Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ සීමිත CSS සහය ඇති බ්‍රවුසර අනුවාදයක් භාවිතා කරයි.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රිය කරන්න).ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.
ස්ලයිඩ තුනක කැරොසල් එකක් එකවර පෙන්වයි.වරකට විනිවිදක තුනක් හරහා ගමන් කිරීමට පෙර සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, නැතහොත් වරකට විනිවිදක තුනක් හරහා ගමන් කිරීමට අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩර් බොත්තම් භාවිතා කරන්න.
රුධිර-මොළයේ බාධකය සහ රුධිර-මොළයේ බාධකය ජෛව චිකිත්සක නියෝජිතයන් මධ්යම ස්නායු පද්ධතියේ ඔවුන්ගේ ඉලක්ක කරා ළඟා වීම වළක්වයි, එමගින් ස්නායු රෝග සඳහා ඵලදායී ප්රතිකාර වලට බාධා කරයි.vivo හි නව මොළ ප්‍රවාහකයන් සොයා ගැනීම සඳහා, අපි T7 phage peptide පුස්තකාලයක් හඳුන්වා දුන් අතර, මීයන්ගේ කැනුලේටඩ් සවිඥානික විශාල තටාක ආකෘතියක් භාවිතා කරමින් අනුක්‍රමිකව එකතු කරන ලද රුධිරය සහ මස්තිෂ්ක තරලය (CSF) හඳුන්වා දුන්නෙමු.තෝරා ගැනීමේ වට හතරකින් පසු විශේෂිත ෆේජ් ක්ලෝන CSF තුළ බෙහෙවින් පොහොසත් විය.තනි පුද්ගල අපේක්ෂක පෙප්ටයිඩ පරීක්ෂා කිරීමෙන් CSF හි 1000 ගුණයකට වඩා වැඩි පොහොසත් වීමක් අනාවරණය විය.හඳුනාගත් නව සංක්‍රාන්ති පෙප්ටයිඩයට සම්බන්ධ BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධකයක් භාවිතයෙන් මස්තිෂ්ක තරලයේ ඇමයිලොයිඩ්-β මට්ටම 40% කින් අඩු කිරීමෙන් මොළයට පෙප්ටයිඩ-මැදිහත් වූ බෙදා හැරීමේ ජෛව ක්‍රියාකාරීත්වය තහවුරු විය.මෙම ප්‍රතිඵල යෝජනා කරන්නේ in vivo phage තෝරාගැනීමේ ක්‍රම මගින් හඳුනාගත් පෙප්ටයිඩ, චිකිත්සක බලපෑමක් ඇතිව මොළයට සාර්ව අණු පද්ධතිමය ලෙස ලබා දීම සඳහා ප්‍රයෝජනවත් වාහන විය හැකි බවයි.
මධ්‍යම ස්නායු පද්ධතියේ (CNS) ඉලක්කගත ප්‍රතිකාර පර්යේෂණය බොහෝ දුරට අවධානය යොමු කර ඇත්තේ මොළයට සක්‍රීය ඖෂධ බෙදා හැරීමට හේතු වන යාන්ත්‍රණයන් සොයා ගැනීම සඳහා අඩු උත්සාහයකින්, CNS ඉලක්ක කරන ගුණාංග ප්‍රදර්ශනය කරන ප්‍රශස්ත ඖෂධ සහ නියෝජිතයන් හඳුනා ගැනීමයි.මත්ද්‍රව්‍ය බෙදා හැරීම, විශේෂයෙන් විශාල අණු, නවීන ස්නායු විද්‍යාවේ ඖෂධ සංවර්ධනයේ අනිවාර්ය අංගයක් වන බැවින් මෙය දැන් වෙනස් වීමට පටන් ගෙන ඇත.මධ්‍යම ස්නායු පද්ධතියේ පරිසරය මස්තිෂ්ක වාහිනී බාධක පද්ධතිය මගින් හොඳින් ආරක්ෂා වී ඇති අතර එය රුධිර මොළයේ බාධක (BBB) ​​සහ රුධිර මොළයේ බාධක (BCBB) 1 කින් සමන්විත වන අතර එමඟින් මොළයට ඖෂධ ලබා දීම අභියෝගාත්මක වේ1,2.සියලුම විශාල අණු ඖෂධ සහ කුඩා අණු ඖෂධවලින් 98% කට වඩා මොළයෙන් ඉවත් වන බව ඇස්තමේන්තු කර ඇත3.CNS 4,5 වෙත චිකිත්සක ඖෂධ කාර්යක්ෂම හා නිශ්චිත බෙදාහැරීමක් සපයන නව මොළයේ ප්රවාහන පද්ධති හඳුනා ගැනීම ඉතා වැදගත් වන්නේ එබැවිනි.කෙසේ වෙතත්, BBB සහ BCSFB ද මත්ද්‍රව්‍ය බෙදා හැරීම සඳහා විශිෂ්ට අවස්ථාවක් ඉදිරිපත් කරන්නේ ඒවා මොළයේ සියලුම ව්‍යුහයන් එහි පුළුල් සනාල හරහා විනිවිද ගොස් ඇතුළු වන බැවිනි.මේ අනුව, මොළයට බෙදා හැරීමේ ආක්‍රමණශීලී නොවන ක්‍රම භාවිතා කිරීමට දැනට දරන උත්සාහයන් බොහෝ දුරට පදනම් වී ඇත්තේ අන්තරාසර්ග BBB6 ප්‍රතිග්‍රාහකය භාවිතා කරමින් ප්‍රතිග්‍රාහක-මැදිහත් ප්‍රවාහනයේ (PMT) යාන්ත්‍රණය මත ය.Transferrin receptor pathway7,8 භාවිතා කරමින් මෑත කාලීන ප්‍රධාන දියුණුව තිබියදීත්, වැඩිදියුණු කළ ගුණාංග සහිත නව බෙදාහැරීමේ පද්ධති තවදුරටත් සංවර්ධනය කිරීම අවශ්‍ය වේ.මේ සඳහා, අපගේ ඉලක්කය වූයේ CSF ප්‍රවාහනයට මැදිහත් විය හැකි පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගැනීමයි, මන්ද ඒවා ප්‍රතිපත්තිමය වශයෙන් CNS වෙත සාර්ව අණු ලබා දීමට හෝ නව ප්‍රතිග්‍රාහක මාර්ග විවෘත කිරීමට භාවිතා කළ හැකි බැවිනි.විශේෂයෙන්ම, මස්තිෂ්ක වාහිනී පද්ධතියේ (BBB සහ BSCFB) විශේෂිත ප්රතිග්රාහක සහ ප්රවාහකයන් ජෛව චිකිත්සක ඖෂධවල ක්රියාකාරී සහ නිශ්චිත බෙදාහැරීම සඳහා විභව ඉලක්ක ලෙස සේවය කළ හැකිය.මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලය (CSF) යනු choroid plexus (CS) හි ස්‍රාවය කරන නිෂ්පාදනයක් වන අතර එය subarachnoid අවකාශය සහ කශේරුකා අවකාශය හරහා මොළයේ අන්තරාල තරලය සමඟ සෘජුව සම්බන්ධ වේ.සබ්බරාක්නොයිඩ් මස්තිෂ්ක තරලය මොළයේ අන්තරාලය තුළට අධික ලෙස විසරණය වන බව මෑතකදී පෙන්වා දී ඇත.මෙම subarachnoid ගලා එන මාර්ගය භාවිතයෙන් හෝ සෘජුවම BBB හරහා parenchymal අවකාශය වෙත ප්‍රවේශ වීමට අපි බලාපොරොත්තු වෙමු.මෙය සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා, අපි මෙම වෙනස් මාර්ග දෙකෙන් ප්‍රවාහනය කරන පෙප්ටයිඩ ඉතා මැනවින් හඳුනා ගන්නා ශක්තිමත් in vivo phage තේරීමේ උපාය මාර්ගයක් ක්‍රියාත්මක කළෙමු.
