Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තූතියි. ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රව්සර් අනුවාදයේ CSS සඳහා සීමිත සහයක් ඇත. හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රව්සරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රිය කරන්න). මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාස සහ JavaScript නොමැතිව අඩවිය ප්‍රදර්ශනය කරන්නෙමු.
මිනිස් බඩවැල් රූපජනකය මගින් ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ක්ෂුද්‍ර වාස්තු විද්‍යාවේ සහ අවකාශීය සංවිධානයේ ගුප්ත-විලස් ලක්ෂණ ස්ථාපිත කරයි. බාහිර ක්ෂුද්‍රජීවී ප්‍රතිදේහජනක සහ ඒවායේ පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය වලින් බාසල් ගුප්තයේ කඳ සෛල නිකේතනය ආරක්ෂා කිරීමෙන් බඩවැල් හෝමියස්ටැසිස් පවත්වා ගැනීමට මෙම අද්විතීය ව්‍යුහය අවශ්‍ය වේ. ඊට අමතරව, බඩවැල් විලී සහ ස්‍රාවය කරන ශ්ලේෂ්මල බඩවැල් ශ්ලේෂ්මල මතුපිට ආරක්ෂිත බාධකයක් සහිත ක්‍රියාකාරීව වෙනස් වූ එපිටිලියල් සෛල ඉදිරිපත් කරයි. එබැවින්, ත්‍රිමාණ අපිච්ඡද ව්‍යුහයන් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම in vitro බඩවැල් ආකෘති ගොඩනැගීම සඳහා ඉතා වැදගත් වේ. සැලකිය යුතු ලෙස, කාබනික අනුකාරක බඩවැල්-මත-චිපයට වැඩිදියුණු කළ භෞතික විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් සහ ජෛව යාන්ත්‍ර විද්‍යාව සමඟ බඩවැල් එපිටිලියම් හි ස්වයංසිද්ධ ත්‍රිමාණ රූපජනකය ඇති කළ හැකිය. මෙහිදී, ක්ෂුද්‍ර තරල චිපයක් මත මෙන්ම ට්‍රාන්ස්වෙල් එම්බෙඩඩ් දෙමුහුන් චිපයක් මත බඩවැලේ බඩවැල් රූපජනකය ශක්තිමත් ලෙස ඇති කිරීම සඳහා අපි ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකි ප්‍රොටෝකෝලයක් සපයන්නෙමු. සාම්ප්‍රදායික සැකසුම් තුළ මෙන්ම ක්ෂුද්‍ර තරල වේදිකාවක් මත උපාංග නිෂ්පාදනය, Caco-2 හෝ බඩවැල් කාබනික එපිටිලියල් සෛල වගා කිරීම, 3D රූපජනකය ප්‍රේරණය කිරීම සහ ස්ථාපිත ගුනාංගීකරණය සඳහා සවිස්තරාත්මක ක්‍රම අපි විස්තර කරමු. බහු රූපකරණ ක්‍රම භාවිතා කරමින් ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් . මෙම ප්‍රොටෝකෝලය දින 5 ක් සඳහා බාසෝලාටරල් තරල ප්‍රවාහය පාලනය කිරීමෙන් ක්‍රියාකාරී බඩවැල් ක්ෂුද්‍ර ගෘහ නිර්මාණ ශිල්පයේ පුනර්ජනනය සාක්ෂාත් කර ගනී. අපගේ in vitro morphogenesis ක්‍රමය භෞතික විද්‍යාත්මකව අදාළ කැපුම් ආතතිය සහ යාන්ත්‍රික චලිතය භාවිතා කරන අතර සංකීර්ණ සෛල ඉංජිනේරු විද්‍යාව හෝ හැසිරවීම අවශ්‍ය නොවේ, එය පවතින අනෙකුත් ශිල්පීය ක්‍රම අභිබවා යා හැකිය. අපගේ යෝජිත ප්‍රොටෝකෝලය ජෛව වෛද්‍ය පර්යේෂණ ප්‍රජාව සඳහා පුළුල් ඇඟවුම් ඇති කළ හැකි බවත්, ජෛව වෛද්‍ය, සායනික සහ ඖෂධීය යෙදුම් සඳහා ත්‍රිමාණ බඩවැල් එපිටිලියල් ස්ථර ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේ ක්‍රමයක් සපයන බවත් අපි සිතමු.
ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප්1,2,3,4,5 හෝ ද්වි-ස්ථර ක්ෂුද්‍ර තරල උපාංග6,7 තුළ වගා කරන ලද බඩවැල් එපිටිලියල් Caco-2 සෛල, යටින් පවතින යාන්ත්‍රණය පිළිබඳ පැහැදිලි අවබෝධයකින් තොරව ස්වයංසිද්ධ 3D රූපජනක ක්‍රියාවලියට භාජනය විය හැකි බව අත්හදා බැලීම්වලින් පෙන්නුම් කෙරේ. අපගේ මෑත අධ්‍යයනයේ දී, සංස්කෘතික උපාංගවලින් බාසෝපාර්ශ්විකව ස්‍රාවය කරන ලද රූපජනක ප්‍රතිවිරෝධක ඉවත් කිරීම අවශ්‍ය බවත්, 3D අපිච්ඡද රූපජනක ක්‍රියාවලිය ඇති කිරීමට ප්‍රමාණවත් බවත් අපට පෙනී ගිය අතර, එය Caco-2 සහ රෝගියාගෙන් ලබාගත් බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය මගින් පෙන්නුම් කර ඇත. අපිච්ඡද සෛල වලංගු කරන ලදී. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි විශේෂයෙන් අවධානය යොමු කළේ "දෙමුහුන් චිප්" ලෙස හඳුන්වන ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් අඩංගු ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් සහ නවීකරණය කරන ලද ක්ෂුද්‍ර තරල උපාංගවල ප්‍රබල Wnt ප්‍රතිවිරෝධකයක් වන ඩික්කොෆ්-1 (DKK-1) හි සෛල නිෂ්පාදනය සහ සාන්ද්‍රණ ව්‍යාප්තිය කෙරෙහි ය. චිප් මත බඩවැල් වලට බාහිර Wnt ප්‍රතිවිරෝධක (DKK-1, Wnt මර්දනකය 1, ස්‍රාවය කරන ලද ෆ්‍රිස්ල්ඩ්-ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් 1, හෝ Soggy-1 වැනි) එකතු කිරීම රූපජනක වීම වළක්වන බව හෝ පූර්ව ව්‍යුහගත 3D අපිච්ඡද ස්ථරයට බාධා කරන බව අපි පෙන්නුම් කරමු, සංස්කෘතිය අතරතුර ප්‍රතිවිරෝධක ආතතිය බඩවැල් රූපජනක වීම සඳහා වගකිව යුතු බව යෝජනා කරයි. එබැවින්, එපිටිලියල් අතුරුමුහුණතෙහි ශක්තිමත් රූපජනකයක් ලබා ගැනීම සඳහා ප්‍රායෝගික ප්‍රවේශයක් වන්නේ ක්‍රියාකාරී ෆ්ලෂ් කිරීම (උදා: ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් හෝ දෙමුහුන්-ඒ-චිප් වේදිකා වල) හෝ විසරණය මගින් බාසෝලාටරල් මැදිරියේ Wnt ප්‍රතිවිරෝධක මට්ටම් ඉවත් කිරීම හෝ අවම වශයෙන් පවත්වා ගැනීමයි. බාසෝලාටරල් මාධ්‍ය (උදා: ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් වලින් විශාල බාසෝලාටරල් ජලාශවලට ළිං වල).
මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ, අපි පොලිඩිමෙතිල්සිලොක්සේන් (PDMS) මත පදනම් වූ සිදුරු සහිත පටල (පියවර 6A, 7A, 8, 9) හෝ ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් වල පොලියෙස්ටර් පටල (පියවර 6B, 7B, 8, 9) සහ ප්‍රේරිත 3D රූපජනක ඉන් විට්‍රෝ (පියවර 10) මත බඩවැල් එපිටිලියල් සෛල වගා කිරීම සඳහා ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් ක්ෂුද්‍ර උපාංග සහ ට්‍රාන්ස්වෙල්-ඇතුළත් කළ හැකි දෙමුහුන් චිප්ස් (පියවර 1-5) නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා සවිස්තරාත්මක ක්‍රමයක් සපයන්නෙමු. බහු රූපකරණ ක්‍රම යෙදීමෙන් පටක-විශේෂිත හිස්ටෝජෙනිස් සහ පෙළපත්-යැපෙන සෛලීය අවකලනය පෙන්නුම් කරන සෛලීය සහ අණුක ලක්ෂණ ද අපි හඳුනා ගත්තෙමු (පියවර 11-24). සිදුරු සහිත පටලවල මතුපිට වෙනස් කිරීම, 2D ඒකස්ථර නිර්මාණය කිරීම සහ බඩවැල් ජෛව රසායනික සහ ජෛව යාන්ත්‍රික ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය ඇතුළු තාක්ෂණික විස්තර සහිත සංස්කෘතික ආකෘති දෙකකින් අපි Caco-2 හෝ බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය වැනි මිනිස් බඩවැල් එපිටිලියල් සෛල භාවිතා කරමින් රූපජනක ප්‍රේරණය ඇති කරමු.in vitro.2D එපිටිලියල් ඒකස්ථර වලින් 3D රූපජනක ප්‍රේරණය ඇති කිරීම සඳහා, අපි මෝෆොජන් ප්‍රතිවිරෝධක ඉවත් කළෙමු. සංස්කෘතික ආකාර දෙකෙහිම, මාධ්‍යය සංස්කෘතියේ බාසෝලාටරල් මැදිරියට ගලා යාමෙන්. අවසාන වශයෙන්, අපි මෝෆෝජන්-යැපෙන එපිටිලියල් වර්ධනය, කල්පවත්නා ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී සහ-සංස්කෘතීන්, රෝග කාරක ආසාදනය, ගිනි අවුලුවන තුවාල, එපිටිලියල් බාධක අක්‍රියතාව සහ ප්‍රෝබියොටික්-පාදක ප්‍රතිකාර ආකෘතිකරණය කිරීමට භාවිතා කළ හැකි පුනර්ජනනීය ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථරයක උපයෝගීතාව පිළිබඳ නිරූපණයක් සපයන්නෙමු. උදාහරණය. බලපෑම්.
