Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රවුසර අනුවාදය CSS සඳහා සීමිත සහයක් ඇත.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන බ්‍රවුසරයක් (හෝ Internet Explorer හි ගැළපුම් මාදිලිය ක්‍රියාවිරහිත කිරීම) භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු. මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය ප්‍රදර්ශනය කරන්නෙමු.
මානව බඩවැල් මෝර්ෆොජෙනිස් මගින් ත්‍රිමාණ අපිච්ඡද ක්ෂුද්‍ර වාස්තු විද්‍යාවේ සහ අවකාශීය සංවිධානයේ ගුප්ත-විලස් ලක්ෂණ තහවුරු කරයි. මෙම අද්විතීය ව්‍යුහය බාසල් ගුප්තකේ ඇති ප්‍රාථමික සෛල නිකේතනය බාහිර ක්ෂුද්‍ර ජීවී ප්‍රතිදේහජනක වලින් සහ ඒවායේ පරිවෘත්තීය වලින් ආරක්ෂා කිරීමෙන් බඩවැල් හෝමියස්ටැසිස් පවත්වා ගැනීමට අවශ්‍ය වේ. ශ්ලේෂ්මල මතුපිට.එබැවින්, ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ව්‍යුහයන් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම in vitro gut ආකෘති තැනීම සඳහා ඉතා වැදගත් වේ.විශේෂයෙන්, කාබනික මයිමෙටික් ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් මගින් බඩවැලේ එපිටිලියම්හි ස්වයංසිද්ධ ත්‍රිමාණ morphogenesis ඇති කළ හැක. ක්ෂුද්‍ර තරල චිපයක් මත මෙන්ම ට්‍රාන්ස්වෙල් කාවැද්දූ දෙමුහුන් චිපයක් මත බඩවැලේ ඇති tinal morphogenesis. අපි උපාංග නිෂ්පාදනය සඳහා සවිස්තරාත්මක ක්රම විස්තර, Caco-2 හෝ intestinal organoid epithelial සෛල වගා කිරීම සාම්ප්රදායික සැකසුම් මෙන්ම microfluidic වේදිකාවක් මත, මෙම බහුවිධ mophogenesis ස්ථාපිත motheogeness induction. ප්‍රොටෝකෝලය 5 d සඳහා basolateral තරල ප්‍රවාහය පාලනය කිරීමෙන් ක්‍රියාකාරී බඩවැල් ක්ෂුද්‍ර නිර්මාණ ශිල්පය ප්‍රතිජනනය ලබා ගනී. අපගේ in vitro morphogenesis ක්‍රමය කායික විද්‍යාත්මකව අදාළ කැපුම් ආතතිය සහ යාන්ත්‍රික චලිතය භාවිතා කරන අතර සංකීර්ණ සෛල ඉංජිනේරු විද්‍යාව හෝ හැසිරවීම අවශ්‍ය නොවේ. ජෛව වෛද්‍ය, සායනික සහ ඖෂධීය යෙදුම් සඳහා vitro තුළ ඇති epithelial ස්ථර.
අත්හදා බැලීම්වලින් පෙන්නුම් කරන්නේ බඩවැල්වල ඇති එපිටිලියල් Caco-2 සෛල gut-on-a-chip1,2,3,4,5 හෝ bilayer microfluidic devices6,7 හි වගා කරන ලද යටින් පවතින යාන්ත්‍රණය පිළිබඳ පැහැදිලි අවබෝධයක් නොමැතිව ස්වයංසිද්ධ 3D morphogenesis වලට භාජනය විය හැකි බවයි. Duce 3D epithelial morphogenesis in vitro, එය Caco-2 සහ රෝගීන් විසින් ව්‍යුත්පන්න වූ බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය මගින් පෙන්නුම් කර ඇත.අපිච්ඡද සෛල වලංගු කරන ලදී.මෙම අධ්‍යයනයේදී, අපි විශේෂයෙන් අවධානය යොමු කළේ ප්‍රබල Wnt ප්‍රතිවිරෝධකයක් වන Dickkopf-1 (DKK-1) හි සෛල නිෂ්පාදනය සහ සාන්ද්‍රණය ව්‍යාප්තිය කෙරෙහි අවධානය යොමු කළ අතර, “හයිබ්‍රිඩ් චිප්” ලෙස හඳුන්වන ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් අඩංගු සහ නවීකරණය කරන ලද ක්ෂුද්‍ර තරල උපාංගවල (WK 1, ස්‍රාවය කරන ලද ෆ්‍රිස්ල්-ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් 1, හෝ සෝගී-1) ඔන්-චිප් බඩවැලේ මෝර්ෆොජෙනිසිස් වළක්වයි හෝ පූර්ව ව්‍යුහගත ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් තට්ටුව කඩාකප්පල් කරයි, සංස්කෘතිය තුළ ඇති ප්‍රතිවිරෝධතා ආතතිය බඩවැල් මෝර්ෆොජෙනසිස් සඳහා වගකිව යුතු බව යෝජනා කරයි. එම නිසා එපිට්‍රොජන් වල ප්‍රතිවිරෝධතා ඉවත් කිරීම ප්‍රායෝගික ප්‍රවේශයක් වේ. සක්‍රීය ෆ්ලෂ් කිරීම (උදා: බඩ-ඔන්-ඒ-චිප් හෝ දෙමුහුන්-ඒ-චිප් වේදිකාවල) හෝ විසරණය .බසොලේටරල් මාධ්‍ය (උදා: ට්‍රාන්ස්වෙල් සිට ළිංවල විශාල බාසෝලේටරල් සංචිතවලට ඇතුළු කිරීමෙන්) බාසෝලේටරල් මැදිරියේ Wnt ප්‍රතිවිරෝධක මට්ටම් පවත්වා ගැනීම.
මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ, අපි පොලිඩිමෙතිල්සිලෝක්සේන් (PDMS) මත පදනම් වූ porous membranes (steps 6A, 7A, 9Embrans in porous membranes) මත බඩවැල් එපිටිලියල් සෛල වගා කිරීම සඳහා gut-on-a-chip microdevices සහ Transwell-insertable hybrid chips (පියවර 1-5) සැකසීම සඳහා සවිස්තරාත්මක ක්‍රමයක් සපයන්නෙමු. s 6B, 7B, 8, 9) සහ induced 3D morphogenesis in vitro (පියවර 10). අපි පටක විශේෂිත histogenesis සහ පරම්පරාව මත යැපෙන සෛල විභේදනය පෙන්නුම් කරන සෛලීය සහ අණුක ලක්ෂණ බහු රූපකරණ ක්‍රම යෙදීමෙන් හඳුනා ගත්තෙමු (පියවර 11-24 වැනි මානව සෛල භාවිතා කිරීම මගින් අපි කැටිනොජෙනිස් ඉන්ඩේටේස් ඉන්ඩේස් 2. al organoids, porous membranes මතුපිට වෙනස් කිරීම, 2D monolayers නිර්මාණය, සහ බඩවැල් ජෛව රසායනික සහ ජෛව යාන්ත්‍රික microenvironment.in vitro ප්‍රතිනිෂ්පාදනය ඇතුළු තාක්ෂණික විස්තර සහිත සංස්කෘතික ආකෘති දෙකකින්. සංස්කෘතියේ මැදිරිය.අවසාන වශයෙන්, අපි morphogen මත යැපෙන අපිච්ඡද වර්ධනය, කල්පවත්නා ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී සම සංස්කෘතීන්, රෝග කාරක ආසාදන, ගිනි අවුලුවන තුවාල, අපිච්ඡද බාධක අක්‍රියතාව, සහ ප්‍රොබියොටික් මත පදනම් වූ ප්‍රතිකාර ආදර්ශයට යොදා ගත හැකි පුනර්ජනනීය ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථරයක උපයෝගිතා නියෝජනයක් සපයන්නෙමු.