අපි දැන් ඉහළම පුස්තකාල විවිධත්වය සහිත මූලික තේරීම් වටයන් නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා CSF නියැදීම සමඟ ඉහළ ප්‍රතිදාන අනුක්‍රමණය (HTS) සමඟ අනුක්‍රමික in vivo phage සංදර්ශක පිරික්සුම් ක්‍රමයක් විස්තර කරන්නෙමු.රුධිරය අපවිත්‍ර වීම වළක්වා ගැනීම සඳහා ස්ථිරව තැන්පත් කරන ලද විශාල සිස්‌ටේනා (CM) කැනියුලාවක් සහිත සවිඥානක මීයන් මත පරීක්‍ෂණය සිදු කරන ලදී.වැදගත් ලෙස, මෙම ප්‍රවේශය මස්තිෂ්ක වාහිනී බාධක හරහා ප්‍රවාහන ක්‍රියාකාරකම් සහිත මොළය ඉලක්ක කර ගැනීම සහ පෙප්ටයිඩ යන දෙකම තෝරා ගනී.අපි T7 phages ඒවායේ කුඩා ප්‍රමාණය (~60 nm)10 නිසා භාවිතා කළ අතර ඒවා එන්ඩොතලියල් සහ/හෝ අපිච්ඡද-මැඩුල්ලා බාධකයේ අන්තර් සෛලීය හරස් කිරීමට ඉඩ සලසන වෙසිලිකා ප්‍රවාහනය සඳහා සුදුසු බව යෝජනා කළෙමු.වට හතරකින් පසු, vivo CSF ​​පොහොසත් කිරීම සහ මස්තිෂ්ක ක්ෂුද්‍ර වාහිනී ආශ්‍රිතව ශක්තිමත් බව පෙන්වන ෆේජ් ජනගහනය හුදකලා විය.වැදගත්ම දෙය නම්, වඩාත් කැමති සහ රසායනිකව සංස්ලේෂණය කරන ලද හොඳම අපේක්ෂක පෙප්ටයිඩ මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළට ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩ ප්‍රවාහනය කිරීමට හැකි බව පෙන්නුම් කිරීමෙන් අපගේ සොයාගැනීම් තහවුරු කිරීමට අපට හැකි විය.පළමුව, BACE1 පෙප්ටයිඩයේ නිෂේධකයක් සමඟ ප්‍රමුඛ සංක්‍රමණ පෙප්ටයිඩයක් ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් CNS හි ඖෂධීය බලපෑම් ස්ථාපිත කරන ලදී.vivo ක්‍රියාකාරී පිරික්සුම් ක්‍රමෝපායන් තුළ නව මොළ ප්‍රවාහන පෙප්ටයිඩ ඵලදායී ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩ වාහකයන් ලෙස හඳුනාගත හැකි බව පෙන්වීමට අමතරව, නව මොළය ප්‍රවාහනය කිරීමේ මාර්ග හඳුනාගැනීමේදී ද එවැනිම ක්‍රියාකාරී තේරීම් ප්‍රවේශයන් වැදගත් වනු ඇතැයි අපි අපේක්ෂා කරමු.
සමරු ඵලක සාදන ඒකක (PFU) මත පදනම්ව, ෆේජ් ඇසුරුම් පියවරෙන් පසුව, ආසන්න වශයෙන් 109 ක විවිධත්වයක් සහිත අහඹු 12-mer රේඛීය T7 ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයක් නිර්මාණය කර නිර්මාණය කරන ලදී (ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රම බලන්න).vivo panning හිදී අප පෙර මෙම පුස්තකාලය හොඳින් විශ්ලේෂණය කළ බව සැලකිල්ලට ගැනීම වැදගත්ය.නවීකරණය කරන ලද ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් ෆේජ් පුස්තකාල සාම්පලවල PCR විස්තාරණය HTS වෙත සෘජුවම අදාළ වන ඇම්ප්ලිකන් ජනනය කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 1a).අ) HTS11 අනුක්‍රමික දෝෂ, b) ප්‍රයිමර්වල (NNK) 1-12 ගුණාත්මක භාවයට ඇති බලපෑම, සහ c) පොරොත්තු පුස්තකාලයේ වල්-වර්ගයේ (wt) ෆේජ් (ඇටසැකිල්ල ඇතුළු කිරීම්) තිබීම හේතුවෙන්, සත්‍යාපිත අනුක්‍රමික තොරතුරු පමණක් උකහා ගැනීම සඳහා අනුක්‍රමික පෙරීමේ ක්‍රියා පටිපාටියක් ක්‍රියාත්මක කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 1).මෙම පෙරහන් පියවර සියලුම HTS අනුක්‍රමික පුස්තකාල සඳහා අදාළ වේ.සම්මත පුස්තකාලය සඳහා, සම්පූර්ණ කියවීම් 233,868 ක් ලබා ගත් අතර, එයින් 39% ක් පෙරහන් නිර්ණායක සමත් වූ අතර පුස්තකාල විශ්ලේෂණය සහ පසු වට සඳහා තේරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 1c-e).කියවීම් ප්‍රධාන වශයෙන් නියුක්ලියෝටයිඩ 36 (පරිපූරක Fig. 1c) හි උච්ච සහිත දිග පාදක යුගල 3 ක ගුණාකාර විය, පුස්තකාල සැලසුම (NNK) 1-12 තහවුරු කරයි.සැලකිය යුතු ලෙස, පුස්තකාල සාමාජිකයින්ගෙන් ආසන්න වශයෙන් 11% ක 12-මාන වල්-වර්ගයේ (wt) කොඳු නාරටිය PAGISRELVDKL ඇතුළු කිරීමක් අඩංගු වූ අතර, අනුපිළිවෙලින් අඩකට ආසන්න (49%) ඇතුළත් කිරීම් හෝ මකාදැමීම් අඩංගු විය.පුස්තකාල පුස්තකාලයේ HTS මගින් පුස්තකාලයේ ඇති පෙප්ටයිඩවල ඉහළ විවිධත්වය තහවුරු කරන ලදී: පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලින් 81% කට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් එක් වරක් පමණක් හමු වූ අතර ≥4 පිටපත් වල සිදු වූයේ 1.5% ක් පමණි (පරිපූරක Fig. 2a).සංග්‍රහයේ ඇති සියලුම ස්ථාන 12 හි ඇති ඇමයිනෝ අම්ලවල සංඛ්‍යාත (aa) පරිහානියට පත් වූ NKK ප්‍රතිපෝෂණය මගින් ජනනය කරන ලද කෝඩෝන සංඛ්‍යාව සඳහා අපේක්ෂිත සංඛ්‍යාත සමඟ හොඳින් සම්බන්ධ වේ (පරිපූරක Fig. 2b).මෙම ඇතුළු කිරීම් මගින් කේතනය කරන ලද aa අවශේෂවල නිරීක්ෂිත සංඛ්‍යාතය ගණනය කළ සංඛ්‍යාතය (r = 0.893) සමඟ හොඳින් සම්බන්ධ වේ (පරිපූරක Fig. 2c).එන්නත් කිරීම සඳහා ෆේජ් පුස්තකාල සකස් කිරීම එන්ඩොටොක්සින් විස්තාරණය කිරීමේ සහ ඉවත් කිරීමේ පියවර ඇතුළත් වේ.මෙය ෆේජ් පුස්තකාලවල විවිධත්වය අඩු කළ හැකි බව කලින් පෙන්වා දී ඇත12,13.එබැවින්, අපි එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කර ඇති තහඩු-විස්තාරණය කළ ෆේජ් පුස්තකාලයක් අනුපිළිවෙලට ගෙන AA සංඛ්‍යාතය තක්සේරු කිරීම සඳහා මුල් පුස්තකාලය සමඟ සංසන්දනය කළෙමු.මුල් තටාකය සහ විස්තාරණය කරන ලද සහ පිරිසිදු කරන ලද තටාකය (පරිපූරක Fig. 2d) අතර ශක්තිමත් සහසම්බන්ධයක් (r = 0.995) නිරීක්ෂණය කරන ලදී, T7 phage භාවිතයෙන් තහඩු මත විස්තාරණය කරන ලද ක්ලෝන අතර තරඟය ප්‍රධාන පක්ෂග්‍රාහීත්වයක් ඇති නොකළ බව පෙන්නුම් කරයි.පුස්තකාලවල විවිධත්වය (~109) HTS සමඟ පවා සම්පූර්ණයෙන් ග්‍රහණය කර ගත නොහැකි බැවින් මෙම සංසන්දනය එක් එක් පුස්තකාලය තුළ ඇති ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරවල සංඛ්‍යාතය මත පදනම් වේ.එක් එක් ස්ථානයේදී aa හි සංඛ්‍යාත විශ්ලේෂණය ඇතුළත් කළ ප්‍රතිමාවේ අවසාන ස්ථාන තුනෙහි කුඩා ස්ථාන මත යැපෙන පක්ෂග්‍රාහීත්වයක් අනාවරණය විය (පරිපූරක Fig. 2e).අවසාන වශයෙන්, පුස්තකාලයේ ගුණාත්මකභාවය සහ විවිධත්වය පිළිගත හැකි බව අපි නිගමනය කළ අතර තෝරා ගැනීමේ වට කිහිපයක් අතර ෆේජ් පුස්තකාල විස්තාරණය කිරීම සහ සකස් කිරීම හේතුවෙන් විවිධත්වයේ සුළු වෙනස්කම් පමණක් නිරීක්ෂණය විය.