අපගේ ප්‍රොටෝකෝලය මූලික (උදා: බඩවැල් ශ්ලේෂ්මල ජීව විද්‍යාව, ප්‍රාථමික සෛල ජීව විද්‍යාව සහ සංවර්ධන ජීව විද්‍යාව) සහ ව්‍යවහාරික පර්යේෂණ (උදා: පූර්ව සායනික ඖෂධ පරීක්ෂණ, රෝග ආකෘති නිර්මාණය, පටක ඉංජිනේරු විද්‍යාව සහ ආමාශ ආන්ත්‍ර විද්‍යාව) පිළිබඳ පුළුල් පරාසයක විද්‍යාඥයින්ට ප්‍රයෝජනවත් විය හැකිය. බඩවැල් එපිටිලියම් වල ත්‍රිමාණ රූපජනකය ඇති කිරීම සඳහා අපගේ ප්‍රොටෝකෝලයේ ප්‍රතිනිෂ්පාදන හැකියාව සහ ශක්තිමත් බව නිසා, බඩවැල් සංවර්ධනය, පුනර්ජනනය හෝ හෝමියස්ටැසිස් අතරතුර සෛල සංඥාකරණයේ ගතිකත්වය අධ්‍යයනය කරන ප්‍රේක්ෂකයින්ට අපගේ තාක්ෂණික උපාය මාර්ගය බෙදා හැරිය හැකි යැයි අපි සිතමු. ඊට අමතරව, අපගේ ප්‍රොටෝකෝලය නොරොවෛරස් 8, දරුණු උග්‍ර ශ්වසන සින්ඩ්‍රෝමය කොරෝනා වයිරස් 2 (SARS-CoV-2), ක්ලොස්ට්‍රිඩියම් ඩිෆිසයිල්, සැල්මොනෙල්ලා ටයිෆිමියුරියම් 9 හෝ විබ්‍රියෝ කොලරාව වැනි විවිධ බෝවන කාරක යටතේ ආසාදනය ප්‍රශ්න කිරීම සඳහා ප්‍රයෝජනවත් වේ. රෝග ව්‍යාධි විද්‍යාව සහ ව්‍යාධිජනකය පිළිබඳ ප්‍රේක්ෂකයින් ද ප්‍රයෝජනවත් වේ. චිපයක් මත පදනම් වූ බඩවැල් ක්ෂුද්‍ර භෞතික විද්‍යා පද්ධතියක් භාවිතා කිරීම මඟින් කල්පවත්නා සහ-සංස්කෘතිය 10 සහ ආමාශ ආන්ත්‍රික (GI) පත්‍රිකාවේ ධාරක ආරක්ෂාව, ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාර සහ රෝගකාරක ආශ්‍රිත තුවාල අලුත්වැඩියාව පිළිබඳ තක්සේරුව 11 ට ඉඩ ලබා දිය හැකිය. රෝගියාගේ 3D බඩවැල් එපිටිලියල් ස්ථර භාවිතයෙන් 3D බඩවැල් එපිටිලියල් ස්ථර සකස් කරන විට කාන්දු වන බඩවැල් සින්ඩ්‍රෝමය, සෙලියාක් රෝගය, ක්‍රෝන්ගේ රෝගය, වණ කොලිටස්, පවුචයිටිස් හෝ කෝපයට පත් බඩවැල් සින්ඩ්‍රෝමය සමඟ සම්බන්ධ අනෙකුත් GI ආබාධ අනුකරණය කළ හැකිය, මෙම රෝගවලට දුෂ්ට ක්ෂය වීම, ගුප්ත කෙටි කිරීම, ශ්ලේෂ්මල හානි හෝ දුර්වල වූ එපිටිලියල් බාධක ඇතුළත් වේ. ජෛව විද්‍යාව හෝ කඳ සෛල වලින් ලබාගත් බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය 12,13. රෝග පරිසරයේ ඉහළ සංකීර්ණත්වය වඩා හොඳින් ආදර්ශනය කිරීම සඳහා, 3D බඩවැල් විලස්-ක්‍රිප්ට් ක්ෂුද්‍ර වාස්තු විද්‍යාව අඩංගු ආකෘතිවලට රෝගියාගේ පර්යන්ත රුධිර ඒක න්‍යෂ්ටික සෛල (PBMCs) වැනි රෝග-අදාළ සෛල වර්ග එකතු කිරීම පාඨකයින්ට සලකා බැලිය හැකිය. පටක-විශේෂිත ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල, 5.
කොටස් කිරීමේ ක්‍රියාවලියකින් තොරව ත්‍රිමාණ අපිච්ඡද ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය සවි කර දෘශ්‍යමාන කළ හැකි බැවින්, අවකාශීය පිටපත් කිරීමේ විද්‍යාව සහ අධි-විභේදන හෝ සුපිරි-විභේදන රූපකරණය පිළිබඳ වැඩ කරන නරඹන්නන්, අපිච්ඡද නිකේතනවල ජාන සහ ප්‍රෝටීන වල අවකාශීය-කාලික ගතිකත්වය සිතියම්ගත කිරීම කෙරෙහි උනන්දු විය හැකිය. තාක්ෂණය ගැන උනන්දුයි. ක්ෂුද්‍රජීවී හෝ ප්‍රතිශක්තිකරණ උත්තේජක සඳහා ප්‍රතිචාරය. තවද, බඩවැල් හෝමියස්ටැසිස් සම්බන්ධීකරණය කරන කල්පවත්නා ධාරක-ක්ෂුද්‍රජීවී හරස්කඩ 10, 14, විශේෂයෙන් බඩවැල්-මත-චිපයේ, විවිධ ක්ෂුද්‍රජීවී විශේෂ, ක්ෂුද්‍රජීවී ප්‍රජාවන් හෝ මල ක්ෂුද්‍රජීව සම-සංස්කෘතිකරණය කිරීමෙන් ත්‍රිමාණ බඩවැල් ශ්ලේෂ්මල ස්ථරයේ ස්ථාපිත කළ හැකිය. වේදිකාව තුළ.මෙම ප්‍රවේශය විශේෂයෙන් ආකර්ශනීය වන්නේ ශ්ලේෂ්මල ප්‍රතිශක්ති විද්‍යාව, ආමාශ ආන්ත්‍ර විද්‍යාව, මානව ක්ෂුද්‍රජීව විද්‍යාව, සංස්කෘතික විද්‍යාව සහ සායනික ක්ෂුද්‍රජීව විද්‍යාව අධ්‍යයනය කරන ප්‍රේක්ෂකයින් සඳහා වන අතර, රසායනාගාරයේ කලින් වගා නොකළ බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීව වගා කිරීමට උත්සාහ කරයි. අපගේ in vitro morphogenesis ප්‍රොටෝකෝලය, බාසෝලාටරල් මැදිරි අඛණ්ඩව නැවත පුරවන 24, 96 හෝ 384 ළිං තහඩු වල බහු ළිං ඇතුළු කිරීම් වැනි පරිමාණය කළ හැකි සංස්කෘතික ආකෘති වලට අනුවර්තනය කළ හැකි නම්, ආහාර කර්මාන්තය සඳහා ඖෂධ, ජෛව වෛද්‍ය හෝ ඉහළ-ප්‍රතිදාන පරීක්ෂණ හෝ වලංගුකරණ වේදිකා සංවර්ධනය කරන අයට ද ප්‍රොටෝකෝලය බෙදා හැරිය හැකිය. මූලධර්මයේ සාක්ෂියක් ලෙස, අපි මෑතකදී ළිං 24 තහඩු ආකෘතියකට පරිමාණය කළ හැකි බහු-ප්‍රතිදාන රූපජනක පද්ධතියක ශක්‍යතාව පෙන්නුම් කළෙමු.ඊට අමතරව, බහු අවයව-චිප නිෂ්පාදන වාණිජකරණය කර ඇත16,17,18.එබැවින්, අපගේ in vitro morphogenesis ක්‍රමයේ වලංගුකරණය වේගවත් කළ හැකි අතර බොහෝ පර්යේෂණ රසායනාගාර, කර්මාන්ත හෝ රජයේ සහ නියාමන ආයතන විසින් ඖෂධ පරීක්ෂා කිරීම සඳහා පිටපත් කිරීමේ මට්ටමින් in vitro gut morphogenesis සෛලීය නැවත වැඩසටහන්ගත කිරීම තේරුම් ගැනීමට විභවයක් ඇත. හෝ ජෛව චිකිත්සක ඖෂධ අපේක්ෂකයින්ගේ අවශෝෂණය සහ ප්‍රවාහනය ත්‍රිමාණ බඩවැල් ආදේශක භාවිතයෙන් හෝ බඩවැල් රූපජනක ක්‍රියාවලියේ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය තක්සේරු කිරීම සඳහා අභිරුචි හෝ වාණිජ ඉන්ද්‍රිය-මත-චිප ආකෘති භාවිතා කරමින් තක්සේරු කරන ලදී.
බඩවැල් එපිටිලියල් රූපජනකය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා සීමිත මානව-අදාළ පර්යේෂණාත්මක ආකෘති සංඛ්‍යාවක් භාවිතා කර ඇත, ප්‍රධාන වශයෙන් ත්‍රිමාණ රූපජනකය ඉන් විට්‍රෝ තුළ ඇති කිරීම සඳහා ක්‍රියාත්මක කළ හැකි ප්‍රොටෝකෝල නොමැතිකම හේතුවෙන්. ඇත්ත වශයෙන්ම, බඩවැල් රූපජනකය පිළිබඳ වර්තමාන දැනුමෙන් වැඩි ප්‍රමාණයක් සත්ව අධ්‍යයනයන් මත පදනම් වේ (උදා: සීබ්‍රාෆිෂ්20, මීයන්21 හෝ කුකුළන්22). කෙසේ වෙතත්, ඒවා ශ්‍රමය සහ පිරිවැය-දැඩි වන අතර, සදාචාරාත්මකව සැක සහිත විය හැකි අතර, වඩාත්ම වැදගත් දෙය නම්, මානව සංවර්ධන ක්‍රියාවලීන් නිශ්චිතව තීරණය නොකරයි. මෙම ආකෘති බහු-මාර්ග පරිමාණය කළ හැකි ආකාරයකින් පරීක්ෂා කිරීමේ හැකියාවෙන් ද ඉතා සීමිතය. එබැවින්, ත්‍රිමාණ පටක ව්‍යුහයන් ඉන් විට්‍රෝ තුළ ප්‍රතිජනනය කිරීම සඳහා වන අපගේ ප්‍රොටෝකෝලය විවෝ සත්ව ආකෘති මෙන්ම අනෙකුත් සාම්ප්‍රදායික ස්ථිතික 2D සෛල සංස්කෘතික ආකෘති අභිබවා යයි. කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි, ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ව්‍යුහයන් භාවිතා කිරීමෙන් විවිධ ශ්ලේෂ්මල හෝ ප්‍රතිශක්තිකරණ උත්තේජකවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් ගුප්ත-විලස් අක්ෂයේ වෙනස් වූ සෛලවල අවකාශීය ප්‍රාදේශීයකරණය පරීක්ෂා කිරීමට අපට ඉඩ සැලසේ. ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථර මගින් ක්ෂුද්‍රජීවී සෛල ධාරක සාධකවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් අවකාශීය නිකේතන සහ පාරිසරික පරිණාමය සෑදීමට තරඟ කරන ආකාරය අධ්‍යයනය කිරීමට ඉඩක් ලබා දිය හැකිය (උදා: අභ්‍යන්තර හා පිටත ශ්ලේෂ්මල ස්ථර, IgA සහ ප්‍රති-ක්ෂුද්‍ර ජීවී පෙප්ටයිඩ ස්‍රාවය කිරීම). තවද, ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් රූප විද්‍යාව මගින් බඩවැල් ක්ෂුද්‍රජීවය එහි ප්‍රජාවන් ව්‍යුහගත කරන ආකාරය සහ සහජීවනයෙන් ක්ෂුද්‍රජීවී පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය (උදා: කෙටි දාම මේද අම්ල) නිපදවන ආකාරය තේරුම් ගැනීමට අපට ඉඩ සලසයි. එය බාසල් ගුප්ත වල සෛලීය සංවිධානය සහ කඳ සෛල නිකේතන හැඩගස්වයි. මෙම ලක්ෂණ පෙන්නුම් කළ හැක්කේ ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථර විට්‍රෝ තුළ ස්ථාපිත කළ විට පමණි.