අපගේ ප්‍රොටෝකෝලය මූලික (උදා, බඩවැල් ආශ්‍රිත ශ්ලේෂ්මල ජීව විද්‍යාව, ප්‍රාථමික සෛල ජීව විද්‍යාව සහ සංවර්ධන ජීව විද්‍යාව) සහ ව්‍යවහාරික පර්යේෂණ (උදා: පූර්ව සායනික ඖෂධ පරීක්ෂාව, රෝග ආකෘති නිර්මාණය, පටක ඉංජිනේරු විද්‍යාව සහ ආමාශ ආන්ත්‍ර විද්‍යාව) පුළුල් පරාසයක විද්‍යාඥයින්ට ප්‍රයෝජනවත් විය හැකිය. අපගේ තාක්ෂණික උපක්‍රමය බඩවැල් වර්ධනය, ප්‍රතිජනනය හෝ හෝමියස්ටැසිස් අතරතුර සෛල සංඥා වල ගතිකතාවයන් අධ්‍යයනය කරන ප්‍රේක්ෂකයින් වෙත බෙදා හැරිය හැකි බව .මීට අමතරව, Norovirus 8, දරුණු උග්‍ර ශ්වසන සින්ඩ්‍රෝමය Coronavirus Virus 2 (SARS-2) වැනි විවිධ ආසාදන කාරක යටතේ ආසාදන ප්‍රශ්න කිරීම සඳහා අපගේ ප්‍රොටෝකෝලය ප්‍රයෝජනවත් වේ. බ්‍රියෝ කොලරාව.රෝග ව්‍යාධි විද්‍යාව සහ ව්‍යාධිජනකය පිළිබඳ ප්‍රේක්ෂකයින් ද ප්‍රයෝජනවත් වේ. ඔන්-චිප් ගුට් ක්ෂුද්‍ර භෞතික විද්‍යා පද්ධතියක් භාවිතයෙන් කල්පවත්නා සම-සංස්කෘතිය 10 සහ පසුකාලීනව ධාරක ආරක්ෂාව, ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාර සහ රෝග කාරක ආශ්‍රිත තුවාල අළුත්වැඩියා කිරීම ආමාශ ආන්ත්රයික (GI) පත්රිකාවේ 11 තක්සේරු කිරීමට ඉඩ ලබා දේ. colitis, pouchitis, හෝ irritable bowel syndrome රෝගියාගේ 3D intestinal epithelial ස්ථර භාවිතා කරමින් 3D intestinal epithelial ස්ථර සකස් කරන විට අනුකරණය කළ හැක, මෙම රෝග වලට villous atrophy, crypt shortening, mucosal හානි, හෝ දුර්වල වූ epithelial හෝ අවයවීය බාධකයක් රෝගී පරිසරයේ ඉහළ සංකීර්ණත්වය, පාඨකයන්ට ත්‍රිමාණ බඩවැල් විලස්-ක්‍රිප්ට් ක්ෂුද්‍ර වාස්තු විද්‍යාව අඩංගු ආකෘතිවලට රෝගීන්ගේ පර්යන්ත රුධිර ඒක න්‍යෂ්ටික සෛල (පීබීඑම්සී) වැනි රෝගවලට අදාළ සෛල වර්ග එකතු කිරීම සලකා බැලිය හැකිය.පටක විශේෂිත ප්රතිශක්තිකරණ සෛල, 5.
ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය කොටස් කිරීමේ ක්‍රියාවලියකින් තොරව සවි කර දෘශ්‍යමාන කළ හැකි බැවින්, අවකාශීය පිටපත් කිරීම් සහ අධි-විභේදන හෝ අධි-විභේදන රූප මත වැඩ කරන නරඹන්නන් අපිච්ඡද ස්ථානවල ජාන සහ ප්‍රෝටීනවල අවකාශීය ගතිකත්වයන් සිතියම්ගත කිරීමට උනන්දු විය හැකිය.තාක්‍ෂණය ගැන උනන්දුයි.ක්ෂුද්‍රජීවී හෝ ප්‍රතිශක්තිකරණ උත්තේජක වලට ප්‍රතිචාර දැක්වීම.තවද, කල්පවත්නා ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී ක්‍රොස්ටෝක් 10, 14 විවිධ ක්ෂුද්‍රජීවී විශේෂ, ක්ෂුද්‍රජීවී ප්‍රජාවන් හෝ ෆීචල් ක්ෂුද්‍ර ජීවී මත සම-සංස්කරණය කිරීමෙන් ත්‍රිමාණ අන්ත්‍රවල ශ්ලේෂ්මල ස්ථරයේ ආන්ත්‍රික හෝමියෝස්ටැසිස් සම්බන්ධීකරණය කළ හැකිය.වේදිකාව තුළ.මෙම ප්‍රවේශය විද්‍යාගාරයේ කලින් සංස්කෘතීන්ට ලක් නොවූ ගුට් ක්ෂුද්‍රජීව වගා කිරීමට උත්සාහ කරන ශ්ලේෂ්මල ප්‍රතිශක්ති විද්‍යාව, ආමාශ ආන්ත්‍ර විද්‍යාව, මානව ක්ෂුද්‍ර ජීව විද්‍යාව, සංස්කෘතික විද්‍යාව සහ සායනික ක්ෂුද්‍රජීව විද්‍යාව අධ්‍යයනය කරන ප්‍රේක්ෂකයින්ට විශේෂයෙන් ආකර්ෂණීය වේ. ly basolateral මැදිරි නැවත පිරවීම, ප්‍රොටෝකෝලය ආහාර කර්මාන්තය සඳහා ඖෂධීය, ජෛව වෛද්‍ය හෝ අධි-විද්‍යාත්මක පිරික්සුම් හෝ වලංගු වේදිකා සංවර්ධනය කරන අයට ද බෙදා හැරිය හැක. මූලධර්මයේ සාක්ෂියක් ලෙස, අපි මෑතකදී බහු-විද්‍යාත්මක නිෂ්පාදන සඳහා බහු-විද්‍යාත්මක නිෂ්පාදන සඳහා බහු-විද්‍යාත්මක නිෂ්පාදන සඳහා ශක්‍යතාව ප්‍රදර්ශනය කළෙමු. 16,17,18 වානිජකරණය කර ඇත.එබැවින්, අපගේ in vitro morphogenesis ක්‍රමය වලංගු කිරීම කඩිනම් කළ හැකි අතර බොහෝ පර්යේෂණ රසායනාගාර, කර්මාන්ත හෝ රජය සහ නියාමන ආයතන මගින් in vitro gut morphogenesis සෛලීය ප්‍රතික්‍රමලේඛනය අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා භාවිතා කළ හැකිය. rogates හෝ අභිරුචි හෝ වාණිජ organ-on-a-chip ආකෘති භාවිතා කිරීම බඩවැලේ morphogenesis ක්රියාවලිය ප්රතිනිෂ්පාදනය තක්සේරු කිරීමට.
මිනිසුන්ට අදාළ පර්යේෂණාත්මක ආකෘති සීමිත සංඛ්‍යාවක් බඩවැල් එපිටිලියල් මෝර්ෆොජෙනසිස් අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා භාවිතා කර ඇත, ප්‍රධාන වශයෙන් vitro තුළ 3D morphogenesis ප්‍රේරණය කිරීමට ක්‍රියාත්මක කළ හැකි ප්‍රොටෝකෝල නොමැතිකම හේතුවෙන්. ඇත්ත වශයෙන්ම, බඩවැල් මෝර්ෆොජෙනිස් පිළිබඳ වර්තමාන දැනුමෙන් වැඩි ප්‍රමාණයක් සත්ව අධ්‍යයනයන් මත පදනම් වේ (උදා, zebrafish, m2, zebrafish) සදාචාරාත්මකව සැක සහිත වීම සහ වඩාත්ම වැදගත් දෙය නම්, මානව සංවර්ධන ක්‍රියාවලීන් නිශ්චිතව නිශ්චය නොකිරීමයි. මෙම ආකෘති බහු-මාර්ග පරිමාණය කළ හැකි ආකාරයෙන් පරීක්‍ෂා කිරීමේ හැකියාවද ඉතා සීමිතය. එබැවින්, vivo තුළ ත්‍රිමාණ පටක ව්‍යුහයන් ප්‍රතිජනනය කිරීමේ ප්‍රොටෝකෝලය vivo සත්ව ආකෘතිවල මෙන්ම අනෙකුත් සාම්ප්‍රදායික ස්ථිතික 2D සෛල සංස්කෘතීන්ට පෙර අප විසින් විස්තර කරන ලද විභාග ව්‍යුහයන් 3 ට අවසර දී ඇත. විවිධ ශ්ලේෂ්මල හෝ ප්‍රතිශක්තිකරණ උත්තේජකවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් ගුප්ත-විලස් අක්ෂය තුළ වෙනස් වූ සෛල අවකාශීය ප්‍රාදේශීයකරණය. 3D අපිච්ඡද ස්ථර මගින් ක්ෂුද්‍රජීවී සෛල ධාරක සාධකවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් අවකාශීය නිකේතන සහ පාරිසරික පරිණාමය සෑදීමට තරඟ කරන ආකාරය අධ්‍යයනය කිරීමට ඉඩක් ලබා දිය හැකිය (උදා, අභ්‍යන්තර එදිරිව පිටත ශ්ලේෂ්මල ස්ථර, peptmorlide 3D සහ IgA ප්‍රතිජීවක ස්‍රාවය). බඩවැලේ ක්ෂුද්‍රජීවය එහි ප්‍රජාවන් ව්‍යුහගත කරන්නේ කෙසේද සහ සහජීවනයෙන් ක්ෂුද්‍රජීවී පරිවෘත්තීය (උදා: කෙටි දාම මේද අම්ල) නිපදවන ආකාරය තේරුම් ගැනීමට phology අපට ඉඩ ලබා දෙන අතර එය සෛලීය සංවිධානය සහ මූලික ක්‍රිප්ට් වල ප්‍රාථමික සෛල නිකේතන හැඩගස්වයි. මෙම ලක්ෂණ පෙන්නුම් කළ හැක්කේ vitro තුළ ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථර ස්ථාපිත කළ විට පමණි.
