Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.برائوزر جو نسخو توهان استعمال ڪري رهيا آهيو محدود CSS سپورٽ آهي.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).ساڳئي وقت ۾، مسلسل حمايت کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ پيش ڪنداسين.
Liquid biopsy (LB) ھڪڙو تصور آھي جيڪو تيزيء سان بايوميڊيڪل فيلڊ ۾ مقبوليت حاصل ڪري رھيو آھي.اهو تصور بنيادي طور تي گردش ڪندڙ extracellular DNA (ccfDNA) جي ٽڪرن جي ڳولا تي مبني آهي، جيڪي بنيادي طور تي مختلف بافتن ۾ سيل جي موت کان پوء ننڍن ٽڪرن جي طور تي جاري ڪيا ويا آهن.انهن ٽڪرن جو هڪ ننڍڙو حصو خارجي (پرڏيهي) بافتن يا جاندارن مان نڪرندو آهي.موجوده ڪم ۾، اسان هن تصور کي mussels تي لاڳو ڪيو آهي، هڪ موڪليل نسل جيڪي انهن جي اعلي سامونڊي پاڻي جي فلٽريشن جي صلاحيت لاء مشهور آهن.اسان مڇين جي صلاحيت کي قدرتي فلٽر طور ڪم ڪرڻ لاءِ استعمال ڪندا آهيون مختلف ذريعن کان ماحولياتي ڊي اين اي جي ٽڪرن کي پڪڙڻ لاءِ ته جيئن سامونڊي ساحلي ماحوليات جي حياتياتي تنوع بابت معلومات مهيا ڪري سگهجي.اسان جا نتيجا ظاھر ڪن ٿا ته mussel hemolymph ۾ DNA جا ٽڪرا آھن جن جي سائيز ۾ تمام گھڻو فرق آھي، 1 کان 5 kb تائين.شاٽگن جي ترتيب ڏيکاري ٿي ته ڊي اين اي ٽڪرن جو وڏو تعداد غير ملڪي مائڪروبيل اصل جا آهن.انهن مان، اسان کي بيڪٽيريا، آرڪيا ۽ وائرس مان ڊي اين اي جا ٽڪرا مليا آهن، جن ۾ وائرس شامل آهن جيڪي مختلف قسم جي ميزبان کي متاثر ڪن ٿا عام طور تي ساحل سمندري ماحولياتي نظام ۾ مليا آهن.نتيجي ۾، اسان جي مطالعي مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته LB جو تصور mussels تي لاڳو ڪيو ويو آهي هڪ اميرن جي نمائندگي ڪري ٿو پر اڃا تائين ڄاڻ جو اڻ ڄاتل ذريعو سامونڊي ساحلي ماحولياتي نظام ۾ مائڪروبيل تنوع بابت.
آبهوا جي تبديليءَ جو اثر (CC) سامونڊي ماحوليات جي حياتياتي تنوع تي تحقيق جو هڪ تيزيءَ سان وڌندڙ علائقو آهي.گلوبل وارمنگ نه رڳو اهم جسماني دٻاءُ جو سبب بڻجندي آهي، پر سامونڊي جاندارن جي حرارتي استحڪام جي ارتقائي حدن کي پڻ ڌڪيندي آهي، ڪيترن ئي نسلن جي رهائش کي متاثر ڪندي، انهن کي وڌيڪ سازگار حالتن جي ڳولا لاءِ ترغيب ڏيندي آهي [1, 2].Metazoans جي جيو تنوع کي متاثر ڪرڻ کان علاوه، سي سي ميزبان-مائڪروبيل رابطي جي نازڪ توازن کي خراب ڪري ٿو.هي مائڪروبيل ڊيس بيڪٽيرياسس سامونڊي ماحوليات لاءِ هڪ سنگين خطرو بڻيل آهي ڇاڪاڻ ته اهو سامونڊي جاندارن کي متاثر ٿيندڙ پيٿوجنز لاءِ وڌيڪ حساس بڻائي ٿو [3, 4].اهو يقين آهي ته ايس ايس ڪاميٽي جي موت ۾ هڪ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو، جيڪو عالمي سامونڊي ماحولياتي نظام جي انتظام لاء هڪ سنگين مسئلو آهي [5, 6].اهو هڪ اهم مسئلو آهي جنهن کي ڪيترن ئي سامونڊي نسلن جي معاشي، ماحولياتي ۽ غذائي اثرات ڏني وئي آهي.اهو خاص طور تي پولار علائقن ۾ رهندڙ بائولز لاء صحيح آهي، جتي سي جي اثرات وڌيڪ فوري ۽ سخت آهن [6, 7].حقيقت ۾، bivalves جهڙوڪ Mytilus spp.وڏي پيماني تي سامونڊي ماحولياتي نظام تي سي سي جي اثرات جي نگراني ڪرڻ لاء استعمال ڪيا ويا آهن.تعجب جي ڳالهه ناهي ته، انهن جي صحت جي نگراني ڪرڻ لاء هڪ نسبتا وڏي تعداد ۾ بائيو مارڪرز ٺاهيا ويا آهن، اڪثر ڪري هڪ ٻه-ٽيئر طريقي سان استعمال ڪندي فنڪشنل بائيو مارڪرز شامل آهن اينزيميٽڪ سرگرمي جي بنياد تي يا سيلولر افعال جهڙوڪ سيل وابستگي ۽ فاگوسيٽڪ سرگرمي [8].انهن طريقن ۾ خاص دٻاءُ جي اشارن جي ڪنسنٽريشن جي ماپ پڻ شامل آهي جيڪي سمنڊ جي پاڻيءَ جي وڏي مقدار کي جذب ڪرڻ کان پوءِ نرم بافتن ۾ جمع ٿين ٿا.تنهن هوندي به، اعلي فلٽريشن جي صلاحيت ۽ بائيوولوز جو نيم کليل گردشي نظام مائع بايوپسي (LB) جي تصور کي استعمال ڪندي نئين هيموليف بائيو مارڪرز کي ترقي ڪرڻ جو موقعو فراهم ڪري ٿو، مريض جي انتظام لاء هڪ سادي ۽ گهٽ ۾ گهٽ ناپسنديده طريقو.رت جا نمونا [9، 10].جيتوڻيڪ ڪيترن ئي قسمن جا گردشي ماليڪيول انساني LB ۾ ڳولي سگهجن ٿا، اهو تصور بنيادي طور تي پلازما ۾ گردش ڪندڙ extracellular DNA (ccfDNA) ٽڪرن جي ڊي اين اي تسلسل جي تجزيي تي ٻڌل آهي.درحقيقت، انساني پلازما ۾ گردش ڪندڙ ڊي اين اي جي موجودگي 20 صدي جي وچ کان معلوم ٿي چڪي آهي [11]، پر اهو صرف تازو سالن ۾ آهي ته اعلي-ذريعي ترتيب جي طريقن جي آمد ccfDNA جي بنياد تي ڪلينڪ تشخيص جو سبب بڻيو آهي.انهن گردش ڪندڙ ڊي اين اي جي ٽڪڙن جي موجودگي جزوي طور سيل جي موت کان پوءِ جينومڪ ڊي اين اي (ايٽمي ۽ مائيٽوڪونڊريل) جي غير فعال ڇڏڻ جو سبب آهي. صحتمند ماڻهن ۾، ccfDNA جو ڪنسنٽريشن عام طور تي گهٽ هوندو آهي (<10 ng/mL) پر 5-10 ڀيرا وڌائي سگهجي ٿو مريضن ۾ جيڪي مختلف بيمارين ۾ مبتلا آهن يا دٻاءُ جو شڪار آهن، نتيجي ۾ ٽشوز کي نقصان پهچي ٿو. صحتمند ماڻهن ۾، ccfDNA جو ڪنسنٽريشن عام طور تي گهٽ هوندو آهي (<10 ng/mL) پر 5-10 ڀيرا وڌائي سگهجي ٿو مريضن ۾ جيڪي مختلف بيمارين ۾ مبتلا آهن يا دٻاءُ جو شڪار آهن، نتيجي ۾ ٽشوز کي نقصان پهچي ٿو. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл)، но может повышаться в 5-10 раз у больный низкая ергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. صحتمند ماڻهن ۾، cccDNA جو ڪنسنٽريشن عام طور تي گهٽ هوندو آهي (<10 ng/mL)، پر اهو مريضن ۾ 5-10 ڀيرا وڌي سگهي ٿو جن ۾ مختلف بيماريون آهن يا دٻاءُ هيٺ آهن جيڪي ٽشوز کي نقصان پهچائين ٿا.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力渂受度通从而导致组织损伤.在 健康 个体中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受受択叀叀或承受莗5-10 倍، 从而 组织。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцентрации в 10 нг/мл или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA ڪنسنٽريشن عام طور تي صحتمند ماڻهن ۾ گهٽ (<10 ng/ml) هوندو آهي، پر مختلف بيمارين يا دٻاءُ وارن مريضن ۾ 5-10-گنا وڌائي سگهجي ٿو، جنهن جي نتيجي ۾ ٽشوز کي نقصان پهچي ٿو.ccfDNA ٽڪرن جي سائيز وڏي پيماني تي مختلف آهي، پر عام طور تي 150 کان 200 bp تائين.[12].خود نڪتل ccfDNA جو تجزيو، يعني، ccfDNA عام يا تبديل ٿيل ميزبان سيلن مان، استعمال ڪري سگھجي ٿو جينياتي ۽ ايپيگينيٽڪ تبديلين جو پتو لڳائڻ لاءِ ايٽمي ۽/يا mitochondrial جينوم، ان ڪري ڪلينڪ جي مدد سان مخصوص ماليڪيولر-ٽارگيٽ ٿيل علاج چونڊيندا آهن [13].بهرحال، ccfDNA پرڏيهي ذريعن کان حاصل ڪري سگهجي ٿو جهڙوڪ ccfDNA حمل دوران جنين جي سيلن مان يا ٽرانسپلانٽ ٿيل عضون مان [14,15,16,17].ccfDNA هڪ انفيڪشن ايجنٽ (پرڏيهي) جي نيوڪليڪ ايسڊز جي موجودگي کي ڳولڻ لاءِ معلومات جو هڪ اهم ذريعو پڻ آهي، جيڪو رت جي ثقافتن جي نشاندهي نه ڪيل وسيع انفيڪشن جي غير ناگوار سڃاڻپ جي اجازت ڏئي ٿو، متاثر ٿيل ٽشوز جي ناگوار بايپسي کان پاسو ڪري ٿو [18].تازيون اڀياس حقيقت ۾ ڏيکاريا آهن ته انساني رت ۾ معلومات جو هڪ وسيع ذريعو آهي جيڪو وائرل ۽ بيڪٽيريا جي پيٿوجنز کي سڃاڻڻ لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو، ۽ انساني پلازما ۾ مليل ccfDNA جو اٽڪل 1٪ غير ملڪي آهي [19].انهن مطالعي مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته هڪ عضوي جي گردش ڪندڙ مائڪروبيوم جي جيو تنوع جو اندازو لڳائي سگهجي ٿو ccfDNA تجزيو استعمال ڪندي.بهرحال، تازو تائين، اهو تصور خاص طور تي انسانن ۾ استعمال ڪيو ويو ۽، گهٽ حد تائين، ٻين vertebrates ۾ [20، 21].