ත්‍රිමාණ බඩවැල් එපිටිලියල් ව්‍යුහයන් නිර්මාණය කිරීමේ අපගේ ක්‍රමයට අමතරව, විට්‍රෝ ක්‍රම කිහිපයක් තිබේ. බඩවැල් කාබනික සංස්කෘතිය යනු නිශ්චිත රූපජනක තත්වයන් යටතේ බඩවැල් කඳ සෛල වගා කිරීම මත පදනම් වූ අති නවීන පටක ඉංජිනේරු තාක්‍ෂණයකි23,24,25. කෙසේ වෙතත්, ප්‍රවාහන විශ්ලේෂණය හෝ ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී සහ-සංස්කෘතීන් සඳහා ත්‍රිමාණ කාබනික ආකෘති භාවිතය බොහෝ විට අභියෝගාත්මක වන්නේ බඩවැල් ලුමෙන් කාබනික තුළ කොටු වී ඇති නිසා සහ එම නිසා ක්ෂුද්‍ර ජීවී සෛල හෝ බාහිර ප්‍රතිදේහජනක වැනි ලුමිනල් සංරචක හඳුන්වාදීම සීමිත බැවිනි. ක්ෂුද්‍ර ඉන්ජෙක්ටරයක් ​​භාවිතයෙන් කාබනික ලුමෙන් වෙත ප්‍රවේශය වැඩිදියුණු කළ හැකිය,26,27 නමුත් මෙම ක්‍රමය ආක්‍රමණශීලී සහ ශ්‍රමය-දැඩි වන අතර එය සිදු කිරීමට විශේෂිත දැනුමක් අවශ්‍ය වේ. තවද, ස්ථිතික තත්වයන් යටතේ හයිඩ්‍රොජෙල් ස්කැෆෝල්ඩ් වල නඩත්තු කරන සාම්ප්‍රදායික කාබනික සංස්කෘතීන් සජීවී ජෛව යාන්ත්‍ර විද්‍යාවේ ක්‍රියාකාරීත්වය නිවැරදිව පිළිබිඹු නොකරයි.
පර්යේෂණ කණ්ඩායම් කිහිපයක් විසින් භාවිතා කරන ලද අනෙකුත් ප්‍රවේශයන් ජෙල් මතුපිට හුදකලා මිනිස් බඩවැල් සෛල වගා කිරීමෙන් බඩවැල් එපිටිලියල් ව්‍යුහය අනුකරණය කිරීම සඳහා පූර්ව ව්‍යුහගත 3D හයිඩ්‍රොජෙල් ස්කැෆෝල්ඩ් භාවිතා කරයි. ත්‍රිමාණ මුද්‍රිත, ක්ෂුද්‍ර-ඇඹරූ හෝ ලිතෝග්‍රැෆික් ලෙස සකස් කරන ලද අච්චු භාවිතයෙන් හයිඩ්‍රොජෙල් ස්කැෆෝල්ඩ් සකස් කරන්න. මෙම ක්‍රමය මඟින් භෞතික විද්‍යාත්මකව අදාළ මෝෆොජන් අනුක්‍රමණයන් සහිත ඉන් විට්‍රෝ හි හුදකලා එපිටිලියල් සෛලවල ස්වයං-සංවිධානාත්මක සැකැස්ම පෙන්නුම් කරයි, ස්කැෆෝල්ඩ් තුළ ස්ට්‍රෝමාල් සෛල ඇතුළත් කිරීමෙන් ඉහළ දර්ශන අනුපාත එපිටිලියල් ව්‍යුහයක් සහ ස්ට්‍රෝමා-එපිටිලියල් හරස්කඩක් ස්ථාපිත කරයි. කෙසේ වෙතත්, පූර්ව ව්‍යුහගත ස්කැෆෝල්ඩ් වල ස්වභාවය ස්වයංසිද්ධ මෝෆොජෙනටික් ක්‍රියාවලියම ප්‍රදර්ශනය කිරීම වැළැක්විය හැකිය. මෙම ආකෘති ගතික ලුමිනල් හෝ අන්තරාල ප්‍රවාහයක් සපයන්නේ නැත, බඩවැල් සෛල රූපජනකකරණයට භාජනය වී භෞතික විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරිත්වය ලබා ගැනීමට අවශ්‍ය තරල කැපුම් ආතතිය නොමැති වීම. තවත් මෑත කාලීන අධ්‍යයනයක් ක්ෂුද්‍ර තරල වේදිකාවක හයිඩ්‍රොජෙල් ස්කැෆෝල්ඩ් සහ ලේසර්-කැටයම් ශිල්පීය ක්‍රම භාවිතා කරමින් රටා සහිත බඩවැල් එපිටිලියල් ව්‍යුහයන් භාවිතා කළේය. මූසික බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය බඩවැල් නල ව්‍යුහයන් සෑදීමට කැටයම් කළ රටා අනුගමනය කරන අතර, ක්ෂුද්‍ර තරල විද්‍යාවක් භාවිතයෙන් අභ්‍යන්තර තරල ප්‍රවාහය නැවත සකස් කළ හැකිය. මොඩියුලය.කෙසේ වෙතත්, මෙම ආකෘතිය ස්වයංසිද්ධ රූපජනක ක්‍රියාවලීන් ප්‍රදර්ශනය නොකරයි හෝ බඩවැල් යාන්ත්‍රික ජීව විද්‍යාත්මක චලනයන් ඇතුළත් නොවේ.එකම කණ්ඩායමේ ත්‍රිමාණ මුද්‍රණ ශිල්පීය ක්‍රම ස්වයංසිද්ධ රූපජනක ක්‍රියාවලීන් සහිත කුඩා බඩවැල් නල නිර්මාණය කිරීමට සමත් විය.නලය තුළ විවිධ බඩවැල් කොටස් සංකීර්ණ ලෙස නිෂ්පාදනය කර තිබියදීත්, මෙම ආකෘතියට ලුමිනල් තරල ප්‍රවාහය සහ යාන්ත්‍රික විරූපණය ද නොමැත.අතිරේකව, ආකෘති ක්‍රියාකාරිත්වය සීමිත විය හැකිය, විශේෂයෙන් ජෛව මුද්‍රණ ක්‍රියාවලිය සම්පූර්ණ වූ පසු, පර්යේෂණාත්මක තත්වයන් හෝ සෛලයෙන් සෛලයට අන්තර්ක්‍රියා වලට බාධා කරයි.ඒ වෙනුවට, අපගේ යෝජිත ප්‍රොටෝකෝලය ස්වයංසිද්ධ බඩවැල් රූපජනකය, භෞතික විද්‍යාත්මකව අදාළ කැපුම් ආතතිය, බඩවැල් චලනය අනුකරණය කරන ජෛව යාන්ත්‍ර විද්‍යාව, ස්වාධීන අග්‍ර සහ බාසෝලේටරල් මැදිරිවල ප්‍රවේශ්‍යතාව සහ මොඩියුලරිටියේ සංකීර්ණ ජීව විද්‍යාත්මක ක්ෂුද්‍ර පරිසරයන් නැවත නිර්මාණය කිරීම සපයයි.එබැවින්, අපගේ in vitro 3D රූපජනක ප්‍රොටෝකෝලය පවතින ක්‍රමවල අභියෝග ජය ගැනීම සඳහා අනුපූරක ප්‍රවේශයක් සැපයිය හැකිය.
අපගේ ප්‍රොටෝකෝලය සම්පූර්ණයෙන්ම අවධානය යොමු කර ඇත්තේ ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් රූපජනකය කෙරෙහි වන අතර, සංස්කෘතියේ එපිටිලියල් සෛල පමණක් ඇති අතර මෙසෙන්චයිමල් සෛල, එන්ඩොතලියල් සෛල සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල වැනි අවට සෛල නොමැත. කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි, අපගේ ප්‍රොටෝකෝලයේ හරය වන්නේ හඳුන්වා දුන් මාධ්‍යයේ බාසෝලාටරල් පැත්තේ ස්‍රාවය වන මෝෆොජන් නිෂේධක ඉවත් කිරීමෙන් එපිටිලියල් රූපජනක ප්‍රේරණයයි. අපගේ ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් සහ දෙමුහුන්-ඔන්-ඒ-චිප් වල ශක්තිමත් මොඩියුලරිටි බව අපට රැලි සහිත ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථරය නැවත නිර්මාණය කිරීමට ඉඩ සලසන අතර, එපිටිලියල්-මෙසෙන්චයිමල් අන්තර්ක්‍රියා වැනි අතිරේක ජීව විද්‍යාත්මක සංකීර්ණතා33,34, බාහිර සෛලීය අනුකෘතිය (ECM) තැන්පත් වීම35 සහ, අපගේ ආකෘතියේ, බාසල් ගුප්ත වල කඳ සෛල නිකේතන සම්ප්‍රේෂණය කරන ගුප්ත-විලස් ලක්ෂණ තවදුරටත් සලකා බැලිය යුතුය. මෙසෙන්චයිම් හි ස්ට්‍රෝමල් සෛල (උදා: ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට්) ECM ප්‍රෝටීන නිෂ්පාදනය සහ බඩවැල් රූපජනකය නියාමනය කිරීමේදී ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි35,37,38. අපගේ ආකෘතියට මෙසෙන්චයිමල් සෛල එකතු කිරීම මෝෆොජෙනටික් ක්‍රියාවලිය වැඩි දියුණු කළේය. සහ සෛල ඇමිණුම් කාර්යක්ෂමතාව. අන්ත්ර ක්ෂුද්‍ර පරිසරයේ අණුක ප්‍රවාහනය39 සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල බඳවා ගැනීම40 නියාමනය කිරීමේදී එන්ඩොතලියල් ස්ථරය (එනම්, කේශනාලිකා හෝ වසා ගැටිති) වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි. තවද, පටක ආකෘති බහු-අවයව අන්තර්ක්‍රියා නිරූපණය කිරීම සඳහා නිර්මාණය කරන විට පටක ආකෘති අතර සම්බන්ධ කළ හැකි සනාල සංරචක පූර්ව අවශ්‍යතාවයකි. එබැවින්, ඉන්ද්‍රිය මට්ටමේ විභේදනය සමඟ වඩාත් නිවැරදි භෞතික විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ ආකෘතිගත කිරීම සඳහා එන්ඩොතලියල් සෛල ඇතුළත් කිරීමට අවශ්‍ය විය හැකිය. බඩවැල් රෝග අනුකරණය කිරීමේ සන්දර්භය තුළ සහජ ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාර, ප්‍රතිදේහජනක ඉදිරිපත් කිරීම, සහජ අනුවර්තන ප්‍රතිශක්තිකරණ හරස්කඩ සහ පටක-විශේෂිත ප්‍රතිශක්තිය ප්‍රදර්ශනය කිරීම සඳහා රෝගියාගෙන් ලබාගත් ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල ද අත්‍යවශ්‍ය වේ.