අපගේ ත්‍රිමාණ ආන්ත්‍රික අපිච්ඡද ව්‍යුහයන් නිර්මාණය කිරීමේ ක්‍රමයට අමතරව, in vitro ක්‍රම කිහිපයක් තිබේ. Intestinal organoid සංස්කෘතිය යනු විශේෂිත morphogen තත්ත්ව යටතේ බඩවැල් ප්‍රාථමික සෛල වගා කිරීම මත පදනම් වූ අති නවීන පටක ඉංජිනේරු තාක්‍ෂණයකි. organoid තුළ සංවෘත වන අතර, එබැවින්, ක්ෂුද්ර ජීවී සෛල හෝ බාහිර ප්රතිදේහජනක වැනි ලුමිනල් සංරචක හඳුන්වාදීම සීමා වේ.organoid lumens වෙත ප්‍රවේශය microinjector භාවිතයෙන් වැඩිදියුණු කළ හැක, 26,27 නමුත් මෙම ක්‍රමය ආක්‍රමණශීලී සහ ශ්‍රම-දැඩි වන අතර ක්‍රියාත්මක කිරීමට විශේෂ දැනුමක් අවශ්‍ය වේ. තවද, ස්ථිතික තත්ව යටතේ හයිඩ්‍රොජෙල් පලංචියේ පවත්වාගෙන යනු ලබන සම්ප්‍රදායික organoid සංස්කෘතීන් vivo biomechanics හි ක්‍රියාකාරී බව නිවැරදිව පිළිබිඹු නොකරයි.
පර්යේෂණ කණ්ඩායම් කිහිපයක් විසින් භාවිතා කරන වෙනත් ප්‍රවේශයන් ජෙල් මතුපිට හුදකලා මිනිස් බඩවැල් සෛල වගා කිරීම මගින් බඩවැල් එපිටිලියල් ව්‍යුහය අනුකරණය කිරීම සඳහා පූර්ව ව්‍යුහගත ත්‍රිමාණ හයිඩ්‍රොජෙල් පලංචිය භාවිතා කරයි. ly අදාළ morphogen අනුක්‍රමික, ඉහළ දර්ශන අනුපාත අපිච්ඡද ව්‍යුහයක් ස්ථාපනය කිරීම සහ පලංචියේ ස්ට්‍රෝමාල් සෛල ඇතුළත් කිරීම මගින් ස්ට්‍රෝමා-එපිටිලියල් ක්‍රොස්ටෝක්. කෙසේ වෙතත්, පූර්ව ව්‍යුහගත පලංචියේ ස්වභාවය ස්වයංසිද්ධ රූපජනක ක්‍රියාවලිය ප්‍රදර්ශනය වීම වැළැක්විය හැකිය. morphogenesis සහ භෞතික විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරිත්වය ලබා ගැනීම.තවත් මෑත අධ්‍යයනයක් මගින් ක්ෂුද්‍ර තරල වේදිකාවක හයිඩ්‍රොජෙල් පලංචිය භාවිතා කරන ලද අතර ලේසර් කැටයම් ශිල්පීය ක්‍රම භාවිතා කරමින් රටා සහිත ආන්ත්‍රික එපිටිලියල් ව්‍යුහයන් භාවිතා කරන ලදී.මූසික ආන්ත්‍රික කාබනික ද්‍රව්‍ය ආන්ත්‍රික නල ව්‍යුහයන් සෑදීමට කැටයම් කළ රටා අනුගමනය කරයි. ස්වයංසිද්ධ රූපජනක ක්‍රියාවලීන් හෝ බඩවැල් යාන්ත්‍රික චලන ඇතුළත් නොවේ. එකම කාණ්ඩයේ ත්‍රිමාණ මුද්‍රණ ශිල්පීය ක්‍රම මගින් ස්වයංසිද්ධ රූපජනක ක්‍රියාවලීන් සහිත කුඩා බඩවැල් නල නිර්මාණය කිරීමට සමත් විය. නළය තුළ විවිධ බඩවැල් කොටස් සංකීර්ණ ලෙස සකස් කර තිබියදීත්, මෙම ආකෘතියට ද ලුමිනල් තරල ප්‍රවාහය නොමැති වීම සහ යාන්ත්‍රික විකෘතිතාවයෙන් පසුව, ජෛව ක්‍රියාවලීන්ගේ සම්පූර්ණ ආකෘතිය සීමා විය හැක. bing පර්යේෂණාත්මක තත්වයන් හෝ සෛල-සෛල අන්තර්ක්‍රියා. ඒ වෙනුවට, අපගේ යෝජිත ප්‍රොටෝකෝලය ස්වයංසිද්ධ ගුට් මෝර්ෆොජෙනසිස්, භෞතික විද්‍යාත්මකව අදාළ කැපුම් ආතතිය, බඩවැල් චලනය අනුකරණය කරන ජෛව යාන්ත්‍ර විද්‍යාව, ස්වාධීන අග්‍ර සහ මූලික පාර්ශවීය මැදිරිවල ප්‍රවේශය සහ සංකීර්ණ ජීව විද්‍යාත්මක ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම සපයයි. පවතින ක්‍රමවල අභියෝග ජය ගැනීම සඳහා අනුපූරක ප්‍රවේශයක් සැපයීම.
අපගේ ප්‍රොටෝකෝලය මුලුමනින්ම අවධානය යොමු කර ඇත්තේ ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් මෝර්ෆොජෙනිස් මත වන අතර, සංස්කෘතියේ එපිටිලියල් සෛල පමණක් වන අතර මෙසෙන්චයිමල් සෛල, එන්ඩොතලියල් සෛල සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල වැනි අවට සෛල කිසිවක් නොමැත. පෙර විස්තර කර ඇති පරිදි, අපගේ ප්‍රොටෝකෝලයේ හරය වන්නේ අපවිත්‍ර මූලද්‍රව්‍ය ප්‍රේරණය කිරීමයි. අපගේ gut-on-a-chip සහ hybrid-on-a-chip වල මොඩියුලරිටි අපට undulating 3D epithelial ස්ථරය ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමට ඉඩ සලසයි, epithelial-mesenchymal අන්තර්ක්‍රියා වැනි අතිරේක ජීව විද්‍යාත්මක සංකීර්ණතා mesenchyme හි tromal සෛල (උදා: fibroblasts) vivo35,37,38 හි ECM ප්‍රෝටීන නිෂ්පාදනය සහ බඩවැල් මෝෆෝජෙනසිස් නියාමනය කිරීමේදී ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි. අපගේ ආකෘතියට මෙසෙන්චයිමල් සෛල එකතු කිරීම මෝර්ෆොජෙනටික් ක්‍රියාවලිය වැඩි දියුණු කළ අතර සෛල ඇමුණුම් කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කරයි. 9 සහ අන්ත්‍ර ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල බඳවා ගැනීම්40. තවද, පටක ආකෘති බහු අවයව අන්තර්ක්‍රියා විදහා දැක්වීමට නිර්මාණය කර ඇති විට පටක ආකෘති අතර සම්බන්ධ කළ හැකි සනාල සංරචක පූර්ව අවශ්‍යතාවයකි. එබැවින්, එන්ඩොතලියල් සෛල ඇතුළත් කිරීමට අවශ්‍ය විය හැකිය. අනුවර්තනය කරන ලද ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රොස්ටෝක් අනුභව කරන ලද අතර, අන්ත්‍ර රෝග අනුකරණය කිරීමේ සන්දර්භය තුළ පටක විශේෂිත ප්‍රතිශක්තිය.