BBB සහ/හෝ BCSFB (Fig. 1a-b) හරහා අභ්‍යන්තරව (iv) එන්නත් කරන ලද T7 phage හඳුනා ගැනීම පහසු කිරීම සඳහා සවිඥානක මීයන්ගේ CM වෙත කැනියුලාවක් ශල්‍යකර්මයෙන් බද්ධ කිරීමෙන් අනුක්‍රමික මස්තිෂ්ක තරල නියැදීම සිදු කළ හැකිය.අපි in vivo තේරීමේ පළමු වට තුනේදී ස්වාධීන තේරීම් ආයුධ (අත් A සහ ​​B) දෙකක් භාවිතා කළෙමු (රූපය 1c).තෝරා ගැනීමේ පළමු වට තුනේදී හඳුන්වා දුන් මුළු ෆේජ් ප්‍රමාණය අඩු කිරීමෙන් අපි තේරීමේ දැඩි බව ක්‍රමයෙන් වැඩි කළෙමු.සිව්වන වටය පෑන් කිරීම සඳහා, අපි A සහ ​​B ශාඛා වලින් සාම්පල ඒකාබද්ධ කර අතිරේක ස්වාධීන තේරීම් තුනක් සිදු කළෙමු.මෙම ආකෘතියේ T7 phage අංශුවල in vivo ගුණ අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, වලිගය හරහා මීයන් තුළට Wild-type phage (PAGISRELVDKL master insert) එන්නත් කරන ලදී.මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලයෙන් සහ රුධිරයෙන් විවිධ කාල ස්ථානවල phages ප්‍රතිසාධනය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ සාපේක්ෂව කුඩා T7 icosahedral phages රුධිර මැදිරියෙන් වේගවත් ආරම්භක නිෂ්කාශන අවධියක් ඇති බවයි (පරිපූරක පය. 3).පරිපාලනය කරන ලද ටයිටර සහ මීයන්ගේ රුධිර පරිමාව මත පදනම්ව, අපි ගණනය කළේ දළ වශයෙන් 1% wt පමණි.එන්නත් කිරීමෙන් මිනිත්තු 10 කට පසු පරිපාලන මාත්‍රාවෙන් phage රුධිරයේ අනාවරණය විය.මෙම ආරම්භක වේගවත් පහත වැටීමෙන් පසුව, මන්දගාමී ප්‍රාථමික නිෂ්කාශනය මිනිත්තු 27.7 ක අර්ධ ආයු කාලයක් සමඟ මනිනු ලැබීය.වැදගත් කරුණක් නම්, CSF මැදිරියෙන් ඉතා සුළු phages පමණක් ලබාගෙන ඇති අතර, CSF මැදිරියට වල් ආකාරයේ phage සංක්‍රමණය සඳහා අඩු පසුබිමක් පෙන්නුම් කරයි (පරිපූරක Fig. 3).සාමාන්‍යයෙන්, මුළු නියැදීමේ කාලය තුළ (මිනිත්තු 0-250) මස්තිෂ්ක තරලයේ අනාවරණය වූයේ රුධිරයේ T7 ෆේජ් හි ටයිටර 1 x 10-3% ක් සහ මුලින් එන්නත් කරන ලද 4 x 10-8% ක් පමණි.මස්තිෂ්ක තරලයේ වල් වර්ගයේ ෆේජ් වල අර්ධ ආයු කාලය (මිනිත්තු 25.7) රුධිරයේ නිරීක්ෂණයට සමාන වීම සැලකිය යුතු කරුණකි.CSF මැදිරිය රුධිරයෙන් වෙන් කරන බාධකය CM-කැනියුලේටඩ් මීයන් තුළ නොවෙනස්ව පවතින බව මෙම දත්ත පෙන්නුම් කරයි, phage පුස්තකාල vivo තෝරාගැනීමේදී රුධිරයෙන් CSF මැදිරියට පහසුවෙන් ප්‍රවාහනය කරන ක්ලෝන හඳුනා ගැනීමට ඉඩ සලසයි.
(අ) විශාල තටාකයකින් මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලය (CSF) නැවත නියැදීම සඳහා ක්‍රමයක් සැකසීම.(b) මධ්‍යම ස්නායු පද්ධතියේ (CNS) බාධකයේ සෛලීය පිහිටීම සහ රුධිර-මොළයේ බාධක (BBB) ​​සහ රුධිර-මොළයේ බාධකය තරණය කරන පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කරන තේරීම් උපාය මාර්ගය පෙන්වන රූප සටහන.(ඇ) in vivo phage display screening flowchart.තෝරා ගැනීමේ සෑම වටයකම, ෆේජ් (ඊතල ඇතුළත සත්ව හඳුනාගැනීම්) එන්නත් කරන ලදී.ස්වාධීන විකල්ප ශාඛා දෙකක් (A, B) තෝරා ගැනීමේ 4 වන වටය දක්වා වෙන වෙනම තබා ඇත.තේරීම් වට 3 සහ 4 සඳහා, CSF වෙතින් උපුටා ගන්නා ලද සෑම ෆේජ් ක්ලෝනයක්ම අතින් අනුක්‍රමණය කරන ලදී.(d) T7 පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයට (2 x 1012 phages/සත්ව) එන්නත් කිරීමෙන් පසු කැනුලේටඩ් මීයන් දෙදෙනෙකු තෝරා ගැනීමේ පළමු වටයේදී රුධිරයෙන් (රතු කවයන්) සහ මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලයෙන් (හරිත ත්‍රිකෝණයෙන්) හුදකලා වූ phage චාලක විද්‍යාව.නිල් චතුරස්‍ර මගින් රුධිරයේ ෆේජ් වල සාමාන්‍ය ආරම්භක සාන්ද්‍රණය පෙන්නුම් කරයි, මුළු රුධිර පරිමාව සැලකිල්ලට ගනිමින් එන්නත් කරන ලද ෆේජ් ප්‍රමාණයෙන් ගණනය කෙරේ.කළු චතුරස්‍ර මගින් රුධිර ෆේජ් සාන්ද්‍රණයෙන් බැහැර කරන ලද y රේඛාවේ ඡේදනය වීමේ ලක්ෂ්‍යය දක්වයි.(e,f) පෙප්ටයිඩයේ ඇති සියලුම අතිච්ඡාදනය වන ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරවල සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සහ ව්‍යාප්තිය ඉදිරිපත් කරන්න.කියවීම් 1000 කින් සොයාගත් මෝස්තර ගණන පෙන්වයි.සැලකිය යුතු ලෙස (p <0.001) සාරවත් මෝස්තර රතු තිත් වලින් සලකුණු කර ඇත.(ඉ) එන්නත් කරන ලද පුස්තකාලයේ ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරයේ සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය #1.1 සහ #1.2 සතුන්ගෙන් රුධිරයෙන් ලබාගත් ෆේජ් සමඟ සංසන්දනය කරමින් සහසම්බන්ධතා විසිරීම.(f) රුධිරයේ සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ හුදකලා වූ සත්ව ෆේජ් ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර #1.1 සහ #1.2 හි සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාත සංසන්දනය කරමින් සහසම්බන්ධතා විසිරීම.(g, h) රුධිරයෙන් (g) පොහොසත් වූ phage හි අනුක්‍රමික ID නිරූපණය එදිරිව එන්නත් කරන ලද පුස්තකාල සහ CSF (h) වලින් පොහොසත් කරන ලද phage සහ සතුන් දෙදෙනා තුළම vivo තේරීමේ වටයකින් පසු රුධිරය.එක් අකුරු කේතයේ විශාලත්වය පෙන්නුම් කරන්නේ එම ඇමයිනෝ අම්ලය එම ස්ථානයේ කොපමණ වාරයක් සිදු වේද යන්නයි.කොළ = ධ්‍රැවීය, දම් = උදාසීන, නිල් = මූලික, රතු = ආම්ලික සහ කළු = හයිඩ්‍රොෆෝබික් ඇමයිනෝ අම්ල.රූප සටහන 1a, b නිර්මාණය කර නිෂ්පාදනය කරන ලද්දේ Eduard Urich විසිනි.