දෙමුහුන් චිප් භාවිතය ගුට්-ඔන්-ඒ-චිපයට වඩා සරල ය, මන්ද උපාංග සැකසුම සරල වන අතර ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් භාවිතය බඩවැල් එපිටිලියම් පරිමාණය කළ හැකි සංස්කෘතියකට ඉඩ සලසයි. කෙසේ වෙතත්, පොලියෙස්ටර් පටල සහිත වාණිජමය වශයෙන් ලබා ගත හැකි ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් ප්‍රත්‍යාස්ථ නොවන අතර පෙරිස්ටල්ටික් වැනි චලනයන් අනුකරණය කළ නොහැක. තවද, දෙමුහුන් චිපයේ තබා ඇති ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීමේ අග්‍ර මැදිරිය අග්‍ර පැත්තේ කිසිදු කැපුම් ආතතියකින් තොරව නිශ්චලව පැවතුනි. පැහැදිලිවම, අග්‍ර මැදිරියේ ඇති ස්ථිතික ගුණාංග කලාතුරකින් දෙමුහුන් චිප්ස් වල දිගුකාලීන බැක්ටීරියා සහ-සංස්කෘතියක් සක්‍රීය කරයි. දෙමුහුන් චිප්ස් භාවිතා කරන විට අපට ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් වල ත්‍රිමාණ රූපජනකකරණය ශක්තිමත් ලෙස ඇති කළ හැකි වුවද, භෞතික විද්‍යාත්මකව අදාළ ජෛව යාන්ත්‍ර විද්‍යාව සහ අග්‍ර තරල ප්‍රවාහයේ හිඟය විභව යෙදුම් සඳහා දෙමුහුන් චිප් වේදිකා වල ශක්‍යතාව සීමා කළ හැකිය.
ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් සහ දෙමුහුන්-ඔන්-ඒ-චිප් සංස්කෘතීන්හි මානව ගුප්ත-විලස් අක්ෂයේ පූර්ණ පරිමාණ ප්‍රතිනිර්මාණයන් සම්පූර්ණයෙන්ම ස්ථාපිත කර නොමැත. රූපජනකය එපිටිලියල් ඒකස්ථරයකින් ආරම්භ වන බැවින්, ත්‍රිමාණ ක්ෂුද්‍ර වාස්තු විද්‍යාව අනිවාර්යයෙන්ම ගුප්ත වලට රූප විද්‍යාත්මක සමානකමක් ලබා නොදේ. ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරු ත්‍රිමාණ එපිටිලියම් හි බාසල් ගුප්ත වසම අසල ප්‍රගුණනය වන සෛල ජනගහනය අපි සංලක්ෂිත කළද, ගුප්ත සහ දුෂ්ට කලාප පැහැදිලිව වෙන් කර නොමැත. චිපයේ ඉහළ ඉහළ නාලිකා ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරු එපිටිලියම්හි උස වැඩි කිරීමට හේතු වුවද, උපරිම උස තවමත් ~300–400 µm දක්වා සීමා වේ. කුඩා සහ විශාල බඩවැල්වල මිනිස් බඩවැල් ගුප්ත වල සැබෑ ගැඹුර පිළිවෙලින් ~135 µm සහ ~400 µm වන අතර කුඩා බඩවැල් විලී වල උස ~600 µm41 වේ.
රූපකරණ දෘෂ්ටි කෝණයකින්, ත්‍රිමාණ ක්ෂුද්‍ර වාස්තු විද්‍යාවේ ස්ථානීය සුපිරි-විභේදන රූපකරණය චිපයක් මත ඇති බඩවැල් වලට සීමා විය හැකිය, මන්ද වෛෂයික කාචයේ සිට එපිටිලියල් ස්ථරයට අවශ්‍ය ක්‍රියාකාරී දුර මිලිමීටර කිහිපයක අනුපිළිවෙලකට ය. මෙම ගැටළුව මඟහරවා ගැනීම සඳහා, දුරස්ථ අරමුණක් අවශ්‍ය විය හැකිය. තවද, PDMS හි ඉහළ ප්‍රත්‍යාස්ථතාව හේතුවෙන් රූපකරණ නිදර්ශක සකස් කිරීම සඳහා තුනී කොටස් සෑදීම අභියෝගාත්මක වේ. තවද, චිපයක් මත බඩවැල් ස්ථරයෙන් ස්ථරයට ක්ෂුද්‍ර පිරිසැකසුම් කිරීම එක් එක් ස්ථරය අතර ස්ථිර ඇලවීමක් ඇතුළත් වන බැවින්, එපිටිලියල් ස්ථරයේ මතුපිට ව්‍යුහය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා ඉහළ ස්ථරය විවෘත කිරීම හෝ ඉවත් කිරීම අතිශයින් අභියෝගාත්මක ය. උදාහරණයක් ලෙස, ස්කෑනිං ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂයක් (SEM) භාවිතා කිරීමෙන්.
PDMS හි ජලභීතික බව, ජලභීතික කුඩා අණු සමඟ කටයුතු කරන ක්ෂුද්‍ර තරල පාදක අධ්‍යයනයන්හි සීමිත සාධකයක් වී ඇත, මන්ද PDMS හට එවැනි ජලභීතික අණු නිශ්චිත නොවන ලෙස අවශෝෂණය කළ හැකිය. PDMS සඳහා විකල්ප අනෙකුත් බහු අවයවික ද්‍රව්‍ය සමඟ සලකා බැලිය හැකිය. විකල්පයක් ලෙස, ජලභීතික අණු අවශෝෂණය අවම කිරීම සඳහා PDMS හි මතුපිට වෙනස් කිරීම (උදා: ලිපොෆිලික් ද්‍රව්‍ය 42 හෝ පොලි (එතිලීන් ග්ලයිකෝල්) 43 සමඟ ආලේප කිරීම) සලකා බැලිය හැකිය.
අවසාන වශයෙන්, ඉහළ ප්‍රතිදාන පිරික්සීමක් හෝ "සියල්ලටම ගැලපෙන එක් ප්‍රමාණයකට ගැලපෙන" පරිශීලක-හිතකාමී පර්යේෂණාත්මක වේදිකාවක් සැපයීම සම්බන්ධයෙන් අපගේ ක්‍රමය හොඳින් සංලක්ෂිත වී නොමැත. වත්මන් ප්‍රොටෝකෝලයට ක්ෂුද්‍ර උපාංගයකට සිරින්ජ පොම්පයක් අවශ්‍ය වන අතර එය CO2 ඉන්කියුබේටරයක ඉඩ ලබා ගන්නා අතර මහා පරිමාණ අත්හදා බැලීම් වළක්වයි. නව්‍ය සංස්කෘතික ආකෘතිවල පරිමාණය මගින් මෙම සීමාව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු කළ හැකිය (උදා: 24-ළිං, 96-ළිං, හෝ 384-ළිං සිදුරු සහිත ඇතුළු කිරීම් අඛණ්ඩව නැවත පිරවීමට සහ බාසෝලේටරල් මාධ්‍ය ඉවත් කිරීමට ඉඩ සලසයි).
මිනිස් බඩවැල් එපිටිලියම් වල ත්‍රිමාණ රූපජනකය ඇති කිරීම සඳහා, අපි සමාන්තර ක්ෂුද්‍ර නාලිකා දෙකක් සහ ඒ අතර ප්‍රත්‍යාස්ථ සිදුරු සහිත පටලයක් අඩංගු ක්ෂුද්‍ර තරල චිප බඩවැල් උපාංගයක් භාවිතා කර ලුමෙන්-කේශනාලිකා අතුරුමුහුණතක් නිර්මාණය කළෙමු. ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් මත වගා කරන ලද ධ්‍රැවීකරණය වූ එපිටිලියල් ස්ථරවලට යටින් අඛණ්ඩ බාසෝලාටරල් ප්‍රවාහයක් සපයන තනි නාලිකා ක්ෂුද්‍ර තරල උපාංගයක් (දෙමුහුන් චිපයක්) භාවිතා කිරීම ද අපි පෙන්නුම් කරමු. වේදිකා දෙකෙහිම, බාසෝලාටර මැදිරියෙන් මෝෆෝජන් ප්‍රතිවිරෝධක ඉවත් කිරීම සඳහා ප්‍රවාහයේ දිශානුගත හැසිරවීම යෙදීමෙන් විවිධ මිනිස් බඩවැල් එපිටිලියල් සෛලවල රූපජනකය පෙන්නුම් කළ හැකිය. සම්පූර්ණ පර්යේෂණාත්මක ක්‍රියා පටිපාටිය (රූපය 1) කොටස් පහකින් සමන්විත වේ: (i) බඩවැල් චිපයේ ක්ෂුද්‍ර නිෂ්පාදනය හෝ ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කළ හැකි දෙමුහුන් චිපය (පියවර 1-5; කොටුව 1), (ii) බඩවැල් එපිටිලියල් සෛල (කැකෝ-2 සෛල) හෝ මිනිස් බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය සකස් කිරීම; කොටු 2-5), (iii) බඩවැල් චිප්ස් හෝ දෙමුහුන් චිප්ස් මත බඩවැල් එපිටිලියල් සෛල සංස්කෘතිය (පියවර 6-9), (iv) ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා ත්‍රිමාණ රූපජනක ඉන් විට්‍රෝ (පියවර 10) සහ (v) ප්‍රේරණය (පියවර 11-24). අවසාන වශයෙන්, සුදුසු පාලන කණ්ඩායමක් (පහත සාකච්ඡා කර ඇත) එපිටිලියල් රූපජනක අවකාශීය, තාවකාලික, කොන්දේසි සහිත හෝ ක්‍රියා පටිපාටි පාලනයන් සමඟ සංසන්දනය කිරීමෙන් අභ්‍යන්තර රූපජනක ඉන් විට්‍රෝ (පියවර 10) ප්‍රේරණය කිරීම නිර්මාණය කරන ලදී.