موجوده پيپر ۾، اسان ايل بي جي صلاحيت استعمال ڪريون ٿا ccfDNA جو تجزيو ڪرڻ لاءِ Aulacomya atra، هڪ ڏاکڻي نسل عام طور تي subantarctic Kerguelen Islands ۾ ملي ٿي، ٻيٽن جو هڪ گروپ جيڪو 35 ملين سال اڳ ٺهي هڪ وڏي پليٽ تي آهي.ٻرندڙ ڦاٽڻ.هڪ ان ويٽرو تجرباتي نظام کي استعمال ڪندي، اسان ڏٺو ته سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ ڊي اين اي جا ٽڪرا تيزيءَ سان ڪچرو کڻي ويندا آهن ۽ هيموليف جي خاني ۾ داخل ٿيندا آهن.شاٽگن جي ترتيب ڏيکاريو ويو آهي ته mussel hemolymph ccfDNA ان جي پنهنجي ۽ غير خود اصل جي ڊي اين اي ٽڪرن تي مشتمل آهي، جنهن ۾ symbiotic بيڪٽيريا ۽ DNA جا ٽڪرا شامل آهن بائيومس مان عام طور تي ٿڌي آتش فشاني سامونڊي ساحلي ماحولي نظام جي.Hemolymph ccfDNA ۾ مختلف ميزبان رينجز سان وائرس مان نڪتل وائرل تسلسل پڻ شامل آهن.اسان کي ملٽي سيلولر جانورن مان ڊي اين اي جا ٽڪرا پڻ مليا آهن جهڙوڪ هڏن جي مڇي، سامونڊي اينيمون، الجي ۽ حشرات.نتيجي ۾، اسان جي مطالعي مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته LB تصور کي ڪاميابيء سان لاڳو ڪري سگهجي ٿو سامونڊي غير مقناطيس تي هڪ اميرن جينوميڪ ريپرٽويئر پيدا ڪرڻ لاء سامونڊي ماحولياتي نظام ۾.
بالغ (55-70 ملي ميٽر ڊگھا) Mytilus platensis (M. platensis) ۽ Aulacomya atra (A. atra) پورٽ-او-فرانس (049°21.235 S, 070°13.490 E.) جي وچ واري پٿر واري سامونڊي ڪناري کان گڏ ڪيا ويا.Kerguelen Islands ڊسمبر 2018 ۾. ٻيا بالغ نيري مڇيون (Mytilus spp.) هڪ ڪمرشل سپلائر (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) کان حاصل ڪيون ويون ۽ درجه حرارت تي ڪنٽرول ٿيل (4°C) هواي ٽانڪي ۾ رکيا ويا جنهن ۾ 10-20 L جي 32‰ مصنوعي برائن شامل آهن.(مصنوعي سامونڊي لوڻ ريف ڪرسٽل، فوري سمنڊ، ورجينيا، آمريڪا).هر تجربن لاء، انفرادي شيل جي ڊيگهه ۽ وزن ماپ ڪئي وئي.
هن پروگرام لاءِ هڪ مفت اوپن رسائي پروٽوڪول آن لائن دستياب آهي (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).مختصر طور تي، LB hemolymph اغوا ڪندڙ عضلات مان گڏ ڪيو ويو جيئن بيان ڪيو ويو [22].hemolymph 1200×g تي سينٽرفيوگريشن ذريعي 3 منٽن لاءِ واضح ڪيو ويو، سپرنٽنٽ استعمال ٿيڻ تائين منجمد (-20 ° C) ڪيو ويو.cfDNA جي اڪيلائي ۽ صفائي لاءِ، ٺاهيندڙن جي هدايتن موجب نمونا (1.5-2.0 ml) NucleoSnap cfDNA ڪٽ (Macherey-Nagel، Bethlehen، PA) استعمال ڪندي گل ڪيا ويا ۽ پروسيس ڪيا ويا.وڌيڪ تجزيي تائين ccfDNA -80 ° C تي محفوظ ڪيو ويو.ڪجھ تجربن ۾، ccfDNA کي QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN، Toronto، Ontario، ڪينيڊا) استعمال ڪندي الڳ ۽ صاف ڪيو ويو.صاف ٿيل ڊي اين اي معياري پيڪو گرين پرازم استعمال ڪندي مقدار جي تصديق ڪئي وئي.الڳ ٿيل ccfDNA جي ٽڪرا ورهائڻ جو تجزيو ڪيو ويو ڪيپيلري اليڪٽرروفورسس استعمال ڪندي هڪ Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) استعمال ڪندي هڪ اعلي حساسيت ڊي اين اي کٽ.CCfDNA نموني جي 1 µl استعمال ڪندي ڪارڪردگي جي هدايتن مطابق ڪيو ويو.
hemolymph ccfDNA ٽڪرن جي تسلسل لاءِ، Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) Illumina MiSeq PE75 کٽ جي Illumina DNA Mix کٽ استعمال ڪندي شاٽگن لائبريريون تيار ڪيون.هڪ معياري اڊاپٽر (BioO) استعمال ڪيو ويو.خام ڊيٽا فائلون موجود آهن NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ۽ SRR8924809).FastQC استعمال ڪندي بنيادي پڙهڻ جي معيار جو جائزو ورتو ويو [23].Trimmomatic [24] استعمال ڪيو ويو آهي ڪلپنگ اڊاپٽرز ۽ غريب معيار پڙهڻ لاء.شاٽگن ريڊز سان جوڙيل سرن کي FLASH کي ضم ڪيو ويو ھو ڊگھي سنگل ريڊز ۾ گھٽ ۾ گھٽ 20 بي پي جي اوورليپ سان بي ميل ٿيڻ کان بچڻ لاءِ [25]. ضم ٿيل پڙھڻ کي BLASTN سان بيان ڪيو ويو ھڪڙو bivalve NCBI Taxonomy ڊيٽابيس استعمال ڪندي (e value <1e−3 ۽ 90% homology)، ۽ گھٽ پيچيدگي واري ترتيبن جي نقاب کي DUST استعمال ڪندي ڪيو ويو [26]. ضم ٿيل پڙھڻ کي BLASTN سان بيان ڪيو ويو ھڪڙو bivalve NCBI Taxonomy ڊيٽابيس استعمال ڪندي (e value <1e−3 ۽ 90% homology)، ۽ گھٽ پيچيدگي واري ترتيبن جي نقاب کي DUST استعمال ڪندي ڪيو ويو [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчативых двустворчатых и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. پولڊ ريڊس BLASTN سان NCBI بائيليو ٽيڪونومي ڊيٽابيس استعمال ڪندي بيان ڪيا ويا (e value <1e-3 ۽ 90٪ هومولوجي)، ۽ گھٽ پيچيدگي واري ترتيب ماسڪنگ کي استعمال ڪيو ويو DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值<1e-3复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合并 读湰 读湰 合并 读湰 ，st 迡湰]复杂度 序列 的.. 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных были -3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. پولڊ ريڊس BLASTN سان NCBI bivalve ٽيڪونومڪ ڊيٽابيس استعمال ڪندي بيان ڪيا ويا (e value <1e-3 ۽ 90٪ homology)، ۽ گھٽ پيچيدگي واري ترتيب ماسڪنگ DUST استعمال ڪندي ڪئي وئي [26].پڙھندڙن کي ٻن گروپن ۾ ورهايو ويو آھي: bivalve sequences سان لاڳاپيل (هتي پاڻ کي پڙھيو ويندو آھي) ۽ غير لاڳاپيل (غير خود پڙھڻ).ٻن گروپن کي الڳ الڳ گڏ ڪيو ويو MEGAHIT استعمال ڪندي contigs پيدا ڪرڻ لاء [27].ان کان علاوه، اجنبي مائڪروبيوم ريڊس جي ٽيڪسونومڪ ورڇ Kraken2 استعمال ڪندي درجه بندي ڪئي وئي [28] ۽ گرافڪ طور تي گليڪس تي ڪرونا پائي چارٽ جي نمائندگي ڪئي وئي [29, 30].اسان جي ابتدائي تجربن مان ڪيمرز-59 ٿيڻ لاءِ بهترين ڪلوميٽر مقرر ڪيو ويو. خود ڪنٽيگس پوءِ BLASTN (bivalve NCBI ڊيٽابيس، e value < 1e−10 ۽ 60% homology) سان ترتيب ڏنل حتمي تشريح لاءِ سڃاڻپ ڪئي وئي. خود ڪنٽيگس پوءِ BLASTN (bivalve NCBI ڊيٽابيس، e value < 1e−10 ۽ 60% homology) سان ترتيب ڏنل حتمي تشريح لاءِ سڃاڻپ ڪئي وئي. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых, e омология 60%) для окончательной аннотации. پوءِ خود ڪنٽيگس جي سڃاڻپ ڪئي وئي BLASTN (NCBI bivalve ڊيٽابيس، e value <1e-10 ۽ 60% homology) جي مقابلي ۾ حتمي تشريح لاءِ.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库،e 值<1e-10终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库،e 值<1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (bazat моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTN (NCBI bivalve ڊيٽابيس، e value <1e-10 ۽ 60% homology) جي مقابلي ۾ پاڻمرادو ڪانٽيگس پوءِ حتمي تشريح لاءِ سڃاڻپ ڪئي وئي. متوازي طور تي، غير خودمختاري گروپ جي مقابلي ۾ BLASTN (nt NCBI ڊيٽابيس، اي قدر <1e−10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان تشريح ڪئي وئي. متوازي طور تي، غير خودمختاري گروپ جي مقابلي ۾ BLASTN (nt NCBI ڊيٽابيس، اي قدر <1e−10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان تشريح ڪئي وئي. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI، значение e <1e-10%06могиология). متوازي طور تي، غير ملڪي گروپ جي مقابلي ۾ BLASTN (NT NCBI ڊيٽابيس، اي قدر <1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان تشريح ڪئي وئي.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值<1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值<1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, e.g.1. 60 سيڪڙو). متوازي طور تي، غير خود گروپ جي مقابلي ۾ BLASTN (nt NCBI ڊيٽابيس، اي قدر <1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان تشريح ڪئي وئي. BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq پروٽين NCBI ڊيٽابيس استعمال ڪندي غير خود مختيار تي منعقد ڪئي وئي (اي قدر <1e−10 ۽ 60٪ هومولوجي). BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq پروٽين NCBI ڊيٽابيس استعمال ڪندي غير خود مختيار تي منعقد ڪئي وئي (اي قدر <1e−10 ۽ 60٪ هومولوجي). BLASTX ٽاڪس был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq NCBI پروٽين ڊيٽابيس (e value <1e-10 ۽ 60٪ homology) استعمال ڪندي غير خود مختيار تي ڪيو ويو.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e %01.06). BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq NCBI پروٽين ڊيٽابيس (e value <1e-10 ۽ 60٪ homology) استعمال ڪندي غير خود مختيار تي پڻ ڪيو ويو.BLASTN ۽ BLASTX تلاءَ نان سيلف ڪانٽيگس جي نمائندگي ڪن ٿا فائنل ڪنٽيگس (ڏسو ضمني فائل).