අපි ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයක් CM උපකරණ මීයන් දෙදෙනෙකුට (ක්ලේඩ් A සහ ​​B) එන්නත් කළ අතර මස්තිෂ්ක තරලයෙන් සහ රුධිරයෙන් ෆේජ් හුදකලා කළෙමු (රූපය 1d).පුස්තකාලයේ ආරම්භක වේගවත් නිෂ්කාශනය වල් ආකාරයේ ෆේජ් හා සසඳන විට අඩුවෙන් ප්‍රකාශ විය.සතුන් දෙදෙනාගේම එන්නත් කරන ලද පුස්තකාලයේ සාමාන්‍ය අර්ධ ආයු කාලය රුධිරයේ විනාඩි 24.8 ක්, වල්-වර්ගයේ ෆේජ් වලට සමාන වන අතර CSF හි මිනිත්තු 38.5 කි.සෑම සතෙකුගේම රුධිරය සහ මස්තිෂ්ක තරල ෆේජ් සාම්පල HTS වෙත යොමු කරන ලද අතර කෙටි ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරයක් තිබීම සඳහා හඳුනාගත් සියලුම පෙප්ටයිඩ විශ්ලේෂණය කරන ලදී.ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර තෝරාගනු ලැබුවේ ඒවා ව්‍යුහය ගොඩනැගීමට සහ පෙප්ටයිඩ-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සඳහා අවම පදනමක් සපයන බැවිනි14,15.එන්නත් කරන ලද ෆේජ් පුස්තකාලය සහ සතුන් දෙදෙනාගේම රුධිරයෙන් ලබාගත් ක්ලෝන අතර මෝස්තර බෙදා හැරීමේ හොඳ සහසම්බන්ධයක් අපට හමු විය (රූපය 1e).දත්ත වලින් පෙන්නුම් කරන්නේ පුස්තකාලයේ සංයුතිය රුධිර මැදිරිය තුළ පමණක් ආන්තික ලෙස පොහොසත් වී ඇති බවයි.Weblogo16 මෘදුකාංගයේ අනුවර්තනයක් භාවිතයෙන් ඇමයිනෝ අම්ල සංඛ්‍යාත සහ සම්මුති අනුපිළිවෙල තවදුරටත් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, අපි රුධිර ග්ලයිසීන් අවශේෂවල (රූපය 1g) ශක්තිමත් සුපෝෂණයක් සොයා ගත්තෙමු.CSF වෙතින් තෝරාගත් ක්ලෝන සමඟ රුධිරය සංසන්දනය කළ විට, ශක්තිමත් තේරීමක් සහ මෝස්තරවල සමහරක් ඉවත් කිරීමක් නිරීක්ෂණය කරන ලදී (රූපය 1f), සහ සමහර ඇමයිනෝ අම්ල 12-සාමාජිකයින් (Fig. 1h) හි කලින් තීරණය කළ ස්ථානවල වඩාත් ප්‍රියජනක ලෙස පැවතුනි.සැලකිය යුතු ලෙස, එක් එක් සතුන් මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලයේ සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වන අතර, සතුන් දෙදෙනාගේම රුධිර ග්ලයිසීන් පොහොසත් වීම නිරීක්ෂණය විය (පරිපූරක Fig. 4a-j).සතුන් #1.1 සහ #1.2 මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලයේ අනුක්‍රමික දත්ත දැඩි ලෙස පෙරීමෙන් පසු, 964 සහ 420 අද්විතීය 12-mer පෙප්ටයිඩ ලබා ගන්නා ලදී (පරිපූරක Fig. 1d-e).හුදකලා වූ ෆේජ් ක්ලෝන විස්තාරණය කර vivo තේරීමේ දෙවන වටයකට භාජනය කරන ලදී.තෝරා ගැනීමේ දෙවන වටයෙන් ලබාගත් Phage එක් එක් සත්වයා තුළ HTS වලට ලක් කරන ලද අතර ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර ඇතිවීම විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා හඳුනාගත් සියලුම පෙප්ටයිඩ මෝටිෆ් හඳුනාගැනීමේ වැඩසටහනකට ආදානය ලෙස භාවිතා කරන ලදී (රූපය 2a, b, ef).CSF වෙතින් ප්‍රකෘතිමත් වූ phage හි පළමු චක්‍රය හා සසඳන විට, A සහ ​​B ශාඛාවල CSF හි බොහෝ මෝස්තර තවදුරටත් තෝරා ගැනීම සහ ඉවත් කිරීම අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 2).ඒවා එකිනෙකට වෙනස් අනුක්‍රමික රටාවන් නියෝජනය කරන්නේද යන්න තීරණය කිරීමට ජාල හඳුනාගැනීමේ ඇල්ගොරිතමයක් යොදන ලදී.විකල්ප ක්ලේඩ් A (Fig. 2c, d) සහ clade B (Fig. 2g, h) හි CSF විසින් ප්රතිසාධනය කරන ලද 12-මාන අනුපිළිවෙල අතර පැහැදිලි සමානකමක් නිරීක්ෂණය විය.එක් එක් ශාඛාවෙහි සංචිත විශ්ලේෂණය මගින් 12-mer පෙප්ටයිඩ සඳහා විවිධ තේරීම් පැතිකඩ අනාවරණය විය (පරිපූරක Fig. 5c,d) සහ පළමු වටයේ තේරීමට සාපේක්ෂව දෙවන වටයේ තේරීමෙන් පසු සංචිත කරන ලද ක්ලෝන සඳහා කාලයත් සමඟ CSF / රුධිර ටයිටර් අනුපාතය වැඩි වීමක් (පරිපූරක Fig. 5e).)
vivo ක්‍රියාකාරී ෆේජ් සංදර්ශක තේරීමේ අනුක්‍රමික වට දෙකකින් මස්තිෂ්ක තරලයේ මෝස්තර සහ පෙප්ටයිඩ පොහොසත් කිරීම.
සෑම සතෙකුගේම පළමු වටයෙන් ප්‍රකෘතිමත් වූ සියලුම මස්තිෂ්ක තරල phages (සතුන් #1.1 සහ #1.2) එකතු කර, විස්තාරණය කර, HT අනුපිළිවෙලට සහ නැවත එන්නත් කරන ලදී (2 x 1010 phages/සත්ව) 2 SM කැනුලේටඩ් මීයන් (#1.1 → #).2.1 සහ 2.2, 1.2 → 2.3 සහ 2.4).(a,b,e,f) පළමු සහ දෙවන තේරීම් වටවල සියලුම CSF-ව්‍යුත්පන්න phages වල ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරවල සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සංසන්දනය කරමින් සහසම්බන්ධතා විසිරීම.දිශානති දෙකෙහිම පෙප්ටයිඩවල ඇති සියලුම අතිච්ඡාදනය වන ට්‍රයිප්ටයිඩ නියෝජනය කරන මෝස්තරවල සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සහ ව්‍යාප්තිය.කියවීම් 1000 කින් සොයාගත් මෝස්තර ගණන පෙන්වයි.සංසන්දනය කරන ලද පුස්තකාලවලින් එකක සැලකිය යුතු (p <0.001) තෝරාගත් හෝ බැහැර කරන ලද මෝස්තර රතු තිත් සමඟ උද්දීපනය කෙරේ.(c, d, g, h) vivo තේරීමේ වට 2 සහ 1 මත පදනම්ව සියලුම CSF-පොහොසත් ඇමයිනෝ අම්ල 12 දිගු අනුපිළිවෙලෙහි අනුක්‍රමික ලාංඡන නිරූපණය.එක් අකුරු කේතයේ විශාලත්වය පෙන්නුම් කරන්නේ එම ඇමයිනෝ අම්ලය එම ස්ථානයේ කොපමණ වාරයක් සිදු වේද යන්නයි.ලාංඡනය නියෝජනය කිරීම සඳහා, තේරීම් වට දෙකක් අතර තනි සතුන්ගෙන් ලබාගත් CSF අනුක්‍රමවල සංඛ්‍යාතය සංසන්දනය කර දෙවන වටයේ පොහොසත් අනුපිළිවෙල පෙන්වනු ලැබේ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 සහ (h) #1.2–#2.4.(c, d) සතුන් තුළ දී ඇති ස්ථානයක වඩාත්ම පොහොසත් ඇමයිනෝ අම්ල අංක.2.1 සහ අංක.2.2 හෝ (g, h) සතුන් තුළ අංක.2.3 සහ අංක.2.4 වර්ණයෙන් දැක්වේ.කොළ = ධ්‍රැවීය, දම් = උදාසීන, නිල් = මූලික, රතු = ආම්ලික සහ කළු = හයිඩ්‍රොෆෝබික් ඇමයිනෝ අම්ල.