දෙමුහුන් චිප් භාවිතා කිරීම gut-on-a-chip වලට වඩා සරල වන්නේ උපාංග සැකසුම සරල වන අතර Transwell ඇතුළු කිරීම් භාවිතා කිරීම gut epithelium පරිමාණය කළ හැකි සංස්කෘතියට ඉඩ සලසයි. කෙසේ වෙතත්, පොලියෙස්ටර් පටල සහිත වාණිජමය වශයෙන් ලබා ගත හැකි Transwell ඇතුළු කිරීම් ප්‍රත්‍යාස්ථ නොවන අතර සංසන්දනාත්මක චලනයන් අනුකරණය කළ නොහැක. දෙමුහුන් චිපය අග්‍ර පැත්තේ කිසිදු කැපුම් ආතතියකින් තොරව නිශ්චලව පැවතුනි. පැහැදිලිවම, අග්‍රස්ථ මැදිරියේ ඇති ස්ථිතික ගුණාංග දෙමුහුන් චිප්ස් තුළ දිගු කාලීන බැක්ටීරියා සම-සංස්කෘතිය සක්‍රීය කරන්නේ කලාතුරකිනි. අපට ට්‍රාන්ස්වෙල් තුළ ත්‍රිමාණ මෝර්ෆොජෙනිස් ප්‍රබල ලෙස ප්‍රේරණය කළ හැකි අතර, භෞතික විද්‍යාත්මක ද්‍රවයන් භාවිතා කරන විට භෞතික විද්‍යාත්මක ප්‍රවාහයන් සීමා කළ හැකිය. විභව යෙදුම් සඳහා දෙමුහුන් චිප් වේදිකා වල හැකියාව.
gut-on-a-chip සහ hybrid-on-a-chip සංස්කෘතීන්හි මානව ගුප්ත-විලස් අක්ෂය පූර්ණ-පරිමාණ ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම් සම්පූර්ණයෙන් තහවුරු වී නොමැත. මෝර්ෆොජෙනිසිස් ආරම්භ වන්නේ අපිච්ඡද ඒකස්ථරයකින් බැවින්, ත්‍රිමාණ ක්ෂුද්‍ර ගෘහ නිර්මාණ ශිල්පය මගින් ක්‍රිප්ට්-විලස් ක්‍රිප්ට්-විලස් අක්ෂයේ ජීව ක්‍රිප්ටිය ආසන්නයේ ජීව ගුණයට රූප විද්‍යාත්මක සමානකමක් ලබා නොදේ. ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරුමය ත්‍රිමාණ එපිටිලියම් වල වසම, ගුප්ත සහ වල් ප්‍රදේශ පැහැදිලිව වෙන් කර නොමැත. චිපයේ ඉහළ ඉහළ නාලිකා ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරු එපිටිලියම්වල උස වැඩි කිරීමට හේතු වුවද, උපරිම උස තවමත් ~300-400 µm දක්වා සීමා වේ. මිනිස් බඩවැල්වල සැබෑ ගැඹුර 30 µ0 කුඩා අන්ත්‍රවල 30 ~ විශාල ගැඹුර වේ. µm, පිළිවෙලින්, සහ කුඩා අන්ත්‍ර වල උස ~600 µm41 වේ.
නිරූපණ දෘෂ්ටි කෝණයකින්, ත්‍රිමාණ ක්ෂුද්‍ර වාස්තු විද්‍යාවේ ස්ථානීය සුපිරි විභේදන රූප කිරීම චිපයක් මත ඇති අන්ත්‍රයට සීමා විය හැක, මන්ද යත් වෛෂයික කාචයේ සිට එපිටිලියල් ස්ථරයට අවශ්‍ය ක්‍රියාකාරී දුර මිලිමීටර කිහිපයක අනුපිළිවෙලට පවතින බැවිනි. මෙම ගැටළුව මඟහරවා ගැනීම සඳහා, දුරස්ථ අරමුණක් අවශ්‍ය විය හැකිය. DMS.තව දුරටත්, චිපයක් මත ඇති අන්ත්‍රයේ ස්තරයෙන් ස්ථර ක්ෂුද්‍ර සැකැස්ම එක් එක් ස්ථරයක් අතර ස්ථිර ඇලීමක් ඇතුළත් වන බැවින්, එපිටිලියල් ස්ථරයේ මතුපිට ව්‍යුහය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා ඉහළ ස්ථරය විවෘත කිරීම හෝ ඉවත් කිරීම අතිශයින් අභියෝගාත්මක ය. නිදසුනක් ලෙස, ස්කෑනිං ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂයක් (SEM) භාවිතා කිරීමෙනි.
PDMS හි ජලභීතිකාව හයිඩ්‍රොෆෝබික් කුඩා අණු සමඟ කටයුතු කරන ක්ෂුද්‍ර තරල පදනම් වූ අධ්‍යයනයන්හි සීමාකාරී සාධකයක් වී ඇත, මන්ද PDMS හට එවැනි ජලභීතික අණු විශේෂිතව අවශෝෂණය කළ හැකි බැවිනි. PDMS සඳහා විකල්ප වෙනත් බහු අවයවීය ද්‍රව්‍ය සමඟ සලකා බැලිය හැකිය. 43) ජලභීතික අණු වල අවශෝෂණය අවම කිරීම සඳහා සලකා බැලිය හැක.
අවසාන වශයෙන්, අපගේ ක්‍රමය ඉහළ කාර්යක්‍ෂම පිරික්සීමක් හෝ “සියල්ලටම ගැලපෙන” පරිශීලක-හිතකාමී පර්යේෂණ වේදිකාවක් සැපයීම සම්බන්ධයෙන් හොඳින් සංලක්ෂිත වී නොමැත. වත්මන් ප්‍රොටෝකෝලයට මයික්‍රෝ උපාංගයකට සිරින්ජ පොම්පයක් අවශ්‍ය වේ, එය CO2 ඉන්කියුබේටරයක ඉඩ ලබා ගන්නා අතර මහා පරිමාණ අත්හදා බැලීම් වළක්වයි. මෙම සීමාව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු කළ හැකිය. 384-හොඳින් සිදුරු සහිත ඇතුළු කිරීම් අඛණ්ඩව නැවත පිරවීමට සහ බාසොලේටරල් මාධ්‍ය ඉවත් කිරීමට ඉඩ සලසයි).
vitro තුළ මානව බඩවැල්වල අපිච්ඡදයේ 3D morphogenesis ඇති කිරීමට, අපි lumen-කේශනාලිකා අතුරු මුහුණතක් නිර්මාණය කිරීමට සමාන්තර microchannels දෙකක් සහ elastic porous membrane අඩංගු microfluidic chip intestinal උපාංගයක් භාවිතා කළා. ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් මත වැඩෙන එපිටිලියල් ස්ථර. වේදිකා දෙකෙහිම, විවිධ මිනිස් අන්ත්‍රයේ එපිටිලියල් සෛලවල මෝර්ෆොජෙනිස් ප්‍රවාහයේ දිශානුගතව හැසිරවීම මගින් බාසොලේටරල් මැදිරියෙන් මෝෆෝජන් ප්‍රතිවිරෝධක ඉවත් කිරීම සඳහා ප්‍රදර්ශනය කළ හැකිය. සම්පූර්ණ පරීක්ෂණ ක්‍රියා පටිපාටිය (රූපය 1) කොටස් පහකින් සමන්විත වේ (රූප සටහන 1) eps 1-5; කොටුව 1), (ii) අන්ත්‍ර අපිච්ඡද සෛල (Caco-2 සෛල) හෝ මානව ආන්ත්‍රික කාබනික ද්‍රව්‍ය සකස් කිරීම;පෙට්ටි 2-5), (iii) බඩවැල් චිප්ස් හෝ දෙමුහුන් චිප්ස් මත බඩවැල් එපිටිලියල් සෛල සංස්කෘතිය (පියවර 6-9), (iv) ත්‍රිමාණ මෝර්ෆොජෙනිසිස් ප්‍රේරණය in vitro (පියවර 10) සහ (v) ) ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා සුදුසු ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය. ) එපිටිලියල් මෝර්ෆොජෙනසිස් අවකාශීය, තාවකාලික, කොන්දේසිගත හෝ ක්‍රියා පටිපාටි පාලනයන් සමඟ සංසන්දනය කිරීම මගින් in vitro morphogenesis වල සඵලතාවය තහවුරු කිරීමට සැලසුම් කර ඇත.