PCR لاءِ استعمال ٿيل پرائمر ٽيبل S1 ۾ درج ٿيل آھن.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) استعمال ڪيو ويو ccfDNA ٽارگيٽ جين کي وڌائڻ لاءِ.هيٺيون رد عمل جون حالتون استعمال ڪيون ويون: 95 ° C تي 3 منٽن لاءِ، 1 منٽ لاءِ 95 ° C تي، 1 منٽ لاءِ annealing گرمي پد مقرر ڪريو، 1 منٽ لاءِ 72 ° C تي ڊگھائي، 35 cycles، ۽ آخر ۾ 10 منٽن اندر 72 ° C..PCR پروڊڪٽس کي اليڪٽرروفورسز ذريعي ايگرز جيل (1.5٪) ۾ الڳ ڪيو ويو جنهن ۾ SYBRTM سيف ڊي اين اي جيل اسٽين (انوٽروجن، برلنگٽن، آن، ڪئناڊا) 95 V تي.
4 ڊگري سينٽي گريڊ تي 24 ڪلاڪن لاءِ 500 مليل آڪسيجن واري سمنڊ جي پاڻيءَ (32 PSU) ۾ ميسلز (Mytilus spp.) کي ترتيب ڏنو ويو.Plasmid DNA جنهن ۾ انساني galectin-7 cDNA sequence (NCBI Accession Number L07769) کي انڪوڊنگ ۾ داخل ڪيو ويو ان کي 190 μg/μl جي آخري ڪنسنٽريشن تي شيشي ۾ شامل ڪيو ويو.ڊي اين اي جي اضافي کان سواءِ ساڳين حالتن هيٺ پکڙيل مشڪون ڪنٽرول هئا.ٽيون ڪنٽرول ٽينڪ بغير ڊي اين اي تي مشتمل آهي.سمنڊ جي پاڻي ۾ ڊي اين اي جي معيار کي مانيٽر ڪرڻ لاء، سمنڊ جي پاڻي جا نمونا (20 μl؛ ٽي ورهاڱي) هر ٽينڪ مان ورتو ويو وقت تي.پلاسميڊ ڊي اين اي جي پيچيدگي لاء، LB مشڪون ظاهر ڪيل وقتن تي گڏ ڪيا ويا ۽ qPCR ۽ ddPCR پاران تجزيو ڪيو ويو.سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ لوڻ جي وڏي مقدار جي ڪري، PCR جي معيار واري پاڻيءَ (1:10) ۾ aliquots کي تمام PCR assays کان اڳ ملائي ڇڏيو ويو.
ڊجيٽل بوند پي سي آر (ddPCR) استعمال ڪيو ويو BioRad QX200 پروٽوڪول (مسيساگا، اونٽاريو، ڪئناڊا).وڌ ۾ وڌ درجه حرارت کي طئي ڪرڻ لاء درجه حرارت پروفائل استعمال ڪريو (ٽيبل S1).قطرا هڪ QX200 ڊراپ جنريٽر (BioRad) استعمال ڪندي ٺاهيا ويا.ddPCR هن ريت ڪيو ويو: 5 منٽ لاءِ 95 ° سي، 50 چڪر 95 ° سي 30 سيڪنڊن لاءِ ۽ ڏنل اينيلنگ گرمي پد 1 منٽ لاءِ ۽ 72 ° سي 30 سيڪنڊن لاءِ، 5 منٽ لاءِ 4 °C ۽ 90 ° سي 5 منٽن اندر.قطرن جو تعداد ۽ مثبت رد عمل (ڪاپين جو تعداد/µl) هڪ QX200 ڊراپ ريڊر (BioRad) استعمال ڪندي ماپيو ويو.10,000 کان گهٽ بوندن جا نمونا رد ڪيا ويا.هر دفعي ڊي پي سي آر هلائڻ دوران پيٽرن ڪنٽرول نه ڪيو ويو.
qPCR روٽر-جين® 3000 (ڪوربيٽ ريسرچ، سڊني، آسٽريليا) ۽ LGALS7 مخصوص پرائمر استعمال ڪندي ڪيو ويو.QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) استعمال ڪندي سڀ مقداري PCRs 20 μl ۾ ڪيا ويا.qPCR 95 ° C تي 15 منٽ انڪيوبيشن سان شروع ڪيو ويو جنهن بعد 40 سائيڪلون 95 ° C تي 10 سيڪنڊن لاءِ ۽ 60 ° C تي 60 سيڪنڊن لاءِ هڪ ڊيٽا گڏ ڪرڻ سان.پگھلڻ وارا وکر 95 ° C تي لڳاتار ماپون استعمال ڪندي 5 s لاءِ، 65 ° C 60 s لاءِ، ۽ qPCR جي آخر ۾ 97 ° C تي ٺاهيا ويا.هر qPCR ٽنهي ۾ ڪيو ويو، سواء ڪنٽرول نموني کان سواء.
جيئن ته mussels انهن جي اعلي فلٽريشن جي شرح جي ڪري سڃاتل آهن، اسان پهرين تحقيق ڪئي ته ڇا اهي سمنڊ جي پاڻي ۾ موجود ڊي اين اي ٽڪرن کي فلٽر ۽ برقرار رکي سگهن ٿا.اسان کي پڻ دلچسپي هئي ته ڇا اهي ٽڪرا انهن جي نيم کليل لففيڪ سسٽم ۾ جمع ٿين ٿا.اسان هن مسئلي کي تجرباتي طور حل ڪيو آهي حل ٿيندڙ ڊي اين اي جي ٽڪڙن جي قسمت جو پتو لڳائڻ سان جيڪو نيري مسل ٽينڪن ۾ شامل ڪيو ويو آهي.ڊي اين اي جي ٽڪرن جي ٽريڪنگ کي آسان ڪرڻ لاءِ، اسان غير ملڪي (نه خود) پلازميڊ ڊي اين اي استعمال ڪيو جنهن ۾ انساني گليڪٽين-7 جين شامل آهي.ddPCR سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ پلاسمڊ ڊي اين اي جا ٽڪرا ۽ پٿرن کي ڳولي ٿو.اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته جيڪڏهن سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ ڊي اين اي جي ٽڪرن جو مقدار وقت سان گڏ (7 ڏينهن تائين) مشڪن جي غير موجودگيءَ ۾ نسبتاً برقرار رهيو ته پوءِ مشڪن جي موجودگيءَ ۾ اها سطح تقريباً 8 ڪلاڪن اندر مڪمل طور تي غائب ٿي وئي (تصوير 1a,b).خارجي ڊي اين اي جا ٽڪرا آسانيءَ سان 15 منٽن اندر intravalvular fluid ۽ hemolymph (Fig. 1c) ۾ ڳوليا ويا.اهي ٽڪرا اڃا تائين ظاهر ٿيڻ کان پوء 4 ڪلاڪن تائين ڳولي سگهجن ٿا.ڊي اين اي جي ٽڪرن جي حوالي سان هي فلٽرنگ سرگرمي بيڪٽيريا ۽ الگا جي فلٽرنگ سرگرمي جي مقابلي ۾ آهي [31].انهن نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته مچيل خارجي ڊي اين اي کي فلٽر ڪري سگهن ٿا ۽ جمع ڪري سگهن ٿا انهن جي سيال حصن ۾.
سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ پلاسمڊ ڊي اين اي جي نسبتي ڪنسنٽريشن (A) يا مشڪن جي غير موجودگي (B) ۾، ڊي پي سي آر پاران ماپيل.A ۾، نتيجن کي سيڪڙو طور بيان ڪيو ويو آهي، باڪس جي سرحدن سان 75th ۽ 25th سيڪڙو جي نمائندگي ڪن ٿا.نصب ٿيل لاگارٿمڪ وکر ڳاڙهي ۾ ڏيکاريل آهي، ۽ سرمائي ۾ ڇانو ٿيل علائقو 95٪ اعتماد جي وقفي جي نمائندگي ڪري ٿو.B ۾، ڳاڙهي لڪير مطلب جي نمائندگي ڪري ٿي ۽ نيري لڪير ڪنسنٽريشن لاءِ 95٪ اعتماد جي وقفي جي نمائندگي ڪري ٿي.C hemolymph ۾ پلاسميڊ ڊي اين اي جو جمع ٿيڻ ۽ پلاسميڊ ڊي اين اي جي اضافي کان پوءِ مختلف وقتن تي مشڪن جي والوولر سيال.نتيجا پيش ڪيا ويا آهن مڪمل ڪاپيون ڳوليل / ايم ايل (±SE).
اڳيون، اسان ccfDNA جي اصليت جي تحقيق ڪئي ڪرگيولين ٻيٽ تي ميسل بسترن مان گڏ ڪيل mussels ۾، جزائر جو هڪ دور دراز گروپ محدود انسٿروپجنڪ اثر سان.هن مقصد لاء، mussel hemolymphs کان cccDNA کي الڳ ڪيو ويو ۽ طريقن سان صاف ڪيو ويو عام طور تي انساني cccDNA کي صاف ڪرڻ لاء استعمال ڪيو ويو [32, 33].اسان کي معلوم ٿيو آهي ته مشڪن ۾ سراسري هيموليمف ccfDNA ڪنسنٽريشن گهٽ مائڪروگرامس في مليل هيموليف رينج ۾ آهي (ڏسو ٽيبل S2، ضمني معلومات).مرڪب جي اها حد صحتمند ماڻهن جي ڀيٽ ۾ تمام گهڻي آهي (گهٽ نانوگرام في ملي ليٽر)، پر نادر ڪيسن ۾، ڪينسر جي مريضن ۾، سي سي ايف ڊي اين اي جي سطح ڪيترن ئي مائڪروگرام في ملي ليٽر تائين پهچي سگهي ٿي [34, 35].Hemolymph ccfDNA جي ماپ جي ورڇ جي تجزيي مان معلوم ٿئي ٿو ته اهي ٽڪرا سائيز ۾ تمام گهڻو مختلف آهن، 1000 bp کان 1000 bp تائين.5000 بي پي تائين (تصوير 2).ساڳيا نتيجا حاصل ڪيا ويا سليڪا تي ٻڌل QIAamp Investigator Kit، هڪ طريقو عام طور تي فارنزڪ سائنس ۾ استعمال ڪيو ويو آهي تيزيءَ سان جينومڪ ڊي اين اي کي تيزيءَ سان الڳ ڪرڻ ۽ صاف ڪرڻ لاءِ گهٽ ڪنسنٽريشن ڊي اين اي نمونن، بشمول ccfDNA [36].
نمائندو ccfDNA اليڪٽرروفورگرام جو mussel hemolymph.NucleoSnap پلازما کٽ (مٿي) ۽ QIAamp ڊي اين اي تحقيقاتي کٽ سان ڪڍيو ويو.B وائلن پلاٽ مشلز ۾ hemolymph ccfDNA ڪنسنٽريشن (±SE) جي ورڇ ڏيکاريندي.ڪارا ۽ ڳاڙهي لائينون، ترتيب سان وچين ۽ پھريون ۽ ٽيون چوٿين جي نمائندگي ڪن ٿيون.
تقريبن 1٪ ccfDNA انسانن ۽ پرائمٽس ۾ هڪ غير ملڪي ذريعو آهي [21, 37].bivalves جي نيم کليل گردشي سرشتي، مائڪروبيل سان مالا مال سامونڊي پاڻي، ۽ mussel ccfDNA جي ماپ جي ورڇ کي نظر ۾ رکندي، اسان اهو سمجهيو ته mussel hemolymph ccfDNA شايد مائڪروبيل ڊي اين اي جو هڪ امير ۽ متنوع تلاءُ تي مشتمل هجي.هن مفروضي کي جانچڻ لاءِ، اسان ڪرگيولين ٻيٽن مان گڏ ڪيل Aulacomya atra نموني مان hemolymph ccfDNA ترتيب ڏني، 10 ملين کان وڌيڪ پڙهيا، جن مان 97.6٪ معيار ڪنٽرول پاس ڪيو.پڙھندڙن کي پوءِ BLASTN ۽ NCBI bivalve ڊيٽابيس (Fig. S1، ضمني معلومات) استعمال ڪندي خود ۽ غير خود ذريعن جي مطابق درجه بندي ڪئي وئي.
انسانن ۾، ايٽمي ۽ ميڪوڪونڊريل ڊي اين اي ٻنهي کي رت جي وهڪري ۾ آزاد ڪري سگهجي ٿو [38].بهرحال، موجوده مطالعي ۾، اهو ممڪن نه هو ته تفصيل سان بيان ڪرڻ لاء ائٽمي جينومڪ ڊي اين اي mussels، ڏنو ويو آهي ته A. atra جينوم ترتيب يا بيان نه ڪيو ويو آهي.بهرحال، اسان bivalve لائبريري (Fig. S2، ضمني معلومات) استعمال ڪندي اسان جي پنهنجي اصل جي ڪيترن ئي ccfDNA ٽڪرن کي سڃاڻڻ جي قابل ٿي ويا.اسان پڻ تصديق ڪئي ته اسان جي پنهنجي اصليت جي ڊي اين اي ٽڪرن جي موجودگي جي هدايت ڪئي PCR ايمپليفڪيشن انهن A. atra genes جي ترتيب سان (Fig. 3).اهڙي طرح، ڏنو ويو آهي ته A. atra جو mitochondrial جينوم عوامي ڊيٽابيس ۾ موجود آهي، ڪو به ثبوت ڳولي سگهي ٿو mitochondrial ccfDNA ٽڪڙن جي موجودگي لاء A. atra جي hemolymph ۾.mitochondrial DNA جي ٽڪڙن جي موجودگي PCR amplification (Fig. 3) ذريعي تصديق ڪئي وئي.
A. atra (ڳاڙهي نقطا - اسٽاڪ نمبر: SRX5705969) ۽ M. پلاٽينسس (نيرو نقطا - اسٽاڪ نمبر: SRX5705968) جي هيموليمف ۾ مختلف mitochondrial جينس موجود هئا PCR پاران وڌايو ويو.FTA پيپر تي اسٽور ٿيل A. Atra کان هيموليمف سپرنيٽنٽ جي ايمپليفڪيشن آف بريٽون ايٽ ال.، 2011 B مان ترتيب ڏنل شڪل.پي سي آر ٽيوب ۾ سڌو شامل ڪرڻ لاءِ 3 ملي ايم پنچ استعمال ڪريو جنهن ۾ پي سي آر مکس شامل آهي.
سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ وڏي مقدار ۾ مائڪروبيل مواد کي نظر ۾ رکندي، اسان شروعات ۾ هيموليف ۾ مائڪروبيل ڊي اين اي جي ترتيب جي خاصيت تي ڌيان ڏنو.هن کي ڪرڻ لاء، اسان ٻه مختلف حڪمت عمليون استعمال ڪندا آهيون.پهرين حڪمت عملي Kraken2 استعمال ڪئي، هڪ الگورٿم جي بنياد تي ترتيب جي درجه بندي پروگرام جيڪو مائڪروبيل ترتيبن کي سڃاڻي سگهي ٿو هڪ درستگي سان BLAST ۽ ٻين اوزارن جي مقابلي ۾ [28].6719 کان وڌيڪ ريڊز بيڪٽيريا جي اصل هجڻ جو طئي ڪيو ويو، جڏهن ته 124 ۽ 64 آرڪيا ۽ وائرس مان هئا، ترتيب سان (تصوير 4).سڀ کان وڌيڪ گهڻائي بيڪٽيريا ڊي اين اي جا ٽڪرا هئا Firmicutes (46٪)، پروٽينوبيڪٽيريا (27٪)، ۽ بيڪٽيروائيڊٽس (17٪) (Fig. 4a).هي ورهاست سامونڊي نيري ميسل مائڪروبيوم جي پوئين مطالعي سان برابر آهي [39, 40].Gammaproteobacteria Proteobacteria (44٪) جو مکيه طبقو هو، جنهن ۾ ڪيترائي Vibrionales (Fig. 4b) شامل هئا.ddPCR طريقي جي تصديق ڪئي وئي Vibrio DNA ٽڪڙن جي ccfDNA ۾ A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].ccfDNA جي بيڪٽيريا جي اصليت بابت وڌيڪ معلومات حاصل ڪرڻ لاء، هڪ اضافي طريقو ورتو ويو (تصوير S2، اضافي معلومات). انهي صورت ۾، پڙهي ٿو ته اوورليپ ٿيل گڏ ٿيل-آخر پڙهڻ جي طور تي گڏ ڪيا ويا آهن ۽ BLASTN ۽ 1e−3 جي اي قدر ۽ 90٪ هومولوجي سان هڪ ڪٽ آف استعمال ڪندي خود (bivalves) يا غير خود اصل جي طور تي درجه بندي ڪيا ويا آهن. انهي صورت ۾، پڙهي ٿو ته اوورليپ ٿيل گڏ ٿيل-آخر پڙهڻ جي طور تي گڏ ڪيا ويا آهن ۽ BLASTN ۽ 1e−3 جي اي قدر ۽ 90٪ هومولوجي سان هڪ ڪٽ آف استعمال ڪندي خود (bivalves) يا غير خود اصل جي طور تي درجه بندي ڪيا ويا آهن. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как чтения ски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90٪. انهي صورت ۾، اوورليپنگ ريڊس گڏ ڪيا ويا گڏ ٿيل ختم ٿيل پڙهڻ جي طور تي ۽ درجه بندي ڪيا ويا مقامي (bivalve) يا غير اصل جي طور تي BLASTN ۽ 1e-3 جي قيمت استعمال ڪندي ۽ ڪٽ آف > 90٪ هومولوجي سان.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 值和>为自身 (双壳类) 或非自身来源.在 这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用 的使用的使用使用e%0和匐和1>使用 بلاسٽن 和1和1源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身. . . . . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствения были или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90٪. انهي صورت ۾، اوورليپنگ ريڊس گڏ ڪيا ويا جيئن ته جوڙيل ختم ٿيل پڙهائي ۽ درجه بندي ڪئي وئي پنهنجي (bivalves) يا غير اصل استعمال ڪندي اي BLASTN ۽ 1e-3 قدر ۽ هڪ هومولوجي حد > 90٪.جيئن ته A. atra جينوم اڃا تائين ترتيب نه ڏني وئي آهي، اسان ميگاهٽ ايندڙ نسل جي ترتيب (NGS) گڏ ڪرڻ واري ڊي نوو اسيمبلي جي حڪمت عملي استعمال ڪئي.مجموعي طور تي 147,188 contigs جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي انحصار (bivalves) اصل جي طور تي.اهي Contigs پوءِ BLASTN ۽ BLASTX استعمال ڪندي 1e-10 جي اي-قيمتن سان ڌماڪا ڪيا ويا.هن حڪمت عملي اسان کي A. atra ccfDNA ۾ موجود 482 غير بائيليو ٽڪرن کي سڃاڻڻ جي اجازت ڏني.اڌ کان وڌيڪ (57٪) انهن ڊي اين اي ٽڪرا بيڪٽيريا مان حاصل ڪيا ويا آهن، خاص طور تي گلن جي علامتن مان، جن ۾ سلفوٽروفڪ سمبيونٽس شامل آهن، ۽ گل جي علامتون Solemya velum (Fig. 5).