තුන්වන වටයේ තේරීමෙන් පසුව, අපි සතුන් දෙදෙනෙකුගෙන් හුදකලා වූ CSF-ප්‍රතිසංවිධානය කරන ලද ෆේජ් ක්ලෝන 332 කින් අද්විතීය පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් 124 ක් (#3.1 සහ #3.2) හඳුනා ගත්තෙමු (පරිපූරක Fig. 6a).අනුක්‍රමය LGSVS (18.7%) ඉහළම සාපේක්ෂ අනුපාතය ඇති අතර, පසුව වල්-වර්ග ඇතුළු කිරීම් PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), සහ SARGSWREIVSLS (2.2%) විය.අවසාන සිව්වන වටයේ දී, අපි වෙනම සතුන් තිදෙනෙකුගෙන් ස්වාධීනව තෝරාගත් ශාඛා දෙකක් එකතු කළෙමු (රූපය 1c).CSF වෙතින් ලබා ගත් අනුක්‍රමික ෆේජ් ක්ලෝන 925 න්, සිව්වන වටයේ දී අපට අනන්‍ය පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් 64 ක් (පරිපූරක Fig. 6b) හමු විය, ඒ අතර වල් වර්ගයේ ෆේජ් වල සාපේක්ෂ අනුපාතය 0.8% දක්වා පහත වැටුණි.සිව්වන වටයේ වඩාත් සුලභ CSF ක්ලෝන වූයේ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC සහ RRPQKINGARVC (3.6%) එස්ඩී.%)).තෝරාගත් පෙප්ටයිඩවල දිග පරාසය NNK පුස්තකාල නිර්මාණය සඳහා පරිහානියට පත් කෝඩෝන භාවිතා කරන විට පුස්තකාල ප්‍රයිමර්වල ඇති නියුක්ලියෝටයිඩ ඇතුළත් කිරීම්/මකාදැමීම් හෝ නොමේරූ නැවතුම් කෝඩෝන නිසා වේ.නොමේරූ නැවතුම් කෝඩෝන කෙටි පෙප්ටයිඩ ජනනය කරන අතර ඒවා තෝරාගනු ලබන්නේ හිතකර aa මෝස්තරය අඩංගු බැවිනි.දිගු පෙප්ටයිඩ කෘත්‍රිම පුස්තකාලවල ප්‍රයිමර්වල ඇතුළත් කිරීම්/මැකීම් නිසා ඇති විය හැක.මෙය නිර්මාණය කර ඇති නැවතුම් කෝඩෝනය රාමුවෙන් පිටත ස්ථානගත කර නව නැවතුම් කෝඩෝනයක් පහළට දිස්වන තෙක් එය කියවයි.සාමාන්‍යයෙන්, අපි ආදාන දත්ත නියැදි ප්‍රතිදාන දත්ත සමඟ සංසන්දනය කිරීමෙන් තේරීම් වට හතරටම පොහොසත් කිරීමේ සාධක ගණනය කළෙමු.තිරගත කිරීමේ පළමු වටය සඳහා, අපි විශේෂිත නොවන පසුබිම් යොමුවක් ලෙස වල්-වර්ගයේ ෆේජ් ටයිටර් භාවිතා කළෙමු.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, පළමු CSF චක්‍රයේ දී සෘණ ෆේජ් තෝරාගැනීම ඉතා ප්‍රබල වූ නමුත් රුධිරයේ (පය. 3a) නොවේ, එය පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ බොහෝ සාමාජිකයින් CSF මැදිරියට හෝ සාපේක්ෂ ෆේජ් වලට නිෂ්ක්‍රීය ලෙස විසරණය වීමේ අඩු සම්භාවිතාව නිසා විය හැකියකෙසේ වෙතත්, දෙවන වටයේ panning වලදී, CSF හි phages ප්‍රබල තේරීමක් ක්ලේඩ් දෙකෙහිම නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, පෙර වටය CSF අවශෝෂණය ප්‍රවර්ධනය කරන පෙප්ටයිඩ ප්‍රදර්ශනය කරන phages වලින් පොහොසත් වී ඇති බව යෝජනා කරයි (රූපය 3a).නැවතත්, සැලකිය යුතු රුධිර පොහොසත් කිරීමකින් තොරව.එසේම තුන්වන සහ සිව්වන වට වලදී, phage ක්ලෝන CSF හි සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් විය.අවසාන තේරීම් වට දෙක අතර එක් එක් අද්විතීය පෙප්ටයිඩ අනුක්‍රමයේ සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සසඳන විට, සිව්වන වටයේ තේරීමේ අනුපිළිවෙල වඩාත් පොහොසත් වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 3b).පෙප්ටයිඩ දිශානතිය දෙකම භාවිතා කරමින් අද්විතීය පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් 64 කින් ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර 931 ක් උපුටා ගන්නා ලදී.සිව්වන වටයේ වඩාත්ම සාරවත් මෝස්තර, එන්නත් කරන ලද පුස්තකාලයට (කපා හැරීම: 10% පොහොසත් කිරීම) (පරිපූරක Fig. 6c) හා ​​සසඳන විට සියලු වට හරහා ඔවුන්ගේ පොහොසත් කිරීමේ පැතිකඩ සඳහා වඩාත් සමීපව පරීක්ෂා කරන ලදී.සාමාන්‍ය තේරීම් රටාවන් පෙන්නුම් කළේ අධ්‍යයනය කරන ලද චේතනා බොහොමයක් තේරීම් ශාඛා දෙකෙහිම පෙර පැවති සියලුම වටවල පොහොසත් වී ඇති බවයි.කෙසේ වෙතත්, සමහර ආකෘතීන් (උදා: SGL, VSG, LGS GSV) ප්‍රධාන වශයෙන් විකල්ප ක්ලේඩ් A වෙතින් වන අතර අනෙක් ඒවා (උදා: FGW, RTN, WGF, NTR) විකල්ප B කාණ්ඩයෙන් පොහොසත් විය.
ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් පේලෝඩ් වලට සංකලනය කරන ලද CSF-සපෝෂිත ෆේජ් ඩිස්ප්ලේ පෙප්ටයිඩ සහ බයෝටයිනයිලේටඩ් ලීඩර් පෙප්ටයිඩවල CSF ප්‍රවාහනය වලංගු කිරීම.
(a) එන්නත් කරන ලද (ආදාන = I) phage (PFU) ටයිටර සහ අධිෂ්ඨාන කළ CSF phage titers (ප්‍රතිදානය = O) මත පදනම්ව වට හතරේම (R1-R4) ගණනය කරන ලද පොහොසත් කිරීමේ අනුපාත.පසුගිය වට තුනේ (R2-R4) පොහොසත් කිරීමේ සාධක ගණනය කරනු ලැබුවේ බර දත්ත සමඟ පෙර වටය සහ පළමු වටය (R1) සමඟ සැසඳීමෙනි.විවෘත බාර් යනු මස්තිෂ්ක තරලය, සෙවන සහිත තීරු ප්ලාස්මා වේ.(***p<0.001, සිසුන්ගේ t-test මත පදනම්ව).(ආ) තෝරා ගැනීමේ 4 වෙනි වටයෙන් පසුව CSF හි එකතු කරන ලද සියලුම ෆේජ් වලට ඔවුන්ගේ සාපේක්ෂ අනුපාතය අනුව ශ්‍රේණිගත කර ඇති බහුල ෆේජ් පෙප්ටයිඩ ලැයිස්තුව.වඩාත් සුලභ ෆේජ් ක්ලෝන හය වර්ණයෙන්, අංකවලින් සහ තෝරා ගැනීමේ වට 3 සහ 4 අතර (ඇතුළත් කිරීම්) අතර ඒවායේ පොහොසත් කිරීමේ සාධකවලින් උද්දීපනය කර ඇත.(c,d) 4 වටයේ ඇති වඩාත්ම පොහොසත් ෆේජ් ක්ලෝන, හිස් ෆේජ් සහ මාපිය ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාල හය CSF නියැදි ආකෘතියක් තුළ තනි තනිව විශ්ලේෂණය කරන ලදී.CSF සහ රුධිර සාම්පල නියමිත වේලාවන්හිදී එකතු කරන ලදී.;එක් එක් එන්නත් කරන ලද ෆේජ් ක්ලෝනයේ සහ ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ CSF ඖෂධීය විද්‍යාව කාලයත් සමඟ පෙන්වා ඇත.(d) නියැදීමේ කාලය තුළ සියලුම ප්‍රතිසාධන phages/mL සඳහා සාමාන්‍ය CSF/රුධිර අනුපාතය පෙන්වයි.(ඉ) සින්තටික් ලීඩර් පෙප්ටයිඩ හතරක් සහ එක් ස්ක්‍රැම්බල්ඩ් පාලනයක් බයෝටින් සමඟ ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් සමඟ සම්බන්ධ කර ඔවුන්ගේ එන්-ටර්මිනස් (ටෙට්‍රාමර් සංදර්ශකය) හරහා ඉන්ජෙක්ෂන් (වලිග නහර iv, 10 mg streptavidin/kg).අවම වශයෙන් ඉන්ටියුබේටඩ් මීයන් තුනක් (N = 3).)CSF සාම්පල සඳහන් කරන ලද කාල ලක්ෂ්‍යවලදී එකතු කරන ලද අතර ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් සාන්ද්‍රණය CSF ප්‍රති-ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් ELISA මගින් මනිනු ලැබේ (nd = අනාවරණය කර නොමැත).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA පරීක්ෂණය මත පදනම්ව).(f) තෝරා ගැනීමේ 4 වැනි වටයේ සිට අනෙකුත් තෝරාගත් ෆේජ් පෙප්ටයිඩ ක්ලෝන සමඟ වඩාත් පොහොසත් ෆේජ් පෙප්ටයිඩ ක්ලෝනය #2002 (දම්) ඇමයිනෝ අම්ල අනුක්‍රමය සංසන්දනය කිරීම.සමාන හා සමාන ඇමයිනෝ අම්ල කොටස් වර්ණ-කේත කර ඇත.