අපි විවිධ සංස්කෘතීන් වේදිකා දෙකක් භාවිතා කළෙමු: සෘජු නාලිකා හෝ රේඛීය නොවන සංකලන නාලිකා සහිත gut-on-a-chip, හෝ 1 කොටුවේ විස්තර කර ඇති පරිදි නිපදවන ලද ක්ෂුද්‍ර තරල උපාංගයක Transwell (TW) ඇතුළත් කිරීම් අඩංගු දෙමුහුන් චිප්, සහ පියවර 1 -5.”Device Fabrication” මගින් E hybridd chip හි ප්‍රධාන පියවර පැහැදිලි කරයි. සෛල ප්‍රභවය (Caco-2 හෝ human intestinal organoids) සහ මෙම ප්‍රොටෝකෝලයෙහි භාවිතා වන සංස්කෘතික ක්‍රියා පටිපාටිය.”In vitro morphogenesis” මගින් Caco-2 හෝ organoid-ව්‍යුත්පන්න එපිටිලියල් සෛල ආන්ත්‍රික චිපයක් මත හෝ ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කරන ලද සමස්ත පියවරයන් පෙන්නුම් කරයි. එක් එක් ඊතලයට පහළින් පියවර අංකය හෝ කොටු අංකය පෙන්වනු ලැබේ. යෙදුම මඟින් ස්ථාපිත බඩවැල් එපිටිලියල් ස්ථර භාවිතා කළ හැකි ආකාරය පිළිබඳ උදාහරණ සපයයි, උදාහරණයක් ලෙස, සෛල අවකලනය ගුනාංගීකරනය, බඩවැල් භෞතික විද්‍යා අධ්‍යයනය, ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී පරිසර පද්ධති පිහිටුවීම, සහ රෝග ආකෘති නිර්මාණය. අන්ත්‍ර චිපය මත ජනනය වන al ස්ථරය.MUC2 සංඥාව ගෝබ්ලට් සෛලවල සහ ශ්ලේෂ්මල මතුපිටින් ස්‍රාවය වන ශ්ලේෂ්මලවල පවතී. Gut Physiology හි ප්‍රතිදීප්ත රූප මගින් sialic අම්ලය සහ N-acetylglucosamine අපද්‍රව්‍ය සඳහා පැල්ලම් කිරීමෙන් නිපදවන ශ්ලේෂ්මල පෙන්නුම් කරයි. චිපයක් මත බඩවැලේ ඇති සජීවී ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී සම සංස්කෘතීන්. වම් පුවරුව ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරු 3D Caco-2 අපිච්ඡද සෛල සමඟ හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (GFP) ප්‍රකාශ කරන E. coli හි සම-සංස්කෘතිය පෙන්වයි. ) සහ න්‍යෂ්ටිය (නිල්) .රෝග ආකෘති නිර්මාණය මගින් බැක්ටීරියා ප්‍රතිදේහජනක (උදා: lipopolysaccharide, LPS) සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල (උදා, PBMC;කොළ පැහැති).Caco-2 සෛල ත්‍රිමාණ අපිච්ඡද ස්ථරයක් පිහිටුවීම සඳහා වගා කරන ලදී.පරිමාණ තීරුව, 50 µm.පහළ පේළියේ රූප: යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කරන ලද “සෛල වෙනස”.2.ඔක්ස්ෆර්ඩ් විශ්වවිද්‍යාල මුද්‍රණාලය;Ref.5 හි අවසරය ඇතිව ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කරන ලදී.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" ref.3 හි අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කරන ලදී.NAS;යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කරන ලද "රෝග ආකෘති නිර්මාණය".5.NAS.
Gut-on-chip සහ hybrid chips යන දෙකම PDMS අනුරූ භාවිතයෙන් නිපදවා ඇති අතර ඒවා මෘදු ලිතෝග්‍රැෆි1,44 මගින් සිලිකන් අච්චු වලින් ගලවා SU-8 සමඟ රටා සකස් කර ඇත. එක් එක් චිපයේ ඇති ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවල සැලසුම තීරණය වන්නේ ෂියර් ආතතිය සහ ජල ගතික පීඩනය වැනි හයිඩ්‍රොඩයිනමික් සලකා බැලීමෙනි. සමාන්තරව ඇති සමාන්තර සෘජු ක්ෂුද්‍ර නාලිකා දෙකකින් සමන්විත වූ එය, සංකීර්ණ ගුට්-ඔන්-ඒ-චිපයක් බවට පරිණාමය වී ඇත (දිගු දත්ත Fig. 1b) එයට වක්‍ර ක්ෂුද්‍ර නාලිකා යුගලයක් ඇතුළත් වන අතර එය වැඩිවන තරල පදිංචි කාලය, රේඛීය නොවන ප්‍රවාහ රටා සහ සංස්කෘත සෛලවල බහුඅක්ෂීය විරූපණය ප්‍රතිනිර්මාණය කළ යුතුය. , සංකීර්ණ gut-on-a-chips තෝරාගත හැක. අපි ඔප්පු කර ඇති පරිදි කැටි ගැසුණු Gut-Chip ද මුල් Gut-Chip හා සසඳන විට එපිටිලියල් වර්ධනයේ සමාන මට්ටමක් සහිත සමාන කාල රාමුවක් තුළ 3D morphogenesis ප්‍රබල ලෙස ප්‍රේරණය කරන බව අපි ඔප්පු කර ඇත්තෙමු. SU-8 රටා සහිත සිලිකන් අච්චු මත සුව කරන ලද ලිකාස් කඩා දැමීමෙන් පසු ඍණාත්මක ලක්ෂණ ලබා දුන්නේය (රූපය 1).2a).චිපයක් මත අන්ත්‍රය සෑදීම සඳහා, සකස් කරන ලද ඉහළ PDMS ස්තරය අනුක්‍රමිකව සිදුරු සහිත PDMS පටලයකට බන්ධනය කර, පසුව කොරෝනා ප්‍රතිකාරකය භාවිතයෙන් ආපසු හැරවිය නොහැකි බන්ධනයකින් පහළ PDMS ස්තරය සමඟ සමපාත කර ඇත (රූපය 2b-f). commodate Transwell ඇතුළු කිරීම් (රූපය 2h සහ Extended Data Fig. 2). බන්ධන ක්‍රියාවලිය සිදු කරනු ලබන්නේ PDMS අනුරුව සහ වීදුරු මතුපිට ඔක්සිජන් ප්ලාස්මා හෝ කොරෝනා ප්‍රතිකාරය මගින් ප්‍රතිකාර කිරීමෙනි.
a, SU-8 රටා සහිත සිලිකන් අච්චු වලින් PDMS කොටස් සකස් කිරීමේ ක්‍රමානුකුල නිදර්ශනය. නොසුදුන ලද PDMS ද්‍රාවණය සිලිකන් අච්චුවකට වත් කර (වමේ), 60 °C (මැද) සහ කඩා ඉවත් කර (දකුණේ) කපා ඉවත් කරන ලදී. PDMS porous membrane.d නිෂ්පාදනය සඳහා භාවිතා කරන සිලිකන් අච්චුව, ඉහළ සහ පහළ PDMS සංරචකවල ඡායාරූප මාලාවක් සහ එකලස් කරන ලද චිප් ආන්ත්‍රික උපාංගය.e, ඉහළ, පටල සහ පහළ PDMS සංරචක පෙළගැස්වීමේ ක්‍රමානුකුලව. අධි බලැති ක්ෂුද්‍ර නාලිකා සහ රික්ත කුටීර සමඟ, ක්ෂුද්‍ර තරල සෛල සංස්කෘතිය සඳහා ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප සැකසුම. සිලිකොන් බටයක් සහ සිරින්ජයක් සමඟ එකලස් කරන ලද චිපයක් මත සාදන ලද බඩවැල් ආවරණයක් මත තබා ඇත. චිප් උපකරණය පෙට්‍රි ඩිෂ් නලයක පියනක් මත තබා ඇත. දෙමුහුන් චිප් නිපදවීම සහ දෙමුහුන් චිප් භාවිතා කරමින් ත්‍රිමාණ මෝර්ෆොජෙනිස් වල ඡායාරූප. සංස්කෘතියට ස්වාධීනව සකස් කරන ලද ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් 2D බඩවැල් එපිටිලියල් සෛලවල දෙමුහුන් චිපයට ඇතුළු කරන ලදී. තීරුව, 1 cm.h යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව නැවත මුද්‍රණය කරන ලදී.4.එල්සෙවියර්.
මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ, Caco-2 සෛල රේඛාව සහ බඩවැල් ආශ්‍රිත කාබනික ද්‍රව්‍ය අපිච්ඡද ප්‍රභවයන් ලෙස භාවිතා කරන ලදී (රූපය 3a). සෛල වර්ග දෙකම ස්වාධීනව වගා කරන ලදී (කොටුව 2 සහ කොටු 5) සහ ECM-ආලේපිත ක්ෂුද්‍ර නාලිකා on-chip gut හෝ Transwell inserts (Cells 9 inserts) බීජ කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. ඡේද 10 සහ 50 අතර ටී-ප්ලාස්ක් වල අස්වනු නෙලනු ලබන්නේ ට්‍රයිප්සිනීකරණ තරලය (කොටුව 2) මගින් විඝටනය වූ සෛල අත්හිටුවීම් සකස් කිරීම සඳහා ය. බඩවැල් ආශ්‍රිත බයොප්සි හෝ ශල්‍ය ඛණ්ඩනයන්හි මානව බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය මැට්‍රිජල් පලංචියේ ගෝලාකාරවල වගා කරන ලදී. nt, R-spondin, සහ Noggin) සහ 3 වන පෙට්ටියේ විස්තර කර ඇති පරිදි සකස් කරන ලද වර්ධන සාධක, organoids විෂ්කම්භය ~500 µm දක්වා වර්ධනය වන තෙක් සෑම දිනකම අතිරේකව සපයනු ලැබේ. සම්පූර්ණයෙන් වැඩුණු organoids අස්වැන්න නෙළා, බඩවැලේ බීජ කිරීම සඳහා තනි සෛල වලට විඝටනය කරනු ලැබේ. උදා: ulcerative colitis, Crohn's disease, කොලරෙක්ටල් පිළිකා, හෝ සාමාන්‍ය පරිත්‍යාගශීලියා), තුවාල වූ ස්ථානය (උදා, තුවාලය එදිරිව තුවාල නොවන ප්‍රදේශය) සහ පත්‍රිකාවේ ආමාශ ආන්ත්රයික පිහිටීම (උදා, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, හෝ rectum).අපි සාමාන්‍ය colonoids සඳහා ප්‍රශස්ත ලෙස සකස් කරන ලද colonoids (Botocoloids) සපයන්නෙමු. කුඩා ආන්ත්‍රික කාබනික ද්‍රව්‍යවලට වඩා මෝර්ෆොජන් වැඩි සාන්ද්‍රණයක් අවශ්‍ය වේ.