قسم جي سطح تي لاڳاپي جي گهڻائي.B ٻن مکيه فائيلا (Firmicutes ۽ Proteobacteria) جي مائڪروبيئل تنوع.ddPCR C Vibrio spp جو نمائندو واڌارو.A. 16S rRNA جين جا ٽڪرا (نيرو) ٽن ايترا هيموليفس ۾.
مجموعي طور تي 482 گڏ ڪيل ڪنٽينز جو تجزيو ڪيو ويو.metagenomic contig تشريح (prokaryotes ۽ eukaryotes).B BLASTN ۽ BLASTX پاران سڃاڻپ ٿيل بيڪٽيريا ڊي اين اي ٽڪرن جي تفصيلي ورڇ.
Kraken2 تجزيي اهو پڻ ظاهر ڪيو ته mussel ccfDNA ۾ آرڪيال ڊي اين اي جا ٽڪرا شامل آهن، جن ۾ يوريارچيوٽا (65٪)، ڪرينارچيوٽا (24٪)، ۽ ٿورمارچيوٽا (11٪) (تصوير 6a) شامل آهن.Euryarchaeota ۽ Crenarchaeota مان نڪتل ڊي اين اي جي ٽڪڙن جي موجودگي، اڳ ۾ ڪيليفورنيا جي mussels جي مائڪروبيل ڪميونٽي ۾ مليا هئا، حيران ٿيڻ نه گهرجي [42].جيتوڻيڪ Euryarchaeota اڪثر ڪري انتهائي حالتن سان جڙيل آهي، اهو هاڻي تسليم ڪيو ويو آهي ته Euryarchaeota ۽ Crenarcheota ٻئي آهن سڀ کان وڌيڪ عام پروڪاريوٽس سامونڊي cryogenic ماحول ۾ [43, 44].مشيلن ۾ ميٿانوجينڪ مائڪروجنزمن جي موجودگي حيرت انگيز نه آهي، تازو رپورٽون ڏنيون ويون آهن وسيع ميٿين جي هيٺان لڪير کان Kerguelen Plateau [45] ۽ ممڪن مائڪروبيل ميٿين جي پيداوار جو مشاهدو ڪيو ويو آهي Kerguelen ٻيٽ جي ساحل تي [46].
اسان جو ڌيان پوءِ ڊي اين اي وائرس مان پڙهڻ ڏانهن ويو.اسان جي بهترين ڄاڻ تائين، هي پهريون آف-ٽارگٽ مطالعو آهي مچلن جي وائرس جي مواد جو.جيئن توقع ڪئي وئي، اسان کي بيڪٽيريوفاجز (Caudovirales) (Fig. 6b) جا ڊي اين اي ٽڪرا مليا.بهرحال، سڀ کان عام وائرل ڊي اين اي nucleocytoviruses جي هڪ فيلم مان ايندو آهي، جنهن کي نيوڪليئر سائٽوپلاسمڪ لارج ڊي اين اي وائرس (NCLDV) به چيو ويندو آهي، جنهن ۾ ڪنهن به وائرس جو سڀ کان وڏو جينوم هوندو آهي.هن فيلم جي اندر، اڪثر ڊي اين اي تسلسل خاندانن Mimimidoviridae (58%) ۽ Poxviridae (21%) سان تعلق رکن ٿا، جن جي قدرتي لشڪر ۾ فقرا ۽ ارٿروپڊس شامل آهن، جڏهن ته انهن ڊي اين اي ترتيبن جو هڪ ننڍڙو حصو ڄاتل وائرولوجيڪل الگا سان تعلق رکي ٿو.سامونڊي eukaryotic algae کي متاثر ڪري ٿو.پنڊورا وائرس مان پڻ ترتيبون حاصل ڪيون ويون آهن، وڏي وائرس ڪنهن به ڄاتل وائرل نسل جي سڀ کان وڏي جينوم سائيز سان.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، ميزبانن جي حد تائين معلوم ٿئي ٿو ته وائرس سان متاثر ٿي، جيئن ته هيموليمف ccfDNA ترتيب سان طئي ڪيو ويو آهي، نسبتا وڏي هئي (شڪل S3، اضافي معلومات).ان ۾ وائرس شامل آهن جيڪي حشرات کي متاثر ڪن ٿا جهڙوڪ Baculoviridae ۽ Iridoviridae، انهي سان گڏ وائرس جيڪي اميبا، الجي ۽ vertebrates کي متاثر ڪن ٿا.اسان پيتووائرس سائبريڪم جينوم سان ملندڙ تسلسل پڻ ڏٺا.Pitoviruses (جنهن کي ”زومبي وائرس“ جي نالي سان پڻ سڃاتو وڃي ٿو) پهريون ڀيرو سائبيريا ۾ 30,000 سال پراڻي پرما فراسٽ کان الڳ ڪيا ويا [47].اهڙيءَ طرح، اسان جا نتيجا اڳئين رپورٽن سان مطابقت رکن ٿا، ڏيکارين ٿا ته انهن وائرسن جون سڀ جديد نسلون ناپيد نه آهن [48] ۽ اهي وائرس ريموٽ سبارڪڪ سمندري ماحولياتي نظام ۾ موجود هوندا.
آخرڪار، اسان اهو ڏسڻ لاءِ آزمايو ته ڇا اسان ٻين ملٽي سيلولر جانورن مان ڊي اين اي جا ٽڪرا ڳولي سگهون ٿا.BLASTN ۽ BLASTX پاران nt، nr ۽ RefSeq لائبريرين (جينومڪ ۽ پروٽين) سان مجموعي طور تي 482 پرڏيهي ڪانٽيگ جي سڃاڻپ ڪئي وئي.اسان جا نتيجا ظاھر ڪن ٿا ته ccfDNA جي خارجي ٽڪرن ۾ گھڻ-سيلولر جانورن جي ھڏين جو ڊي اين اي غالب آھي (تصوير 5).حشرات ۽ ٻين نسلن مان ڊي اين اي جا ٽڪرا پڻ مليا آهن.ڊي اين اي جي ٽڪرن جو هڪ نسبتا وڏو حصو سڃاڻپ نه ڪيو ويو آهي، ممڪن آهي ته زميني نسلن جي مقابلي ۾ جينوميڪ ڊيٽابيس ۾ سامونڊي نسلن جي وڏي تعداد جي گهٽتائي سبب [49].