සිව්වන වටයේ (රූපය 3b) සියලු පොහොසත් phages අතරින්, CSF නියැදි ආකෘතියේ වැඩිදුර තනි විශ්ලේෂණය සඳහා අපේක්ෂක ක්ලෝන හයක් තෝරා ගන්නා ලදී.අපේක්ෂක ෆේජ් හයක්, හිස් ෆේජ් (ඇතුළත් කිරීමක් නැත) සහ ප්‍රොපේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාල සමාන ප්‍රමාණවලින් කන්නියුලේටඩ් CM සතුන් තිදෙනෙකුට එන්නත් කරන ලද අතර, CSF (පය. 3c) සහ රුධිරය (පරිපූරක පය. 7) විශ්ලේෂණයන්හි ඖෂධවේදය තීරණය කරන ලදී.පරීක්ෂා කරන ලද සියලුම ෆේජ් ක්ලෝන හිස් පාලන ෆේජ් (#1779) ට වඩා 10-1000 ගුණයකින් ඉහළ මට්ටමක CSF මැදිරිය ඉලක්ක කර ඇත.උදාහරණයක් ලෙස, #2020 සහ #2077 ක්ලෝන වල පාලන ෆේජ් වලට වඩා 1000 ගුණයකින් වැඩි CSF ටයිටර තිබුණි.තෝරාගත් එක් එක් පෙප්ටයිඩයේ ඖෂධීය පැතිකඩ වෙනස් වේ, නමුත් ඒ සියල්ලටම ඉහළ CSF හෝමිං හැකියාවක් ඇත.ක්ලෝන #1903 සහ #2011 සඳහා කාලයත් සමඟ නිරන්තර අඩුවීමක් අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර #2077, #2002 සහ #2009 ක්ලෝන සඳහා පළමු මිනිත්තු 10 තුළ වැඩි වීමක් සක්‍රීය ප්‍රවාහනය පෙන්නුම් කළ හැකි නමුත් සත්‍යාපනය කළ යුතුය.ක්ලෝන #2020, #2002, සහ #2077 ඉහළ මට්ටම්වලදී ස්ථාවර වූ අතර, ක්ලෝන #2009 හි CSF සාන්ද්‍රණය ආරම්භක වැඩිවීමෙන් පසුව සෙමින් අඩු විය.ඉන්පසුව අපි එක් එක් CSF අපේක්ෂකයාගේ සාපේක්ෂ සංඛ්යාතය එහි රුධිර සාන්ද්රණය සමඟ සංසන්දනය කළෙමු (රූපය 3d).සෑම CSF අපේක්ෂකයෙකුගේම මධ්‍යන්‍ය ටයිටරය එහි රුධිර ටයිටරය සමඟ ඇති සහසම්බන්ධයෙන් පෙන්නුම් කළේ අපේක්ෂකයින් හය දෙනාගෙන් තිදෙනෙකු රුධිර CSF වලින් සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් වී ඇති බවයි.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, #2077 ක්ලෝනය ඉහළ රුධිර ස්ථායීතාවයක් පෙන්නුම් කරයි (පරිපූරක රූපය 7).CSF මැදිරිය තුළට phage අංශු හැර අනෙකුත් භාණ්ඩ සක්‍රියව ප්‍රවාහනය කිරීමට පෙප්ටයිඩවලටම හැකියාව ඇති බව තහවුරු කිරීම සඳහා, අපි phage අංශුවට පෙප්ටයිඩ සම්බන්ධ වන N-terminus හි දී biotin සමඟ ව්‍යුත්පන්න කරන ලද ලීඩර් පෙප්ටයිඩ හතරක් සංස්ලේෂණය කළෙමු.ෆේජ් ජ්‍යාමිතිය තරමක් අනුකරණය කරන බහුඅවයවික ආකෘති ලබා ගැනීම සඳහා බයෝටයිනයිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ (අංක 2002, 2009, 2020 සහ 2077) ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් (එස්ඒ) සමඟ සංයෝජන කරන ලදී.මෙම ආකෘතිය අපට රුධිරයේ සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ SA නිරාවරණය භාණ්ඩ ප්‍රවාහනය කරන ප්‍රෝටීන් පෙප්ටයිඩ ලෙස මැනීමට ඉඩ ලබා දුන්නේය.වැදගත් කරුණක් නම්, කෘත්‍රිම පෙප්ටයිඩ මෙම SA-සංයෝජක ආකෘතියෙන් පරිපාලනය කළ විට ෆේජ් දත්ත බොහෝ විට ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකිය (රූපය 3e).තැළුණු පෙප්ටයිඩවලට අඩු ආරම්භක නිරාවරණයක් සහ වේගවත් CSF නිෂ්කාශනය පැය 48 ක් ඇතුළත හඳුනාගත නොහැකි මට්ටම් ඇත.මෙම පෙප්ටයිඩ ෆේජ් ක්ලෝන CSF අවකාශයට බෙදා හැරීමේ මාර්ග පිළිබඳ අවබෝධයක් ලබා ගැනීම සඳහා, vivo තුළ අභ්‍යන්තර එන්නත් කිරීමෙන් පැය 1 කට පසු ෆේජ් අංශු කෙලින්ම හඳුනා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව (IHC) භාවිතයෙන් අපි තනි ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පහරවල් දේශීයකරණය කිරීම විශ්ලේෂණය කළෙමු.සැලකිය යුතු ලෙස, #2002, #2077, සහ #2009 ක්ලෝන මොළයේ කේශනාලිකා වල ශක්තිමත් පැල්ලම් මගින් අනාවරණය කර ගත හැකි අතර, පාලන ෆේජ් (#1779) සහ #2020 ක්ලෝන අනාවරණය කර නොතිබුණි (පරිපූරක රූපය 8).මෙයින් ඇඟවෙන්නේ මෙම පෙප්ටයිඩ BBB තරණය කිරීමෙන් මොළයට ඇති බලපෑමට දායක වන බවයි.BSCFB මාර්ගය ද සම්බන්ධ විය හැකි බැවින්, මෙම උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා තවදුරටත් සවිස්තරාත්මක විශ්ලේෂණයක් අවශ්‍ය වේ.අනෙකුත් තෝරාගත් පෙප්ටයිඩ සමඟ වඩාත්ම පොහොසත් වූ ක්ලෝනයේ (#2002) ඇමයිනෝ අම්ල අනුක්‍රමය සංසන්දනය කිරීමේදී, ඒවායින් සමහරක් සමාන ඇමයිනෝ අම්ල දිගු ඇති බව සටහන් විය, එය සමාන ප්‍රවාහන යාන්ත්‍රණයක් දැක්විය හැකිය (රූපය 3f).