අපි වෙනස් සංස්කෘතික වේදිකා දෙකක් භාවිතා කළෙමු: සෘජු නාලිකා හෝ රේඛීය නොවන කැටි ගැසුණු නාලිකා සහිත ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප්, හෝ ක්ෂුද්‍ර තරල උපාංගයක ට්‍රාන්ස්වෙල් (TW) ඇතුළු කිරීම් අඩංගු දෙමුහුන් චිප්, කොටුව 1 හි විස්තර කර ඇති පරිදි නිෂ්පාදනය කරන ලද අතර පියවර 1 -5. "උපාංග නිෂ්පාදනය" තනි චිපයක් හෝ දෙමුහුන් චිපයක් සෑදීමේ ප්‍රධාන පියවර පෙන්වයි." මානව බඩවැල් එපිටිලියල් සෛල සංස්කෘතිය" මෙම ප්‍රොටෝකෝලයේ භාවිතා කරන සෛල ප්‍රභවය (Caco-2 හෝ මානව බඩවැල් කාබනික) සහ සංස්කෘතික ක්‍රියා පටිපාටිය පැහැදිලි කරයි." In vitro morphogenesis" මඟින් Caco-2 හෝ කාබනික-ව්‍යුත්පන්න එපිටිලියල් සෛල බඩවැල් චිපයක් මත හෝ දෙමුහුන් චිපයක ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් මත වගා කරන සමස්ත පියවර පෙන්වයි, ඉන්පසු 3D morphogenesis ප්‍රේරණය සහ සංලක්ෂිත එපිටිලියල් ව්‍යුහයක් සෑදීම. වැඩසටහන් පියවර අංකය හෝ කොටු අංකය එක් එක් ඊතලයට පහළින් ප්‍රදර්ශනය කෙරේ. ස්ථාපිත බඩවැල් එපිටිලියල් ස්ථර භාවිතා කළ හැකි ආකාරය පිළිබඳ උදාහරණ යෙදුම මඟින් සපයයි, උදාහරණයක් ලෙස, සෛල අවකලනය ලක්ෂණකරණය, බඩවැල් කායික විද්‍යා අධ්‍යයනයන්, ධාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී පරිසර පද්ධති ස්ථාපිත කිරීම සහ රෝග වලදී. ආකෘති නිර්මාණය. “සෛල අවකලනය” තුළ ඇති ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්ත රූප, බඩවැල් චිපය මත ජනනය වන 3D Caco-2 එපිටිලියල් ස්ථරයේ ප්‍රකාශිත න්‍යෂ්ටීන්, F-ඇක්ටින් සහ MUC2 පෙන්වයි. MUC2 සංඥා කිරීම ගොබ්ලට් සෛලවල සහ ශ්ලේෂ්මල මතුපිටින් ස්‍රාවය වන ශ්ලේෂ්මලවල පවතී. බඩවැල් කායික විද්‍යාවේ ඇති ප්‍රතිදීප්ත රූප, ප්‍රතිදීප්ත තිරිඟු විෂබීජ ඇග්ලුටිනින් භාවිතයෙන් සියාලික් අම්ලය සහ N-ඇසිටිල්ග්ලූකොසැමයින් අපද්‍රව්‍ය සඳහා පැල්ලම් කිරීමෙන් නිපදවන ශ්ලේෂ්මල පෙන්වයි. “ධාරක-ක්ෂුද්‍රජීවී සම-සංස්කෘති” හි ඇති අතිච්ඡාදනය වන රූප දෙක, චිපයක් මත බඩවැලේ නියෝජිත ධාරක-ක්ෂුද්‍රජීවී සම-සංස්කෘතීන් පෙන්වයි. වම් පුවරුවේ ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරු 3D Caco-2 එපිටිලියල් සෛල සමඟ හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන් (GFP) ප්‍රකාශ කරන E. coli හි සම-සංස්කෘතිය පෙන්වයි. දකුණු පුවරුවේ 3D Caco-2 එපිටිලියල් සෛල සමඟ සම-සංස්කෘති කරන ලද GFP E. coli හි ප්‍රාදේශීයකරණය, පසුව F-ඇක්ටින් (රතු) සහ න්‍යෂ්ටීන් (නිල්) සමඟ ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්ත පැල්ලම් පෙන්වයි. රෝග ආකෘති නිර්මාණය බැක්ටීරියා සමඟ භෞතික විද්‍යාත්මක අභියෝගය යටතේ බඩවැල් දැවිල්ල චිප්ස් වල නිරෝගී සහ කාන්දු වන බඩවැල් නිරූපණය කරයි. ප්‍රතිදේහජනක (උදා: ලිපොපොලිසැකරයිඩ, LPS) සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල (උදා: PBMC; කොළ). ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථරයක් ස්ථාපිත කිරීම සඳහා Caco-2 සෛල වගා කරන ලදී. පරිමාණ තීරුව, 50 µm. පහළ පේළියේ රූප: යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කරන ලද “සෛල අවකලනය”.2. ඔක්ස්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාල මුද්‍රණාලය; Ref.5 වෙතින් අවසරය ඇතිව ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කරන ලදී. NAS; "ධාරක-ක්ෂුද්‍රජීවී සහ-සංස්කෘතිය" ref.3 වෙතින් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කරන ලදී. NAS; "රෝග ආකෘති නිර්මාණය" යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කරන ලදී.5. NAS.
මෘදු ලිතෝග්‍රැෆි මගින් සිලිකන් අච්චු වලින් ඉවත් කරන ලද PDMS අනුරූ භාවිතයෙන් gut-on-chip සහ දෙමුහුන් චිප් දෙකම නිෂ්පාදනය කරන ලදී1,44 සහ SU-8 සමඟ රටා කර ඇත. එක් එක් චිපයේ ක්ෂුද්‍ර නාලිකා වල සැලසුම තීරණය වන්නේ ෂියර් ආතතිය සහ ජල ගතික පීඩනය වැනි ජල ගති විද්‍යාව සලකා බැලීමෙනි1,4,12. සමාන්තර සෘජු ක්ෂුද්‍ර නාලිකා දෙකකින් සමන්විත වූ මුල් gut-on-a-chip නිර්මාණය (විස්තීරණ දත්ත රූපය 1a), ප්‍රේරණය කිරීම සඳහා වක්‍ර ක්ෂුද්‍ර නාලිකා යුගලයක් ඇතුළත් සංකීර්ණ gut-on-a-chip (විස්තීරණ දත්ත රූපය 1b) බවට පරිණාමය වී ඇත (විස්තීරණ දත්ත රූපය 1b) එයට ප්‍රේරණය කිරීම සඳහා වක්‍ර ක්ෂුද්‍ර නාලිකා යුගලයක් ඇතුළත් වේ වැඩි කරන ලද තරල පදිංචි කාලය, රේඛීය නොවන ප්‍රවාහ රටා සහ වගා කරන ලද සෛලවල බහුඅක්ෂීය විරූපණය (රූපය 2a-f) 12. වඩාත් සංකීර්ණ gut-on-a-chips නැවත නිර්මාණය කිරීමට අවශ්‍ය වූ විට, සංකීර්ණ gut-on-a-chips තෝරා ගත හැකිය. අපි පෙන්නුම් කර ඇත්තේ සංකෝචනය වූ Gut-Chip ද සමාන කාල රාමුවක් තුළ 3D morphogenesis ප්‍රේරණය කරන බවයි. වගා කරන ලද සෛල වර්ගය කුමක් වුවත්, මුල් බඩවැල්-චිප් හා සසඳන විට වර්ධනය. එබැවින්, ත්‍රිමාණ රූපජනකකරණය ඇති කිරීම සඳහා, රේඛීය සහ සංකීර්ණ චිප මත බඩවැල් සැලසුම් එකිනෙකට හුවමාරු කළ හැකිය. SU-8 රටා සහිත සිලිකන් අච්චු මත සුව කරන ලද PDMS අනුරූ, කඩා දැමීමෙන් පසු ඍණාත්මක ලක්ෂණ ලබා දුන්නේය (රූපය 2a). චිපයක් මත බඩවැල් නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා, සකස් කරන ලද ඉහළ PDMS ස්ථරය සිදුරු සහිත PDMS පටලයකට අනුක්‍රමිකව බන්ධනය කර, පසුව කොරෝනා ප්‍රතිකාරකයක් භාවිතයෙන් ආපසු හැරවිය නොහැකි බන්ධනයකින් පහළ PDMS ස්ථරය සමඟ පෙළගස්වන ලදී (රූපය 2b-f). දෙමුහුන් චිප් නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා, සුව කරන ලද PDMS අනුරූ වීදුරු ස්ලයිඩවලට බන්ධනය කර ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් සඳහා ඉඩ සැලසිය හැකි තනි නාලිකා ක්ෂුද්‍ර තරල උපාංග නිර්මාණය කරන ලදී (රූපය 2h සහ විස්තීරණ දත්ත රූපය 2). PDMS අනුරුවේ සහ වීදුරුවේ මතුපිට ඔක්සිජන් ප්ලාස්මා හෝ කොරෝනා ප්‍රතිකාර සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් බන්ධන ක්‍රියාවලිය සිදු කෙරේ. සිලිකොන් නළයට සවි කර ඇති ක්ෂුද්‍ර සැකසූ උපාංගය විෂබීජහරණය කිරීමෙන් පසු, උපාංග සැකසුම බඩවැල් එපිටිලියම්හි ත්‍රිමාණ රූපජනකය සිදු කිරීමට සූදානම් විය (රූපය 2g).
a, SU-8 රටා සහිත සිලිකන් අච්චු වලින් PDMS කොටස් සකස් කිරීම පිළිබඳ ක්‍රමානුකූල නිදර්ශනය. නොකැඩූ PDMS ද්‍රාවණය සිලිකන් අච්චුවකට (වමේ) වත් කර, 60 °C (මැද) දී සුව කර, (දකුණේ) ඉවත් කරන ලදී. කඩා දැමූ PDMS කැබලිවලට කපා තවදුරටත් භාවිතය සඳහා පිරිසිදු කරන ලදී.b, PDMS ඉහළ ස්ථරය සකස් කිරීමට භාවිතා කරන සිලිකන් අච්චුවේ ඡායාරූපය.c, PDMS සිදුරු සහිත පටලය නිපදවීමට භාවිතා කරන සිලිකන් අච්චුවේ ඡායාරූපය.d, ඉහළ සහ පහළ PDMS සංරචකවල සහ එකලස් කරන ලද චිපයේ බඩවැල් උපාංගයේ ඡායාරූප මාලාවක්.e, ඉහළ, පටල සහ පහළ PDMS සංරචක පෙළගැස්වීමේ ක්‍රමානුකූල.එක් එක් ස්ථරයක් ප්ලාස්මා හෝ කොරෝනා ප්‍රතිකාර මගින් ආපසු හැරවිය නොහැකි ලෙස බන්ධනය කර ඇත.f, අධිස්ථාපනය කරන ලද කැටි ගැසුණු ක්ෂුද්‍ර නාලිකා සහ රික්ත කුටි සහිත පිරිසැකසුම් කරන ලද ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් උපාංගයේ ක්‍රමානුකූල.උදා: ක්ෂුද්‍ර තරල සෛල සංස්කෘතිය සඳහා ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් සැකසීම.සිලිකොන් නලයක් සහ සිරින්ජයක් සමඟ එකලස් කරන ලද චිපයක් මත පිරිසැකසුම් කරන ලද බඩවැල් a මත තබා ඇත. ආවරණ ස්ලිප්. චිප් උපාංගය සැකසීම සඳහා 150 mm පෙට්‍රි දීසියක පියන මත තබා ඇත. සිලිකොන් නළය වැසීමට බන්ධකය භාවිතා කරයි.h, දෙමුහුන් චිප් භාවිතා කරමින් දෙමුහුන් චිප් නිෂ්පාදනයේ සහ 3D රූපජනකයේ දෘශ්‍ය ඡායාරූප. අන්ත්‍ර 3D රූපජනකය ඇති කිරීම සඳහා බඩවැල් එපිටිලියල් සෛලවල 2D ඒකස්ථර වගා කිරීම සඳහා ස්වාධීනව සකස් කරන ලද ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් දෙමුහුන් චිපයට ඇතුළු කරන ලදී. ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම මත ස්ථාපිත කර ඇති සෛල ස්ථරයට යටින් ඇති ක්ෂුද්‍ර නාලිකා හරහා මාධ්‍යය සිදුරු කර ඇත.පරිමාණ තීරුව, 1 සෙ.මී.h යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව නැවත මුද්‍රණය කරන ලදී.4. එල්සෙවියර්.
මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ, Caco-2 සෛල රේඛාව සහ බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය එපිටිලියල් ප්‍රභවයන් ලෙස භාවිතා කරන ලදී (රූපය 3a). සෛල වර්ග දෙකම ස්වාධීනව වගා කරන ලද අතර (කොටුව 2 සහ කොටුව 5) සහ චිප් බඩවැල් හෝ ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් වල ECM-ආලේපිත ක්ෂුද්‍ර නාලිකා බීජ කිරීමට භාවිතා කරන ලදී. සෛල සංගත වන විට (> ෆ්ලාස්ක් වල 95% ආවරණය), නිතිපතා වගා කරන ලද Caco-2 සෛල (ඡේද 10 සහ 50 අතර) T-ෆ්ලාස්ක් වල අස්වනු නෙලනු ලබන්නේ ට්‍රිප්සිනීකරණ තරලය (කොටුව 2) මගින් විඝටනය වූ සෛල අත්හිටුවීම් සකස් කිරීම සඳහා ය. බඩවැල් ජෛව පරීක්ෂණ හෝ ශල්‍යකර්ම ඉවත් කිරීම් වලින් මිනිස් බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය ව්‍යුහාත්මක ක්ෂුද්‍ර පරිසරයට සහාය වීම සඳහා ළිං තහඩු 24 ක මැට්‍රිගල් ස්කැෆෝල්ඩ් ගෝලාකාරවල වගා කරන ලදී. අත්‍යවශ්‍ය මෝෆොජන් (Wnt, R-spondin සහ Noggin වැනි) අඩංගු මධ්‍යම ප්‍රමාණය සහ කොටුව 3 හි විස්තර කර ඇති පරිදි සකස් කරන ලද වර්ධන සාධක අඩංගු මධ්‍යම ප්‍රමාණය, කාබනික ද්‍රව්‍ය විෂ්කම්භයෙන් ~500 µm දක්වා වර්ධනය වන තෙක් සෑම දිනකම අතිරේක කරන ලදී. සම්පූර්ණයෙන්ම වැඩුණු කාබනික ද්‍රව්‍ය අස්වනු නෙළා විඝටනය කරනු ලැබේ. චිපයක් මත බඩවැල් හෝ ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් මත බීජ වැපිරීම සඳහා තනි සෛල තුළට (කොටුව 5). අප කලින් වාර්තා කර ඇති පරිදි, එය රෝග වර්ගය 12, 13 (උදා: ulcerative colitis, Crohn's disease, colorectal cancer, හෝ සාමාන්‍ය පරිත්‍යාගශීලියා), තුවාල වූ ස්ථානය (උදා: තුවාලය හා තුවාල නොවූ ප්‍රදේශය) සහ පත්‍රිකාවේ ආමාශ ආන්ත්‍රික පිහිටීම (උදා: duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, හෝ rectum) අනුව වෙන්කර හඳුනාගත හැකිය. කුඩා අන්ත්‍ර අවයව වලට වඩා සාමාන්‍යයෙන් ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් යුත් මෝෆොජන් අවශ්‍ය වන කොලනික් කාබනික ද්‍රව්‍ය (කොලොයිඩ්) වගා කිරීම සඳහා අපි 5 වන කොටුවේ ප්‍රශස්ත ප්‍රොටෝකෝලයක් සපයන්නෙමු.
a, බඩවැල් චිපයේ බඩවැල් රූපජනක ප්‍රේරණය සඳහා කාර්ය ප්‍රවාහය. ත්‍රිමාණ රූපජනක නිරූපණය නිරූපණය කිරීම සඳහා Caco-2 මිනිස් බඩවැල් එපිටිලියම් සහ බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ භාවිතා වේ. හුදකලා එපිටිලියල් සෛල සකස් කරන ලද බඩවැල්-මත-චිප් උපාංගයේ (චිප් සකස් කිරීම) බීජ කරන ලදී. සෛල 0 වන දින (D0) PDMS සිදුරු සහිත පටලයට බීජ කර (බීජ කර) සම්බන්ධ කළ පසු (ඇමිණූ) පළමු දින 2 සඳහා අග්‍ර (AP) ප්‍රවාහය ආරම්භ කර නඩත්තු කරනු ලැබේ (ප්‍රවාහය, AP, D0-D2). සම්පූර්ණ 2D ඒකස්ථරයක් සෑදූ විට චක්‍රීය දිගු කිරීමේ චලිතයන් (දිගු කිරීම, ප්‍රවාහය, AP සහ BL) සමඟ බාසෝලාටරල් (BL) ප්‍රවාහය ද ආරම්භ වේ. ක්ෂුද්‍ර තරල සංස්කෘතියෙන් දින 5 කට පසු (රූපජනක විද්‍යාව, D5) ස්වයංසිද්ධව බඩවැල් 3D රූපජනකය සිදු විය. අදියර ප්‍රතිවිරුද්ධ රූප සෑම පර්යේෂණාත්මක පියවරකදීම හෝ කාල ලක්ෂ්‍යයකම Caco-2 සෛලවල නියෝජිත රූප විද්‍යාව පෙන්වයි (තීරු ප්‍රස්ථාරය, 100 µm). බඩවැල්වල අනුරූප කඳුරැල්ල නිරූපණය කරන ක්‍රමානුරූප රූප සටහන් හතරක් රූපජනකය (ඉහළ දකුණ).ක්‍රමලේඛනයේ ඇති ඉරි සහිත ඊතල තරල ප්‍රවාහයේ දිශාව නියෝජනය කරයි.b, ස්ථාපිත 3D Caco-2 එපිටිලියම් (වමේ) මතුපිට ස්ථලකය පෙන්වන SEM රූපය. විශාලනය කරන ලද ප්‍රදේශය (සුදු ඉරි සහිත කොටුව) උද්දීපනය කරන ලද ඇතුළත් කිරීම 3D Caco-2 ස්ථරයේ (දකුණ) ප්‍රතිජනනය කරන ලද මයික්‍රොවිල්ලි පෙන්වයි.c, ස්ථාපිත Caco-2 3D හි තිරස් ඉදිරිපස දර්ශනය, ක්ලෝඩින් (ZO-1, රතු) සහ අඛණ්ඩ බුරුසු මායිම් පටල F-ඇක්ටින් (කොළ) සහ න්‍යෂ්ටි (නිල්) ලෙස ලේබල් කර ඇත. බඩවැල් චිප්ස් මත එපිටිලියල් සෛලවල ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්තතාව සංවෘත දෘශ්‍යකරණය.මැද රූපලේඛනයට යොමු කරන ඊතල එක් එක් සංවෘත දර්ශනය සඳහා නාභීය තලයේ පිහිටීම දක්වයි.d, 3, 7, 9, 11 සහ 13 දිනවල අදියර ප්‍රතිවිරුද්ධ අන්වීක්ෂය මගින් ලබාගත් චිපයක් මත වගා කරන ලද කාබනික ද්‍රව්‍යවල රූප විද්‍යාත්මක වෙනස්කම් වල කාල ගමන් මග. ඇතුළත් කිරීම (ඉහළ දකුණ) සපයා ඇති රූපයේ ඉහළ විශාලනය පෙන්වයි.e, දිනයේදී ගන්නා ලද පෙත්තක් මත බඩවැලේ ස්ථාපිත කර ඇති කාබනික ද්‍රව්‍ය 3D එපිටිලියම් හි DIC ෆොටෝමික්‍රොග්‍රැෆ් 7.f, කඳ සෛල (LGR5; මැජෙන්ටා), ගොබ්ලට් සෛල (MUC2; කොළ), F-ඇක්ටින් (අළු) සහ න්‍යෂ්ටි (සයන්) සඳහා සලකුණු පෙන්වන ආවරණ ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්ත රූප, පිළිවෙලින් දින 3ක් බඩවැල් චිප්ස් මත වගා කරන ලද (වමේ) සහ දින 13ක (මැද) කාබනික ස්ථරයේ. MUC2 සංඥා කිරීමකින් තොරව LGR5 සංඥා ඉස්මතු කරන විස්තීරණ දත්ත රූපය 3 ද බලන්න. සංස්කෘතියේ 13 වන දින CellMask ඩයි (දකුණේ) සමඟ ප්ලාස්මා පටලය පැල්ලම් කිරීමෙන් චිපයක් මත බඩවැල් තුළ ස්ථාපිත කර ඇති 3D කාබනික එපිටිලියම්හි එපිටිලියල් ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය (දකුණේ) පෙන්වන ප්‍රතිදීප්ත රූප. වෙනත් ආකාරයකින් සඳහන් නොකළහොත් පරිමාණ තීරුව 50 μm වේ.b යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව නැවත මුද්‍රණය කර ඇත.2. ඔක්ස්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාල මුද්‍රණාලය; c යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කර ඇත.2. ඔක්ස්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාල මුද්‍රණාලය; e සහ f යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව අනුවර්තනය කර ඇත.12 නිර්මාණාත්මක පොදු බලපත්‍රය CC BY 4.0 යටතේ.
චිපයක් මත ඇති බඩවැල් තුළ, සාර්ථක ECM ආලේපනයක් සඳහා PDMS සිදුරු සහිත පටලයේ ජලභීතික මතුපිට වෙනස් කිරීම අවශ්‍ය වේ. මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ, PDMS පටලවල ජලභීතිකතාව වෙනස් කිරීම සඳහා අපි වෙනස් ක්‍රම දෙකක් යොදන්නෙමු. Caco-2 සෛල වගා කිරීම සඳහා, UV/ඕසෝන් ප්‍රතිකාරය මගින් මතුපිට සක්‍රිය කිරීම පමණක් PDMS මතුපිට ජලභීතිකතාව අඩු කිරීමට, ECM ආලේප කිරීමට සහ PDMS පටලයට Caco-2 සෛල සම්බන්ධ කිරීමට ප්‍රමාණවත් විය. කෙසේ වෙතත්, කාබනික එපිටිලියම් වල ක්ෂුද්‍ර තරල සංස්කෘතියට PDMS ක්ෂුද්‍ර නාලිකා වලට පොලිඑතිලීන් (PEI) සහ ග්ලූටරල්ඩිහයිඩ් අනුක්‍රමිකව යෙදීමෙන් ECM ප්‍රෝටීන කාර්යක්ෂමව තැන්පත් කිරීම සඳහා රසායනික පාදක මතුපිට ක්‍රියාකාරීත්වය අවශ්‍ය වේ. මතුපිට වෙනස් කිරීමෙන් පසු, ක්‍රියාකාරී PDMS මතුපිට ආවරණය කිරීම සඳහා ECM ප්‍රෝටීන තැන්පත් කර පසුව හුදකලා කාබනික එපිටිලියම් තුළට හඳුන්වා දෙන ලදී. සෛල සවි කිරීමෙන් පසු, ක්ෂුද්‍ර තරල සෛල සංස්කෘතිය ආරම්භ වන්නේ සෛල සම්පූර්ණ ඒක ස්ථරයක් සාදන තෙක් ඉහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවට මාධ්‍යය පමණක් සිදුරු කිරීමෙනි, පහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකාව ස්ථිතික තත්වයන් පවත්වා ගනී. මතුපිට සක්‍රිය කිරීම සහ ECM ආලේපනය සඳහා මෙම ප්‍රශස්ත ක්‍රමය මඟින් කාබනික එපිටිලියම් ඇමිණීම සක්‍රීය කරයි. PDMS මතුපිට ත්‍රිමාණ රූපජනකය ඇති කිරීමට.
ට්‍රාන්ස්වෙල් සංස්කෘතීන්ට සෛල බීජ වැපිරීමට පෙර ECM ආලේපනයක් ද අවශ්‍ය වේ; කෙසේ වෙතත්, ට්‍රාන්ස්වෙල් සංස්කෘතීන්ට සිදුරු සහිත ඇතුළු කිරීම්වල මතුපිට සක්‍රිය කිරීම සඳහා සංකීර්ණ පූර්ව ප්‍රතිකාර පියවර අවශ්‍ය නොවේ. ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් මත වැඩෙන Caco-2 සෛල සඳහා, සිදුරු සහිත ඇතුළු කිරීම් මත ECM ආලේපනය විඝටනය වූ Caco-2 සෛල ඇමිණීම (<පැය 1) සහ තද සන්ධි බාධක සෑදීම (<දින 1-2) වේගවත් කරයි. ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් මත වගා කරන කාබනික ද්‍රව්‍ය සඳහා, හුදකලා කාබනික ද්‍රව්‍ය ECM-ආලේපිත ඇතුළු කිරීම් මත බීජ කර, පටල මතුපිටට (<පැය 3) සම්බන්ධ කර, කාබනික ද්‍රව්‍ය බාධක අඛණ්ඩතාවයෙන් සම්පූර්ණ ඒක ස්ථරයක් සාදන තෙක් නඩත්තු කරනු ලැබේ. ට්‍රාන්ස්වෙල් සංස්කෘතීන් දෙමුහුන් චිප් භාවිතයෙන් තොරව ළිං 24 තහඩු වල සිදු කරනු ලැබේ.