موجوده پيپر ۾، اسان ايل بي تصور کي mussels تي لاڳو ڪريون ٿا، اهو بحث ڪيو ته هيموليمف ccfDNA شاٽ جي ترتيب سامونڊي ساحلي ماحولياتي نظام جي جوڙجڪ ۾ بصيرت مهيا ڪري سگهي ٿي.خاص طور تي، اسان ڏٺو ته 1) mussel hemolymph ۾ نسبتا وڏي (~ 1-5 kb) گردش ڪندڙ ڊي اين اي ٽڪرا (~ 1-5 kb) جي نسبتا اعلي ڪنسنٽريشن (مائڪروگرام ليول) تي مشتمل آهي؛2) اهي ڊي اين اي جا ٽڪرا ٻئي آزاد ۽ غير آزاد آهن 3) انهن ڊي اين اي ٽڪڙن جي خارجي ذريعن مان، اسان کي بيڪٽيريا، آرڪيال ۽ وائرل ڊي اين اي، گڏوگڏ ٻين ملٽي سيلولر جانورن جو ڊي اين اي مليو.4) هيموليمف ۾ انهن پرڏيهي ccfDNA ٽڪڙن جو جمع تيزيءَ سان ٿئي ٿو ۽ مشڪن جي اندروني فلٽرنگ سرگرمي ۾ حصو وٺي ٿو.آخر ۾، اسان جي مطالعي مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته LB جو تصور، جيڪو گهڻو ڪري بائيو ميڊيسن جي شعبي ۾ لاڳو ڪيو ويو آهي، هڪ امير پر اڻ ڄاتل ڄاڻ جو ذريعو انڪوڊ ڪري ٿو جيڪو استعمال ڪري سگهجي ٿو موڪليل نسلن ۽ انهن جي ماحول جي وچ ۾ رابطي کي بهتر سمجهڻ لاء.
primates کان علاوه، ccfDNA جي اڪيلائي کي ٿلهي جانورن ۾ ٻڌايو ويو آهي، جن ۾ چوٿون، ڪتا، ٻڪريون ۽ گھوڙا شامل آهن [50، 51، 52].تنهن هوندي، اسان جي ڄاڻ ۾، اسان جو مطالعو پهريون آهي جنهن کي ccfDNA جي ڳولا ۽ ترتيب جي رپورٽ سامونڊي نسلن ۾ کليل گردش سسٽم سان.هي جسماني خصوصيت ۽ مشڪن جي فلٽرنگ جي صلاحيت، گهٽ ۾ گهٽ جزوي طور، ٻين نسلن جي مقابلي ۾ گردش ڪندڙ ڊي اين اي جي ٽڪرن جي مختلف سائيز خاصيتن جي وضاحت ڪري سگهي ٿي.انسانن ۾، رت ۾ گردش ڪندڙ اڪثر ڊي اين اي ٽڪرا ننڍا ننڍا ٽڪرا هوندا آهن جن جي سائيز 150 کان 200 bp تائين هوندي آهي.167 بي پي جي وڌ ۾ وڌ چوٽي سان [34، 53].ڊي اين اي جي ٽڪرن جو هڪ ننڍڙو پر اهم حصو 300 ۽ 500 بي پي جي وچ ۾ آهي، ۽ اٽڪل 5٪ 900 بي پي کان ڊگهو آهي.[54].هن سائيز جي ورڇ جو سبب اهو آهي ته پلازما ۾ ccfDNA جو بنيادي ذريعو سيل جي موت جي نتيجي ۾ ٿئي ٿو، يا ته سيل جي موت جي نتيجي ۾ يا صحتمند ماڻهن ۾ گردش ڪندڙ هيماٽوپوئيٽڪ سيلز جي necrosis سبب يا سرطان جي مريضن ۾ ٽيومر سيلز جي apoptosis جي ڪري (جنهن کي گردش ڪندڙ tumor DNA طور سڃاتو وڃي ٿو).، ctDNA).hemolymph ccfDNA جي ماپ جي ورڇ جيڪا اسان کي 1000 کان 5000 bp جي وچ ۾ ملي ٿي، جيڪا اسان کي ملي ٿي، ان مان معلوم ٿئي ٿو ته mussel ccfDNA جي اصليت مختلف آهي.هي هڪ منطقي مفروضو آهي، ڇاڪاڻ ته مڇين ۾ هڪ نيم کليل ويسڪولر سسٽم هوندو آهي ۽ اهي سامونڊي آبي ماحول ۾ رهن ٿا، جن ۾ مائڪروبيل جينومڪ ڊي اين اي جي وڏي مقدار هوندي آهي.درحقيقت، اسان جي ليبارٽري تجربن ۾ exogenous DNA استعمال ڪندي ڏيکاريو ويو آهي ته مڇيون ڊي اين اي جا ٽڪرا سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ گڏ ڪندا آهن، گهٽ ۾ گهٽ ڪجهه ڪلاڪن کان پوءِ اهي سيلولر اپٽيڪ ۽/يا ڇڏڻ ۽/يا مختلف تنظيمن ۾ ذخيرو ٿيڻ کان پوءِ خراب ٿي ويندا آهن.سيلز جي نايابيت (ٻنهي پروڪاريوٽڪ ۽ يوڪريوٽڪ) کي نظر ۾ رکندي، intravalvular compartments جو استعمال ccfDNA جي مقدار کي خود ذريعن ۽ پرڏيهي ذريعن کان گھٽائي ڇڏيندو.bivalve innate immunity ۽ گردش ڪندڙ phagocytes جي وڏي تعداد جي اهميت کي نظر ۾ رکندي، اسان اڳتي وڌو ته غير ملڪي ccfDNA به گردش ڪندڙ phagocytes ۾ افزودگيءَ سان ڀريل آهي جيڪي خوردبيني ۽/يا سيلولر ڊبرس جي انجڻ تي غير ملڪي DNA گڏ ڪن ٿا.گڏجي گڏ ڪيو ويو، اسان جا نتيجا ڏيکاري ٿو ته bivalve hemolymph ccfDNA ماليڪيولر معلومات جو هڪ منفرد ذخيرو آهي ۽ انهن جي حيثيت کي مضبوط ڪري ٿو هڪ موڪليل نسل جي حيثيت سان.
اسان جي ڊيٽا ظاهر ڪري ٿي ته بيڪٽيريا مان نڪتل هيموليمف ccfDNA ٽڪرن جي ترتيب ۽ تجزيو ميزبان بيڪٽيريا فلورا ۽ ڀرپاسي سامونڊي ماحولياتي نظام ۾ موجود بيڪٽيريا بابت اهم معلومات مهيا ڪري سگھن ٿا.شاٽ سيڪوئنسنگ ٽيڪنڪز ڪمنسل بيڪٽيريا A. atra gill جي ترتيبن کي ظاهر ڪيو آهي جيڪي ياد اچن ها جيڪڏهن روايتي 16S rRNA جي سڃاڻپ جا طريقا استعمال ڪيا وڃن ها، جزوي طور تي ريفرنس لائبريري تعصب جي ڪري.حقيقت ۾، اسان جي ايل بي ڊيٽا جو استعمال ڪيو ويو M. پلاٽينسس مان گڏ ڪيل ساڳئي mussel پرت ۾ Kerguelen ۾ اهو ظاهر ڪيو ويو آهي ته گل سان لاڳاپيل بيڪٽيريا سمبيونٽس جو ٺهيل ٻنهي mussel نسلن لاء ساڳيو هو (Fig. S4، اضافي معلومات).ٻن جينياتي طور تي مختلف mussels جي هي هڪجهڙائي شايد بيڪٽيريا برادرين جي سرد، سلفرس، ۽ آتش فشاني ذخيري ۾ Kerguelen [55, 56, 57, 58] کي ظاهر ڪري ٿي.سلفر جي گھٽتائي ڪندڙ مائڪروجنزمن جي اعلي سطحن کي چڱي طرح بيان ڪيو ويو آهي جڏهن بايوٽربٽ ٿيل ساحلي علائقن [59]، جهڙوڪ پورٽ-آو-فرانس جي ساحل کان مچلن جي فصل کي.هڪ ٻيو امڪان اهو آهي ته commensal mussel flora متاثر ٿي سگھي ٿو افقي ٽرانسميشن [60, 61].وڌيڪ تحقيق جي ضرورت آهي ته سامونڊي ماحول، سامونڊي ڪناري جي مٿاڇري، ۽ مچلن ۾ سمبوٽڪ بيڪٽيريا جي جوڙجڪ جي وچ ۾ لاڳاپو کي طئي ڪرڻ لاء.اهي اڀياس هن وقت جاري آهن.
hemolymph ccfDNA جي ڊگھائي ۽ ڪنسنٽريشن، ان جي صاف ڪرڻ ۾ آساني، ۽ تيز رفتار شاٽ گن جي ترتيب کي اجازت ڏيڻ لاءِ اعليٰ معيار، سامونڊي ساحلي ماحولي نظام ۾ جيوتائي تنوع جو جائزو وٺڻ لاءِ mussel ccfDNA استعمال ڪرڻ جا ڪيترائي فائدا آھن.اهو طريقو خاص طور تي وائرل ڪميونٽيز (وائرومس) کي مخصوص ماحولياتي نظام ۾ خاص طور تي اثرائتو آهي [62, 63].بيڪٽيريا، آرڪيا، ۽ يوڪريوٽس جي برعڪس، وائرل جينوم ۾ phylogenetically محفوظ ڪيل جين شامل نه آهن جهڙوڪ 16S تسلسل.اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته اشاري جي نسلن مان مائع بايوپسيز جهڙوڪ mussels استعمال ڪري سگھجن ٿيون نسبتا وڏي تعداد ۾ ccfDNA وائرس جي ٽڪڙن کي سڃاڻڻ لاءِ سڃاتل ميزبانن کي متاثر ڪرڻ لاءِ جيڪي عام طور تي ساحلي سامونڊي ماحولياتي نظام ۾ آباد آهن.ھن ۾ وائرس شامل آھن جيڪي پروٽوزوا، آرٿروپاڊس، حشرات، ٻوٽن، ۽ بيڪٽيريا وائرس (مثال طور، بيڪٽيريوفاجز) کي متاثر ڪن ٿا.ساڳي ئي ورهاست ملي وئي جڏهن اسان هيموليمف ccfDNA virome of blue mussels (M. platensis) کي جانچيو ته ساڳئي mussel پرت ۾ گڏ ڪيل Kerguelen (ٽيبل S2، ضمني معلومات).ccfDNA جي شاٽگن جي ترتيب يقيني طور تي انسانن يا ٻين نسلن جي وائرس جي مطالعي ۾ رفتار حاصل ڪرڻ جو هڪ نئون طريقو آهي [21، 37، 64].اهو طريقو خاص طور تي ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي وائرسز جي مطالعي لاءِ ڪارآمد آهي، ڇاڪاڻ ته بالٽمور ۾ وائرس جي سڀ کان وڌيڪ متنوع ۽ وسيع طبقي جي نمائندگي ڪندڙ سڀني ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي وائرسز ۾ ڪوبه هڪ جين محفوظ ناهي [65].جيتوڻيڪ انهن مان گھڻا وائرس اڻ ڳڻيا رهجي ويا آهن ۽ انهن ۾ وائرس دنيا جي مڪمل طور تي اڻڄاتل حصي جا وائرس شامل ٿي سگهن ٿا [66]، اسان ڏٺو آهي ته وائرس ۽ ميزبانن جون حدون A. atra ۽ M. platensis ٻن نسلن جي وچ ۾ اچي وڃن ٿيون.ساڳئي طرح (ڏسو شڪل S3، اضافي معلومات).هي هڪجهڙائي حيرت انگيز ناهي، ڇاڪاڻ ته اهو ماحول ۾ موجود ڊي اين اي جي اپٽيڪ ۾ چونڊ جي گهٽتائي کي ظاهر ڪري سگهي ٿو.صاف ٿيل آر اين اي استعمال ڪندي مستقبل جي مطالعي کي في الحال آر اين اي ويروم کي خاص ڪرڻ جي ضرورت آهي.