එහි අද්විතීය ප්ලාස්මා පැතිකඩ සහ කාලයත් සමඟ CSF හි සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් හේතුවෙන්, phage display clone #2077 පැය 48 ක කාලයක් පුරා තවදුරටත් ගවේෂණය කරන ලද අතර තිරසාර SA මට්ටම් සමඟ සම්බන්ධව නිරීක්ෂණය කරන ලද CSF හි වේගවත් වැඩිවීම ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීමට හැකි විය (රූපය 4a).හඳුනාගත් අනෙකුත් ෆේජ් ක්ලෝන සම්බන්ධයෙන්, #2077 මොළයේ කේශනාලිකා සඳහා දැඩි ලෙස පැල්ලම් කර ඇති අතර ඉහළ විභේදනයකින් බැලූ විට කේශනාලිකා මාර්කර් ලෙක්ටින් සමඟ සැලකිය යුතු කොලොකල්කරණයක් පෙන්නුම් කළ අතර සමහර විට පරෙන්චිමල් අවකාශයේ යම් පැල්ලම් ඇති විය හැකිය (රූපය 4b).පෙප්ටයිඩ-මැදිහත් ඖෂධීය බලපෑම් CNS තුළ ලබා ගත හැකිද යන්න විමර්ශනය කිරීම සඳහා, අපි i) #2077 සංක්‍රමණ පෙප්ටයිඩ සහ ii) BACE1 inhibitor පෙප්ටයිඩවල biotinylated අනුවාද විවිධ අනුපාත දෙකකින් SA සමඟ මිශ්‍ර කරන ලද පරීක්ෂණයක් සිදු කළෙමු.එක් සංයෝජනයක් සඳහා අපි BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධකය පමණක් භාවිතා කළ අතර අනෙක් සඳහා අපි BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධකය #2077 පෙප්ටයිඩයට 1:3 අනුපාතයක් භාවිතා කළෙමු.සාම්පල දෙකම අභ්‍යන්තරව පරිපාලනය කරන ලද අතර බීටා-ඇමිලොයිඩ් පෙප්ටයිඩ 40 (Abeta40) හි රුධිරය සහ මස්තිෂ්ක තරල මට්ටම් කාලයත් සමඟ මනිනු ලැබීය.Abeta40 CSF හි මනිනු ලැබුවේ එය මොළයේ parenchyma හි BACE1 නිෂේධනය පිළිබිඹු කරන බැවිනි.අපේක්ෂා කළ පරිදි, සංකීර්ණ දෙකම Abeta40 හි රුධිර මට්ටම් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළේය (රූපය 4c, d).කෙසේ වෙතත්, පෙප්ටයිඩ මිශ්‍රණයක් අඩංගු සාම්පල පමණි.2077 සහ SA සමඟ සංයෝජිත BACE1 පෙප්ටයිඩයේ නිෂේධකයක් මස්තිෂ්ක තරලයේ Abeta40 හි සැලකිය යුතු අඩුවීමක් ඇති කළේය (රූපය 4c).දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ පෙප්ටයිඩ අංක.2077 60 kDa SA ප්‍රෝටීනය CNS වෙත ප්‍රවාහනය කිරීමට සමත් වන අතර BACE1 පෙප්ටයිඩයේ SA-සංයුජ නිෂේධක සමඟ ඖෂධීය බලපෑම් ඇති කරයි.
(අ) CSF පෙප්ටයිඩ #2077 (RLSSVDSDLSGC) හි දිගුකාලීන ඖෂධීය පැතිකඩ පෙන්වන T7 ෆේජ් හි ක්ලෝනල් එන්නත් (2 × 10 phages/සත්ව) සහ අවම වශයෙන් CM-intubated මීයන් තිදෙනෙකු තුළ එන්නත් නොකළ පාලන ෆේජ් (#1779).(ආ) පෙප්ටයිඩ #2077 සහ යාත්‍රාවල (ලෙක්ටින්) ප්‍රති-පැල්ලම් පෙන්වන ෆේජ්-එන්නත් කරන ලද මීයන් (2 × 10 10 ෆේජ්/සත්ව) තුළ ඇති නියෝජිත බාහික ක්ෂුද්‍ර නාලිකාවල කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂීය රූපය.මෙම ෆේජ් ක්ලෝන මීයන් 3 දෙනෙකුට ලබා දී පෙරා පැය 1ක් සංසරණය වීමට ඉඩ හැරියේය.T7 ෆේජ් කැප්සිඩයට එරෙහිව පොලික්ලෝනල් FITC-ලේබල් කරන ලද ප්‍රතිදේහ වලින් මොළය කොටස් කර පැල්ලම් කර ඇත.පර්ෆියුෂන් සහ පසුව සවි කිරීමට මිනිත්තු දහයකට පෙර, DyLight594-ලේබල් කරන ලද ලෙක්ටින් අභ්‍යන්තරව පරිපාලනය කරන ලදී.කේශනාලිකා සහ පෙරිවාස්කියුලර් මොළයේ පටක වල ක්ෂුද්‍ර වාහිනීවල ලුමිනල් පැත්තේ සහ ෆේජ් (කොළ) ලෙක්ටින් පැල්ලම් (රතු) පෙන්නුම් කරන ප්‍රතිදීප්ත රූප.පරිමාණ තීරුව 10 µm ට අනුරූප වේ.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide තනිකරම හෝ biotinylated transit peptide #2077 සමඟ ඒකාබද්ධව streptavidin සමඟ සම්බන්ධ කර පසුව අවම වශයෙන් කැනුලේටඩ් CM මීයන් තිදෙනෙකු (10 mg streptavidin/kg) එන්නත් කරන ලදී.Aβ40 හි BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධනය-මැදිහත් වීම අඩු කිරීම Aβ1-40 ELISA මගින් රුධිරයේ (රතු) සහ මස්තිෂ්ක තරලය (තැඹිලි) මගින් මනිනු ලැබේ.වඩා හොඳ පැහැදිලිකම සඳහා, 100% පරිමාණයෙන් ප්‍රස්ථාරය මත තිත් රේඛාවක් අඳිනු ලැබේ.(ඇ) 3:1 අනුපාතයකින් සංක්‍රමණ පෙප්ටයිඩ #2077 සහ BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩ සමඟ සංයෝජිත ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද මීයන්ගේ රුධිරයේ (රතු ත්‍රිකෝණ) සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ (තැඹිලි ත්‍රිකෝණ) Aβ40 හි ප්‍රතිශතය අඩු කිරීම.(d) ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද මීයන්ගේ රුධිරයේ Aβ40 (රතු කව) සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ (තැඹිලි කව) ප්‍රතිශතයක් අඩු කිරීම සහ BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩයකට පමණි.පාලනයේ Aβ සාන්ද්‍රණය 420 pg/ml (සම්මත අපගමනය = 101 pg/ml) විය.