ස්ථාපිත එපිටිලියල් ස්ථරයක බාසෝලාටරල් අංශයට තරල ප්‍රවාහය යෙදීමෙන් විට්‍රෝ 3D රූපජනකය ආරම්භ කළ හැකිය. චිපයක් මත ඇති බඩවැලේ, මාධ්‍යය ඉහළ සහ පහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකා වලට සිදුරු කළ විට එපිටිලියල් රූපජනකය ආරම්භ විය (රූපය 3a). කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි, දිශානුගත ස්‍රාවය කරන ලද මෝෆෝජන් නිෂේධක අඛණ්ඩව ඉවත් කිරීම සඳහා පහළ (බාසෝලාටරල්) මැදිරියේ තරල ප්‍රවාහය හඳුන්වා දීම ඉතා වැදගත් වේ. සිදුරු සහිත පටල මත බැඳී ඇති සෛල වලට ප්‍රමාණවත් පෝෂ්‍ය පදාර්ථ සහ සෙරුමය සැපයීම සහ ලුමිනල් ෂියර් ආතතිය ජනනය කිරීම සඳහා, අපි සාමාන්‍යයෙන් චිපයක් මත බඩවැලේ ද්විත්ව ප්‍රවාහයක් යොදන්නෙමු. දෙමුහුන් චිප්ස් වලදී, එපිටිලියල් ඒකස්ථර අඩංගු ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් දෙමුහුන් චිප්ස් තුළට ඇතුළු කරන ලදී. ඉන්පසු, ක්ෂුද්‍ර නාලිකාව හරහා සිදුරු සහිත ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීමේ බාසෝලාටරල් පැත්ත යටතේ මාධ්‍යය යොදන ලදී. සංස්කෘතික වේදිකා දෙකෙහිම බාසෝලාටරල් ප්‍රවාහය ආරම්භ කිරීමෙන් දින 3-5 කට පසු බඩවැල් රූපජනකය සිදු විය.
ක්ෂුද්‍ර ඉංජිනේරු ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථරවල රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ, අදියර ප්‍රතිවිරුද්ධ අන්වීක්ෂය, අවකල මැදිහත්වීම් ප්‍රතිවිරුද්ධතාව (DIC) අන්වීක්ෂය, SEM, හෝ ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්තතා කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂය (රූප 3 සහ 4) ඇතුළු විවිධ රූපකරණ ක්‍රම යෙදීමෙන් විශ්ලේෂණය කළ හැකිය. ත්‍රිමාණ එපිටිලියල් ස්ථරවල හැඩය සහ නෙරා යාම නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා සංස්කෘතිය තුළ ඕනෑම වේලාවක අදියර ප්‍රතිවිරුද්ධතාව හෝ DIC ප්‍රතිරූපණය පහසුවෙන් සිදු කළ හැකිය. PDMS සහ පොලියෙස්ටර් පටලවල දෘශ්‍ය විනිවිදභාවය හේතුවෙන්, ගුට්-ඔන්-ඒ-චිප් සහ දෙමුහුන් චිප් වේදිකා දෙකටම උපාංගය කොටස් කිරීම හෝ විසුරුවා හැරීම අවශ්‍ය නොවී තත්‍ය කාලීන ස්ථානීය රූපකරණය සැපයිය හැකිය. ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්තතා රූපකරණය සිදු කරන විට (රූප 1, 3c, f සහ 4b, c), සෛල සාමාන්‍යයෙන් 4% (wt/vol) පැරෆෝමල්ඩිහයිඩ් (PFA) සමඟ සවි කර ඇති අතර, පසුව ට්‍රයිටන් X-100 සහ 2% (wt/vol) ) ගව සෙරුම් ඇල්බියුමින් (BSA) අනුපිළිවෙලින් සවි කර ඇත. සෛල වර්ගය අනුව, විවිධ සවි කරන්නන්, පාරගම්යකාරක සහ අවහිර කිරීමේ කාරක විය හැකිය. භාවිතා කෙරේ. පෙළපත මත යැපෙන සෛල හෝ කලාප සලකුණු ඉලක්ක කරගත් ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ චිපයේ ස්ථානීයව නිශ්චල කර ඇති සෛල ඉස්මතු කිරීමට භාවිතා කරයි, ඉන්පසු ද්විතියික ප්‍රතිදේහ සහ න්‍යෂ්ටිය (උදා: 4′,6-ඩයමිඩිනෝ-2-ෆීනයිලීන්) ඉන්ඩෝල්, DAPI) හෝ F-ඇක්ටින් (උදා: ප්‍රතිදීප්ත ලෙස ලේබල් කරන ලද ෆාලොයිඩින්) ඉලක්ක කරගත් ප්‍රති-පැල්ලම් ඩයි එකක් භාවිතා කරයි. ශ්ලේෂ්මල නිෂ්පාදනය (රූපය 1, “සෛල අවකලනය” සහ “බඩවැල් කායික විද්‍යාව”), ක්ෂුද්‍රජීවී සෛල අහඹු ලෙස ජනපදකරණය කිරීම (රූපය 1, “ධාරක-ක්ෂුද්‍රජීවී සම-සංස්කෘතිය”), ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල බඳවා ගැනීම (රූපය 1, 'රෝග ආකෘතිකරණය') හෝ 3D එපිටිලියල් රූප විද්‍යාවේ සමෝච්ඡයන් (රූපය 3c,f සහ 4b,c) හඳුනා ගැනීම සඳහා ස්ථානීයව සිදු කළ හැකිය. ref හි විස්තර කර ඇති පරිදි, ඉහළ ස්ථරය පහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකා ස්ථරයෙන් වෙන් කිරීම සඳහා චිපයේ බඩවැල් වෙනස් කිරීමේදී. රූපය 2 හි පෙන්වා ඇති පරිදි, 3D එපිටිලියල් රූප විද්‍යාව මෙන්ම අග්‍ර බුරුසු මායිමේ ඇති ක්ෂුද්‍ර විලී. SEM මගින් දෘශ්‍යමාන කළ හැක (රූපය 3b). ප්‍රමාණාත්මක PCR5 හෝ තනි සෛල RNA අනුක්‍රමණය සිදු කිරීමෙන් අවකලනය සලකුණු වල ප්‍රකාශනය තක්සේරු කළ හැක. මෙම අවස්ථාවේ දී, බඩවැල් චිප්ස් හෝ දෙමුහුන් චිප්ස් වල වගා කරන ලද එපිටිලියල් සෛලවල ත්‍රිමාණ ස්ථර ට්‍රිප්සිනීකරණය මගින් අස්වනු නෙළා ගන්නා අතර පසුව අණුක හෝ ජාන විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරයි.
a, දෙමුහුන් චිපයක බඩවැල් රූපජනක ප්‍රේරණය සඳහා කාර්ය ප්‍රවාහය. දෙමුහුන් චිප වේදිකාවක ත්‍රිමාණ රූපජනකය නිරූපණය කිරීම සඳහා මෙම ප්‍රොටෝකෝලය තුළ Caco-2 සහ බඩවැල් කාබනික ද්‍රව්‍ය භාවිතා කරනු ලැබේ. සකස් කරන ලද ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් වල විඝටනය වූ එපිටිලියල් සෛල බීජ කරන ලදී (TW සූදානම; පහත රූපය බලන්න). ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීම් වල සෛල බීජ කර (බීජ කර) පොලියෙස්ටර් පටලවලට සම්බන්ධ කළ පසු, සියලුම සෛල ස්ථිතික තත්වයන් යටතේ වගා කරන ලදී (TW සංස්කෘතිය). දින 7 කට පසු, එපිටිලියල් සෛලවල 2D ඒක ස්ථරයක් අඩංගු තනි ට්‍රාන්ස්වෙල් ඇතුළු කිරීමක් දෙමුහුන් චිපයකට ඒකාබද්ධ කර බාසෝලාටරල් ප්‍රවාහයක් (ප්‍රවාහය, BL) හඳුන්වා දෙන ලදී, එය අවසානයේ ත්‍රිමාණ අපිච්ඡද ස්ථරයක් (මෝෆොජෙනසිස්) ජනනය කිරීමට හේතු විය. සෑම පර්යේෂණාත්මක පියවරකදීම හෝ කාල ලක්ෂ්‍යයකම සාමාන්‍ය පරිත්‍යාගශීලියාගෙන් (C103 රේඛාව) ආරෝහණ මහා බඩවැලෙන් ලබාගත් මිනිස් අවයව එපිටිලියල් සෛලවල රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ පෙන්වන අදියර ප්‍රතිවිරුද්ධ ක්ෂුද්‍ර රූප. ඉහළ ස්ථරවල ඇති ක්‍රමලේඛන එක් එක් පියවර සඳහා පර්යේෂණාත්මක වින්‍යාසය නිරූපණය කරයි.b, දෙමුහුන් චිප්ස් (වම් ක්‍රමානුරූප) ඉහළ-පහළ කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂීය දර්ශන සහිත කාබනික එපිටිලියල් සෛලවල ත්‍රිමාණ රූපජනකයට හේතු විය හැක. විවිධ Z ස්ථානවලින් (ඉහළ, මැද සහ පහළ; දකුණු ක්‍රමානුරූප සහ අනුරූප තිත් රේඛා බලන්න) ගත් ඒවා. පැහැදිලි රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ පෙන්නුම් කළේය. ස්ථිතික ට්‍රාන්ස්වෙල් (TW; සුදු ඉරි සහිත පෙට්ටිය තුළ ඇතුළත් කර ඇත) තුළ වගා කරන ලද කාබනික-ව්‍යුත්පන්න එපිටිලියල් සෛලවල F-ඇක්ටින් (සයන්), න්‍යෂ්ටිය (අළු).c, දෙමුහුන් චිපයට එරෙහිව (විශාලතම සම්පූර්ණ ඡායාරූපය) පිළිවෙලින් 2D එදිරිව 3D රූප විද්‍යාව සංසන්දනය කරමින්. 2D සිරස් හරස් කැපුම් දර්ශන යුගලයක් (ඉහළ දකුණු කෙළවරේ ඇතුළත් කර ඇත; "XZ") 2D සහ 3D විශේෂාංග ද පෙන්වයි. පරිමාණ තීරුව, 100 µm.c යොමුවෙන් අවසරය ඇතිව නැවත මුද්‍රණය කරන ලදී.4. එල්සෙවියර්.
සාම්ප්‍රදායික ස්ථිතික සංස්කෘතික තත්වයන් යටතේ එකම සෛල (Caco-2 හෝ බඩවැල් කාබනික එපිටිලියල් සෛල) ද්විමාන ඒකස්ථර බවට වගා කිරීමෙන් පාලනයන් සකස් කළ හැකිය. සැලකිය යුතු ලෙස, ක්ෂුද්‍ර නාලිකා වල සීමිත පරිමාව ධාරිතාව හේතුවෙන් පෝෂක ක්ෂය වීම සිදුවිය හැකිය (එනම් මුල් බඩවැල්-චිප් සැලසුමේ ඉහළ නාලිකාවේ ~4 µL). එබැවින්, බාසෝලේටරල් ප්‍රවාහය යෙදීමට පෙර සහ පසු එපිටිලියල් රූප විද්‍යාව ද සැසඳිය හැකිය.