اسان جي مطالعي ۾، اسان هڪ تمام سخت پائيپ لائين استعمال ڪيو جيڪو ڪوارسڪي ۽ ساٿين جي ڪم مان ٺاهيل آهي [37]، جيڪو استعمال ڪيو ويو پولڊ ريڊس ۽ ڪنٽيگس جي ٻن قدمن کي حذف ڪرڻ کان اڳ ۽ بعد ۾ مقامي ccfDNA جي اسيمبليء جي نتيجي ۾، نتيجي ۾ اڻڄاتل پڙهيل جو وڏو تناسب.تنهن ڪري، اسان ان ڳالهه کي رد نه ٿا ڪري سگهون ته انهن مان ڪجهه اڻ ميپ ٿيل پڙهيا اڃا تائين انهن جي پنهنجي اصليت آهن، بنيادي طور تي ڇاڪاڻ ته اسان وٽ هن mussel جي نسلن لاء ڪو حوالو جينوم نه آهي.اسان هن پائپ لائن کي پڻ استعمال ڪيو ڇو ته اسان خود ۽ غير خود پڙهڻ جي وچ ۾ چيميرا بابت ۽ Illumina MiSeq PE75 پاران ٺاهيل پڙهڻ جي ڊيگهه بابت فڪرمند هئاسين.اڻڄاتل پڙهڻ جي اڪثريت جو هڪ ٻيو سبب اهو آهي ته گهڻو ڪري سامونڊي مائڪروبس، خاص طور تي ڏورانهن علائقن جهڙوڪ Kerguelen ۾، بيان نه ڪيو ويو آهي.اسان Illumina MiSeq PE75 استعمال ڪيو، فرض ڪيو ccfDNA فريگمينٽ ڊگھائي انساني ccfDNA وانگر.مستقبل جي مطالعي لاء، اسان جي نتيجن کي ڏيکاري ٿو ته hemolymph ccfDNA انسانن ۽/يا ٿنڀن جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ پڙهيل آهي، اسان هڪ ترتيب واري پليٽ فارم کي استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏيون ٿا وڌيڪ ccfDNA ٽڪرن لاءِ وڌيڪ مناسب.اهو مشق ان کي وڌيڪ آسان بڻائي ڇڏيندو وڌيڪ اشارن جي نشاندهي ڪرڻ لاءِ وڌيڪ گہرے تجزيو لاءِ.في الحال غير دستياب مڪمل A. atra ائٽمي جينوم جي ترتيب حاصل ڪرڻ سان پڻ خود ۽ غير خود ذريعن کان ccfDNA جي تبعيض کي تمام گهڻو آسان بڻائيندو.ڏنو ويو آهي ته اسان جي تحقيق تي ڌيان ڏنو ويو آهي مائع بايوپسي جي تصور کي لاڳو ڪرڻ جي امڪان تي، اسان اميد ڪريون ٿا ته جيئن اهو تصور مستقبل جي تحقيق ۾ استعمال ڪيو ويندو، نئين اوزار ۽ پائپ لائنون هن طريقي جي صلاحيت کي وڌائڻ لاء تيار ڪيا ويندا.سامونڊي ماحولياتي نظام.
هڪ غير ناگوار ڪلينڪ بائيو مارڪر جي طور تي، ccfDNA جي بلند انساني پلازما جي سطح مختلف بيمارين، ٽشو نقصان، ۽ دٻاء جي حالتن سان لاڳاپيل آهن [67,68,69].اهو واڌارو ٽشو جي نقصان کان پوءِ پنهنجي اصل جي ڊي اين اي ٽڪرن جي ڇڏڻ سان لاڳاپيل آهي.اسان هن مسئلي کي تيز گرمي جي دٻاء کي استعمال ڪندي حل ڪيو، جنهن ۾ مچلن کي مختصر طور تي 30 ° C جي درجه حرارت تي ظاهر ڪيو ويو.اسان اهو تجزيو ٽن آزاد تجربن ۾ ٽن مختلف قسمن جي مشلز تي ڪيو.بهرحال، اسان سخت گرمي جي دٻاء کان پوء ccfDNA جي سطحن ۾ ڪا به تبديلي نه ڳولي (ڏسو شڪل S5، اضافي معلومات).اها دريافت وضاحت ڪري سگهي ٿي، گهٽ ۾ گهٽ جزوي طور تي، حقيقت اها آهي ته مچلن ۾ هڪ نيم کليل گردشي نظام آهي ۽ انهن جي اعلي فلٽرنگ سرگرمي جي ڪري پرڏيهي ڊي اين اي جي وڏي مقدار کي گڏ ڪري ٿو.ٻئي طرف، mussels، ڪيترن ئي invertebrates وانگر، دٻاء-حوصلہ افزائي بافتن جي نقصان لاء وڌيڪ مزاحمتي ٿي سگهي ٿي، ان ڪري انهن جي هيموليف ۾ ccfDNA جي ڇڏڻ کي محدود ڪري ٿي [70, 71].
اڄ تائين، آبي ماحولي نظام ۾ جيوتائي تنوع جو ڊي اين اي تجزيو خاص طور تي ماحولياتي ڊي اين اي (اي ڊي اين اي) ميٽابارڪوڊنگ تي ڌيان ڏنو آهي.جڏهن ته، هي طريقو عام طور تي جيوتياتي تجزيي ۾ محدود هوندو آهي جڏهن پرائمر استعمال ڪيا ويندا آهن.شاٽگن جي ترتيب جو استعمال پي سي آر جي حدن ۽ پرائمر سيٽن جي باصلاحيت چونڊ کي ختم ڪري ٿو.اهڙيء طرح، هڪ لحاظ کان، اسان جو طريقو تازو استعمال ٿيل اعلي-throughput eDNA شاٽگن جي ترتيب واري طريقي جي ويجهو آهي، جيڪو سڌو سنئون ڊي اين اي کي ترتيب ڏيڻ جي قابل آهي ۽ تقريبن سڀني جاندارن جو تجزيو ڪرڻ جي قابل آهي [72, 73].بهرحال، اتي ڪيترائي بنيادي مسئلا آھن جيڪي LB کي معياري eDNA طريقن کان ڌار ڪن ٿا.يقينن، اي ڊي اين اي ۽ ايل بي جي وچ ۾ بنيادي فرق قدرتي فلٽر ميزبان جو استعمال آهي.اي ڊي اين اي جي مطالعي لاءِ قدرتي فلٽر جي طور تي سامونڊي نسلن جهڙوڪ اسپنجز ۽ بائيليوز (ڊريسينا ايس پي پي) جو استعمال ٻڌايو ويو آهي [74, 75].بهرحال، ڊريسنا جي مطالعي ۾ ٽشو بايوپسي استعمال ڪئي وئي جنهن مان ڊي اين اي ڪڍيو ويو.LB کان ccfDNA جي تجزيي کي ٽشو بايپسي جي ضرورت نه آھي، خاص ۽ ڪڏھن ڪڏھن قيمتي سامان ۽ لوجسٽڪس جي eDNA يا ٽشو بايپسي سان لاڳاپيل.حقيقت ۾، اسان تازو ٻڌايو آهي ته LB کان ccfDNA محفوظ ڪري سگهجي ٿو ۽ ايف ٽي اي جي مدد سان تجزيو ڪيو وڃي ٿو بغير ٿڌي زنجير کي برقرار رکڻ، جيڪو ريموٽ علائقن ۾ تحقيق لاء هڪ وڏو چئلينج آهي [76].ccfDNA کي مائع بايوپسيز مان ڪڍڻ به سادو آهي ۽ شاٽ گن جي ترتيب ۽ PCR تجزيي لاءِ اعليٰ معيار جو ڊي اين اي مهيا ڪري ٿو.اھو ھڪڙو وڏو فائدو آھي جيڪو ڪجھ ٽيڪنيڪل حدون ڏنيون آھن جيڪي اي ڊي اين اي تجزيي سان لاڳاپيل آھن [77].نموني جي طريقي جي سادگي ۽ گھٽ قيمت پڻ خاص طور تي ڊگھي مدت جي نگراني پروگرامن لاء مناسب آھي.انهن جي اعلي فلٽرنگ جي صلاحيت کان علاوه، بائيوولوز جي هڪ ٻي معروف خاصيت انهن جي بلغم جي ڪيميائي ميوڪوپوليسڪرائڊ جو ٺهيل آهي، جيڪو وائرس جي جذب کي وڌائيندو آهي [78, 79].هي bivalves هڪ مثالي قدرتي فلٽر جيو تنوع ۽ هڪ ڏنل آبي ماحولي نظام ۾ موسمياتي تبديلي جي اثر کي نمايان ڪرڻ لاءِ.جيتوڻيڪ ميزبان مان نڪتل ڊي اين اي ٽڪڙن جي موجودگي کي اي ڊي اين اي جي مقابلي ۾ طريقي جي حد جي طور تي ڏسي سگهجي ٿو، اي ڊي اين اي جي مقابلي ۾ اهڙي ccfDNA سان لاڳاپيل قيمت صحت جي مطالعي لاءِ موجود معلومات جي وڏي مقدار لاءِ هڪ ئي وقت سمجهي سگهجي ٿي.آفسيٽ ميزبان.ھن ۾ شامل آھي وائرل تسلسل جي موجودگي ميزبان ميزبان جي جينوم ۾ داخل ٿيل.اهو خاص طور تي mussels لاء اهم آهي، bivalves [80, 81] ۾ افقي طور تي منتقل ٿيل ليوڪيمڪ ريٽروائرس جي موجودگي کي ڏنو ويو آهي.اي ڊي اين اي مٿان ايل بي جو ٻيو فائدو اهو آهي ته هي هيمولف ۾ رت جي سيلن کي گردش ڪرڻ واري فيگوسيٽڪ سرگرمي جو استحصال ڪري ٿو، جيڪو مائڪروجنزم (۽ انهن جي جينومس) کي ڍڪي ٿو.Phagocytosis bivalves ۾ رت جي خاني جو بنيادي ڪم آهي [82].