a, බඩවැල් චිපයේ බඩවැල් මෝර්ෆොජෙනිස් ප්‍රේරණය සඳහා කාර්ය ප්‍රවාහය.Caco-2 මානව බඩවැල් එපිටිලියම් සහ බඩවැල් organoids මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ 3D morphogenesis නිරූපණය කිරීමට භාවිතා කරයි. හුදකලා වූ අපිච්ඡද සෛල සකස් කරන ලද බඩවැල් මත බීජ කර ඇත. DMS porous membrane on day 0 (D0), apical (AP) ප්‍රවාහය මුල් දින 2 සඳහා (ප්‍රවාහය, AP, D0-D2) ආරම්භ කර පවත්වා ගෙන යනු ලැබේ. සම්පූර්ණ 2D monolayer එකක් සෑදූ විට 3D monolayer එකක් ඇති වූ විට චක්‍රීය දිගු කිරීමේ චලිතයන් (දිගු කිරීම, ප්‍රවාහය, AP සහ BL) සමඟ Basolateral (BL) ප්‍රවාහය ද ආරම්භ වේ. ක්ෂුද්‍ර තරල සංස්කෘතියේ දින 5ක් (morphogenesis, D5).අදියර ප්‍රතිවිරෝධතා රූප මගින් Caco-2 සෛලවල එක් එක් පර්යේෂණාත්මක පියවර හෝ කාල ලක්ෂ්‍යයේ නියෝජන රූප විද්‍යාව පෙන්වයි (තීරුව ප්‍රස්ථාරය, 100 µm). බඩවැලේ අනුරූප කඳුරැල්ල නිදර්ශනය කරන ක්‍රමානුරූප රූප සටහන් හතරක්. ස්ථාපිත 3D Caco-2 epithelium හි (වමේ). විශාලනය කරන ලද ප්‍රදේශය (සුදු ඉරි ඇති පෙට්ටිය) ඉස්මතු කරන ඇතුල් කිරීම 3D Caco-2 ස්ථරයේ (දකුණේ) ප්‍රතිජනනය කරන ලද microvilli පෙන්වයි. ආන්ත්‍රික චිප්ස් මත එපිටිලියල් සෛලවල ප්‍රතිදීප්ත සංක්‍රමණ දෘශ්‍යකරණය. මැද ක්‍රමානුරූප වෙත යොමු කරන ඊතල මඟින් එක් එක් confocal view සඳහා නාභීය තලයේ පිහිටීම දක්වයි.d, අදියර ප්‍රතිවිරෝධතා අන්වීක්ෂයකින් ලබාගත් චිපයක් මත වගා කරන ලද කාබනික ද්‍රව්‍යවල රූප විද්‍යාත්මක වෙනස්වීම්වල කාල පාඨමාලා 3, 7, 9, 11 දිනවල දී ඉහළ අගයක් පෙන්වයි. 7.f දින ගන්නා ලද පෙත්ත මත බඩවැලේ පිහිටුවා ඇති organoid 3D epithelium හි IC ඡායා රූප සටහන, ප්‍රාථමික සෛල සඳහා සලකුණු පෙන්වන අධිප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිදීප්ත රූප (LGR5;මැජෙන්ටා), ගොබ්ලට් සෛල (MUC2; කොළ), F-actin (අළු) සහ න්යෂ්ටි (සයන්) බඩවැල් චිප්ස් මත දින 3 ක්, පිළිවෙලින් (වමේ) සහ දින 13 (මැද) organoids අපිච්ඡද ස්තරය මත වර්ධනය කර ඇත. එපිටිලියල් ස්තරයේ ඇති දිගු දත්ත රූප සටහන 3 ද බලන්න. සංස්කෘතියේ 13 වන දින CellMask ඩයි (දකුණ) සමඟ ප්ලාස්මා පටලය පැල්ලම් කිරීමෙන් චිපයක් මත බඩවැලේ පිහිටුවා ඇති ත්‍රිමාණ organoid epithelium හි ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය (දකුණේ). වෙනත් ආකාරයකින් ප්‍රකාශ නොකළහොත් පරිමාණ තීරුව 50 μm වේ.b යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව නැවත මුද්‍රණය කර ඇත.2.ඔක්ස්ෆර්ඩ් විශ්වවිද්‍යාල මුද්‍රණාලය;c යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කරන ලදී.2.ඔක්ස්ෆර්ඩ් විශ්වවිද්‍යාල මුද්‍රණාලය;e සහ f යොමුව අවසරය සහිතව අනුවර්තනය කරන ලදී.12 Creative Commons බලපත්‍රය යටතේ CC BY 4.0.
චිපයක් මත බඩවැලේ, සාර්ථක ECM ආලේපනයක් සඳහා PDMS porous membrane හි ජලභීතික මතුපිට වෙනස් කිරීම අවශ්‍ය වේ. මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ, PDMS පටලවල ජලභීතිකාව වෙනස් කිරීමට අපි විවිධ ක්‍රම දෙකක් යොදන්නෙමු. Caco-2 සෛල වගා කිරීම සඳහා, UV/ඕසෝන් ප්‍රතිකාරය සඳහා මතුපිට සක්‍රීය කිරීම ප්‍රමාණවත් විය. PDMS පටලයට Caco-2 සෛල. කෙසේ වෙතත්, organoid epithelium හි ක්ෂුද්‍ර තරල සංස්කෘතියට ECM ප්‍රෝටීන කාර්යක්ෂමව තැන්පත් කිරීම සඳහා රසායනික පාදක මතුපිට ක්‍රියාකාරීත්වය අවශ්‍ය වේ. oid epithelium.සෛල ඇමිණීමෙන් පසු, ක්ෂුද්‍ර තරල සෛල සංස්කෘතිය ආරම්භ වන්නේ සෛල සම්පූර්ණ ඒකස්ථරයක් සාදනු ලබන තෙක් මාධ්‍යය පමණක් ඉහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවට පර්ෆියුස් කිරීමෙන් වන අතර, පහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකාව ස්ථිතික තත්ව පවත්වාගෙන යයි.මෙම ප්‍රශස්ත ක්‍රමය පෘෂ්ඨීය සක්‍රිය කිරීම සහ ECM ආෙල්පනය සඳහා organoid epithelium මතුපිටට ඩී.ඩී.එම්.පී.එම්.එස්.
ට්‍රාන්ස්වෙල් සංස්කෘතීන්ට සෛල වැපිරීමට පෙර ECM ආලේපනය ද අවශ්‍ය වේ;කෙසේ වෙතත්, ට්‍රාන්ස්වෙල් සංස්කෘතීන්ට සිදුරු සහිත ඇතුළු කිරීම් මතුපිට සක්‍රීය කිරීමට සංකීර්ණ පූර්ව ප්‍රතිකාර ක්‍රම අවශ්‍ය නොවේ. ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් මත Caco-2 සෛල වර්ධනය කිරීම සඳහා, සිදුරු සහිත ඇතුළු කිරීම් මත ECM ආලේපනය විඝටනය වූ Caco-2 සෛල (පැය<1) ඇමිණීම වේගවත් කරයි (පැය<1) සහ තද සන්ධි බාධක සෑදීම වේගවත් කරයි ECM-ආලේපිත ඇතුළු කිරීම් මත, පටල මතුපිටට සම්බන්ධ කර (<3 h) සහ organoids බාධක අඛණ්ඩතාව සහිත සම්පූර්ණ ඒක ස්තරයක් සාදනු ලබන තෙක් නඩත්තු කරනු ලැබේ .Transwell සංස්කෘතීන් දෙමුහුන් චිප් භාවිතයෙන් තොරව ළිං 24-ළිං තහඩු වල සිදු කරනු ලැබේ.
