ 100% ميٿانول سان ڌوئڻ کان پوءِ، پلازما جا نمونا SPE پليٽن ۾ شامل ڪيا ويا ۽ سمورو مائع ڪڍيو ويو.نمونا ڌوئي ويا (پهرين 5٪ ميٿانول سان پوءِ 30٪ ميٿانول) ۽ 2٪ NH4OH / 90٪ ميٿانول سان ڀريل.مسلسل N2 ڪرنٽ تي 55 ° C تي 99 منٽ لاء ايليويٽ کي خشڪ ڪرڻ کان پوء، نمونا گهٽجي ويا معياري ڊيلوئنٽس ۾ ۽ Aβ (1-40) ماپ ڪئي وئي جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي.
هن مضمون جو حوالو ڪيئن ڏيو: Urich, E. et al.وييو ۾ سڃاڻپ ٽرانزٽ پيپٽائڊس استعمال ڪندي دماغ تائين سامان پهچائڻ.سائنس.5، 14104؛doi: 10.1038/srep14104 (2015).
لکوتا J.، Skjorringe T.، Thomsen LB ۽ Moos T. ٽارگيٽ ٿيل علاج استعمال ڪندي دماغ ۾ ميڪروموليڪيولر دوائن جي پهچائڻ.جرنل آف نيورو ڪيمسٽري 113، 1-13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. رت جي دماغ جي رڪاوٽ جي وچ ۾ پيپٽائڊ ۽ پروٽين جي دوائن جي پهچائڻ.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
پرڊريج، WM رت جي دماغ جي رڪاوٽ: دماغ جي دوا جي ترقي ۾ هڪ رڪاوٽ.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. بهتر منشيات جي ترسيل لاءِ امڪان ۽ دماغ کي ھدف ڪرڻ choroid plexus-CSF رستي ذريعي.دواسازي ريسرچ 22، 1011-1037، 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
پرڊريج، دماغ جي ترسيل لاءِ ماليڪيولر ٽروجن گھوڙن سان گڏ بائيو دواسازي جي WM جديديت.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
پرڊريج، WM ريڪٽر-ثالث پيپٽائڊ ٽرانسپورٽ رت جي دماغ جي رڪاوٽ ۾.Endocr Rev. 7، 314-330 (1986).
نيووينر، جي وغيره.دماغ جي دخول کي وڌايو ۽ علاج واري اينٽي باڊيز جي افاديت کي استعمال ڪندي monovalent ماليڪيولر شٽل.نيورون 81، 49-60، 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بيئن-لي، اين وغيره.Transferrin receptor (TfR) ٽرانسپورٽ TfR اينٽي باڊيز جي لاڳاپي وارين قسمن جي دماغي اپٽيڪ کي طئي ڪري ٿي.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).