آخر ۾، طريقو ڍڳن جي اعليٰ فلٽرنگ جي صلاحيت (اوسط 1.5 l/h سامونڊي پاڻي) ۽ ٻن ڏينهن جي گردش جو فائدو وٺي ٿو، جيڪو سمنڊ جي پاڻيءَ جي مختلف تہن جي ميلاپ کي وڌائي ٿو، جنهن سان heterologous eDNA کي پڪڙڻ جي اجازت ملي ٿي.[83، 84].اهڙيء طرح، mussel ccfDNA تجزيي هڪ دلچسپ رستو آهي جنهن کي mussels جي غذائي، اقتصادي، ۽ ماحولياتي اثرات ڏني وئي آهي.انسانن مان گڏ ڪيل ايل بي جي تجزيي وانگر، هي طريقو پڻ خارجي مادو جي جواب ۾ ميزبان ڊي اين اي ۾ جينياتي ۽ ايپيگينيٽڪ تبديلين کي ماپڻ جو امڪان پڻ کولي ٿو.مثال طور، ٽين نسل جي ترتيب واري ٽيڪنالاجي کي تصور ڪري سگهجي ٿو ته جينوم-وائڊ ميٿيليشن تجزيو انجام ڏيڻ لاءِ مقامي ccfDNA ۾ nanopore sequencing استعمال ڪندي.هي عمل کي انهيء جي سهولت کي سهولت فراهم ڪئي وڃي ته ڪيفدين جا حصا معائنو پذير ڊجيٽل فارمز جو ادارو آهي، اهو صرف ڪيترين ئي نسلن جو مطالعو جي ضرورت آهي، اهو صرف ڪيترن ئي نسلن تي عمل جي ضرورت آهي ته اهو پوري طور تي آگاهه ڪرڻ جي ضرورت آهي، اهو صرف ڪيترين ترميم جي متعلق موجود آهي ۽ ڪيترن ئي نسلن بابت ضرورت آهيتنهن ڪري، اهو آبهوا جي تبديلي يا آلودگي جي نمائش کان پوءِ جوابي حڪومتي نظامن ۾ قيمتي بصيرت مهيا ڪري سگهي ٿو [87].بهرحال، LB جو استعمال بغير ڪنهن حد تائين ناهي.چوڻ جي ضرورت ناهي، اهو ضروري آهي ته ماحولياتي نظام ۾ اشارو نسلن جي موجودگي.جيئن مٿي ذڪر ڪيو ويو آهي، هڪ ڏنل ماحولياتي نظام جي جيو تنوع جو جائزو وٺڻ لاءِ LB استعمال ڪرڻ لاءِ پڻ سخت بايو انفارميٽڪس پائپ لائن جي ضرورت آهي جيڪا ذريعا مان ڊي اين اي جي ٽڪرن جي موجودگي کي مدنظر رکي ٿي.ٻيو وڏو مسئلو سامونڊي نسلن لاءِ حوالن جينوم جي دستيابي آهي.اميد آهي ته اڳڀرائي جهڙوڪ مرين ميمل جينومس پروجيڪٽ ۽ تازو قائم ڪيل Fish10k پروجيڪٽ [88] مستقبل ۾ اهڙي تجزيي کي آسان بڻائي سگهندا.سامونڊي فلٽر فيڊنگ آرگنزمز تي LB تصور جو اطلاق پڻ ترتيب ڏيڻ واري ٽيڪنالاجي ۾ جديد ترقي سان مطابقت رکي ٿو، ان کي ماحولياتي دٻاءُ جي جواب ۾ سامونڊي رهائش جي صحت بابت اهم معلومات مهيا ڪرڻ لاءِ ملٽي اوم بائيو مارڪرز جي ترقي لاءِ موزون بڻائي ٿو.
جينوم جي ترتيب واري ڊيٽا NCBI جي ترتيب پڙهڻ واري آرڪائيو ۾ جمع ڪئي وئي آهي https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 تحت.
برئرلي اي ايس، ڪنگسفورڊ MJ سامونڊي زندگي ۽ ماحولياتي نظام تي موسمياتي تبديلي جو اثر.ڪول بايولوجي.2009؛19: P602-P614.
گيسي اي، مانيا اي، مزاريس اي ڊي، فريشيٽي ايس، المپانيدو وي، بيويلاڪوا ايس، وغيره.آبهوا جي تبديلي جي گڏيل اثرن ۽ سامونڊي ماحول تي ٻين مقامي دٻاءُ تي غور ڪريو.عام سائنسي ماحول.2021؛ 755: 142564.
ڪاريلا ايف، اينٽوفرمو اي، فارينا ايس، سالاتي ايف، منڊاس ڊي، پراڊو پي، وغيره.).پهرين مارچ جي سائنس.2020؛ 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. گرميءَ جي گھٽتائي برداشت ڪرڻ واري حرارت جي بار بار جي دٻاءُ جي حالتن هيٺ نيري ميسلن جي اونهاري جي موت جي اعلي شرح کي بيان ڪري ٿي.سائنسي رپورٽ 2019؛9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.جانورن جي موت جي تعدد، سببن ۽ حد ۾ تازيون تبديليون.Proc Natl Acad Sci USA.2015؛ 112: 1083-8.
اسڪرپا ايف، سننا ڊي، ايزينا آء، ميگيٽي ڊي، سيروتي ايف، حسيني ايس، وغيره.گھڻن غير جنس-مخصوص پيٿوجنز شايد پينا نوبلس جي وڏي موت جو سبب بڻجن ٿيون.زندگي.2020؛ 10:238.
برادلي ايم، ڪٽس ايس جي، جينڪنز اي، او هارا TM.آبهوا جي تبديليءَ جا امڪاني اثر آرڪٽڪ زونٽڪ بيمارين تي.انٽرنيٽ جي سرڪپولر صحت.2005؛64:468-77.
بيئر جي.، گرين اين ڊبليو، بروڪس ايس، ايلن آئي جي، روس اي، گومز ٽي وغيره.بليو mussels (Mytilus edulis spp.) سامونڊي آلودگي جي نگراني ۾ سگنل آرگنائيزيشن جي طور تي: هڪ جائزو.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G، Marsoni S، Siena S، Bardelli A. ڪينسر جي علاج ۾ مائع بايوپسي جو انضمام.نيٽ ريو صاف آنڪول.2017;14:531-48.
Wan JCM، Massie C، Garcia-Corbacho J، Mouliere F، Brenton JD، Caldas C، et al.Liquid biopsy maturation: tumor DNA کي گردش ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿي.نيٽ ريو ڪينسر.2017؛ 17:223-38.
منڊل پي.، ميٽيس پي. انساني پلازما ۾ نيوڪليڪ اسيد.Soc Biol ماتحت ادارن جي گڏجاڻين جا منٽ.1948؛142:241-3.
Bronkhorst AJ، Ungerer W، Holdenrieder S. سيل فري ڊي اين اي لاءِ نئون ڪردار ڪينسر جي علاج لاءِ ماليڪيولر مارڪر طور.بايومولر تجزيي جي مقدار.2019؛ 17: 100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy ڪلينڪ ۾ داخل ٿئي ٿو - عمل درآمد جا مسئلا ۽ مستقبل جا چئلينج.نيٽ ريو ڪلين آنڪول.2021؛18:297-312.
Lo YM، Corbetta N.، Chamberlain PF، Rai W.، Sargent IL، Redman CW ۽ ٻيا.جنين جو ڊي اين اي ماءُ جي پلازما ۽ سيرم ۾ موجود هوندو آهي.لانسٽ.1997؛350:485-7.
Mufarray MN، Wong RJ، Shaw GM، Stevenson DK، Quake SR حمل جي ڪورس جو مطالعو ۽ حمل دوران عورتن جي رت ۾ گردش ڪندڙ extracellular RNA استعمال ڪندي ان جي پيچيدگيون.ڊپريٽري.2020؛ 8:605219.
Ollerich M، Sherwood K، Keown P، Schütz E، Beck J، Stegbauer J، et al.مائع بايوپسي: ڊونر سيل فري ڊي اين اي استعمال ڪيو ويندو آهي آلوجينڪ زخمن کي ڳولهڻ لاءِ هڪ گردن جي گرافٽ ۾.Nat Rev Nephrol.2021؛17:591-603.
جوآن ايف سي، لو YM پيدائش جي تشخيص ۾ جدت: زچگي پلازما جينوم جي ترتيب.انا ايم ڊي.2016؛ 67:419-32.
Gu W، Deng X، Lee M، Sucu YD، Arevalo S، Stryke D، et al.متاثر ٿيل جسماني رطوبت جي ايندڙ نسل جي ميٽيگينوميڪ ترتيب سان تيز پيجنجن جي سڃاڻپ.نيٽ دوائون.2021؛ 27:115-24.