ස්ථාපිත එපිටිලියල් ස්තරයක බාසොලේටරල් අංශයට තරල ප්‍රවාහය යෙදීමෙන් in vitro 3D morphogenesis ආරම්භ කළ හැක. චිපයක් මත ඇති බඩවැලේ, මාධ්‍යය ඉහළ සහ පහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවලට (Fig. 3a) විසර්ජනය කළ විට එපිටිලියල් මෝෆෝජෙනිසිස් ආරම්භ විය. ස්‍රාවය කරන ලද මෝෆෝජන් නිෂේධක. සිදුරු සහිත පටල මත බැඳී ඇති සෛලවලට ප්‍රමාණවත් පෝෂ්‍ය පදාර්ථ සහ සීරම් සැපයීමට සහ ලුමිනල් ෂියර් ආතතිය ජනනය කිරීමට, අපි සාමාන්‍යයෙන් චිපයක් මත බඩවැලේ ද්විත්ව ප්‍රවාහයක් යොදන්නෙමු. rt microchannel හරහා.ආන්ත්‍රික morphogenesis සංස්කෘතිය වේදිකා දෙකෙහිම basolateral ප්‍රවාහය ආරම්භ වී දින 3-5 කට පසුව සිදු විය.
ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරුමය ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථරවල රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ, අදියර ප්‍රතිවිරුද්ධ අන්වීක්ෂය, අවකල්‍ය මැදිහත්වීම් පරස්පර (DIC) අන්වීක්ෂය, SEM, හෝ immunofluorescence confocal microscopy (Figures 3 සහ 4) ඇතුළු විවිධ රූපකරණ ක්‍රම යෙදීමෙන් විශ්ලේෂණය කළ හැක. අපිච්ඡද ස්ථර.PDMS සහ පොලියෙස්ටර් පටලවල දෘශ්‍ය පාරදෘශ්‍යතාවය හේතුවෙන්, gut-on-a-chip සහ hybrid chip platforms යන දෙකටම උපාංගය කොටස් කිරීම හෝ විසුරුවා හැරීමේ අවශ්‍යතාවයකින් තොරව ස්ථානීය රූපකරණයේදී තත්‍ය කාලීනව සැපයිය හැක. ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්ත රූපකරණය සිදු කරන විට (Figures 1, 3b, c, 4c, c, vol. dehyde (PFA), පසුව ට්‍රයිටන් X-100 සහ 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA) අනුපිළිවෙලින්. සෛල වර්ගය මත පදනම්ව, විවිධ සවිකරන, පාරගම්‍යකාරක සහ අවහිර කාරක භාවිතා කළ හැක. ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ ඉලක්ක කර ගන්නා ප්‍රධාන ප්‍රතිදේහ, ප්‍රතිජීවක සෛල හෝ කලාපීය සලකුණු මගින් ප්‍රතිජීවක සෛල මත ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල හෝ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල මත උද්දීපනය කිරීමට භාවිතා කරයි. සායම් න්‍යෂ්ටිය (උදා, 4′,6-diamidino-2-phenylene) ඉන්ඩෝල්, DAPI) හෝ F-actin (උදා, ප්‍රතිදීප්ත ලෙස ලේබල් කරන ලද phalloidin) ඉලක්ක කර ගනිමින් ශ්ලේෂ්මල නිෂ්පාදනය හඳුනා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිදීපනය මත පදනම් වූ සජීවී ප්‍රතිබිම්බය ස්ථානගතව සිදු කළ හැක (රූපය.1, “සෛල අවකලනය” සහ “බඩවැල් කායික විද්‍යාව”), ක්ෂුද්‍රජීවී සෛල අහඹු ලෙස යටත් විජිතකරණය (රූපය 1, “ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී සම සංස්කෘතිය”), ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල බඳවා ගැනීම (පය. 1, 'රෝග ආකෘති නිර්මාණය') හෝ 3D epithelial morphology හි සමෝච්ඡයන්, henbicify 3 modicify, Fig. ref හි විස්තර කර ඇති පරිදි, ref හි විස්තර කර ඇති පරිදි, පහළ microchannel ස්ථරයෙන් ඉහල ස්ථරය වෙන් කරන්න. 3D epithelial morphology මෙන්ම අග්‍ර බුරුසු මායිමේ ඇති microvilli SEM මගින් දෘෂ්‍යමාන කළ හැක (රූපය 3b). අවකලනය සලකුණු වල ප්‍රකාශනය ප්‍රමාණාත්මක PCR5 හෝ ඒකලිත RNA සෛලවල ප්‍රමාණාත්මක පරිවර්තන සිදුකිරීමෙන් තක්සේරු කළ හැක. ut චිප්ස් හෝ දෙමුහුන් චිප්ස් ට්‍රයිප්සිනීකරණය මගින් අස්වනු නෙලනු ලබන අතර පසුව අණුක හෝ ජාන විශ්ලේෂණය සඳහා යොදා ගනී.
a, දෙමුහුන් චිපයක් තුළ බඩවැල් මෝෆෝජෙනිස් ප්‍රේරණය සඳහා කාර්ය ප්‍රවාහය. දෙමුහුන් චිප් වේදිකාවක් තුළ ත්‍රිමාණ මෝර්ෆොජෙනිස් ප්‍රදර්ශනය කිරීමට මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ Caco-2 සහ බඩවැල් organoids භාවිතා කරනු ලැබේ. විඝටනය වූ අපිච්ඡද සෛල සකස් කරන ලද Transwell ඇතුළු කරන ලද සෛලවල බීජ කර ඇත. ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් වල ඇති පටල, සියලුම සෛල ස්ථිතික තත්ත්‍වයන් (TW සංස්කෘතිය) යටතේ වගා කරන ලදී. දින 7කට පසු, 2D ඒක ස්තරයක අපිච්ඡද සෛල අඩංගු තනි ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීමක් දෙමුහුන් චිපයකට අනුකලනය කරන ලදී. සාමාන්‍ය පරිත්‍යාගශීලියාගෙන් (C103 රේඛාව) ආරෝහණ මහා බඩවැලේ සිට ව්‍යුත්පන්න වූ මානව ඉන්ද්‍රිය එපිටිලියල් සෛලවල රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ පෙන්වන ප්‍රස්ථාර තනතුරු (ඉහළ, මැද සහ පහළ;දකුණු ක්‍රමානුරූප සහ අනුරූප තිත් රේඛා බලන්න).පැහැදිලි රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ පෙන්නුම් කර ඇත.F-actin (cyan), න්යෂ්ටිය (අළු).c, Fluorescence confocal micrographs (3D කෝණික දර්ශනය) ස්ථිතික Transwell (TW; inset within white dashed box) එදිරිව දෙමුහුන් චිප් (විශාලතම සම්පූර්ණ වෙඩි තැබීම 3D morphology) සාපේක්ෂව ical හරස් කැපුම් දසුන් (ඉහළ දකුණු කෙළවරේ ඇතුළත් කිරීම; "XZ") ද 2D සහ 3D විශේෂාංග පෙන්වයි. පරිමාණ තීරුව, 100 µm.c යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව නැවත මුද්‍රණය කර ඇත.4.එල්සෙවියර්.
සාම්ප්‍රදායික ස්ථිතික සංස්කෘතික තත්ව යටතේ එකම සෛල (Caco-2 හෝ intestinal organoid epithelial සෛල) ද්විමාන ඒකස්ථර බවට වගා කිරීමෙන් පාලනය සකස් කළ හැක.විශේෂයෙන්, ක්ෂුද්‍ර නාලිකා වල සීමිත පරිමා ධාරිතාව හේතුවෙන් පෝෂක ක්ෂය වීමක් සිදු විය හැක (එනම් ~4 µL ට පෙර මුල් නිර්මාණයේ සහ ‍ප්‍රති-පිළිවෙලෙහි මුල් පිටපතේ මුල්‍ය නිර්මාණයට පෙර). basolateral ප්රවාහය ද සැසඳිය හැක.
මෘදු ලිතෝග්‍රැෆි ක්‍රියාවලිය පිරිසිදු කාමරයක සිදු කළ යුතුය. චිපයේ (ඉහළ සහ පහළ ස්ථර සහ පටල) සහ දෙමුහුන් චිප්ස් මත එක් එක් ස්ථරයක් සඳහා විවිධ ෆොටෝමාස්ක් භාවිතා කර වෙනම සිලිකන් වේෆර් මත නිපදවා ඇත, මන්ද ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවල උස වෙනස් විය. දෙමුහුන් චිපයේ 200 µm වේ.
ඇසිටෝන් සහිත පිඟානක අඟල් 3ක සිලිකන් වේෆරයක් තබන්න.තත්පර 30ක් සඳහා තහඩුව මෘදු ලෙස කරකවන්න, ඉන්පසු වේෆරය වාතයෙන් වියළන්න. වේෆරය IPA සහිත තහඩුවකට මාරු කරන්න, ඉන්පසු පිරිසිදු කිරීමට තහඩුව තත්පර 30ක් කරකවන්න.
piranha ද්‍රාවණයක් (හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් සහ සාන්ද්‍ර සල්ෆියුරික් අම්ලය මිශ්‍රණය, 1:3 (vol/vol)) විකල්ප වශයෙන් සිලිකන් වේෆර් මතුපිටින් කාබනික අපද්‍රව්‍ය ඉවත් කිරීම උපරිම කිරීමට භාවිතා කළ හැක.