මෘදු ලිතෝග්‍රැෆි ක්‍රියාවලිය පිරිසිදු කාමරයක සිදු කළ යුතුය. චිපයේ (ඉහළ සහ පහළ ස්ථර සහ පටල) සහ දෙමුහුන් චිප් වල ඇති සෑම ස්ථරයක් සඳහාම, ක්ෂුද්‍ර නාලිකා වල උස වෙනස් වූ බැවින්, විවිධ ෆොටෝමාස්ක් භාවිතා කර වෙනම සිලිකන් වේෆර් මත නිෂ්පාදනය කරන ලදී. චිපයේ ඇති බඩවැලේ ඉහළ සහ පහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකා වල ඉලක්ක උස පිළිවෙලින් 500 µm සහ 200 µm වේ. දෙමුහුන් චිපයේ නාලිකා ඉලක්ක උස 200 µm වේ.
ඇසිටෝන් සහිත බඳුනක අඟල් 3ක සිලිකන් වේෆරයක් තබන්න. තහඩුව තත්පර 30ක් මෘදු ලෙස කරකවන්න, පසුව වේෆරය වාතයේ වියළන්න. වේෆරය IPA සහිත තහඩුවකට මාරු කරන්න, ඉන්පසු පිරිසිදු කිරීම සඳහා තහඩුව තත්පර 30ක් කරකවන්න.
සිලිකන් වේෆර් මතුපිටින් කාබනික අපද්‍රව්‍ය ඉවත් කිරීම උපරිම කිරීම සඳහා පිරානා ද්‍රාවණයක් (හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් සහ සාන්ද්‍රිත සල්ෆියුරික් අම්ලයේ මිශ්‍රණය, 1:3 (වෙළුම/වෙළුම)) විකල්පයක් ලෙස භාවිතා කළ හැකිය.
පිරන්හා ද්‍රාවණය අතිශයින් විඛාදනයට ලක්වන අතර තාපය ජනනය කරයි. අමතර ආරක්ෂක පියවරයන් අවශ්‍ය වේ. අපද්‍රව්‍ය බැහැර කිරීම සඳහා, ද්‍රාවණය සිසිල් කර පිරිසිදු වියළි අපද්‍රව්‍ය භාජනයකට මාරු කිරීමට ඉඩ දෙන්න. ද්විතියික බහාලුම් භාවිතා කර අපද්‍රව්‍ය බහාලුම් නිසි ලෙස ලේබල් කරන්න. වඩාත් සවිස්තරාත්මක ක්‍රියා පටිපාටි සඳහා කරුණාකර පහසුකමෙහි ආරක්ෂක මාර්ගෝපදේශ අනුගමනය කරන්න.
වේෆර් 200 °C උණුසුම් තහඩුවක් මත විනාඩි 10ක් තබා විජලනය කරන්න. විජලනය කිරීමෙන් පසු, වේෆර් සිසිල් කිරීම සඳහා වාතයේ පස් වතාවක් සොලවනු ලැබේ.
පිරිසිදු කළ සිලිකන් වේෆරයේ මැදට ෆොටෝරෙසිස්ට් SU-8 2100 ~10 ග්රෑම් වත් කරන්න. ෆොටෝරෙසිස්ට් වේෆරය මත ඒකාකාරව පැතිරීමට කරකැවිල්ල භාවිතා කරන්න. ඉඳහිට ෆොටෝරෙසිස්ට් ඇලෙන සුළු වීම අඩු කිරීමට සහ පැතිරීම පහසු කිරීමට වේෆරය 65°C උණුසුම් තහඩුවක් මත තබන්න. වේෆරය කෙලින්ම උණුසුම් තහඩුව මත තබන්න එපා.
SU-8 වේෆරය මත ඒකාකාරව බෙදා හරින ලද්දේ ධාවනය වන භ්‍රමණ ආලේපනයෙනි. 100 rpm/s ත්වරණයකින් 500 rpm හි ප්‍රචාරණය කිරීම සඳහා SU-8 හි එන භ්‍රමණය තත්පර 5-10ක් සඳහා වැඩසටහන්ගත කරන්න. 1,500 rpm හි 200 µm ඝණකම රටා සඳහා ප්‍රධාන භ්‍රමණය සකසන්න, නැතහොත් 250 µm ඝණකම ලබා ගන්න (චිපයේ බඩවැලේ ඉහළ ස්ථරය සඳහා 500 µm උසක් සාදමින්; පහත “තීරණාත්මක පියවර” බලන්න) 1,200 rpm හි තත්පර 30 කින් 300 rpm/s ත්වරණයකින් සකසා ඇත.
සිලිකන් වේෆරයේ SU-8 රටාවේ ඉලක්ක ඝණකම අනුව ප්‍රධාන භ්‍රමණ වේගය සකස් කළ හැකිය.
චිපයේ බඩවැල්වල ඉහළ ස්ථරය සඳහා 500 µm උස SU-8 රටා නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා, මෙම පෙට්ටියේ භ්‍රමණ ආලේපනය සහ මෘදු පිළිස්සීමේ පියවර (පියවර 7 සහ 8) අනුපිළිවෙලින් පුනරාවර්තනය කරන ලදී (පියවර 9 බලන්න) 250 µm ස්ථර දෙකක් නිපදවීමට. මෙම පෙට්ටියේ 12 වන පියවරේදී UV නිරාවරණය මගින් ස්ථර කර සම්බන්ධ කළ හැකි SU-8 ඝන තට්ටුවක්, 500 µm උස ස්ථරයක් සාදයි.
SU-8 ආලේපිත වේෆර් මෘදු ලෙස බේක් කර, වේෆර් උණුසුම් තහඩුවක් මත 65 °C දී මිනිත්තු 5ක් ප්‍රවේශමෙන් තබන්න, පසුව සැකසුම 95 °C දක්වා මාරු කර තවත් විනාඩි 40ක් ඉන්කියුබේට් කරන්න.
ඉහළ ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවේ SU-8 රටාවේ 500 μm උසක් ලබා ගැනීම සඳහා, 250 μm ඝනකම SU-8 ස්ථර දෙකක් ජනනය කිරීමට පියවර 7 සහ 8 නැවත කරන්න.
UV Mask Aligner භාවිතා කරමින්, වේෆරයේ නිරාවරණ කාලය ගණනය කිරීම සඳහා නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව ලාම්පු පරීක්ෂණයක් සිදු කරන්න. (නිරාවරණ කාලය, ms) = (නිරාවරණ මාත්‍රාව, mJ/cm2)/(ලාම්පු බලය, mW/cm2).
නිරාවරණ කාලය තීරණය කිරීමෙන් පසු, UV ආවරණ පෙළගැස්මේ ආවරණ රඳවනය මත ෆොටෝමාස්ක් එක තබා SU-8 ආලේපිත වේෆරය මත ෆොටෝමාස්ක් එක තබන්න.
UV විසරණය අවම කිරීම සඳහා ෆොටෝමාස්ක් එකේ මුද්‍රිත මතුපිට සිලිකන් වේෆරයේ SU-8 ආලේපිත පැත්තේ කෙලින්ම තබන්න.
කලින් තීරණය කළ නිරාවරණ කාලය සඳහා SU-8 ආලේපිත වේෆර් සහ ෆොටෝමාස්ක් සිරස් අතට UV ආලෝකයේ 260 mJ/cm2 ට නිරාවරණය කරන්න (මෙම කොටුවේ 10 වන පියවර බලන්න).
UV නිරාවරණයෙන් පසු, 200 μm උසකින් යුත් රටා නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා SU-8-ආලේපිත සිලිකන් වේෆර් 65°C උෂ්ණත්වයකදී සෑම උණුසුම් තහඩුවකම මිනිත්තු 5ක් සහ 95°C උෂ්ණත්වයකදී මිනිත්තු 15ක් පුළුස්සනු ලැබේ. 500 µm උසකින් යුත් රටා නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා පිළිස්සීමෙන් පසු කාලය 95°C සිට මිනිත්තු 30 දක්වා දීර්ඝ කරන්න.
සංවර්ධකයා වීදුරු බඳුනකට වත් කර, බේක් කළ වේෆර් එක පිඟානේ තබා ඇත. SU-8 සංවර්ධකයාගේ පරිමාව වීදුරු තහඩුවේ ප්‍රමාණය අනුව වෙනස් විය හැකිය. නිරාවරණය නොවූ SU-8 සම්පූර්ණයෙන්ම ඉවත් කිරීමට ප්‍රමාණවත් SU-8 සංවර්ධකයෙකු භාවිතා කිරීමට වග බලා ගන්න. උදාහරණයක් ලෙස, 1 L ධාරිතාවක් සහිත 150 mm විෂ්කම්භය වීදුරු බඳුනක් භාවිතා කරන විට, SU-8 සංවර්ධකයාගේ ~300 mL භාවිතා කරන්න. ඉඳහිට මෘදු භ්‍රමණයකින් මිනිත්තු 25 ක් අච්චුව සංවර්ධනය කරන්න.
සකස් කරන ලද අච්චුව නැවුම් සංවර්ධක ~10 mL වලින් සෝදන්න, ඉන්පසු පයිප්පයක් භාවිතයෙන් ද්‍රාවණය ඉසීමෙන් IPA යොදන්න.
වේෆරය ප්ලාස්මා පිරිසිදු කරන්නෙකු තුළ තබා ඔක්සිජන් ප්ලාස්මාවට (වායුගෝලීය වායුව, ඉලක්ක පීඩනය 1 × 10−5 ටෝර්, බලය 125 W) විනාඩි 1.5 ක් නිරාවරණය කරන්න.
වීදුරු ස්ලයිඩයක් ඇතුළත ඇති රික්ත ඩෙසිකේටරයක වේෆරය තබන්න. වේෆර් සහ ස්ලයිඩ එකිනෙකට යාබදව තැබිය හැකිය. රික්ත ඩෙසිකේටරය තහඩුවකින් ස්ථර කිහිපයකට බෙදා ඇත්නම්, ස්ලයිඩ පහළ කුටියේ සහ වේෆර් ඉහළ කුටියේ තබන්න. ට්‍රයික්ලෝරෝ(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)සිලේන් ද්‍රාවණය වීදුරු ස්ලයිඩයක් මතට දමා සිලනීකරණය සඳහා රික්තය යොදන්න.
ශීත කළ Caco-2 සෛල කුප්පියක් 37°C ජල ස්නානයක දියකර, පසුව දියවන ලද සෛල 37°C පෙර රත් කළ Caco-2 මාධ්‍යයේ මිලි ලීටර් 15 ක් අඩංගු T75 ෆ්ලාස්කුවකට මාරු කරන්න.
~90% සංගම්‍යතාවයකින් Caco-2 සෛල පසු කිරීමට, පළමුව Caco-2 මාධ්‍යය, PBS සහ 0.25% ට්‍රිප්සින්/1 mM EDTA 37°C ජල ස්නානයක රත් කරන්න.
රික්තක අභිලාෂය මගින් මාධ්‍යය ආශ්වාස කරන්න. රික්තක අභිලාෂය නැවත නැවත කිරීමෙන් සහ නැවුම් PBS එකතු කිරීමෙන් උණුසුම් PBS මිලි ලීටර් 5 කින් සෛල දෙවරක් සෝදන්න.