Piranha ද්‍රාවණය අතිශයින් විඛාදනයට ලක් වන අතර තාපය ජනනය කරයි. අමතර ආරක්ෂිත පූර්වාරක්ෂාවන් අවශ්‍ය වේ. අපද්‍රව්‍ය බැහැර කිරීම සඳහා විසඳුම සිසිල් කර පිරිසිදු වියළි අපද්‍රව්‍ය භාජනයකට මාරු කිරීමට ඉඩ දෙන්න. ද්විතියික බහාලුම් භාවිතා කරන්න සහ අපද්‍රව්‍ය බහාලුම් නිසි ලෙස ලේබල් කරන්න. වඩාත් සවිස්තරාත්මක ක්‍රියා පටිපාටි සඳහා පහසුකමෙහි ආරක්ෂක මාර්ගෝපදේශ අනුගමනය කරන්න.
මිනිත්තු 10 ක් සඳහා 200 °C උණුසුම් තට්ටුවක් මත තැබීමෙන් වේෆර් විජලනය කරන්න. විජලනය කිරීමෙන් පසු, වේෆරය සිසිල් කිරීම සඳහා වාතයේ පස් වතාවක් සොලවා ඇත.
Photoresist SU-8 2100 ග්‍රෑම් 10 ක් පිරිසිදු කරන ලද සිලිකන් වේෆරයේ මැදට වත් කරන්න. ඡායා ප්‍රතිරෝධය වේෆරය මත ඒකාකාරව පැතිරීමට කරකැවිල්ල භාවිතා කරන්න. ඉඳහිට 65°C උණුසුම් තහඩුවක් මත වේෆරය තබන්න
SU-8 ස්පින් ආලේපනය ධාවනය කිරීම මගින් වේෆරය මත ඒකාකාරව බෙදා හරින ලදී. SU-8 හි එන භ්‍රමණය තත්පර 5-10 ක් සඳහා ක්‍රමලේඛනය කරන්න 500 rpm / s ත්වරණයකින් 100 rpm දී ප්‍රචාරණය කරන්න. ප්‍රධාන භ්‍රමණය 200 µm / s ත්වරණයකට සකසන්න, 200 µm ඝනකම, 0 µm 0 කින් ඝණත්වය 1, 5 ට කින් රටා ලබා ගැනීම චිපයේ ඇති බඩවැලේ ඉහළ ස්ථරය සඳහා 500 µm උස; පහත “විවේචනාත්මක පියවර” බලන්න) තත්පර 300 rpm/s තත්පර 30 ක ත්වරණයකින් 1,200 rpm ට සකසා ඇත.
සිලිකන් වේෆරයේ SU-8 රටාවේ ඉලක්කගත ඝනකම අනුව ප්‍රධාන කැරකෙන වේගය සකස් කළ හැක.
චිපයේ ඇති බඩවැලේ ඉහළ තට්ටුව සඳහා SU-8 රටා 500 µm උසකින් නිර්මාණය කිරීම සඳහා, මෙම පෙට්ටියේ කැරකෙන ආලේපනය සහ මෘදු පිළිස්සීමේ පියවර (පියවර 7 සහ 8) අනුක්‍රමිකව නැවත නැවතත් (පියවර 9 බලන්න) 250 µm ස්ථර දෙකක් නිපදවා ඇත. µm උස.
SU-8 ආලේපිත වේෆර් මෘදු ලෙස පිළිස්සීම, 65 °C උෂ්ණත්වයකදී උණුසුම් තහඩුවක් මත මිනිත්තු 5ක් පරිස්සමින් තැබීමෙන්, පසුව සැකසීම 95 °C වෙත මාරු කර අමතර විනාඩි 40ක් පුර්ව තනන්න.
ඉහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවේ SU-8 රටාවේ 500 μm උසක් ලබා ගැනීම සඳහා, 250 μm ඝන SU-8 ස්ථර දෙකක් උත්පාදනය කිරීමට පියවර 7 සහ 8 නැවත කරන්න.
UV Mask Aligner භාවිතා කරමින්, වේෆරයේ නිරාවරණ කාලය ගණනය කිරීම සඳහා නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව ලාම්පු පරීක්ෂණයක් සිදු කරන්න.(නිරාවරණ කාලය, ms) = (නිරාවරණ මාත්‍රාව, mJ/cm2)/(ලාම්පු බලය, mW/cm2).
නිරාවරණ කාලය නිර්ණය කිරීමෙන් පසු, UV මාස්ක් ඇලයිනර් එකේ මාස්ක් රඳවනය මත ෆොටෝ මාස්ක් එක තබා SU-8 ආලේපිත වේෆරය මත ෆොටෝ මාස්ක් එක තබන්න.
පාරජම්බුල කිරණ විසරණය අවම කිරීම සඳහා ෆොටෝ මාස්ක් එකේ මුද්‍රිත මතුපිට සෘජුවම සිලිකන් වේෆරයේ SU-8 ආලේපිත පැත්තේ තබන්න.
කලින් තීරණය කළ නිරාවරණ කාලය සඳහා SU-8 ආලේපිත වේෆර් සහ ෆොටෝමාස්ක් UV ආලෝකයේ 260 mJ/cm2 දක්වා සිරස් අතට නිරාවරණය කරන්න (මෙම කොටුවේ පියවර 10 බලන්න).
UV නිරාවරණයෙන් පසුව, SU-8-ආලේපිත සිලිකන් වේෆර් 200 μm උසකින් යුත් රටා සැකසීම සඳහා එක් එක් උණුසුම් තහඩුව මත මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 65 ° C සහ 95 ° C දී විනාඩි 15 ක් පුළුස්සනු ලැබේ.
සංවර්ධකයා වීදුරු පිඟානකට වත් කර, බේක් කරන ලද වේෆරය පිඟානේ තබා ඇත. වීදුරු තහඩුවේ ප්‍රමාණය අනුව SU-8 සංවර්ධකයාගේ පරිමාව වෙනස් විය හැකිය. නිරාවරණය නොවූ SU-8 සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කිරීමට ප්‍රමාණවත් SU-8 සංවර්ධකයක් භාවිතා කිරීමට වග බලා ගන්න. උදාහරණයක් ලෙස, 150 mm විෂ්කම්භයක් සහිත SU-8 සංවර්ධකයක් භාවිතා කරන විට, 1 L-30 vel ධාරිතාවක් සහිත m20 vel ~ DU00 වීදුරුවක් භාවිතා කරන්න. ඉඳහිට මෘදු භ්රමණය සමග විනාඩි.
~10 mL නැවුම් සංවර්ධකයකින් පසුව IPA සමඟින් සංවර්ධිත අච්චුව සෝදා පිරිසිදු කරන්න, ද්‍රාවණය පයිප්පයක් භාවිතයෙන් ඉසීමෙන්.
වේෆරය ප්ලාස්මා ක්ලීනර් එකක තබා විනාඩි 1.5ක් ඔක්සිජන් ප්ලාස්මාවට (වායුගෝලීය වායුව, ඉලක්ක පීඩනය 1 × 10−5 ටෝර්, බලය 125 W) නිරාවරණය කරන්න.
ඇතුළත වීදුරු ස්ලයිඩයක් සහිත රික්ත ඩෙසිකේටරයක වේෆරය තබන්න.වේෆර් සහ ස්ලයිඩ දෙපැත්තට තැබිය හැකිය. රික්ත ඩෙසිකේටරය තහඩුවකින් ස්ථර කිහිපයකට බෙදා ඇත්නම්, ස්ලයිඩ පහළ කුටියේ ද වේෆර් ඉහළ කුටියේ ද තබන්න. වීදුරු ස්ලයිඩයක් සහ silanization සඳහා රික්තයක් යොදන්න.
ශීත කළ Caco-2 සෛල කුප්පියක් 37 ° C ජල ස්නානයක දියකර, පසුව දියවන ලද සෛල 37 ° C පෙර උනුසුම් කරන ලද Caco-2 මාධ්‍යයේ 15 mL අඩංගු T75 නළයකට මාරු කරන්න.
Caco-2 සෛල ~90% සංගමයේදී සම්මත කිරීමට, පළමුව උණුසුම් Caco-2 මාධ්‍ය, PBS, සහ 0.25% trypsin/1 mM EDTA 37°C ජල ස්නානයක.
රික්ත අභිලාෂය මගින් මාධ්‍යය උද්දීපනය කරන්න. රික්ත අපේක්ෂාව පුනරාවර්තනය කිරීමෙන් සහ නැවුම් PBS එකතු කිරීමෙන් උණුසුම් PBS 5 mL සමඟ සෛල දෙවරක් සෝදන්න.