ජෛව වෛද්‍ය පර්යේෂණ ක්ෂේත්‍ර කිහිපයකම Phage display සාර්ථකව යෙදී ඇත17.මෙම ක්‍රමය vivo සනාල විවිධත්ව අධ්‍යයන 18,19 සඳහා මෙන්ම මස්තිෂ්ක යාත්‍රා ඉලක්ක කරගත් අධ්‍යයන 20,21,22,23,24,25,26 සඳහා භාවිතා කර ඇත.මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි මෙම තේරීමේ ක්‍රමයේ යෙදීම මස්තිෂ්ක යාත්‍රා ඉලක්ක කරගත් පෙප්ටයිඩ සෘජුව හඳුනා ගැනීමට පමණක් නොව, රුධිර-මොළයේ බාධකය තරණය කිරීම සඳහා ක්‍රියාකාරී ප්‍රවාහන ගුණ ඇති අපේක්ෂකයින් සොයා ගැනීම දක්වා ද ව්‍යාප්ත කළෙමු.අපි දැන් CM intubated මීයන් තුළ in vivo තෝරා ගැනීමේ ක්‍රියා පටිපාටියක් වර්ධනය කිරීම විස්තර කරන අතර CSF හෝමිං ගුණාංග සහිත පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගැනීමට එහි ඇති හැකියාව ප්‍රදර්ශනය කරමු.12-mer සසම්භාවී පෙප්ටයිඩවල පුස්තකාලයක් ප්‍රදර්ශනය කරන T7 phage භාවිතා කරමින්, T7 phage රුධිර-මොළයේ බාධකයට අනුවර්තනය වීමට ප්‍රමාණවත් තරම් කුඩා (ආසන්න වශයෙන් nm 60 nm) 10 බව පෙන්නුම් කිරීමට අපට හැකි විය.කැනියුලේටඩ් CM මීයන්ගෙන් CSF අස්වනු නෙලීම vivo ක්‍රියාකාරී පිරික්සුම් ක්‍රමය තුළ හොඳින් පාලනය වන බවත්, නිස්සාරණය කරන ලද ෆේජ් රුධිර නාල වලට පමණක් නොව රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා ප්‍රවාහකයක් ලෙසද ක්‍රියා කරන බවත් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.තවද, එකවරම රුධිරය එකතු කිරීම සහ CSF සහ රුධිරයෙන් ලබාගත් phages සඳහා HTS යෙදීමෙන්, අපගේ CSF තේරීම රුධිරය පොහොසත් කිරීම හෝ තේරීම් වට අතර ප්‍රසාරණය සඳහා යෝග්‍යතාවයට බල නොපා ඇති බව අපි තහවුරු කළෙමු.කෙසේ වෙතත්, රුධිර මැදිරිය තෝරා ගැනීමේ ක්‍රියා පටිපාටියේ කොටසකි, මන්ද CSF මැදිරියට ළඟා විය හැකි phages මොළයේ පොහොසත් වීමට තරම් දිගු කාලයක් රුධිර ප්‍රවාහයේ සංසරණය විය යුතුය.අමු HTS දත්ත වලින් විශ්වාසනීය අනුක්‍රමික තොරතුරු උකහා ගැනීම සඳහා, අපි විශ්ලේෂණ කාර්ය ප්‍රවාහයේ වේදිකා-විශේෂිත අනුක්‍රමික දෝෂ වලට අනුවර්තනය කරන ලද පෙරහන් ක්‍රියාත්මක කළෙමු.තිරගත කිරීමේ ක්‍රමයට චාලක පරාමිතීන් ඇතුළත් කිරීමෙන්, අපි වල්-වර්ගයේ T7 phages (t½ ~ 28 min) හි වේගවත් ඖෂධීය විද්‍යාව 24, 27, 28 හි තහවුරු කළ අතර මස්තිෂ්ක තරලයේ (t½ ~ 26 min) මිනිත්තුවකට ඔවුන්ගේ අර්ධ ආයු කාලය තීරණය කළෙමු.රුධිරයේ සහ CSF හි සමාන ඖෂධීය පැතිකඩයන් තිබියදීත්, CSF හි රුධිර සාන්ද්‍රණයෙන් 0.001% ක් පමණක් හඳුනා ගත හැකි අතර, රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා වල්-වර්ගයේ T7 ෆේජ් අඩු පසුබිම් සංචලනය පෙන්නුම් කරයි.ක්ලෝන කිහිපයකට CNS මැදිරියට ළඟා විය හැකි බැවින්, විශේෂයෙන් සංසරණයෙන් වේගයෙන් ඉවත් වන ෆේජ් පද්ධති සඳහා vivo පෑන් කිරීමේ උපාය මාර්ග භාවිතා කිරීමේදී පළමු වටයේ තේරීමේ වැදගත්කම මෙම කාර්යය ඉස්මතු කරයි.මේ අනුව, පළමු වටයේ දී, පුස්තකාල විවිධත්වය අඩු කිරීම ඉතා විශාල විය, මන්ද මෙම ඉතා දැඩි CSF ආකෘතියේ අවසානයේ සීමිත ක්ලෝන සංඛ්‍යාවක් පමණක් එකතු කරන ලදී.මෙම in vivo panning උපාය මාර්ගයට CSF මැදිරිය තුළ ක්‍රියාකාරී සමුච්චය වීම, රුධිර මැදිරිය තුළ ක්ලෝන පැවැත්ම සහ පළමු මිනිත්තු 10 ඇතුළත T7 phage ක්ලෝන රුධිරයෙන් ඉක්මනින් ඉවත් කිරීම වැනි තේරීම් පියවර කිහිපයක් ඇතුළත් විය (රූපය 1d සහ අතිරේක Fig. 4M).)මේ අනුව, පළමු වටයෙන් පසුව, CSF හි විවිධ ෆේජ් ක්ලෝන හඳුනා ගන්නා ලදී, නමුත් තනි සතුන් සඳහා එකම ආරම්භක සංචිතය භාවිතා කරන ලදී.විශාල පුස්තකාල සාමාජිකයින් සංඛ්‍යාවක් සිටින මූලාශ්‍ර පුස්තකාල සඳහා විවිධ දැඩි තේරීම් පියවරයන් විවිධත්වයේ සැලකිය යුතු අඩුවීමක් ඇති කරන බව මෙයින් යෝජනා කරයි.එබැවින්, අහඹු සිදුවීම් මූලික තේරීම් ක්‍රියාවලියේ අනිවාර්ය අංගයක් බවට පත්වනු ඇත, එය ප්‍රතිඵලයට බෙහෙවින් බලපායි.මුල් පුස්තකාලයේ ඇති බොහෝ ක්ලෝන වලට ඉතා සමාන CSF පොහොසත් කිරීමේ ප්‍රවණතාවක් තිබෙන්නට ඇත.කෙසේ වෙතත්, එකම පර්යේෂණාත්මක තත්වයන් යටතේ වුවද, ආරම්භක සංචිතයේ ඇති එක් එක් විශේෂිත ක්ලෝන කුඩා සංඛ්‍යාව හේතුවෙන් තේරීම් ප්‍රතිඵල වෙනස් විය හැක.
CSF හි පොහොසත් වූ මෝස්තර රුධිරයේ ඇති ඒවාට වඩා වෙනස් වේ.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, එක් එක් සතුන්ගේ රුධිරයේ ග්ලයිසීන් පොහොසත් පෙප්ටයිඩ වෙත පළමු මාරුව අපි සටහන් කළෙමු.(රූපය 1g, පරිපූරක රූප. 4e, 4f).ග්ලයිසීන් පෙප්ටයිඩ අඩංගු ෆේජ් වඩාත් ස්ථායී විය හැකි අතර සංසරණයෙන් ඉවත් වීමට ඇති ඉඩකඩ අඩුය.කෙසේ වෙතත්, මෙම ග්ලයිසීන් බහුල පෙප්ටයිඩ මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරල සාම්පලවල අනාවරණය නොවූ අතර, සංග්‍රහ කළ පුස්තකාල විවිධ තේරීම් පියවර දෙකක් හරහා ගිය බව යෝජනා කරයි: එකක් රුධිරයේ සහ තවත් එකක් මස්තිෂ්ක තරලයේ එකතු වීමට ඉඩ සලසයි.සිව්වන වටයේ තේරීමේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස CSF-පොහොසත් වූ ක්ලෝන පුළුල් ලෙස පරීක්ෂා කර ඇත.තනි තනිව පරීක්‍ෂා කරන ලද ක්ලෝන සියල්ලම පාහේ හිස් පාලන ෆේජ් හා සසඳන විට CSF වලින් පොහොසත් බව තහවුරු විය.එක් පෙප්ටයිඩ පහරක් (#2077) වඩාත් විස්තරාත්මකව පරීක්ෂා කරන ලදී.එය අනෙකුත් පහරවලට සාපේක්ෂව දිගු ප්ලාස්මා අර්ධ ආයු කාලයක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 3d සහ අතිරේක රූප සටහන 7), සහ සිත්ගන්නා කරුණ නම්, මෙම පෙප්ටයිඩයේ C-ටර්මිනස් හි සිස්ටීන් අවශේෂයක් අඩංගු වීමයි.පෙප්ටයිඩ වලට සිස්ටීන් එකතු කිරීම ඇල්බියුමින් 29 සමඟ බන්ධනය වීමෙන් ඒවායේ ඖෂධීය ගුණ වැඩි දියුණු කළ හැකි බව මෑතකදී පෙන්වා දී ඇත.මෙය දැනට පෙප්ටයිඩ #2077 සඳහා නොදන්නා අතර වැඩිදුර අධ්‍යයනය අවශ්‍ය වේ.සමහර පෙප්ටයිඩ CSF සුපෝෂණයේ සංයුජතා යැපීමක් පෙන්නුම් කළේය (දත්ත පෙන්වා නැත), එය T7 කැප්සිඩයේ ප්‍රදර්ශනය කරන ලද මතුපිට ජ්‍යාමිතිය හා සම්බන්ධ විය හැකිය.අපි භාවිතා කළ T7 පද්ධතිය ෆේජ් අංශුවකට එක් එක් පෙප්ටයිඩයේ පිටපත් 5-15 දක්වා පෙන්වයි.මීයන්ගේ මස්තිෂ්ක බාහිකයට අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලද අපේක්ෂක ඊයම් ෆේජ් ක්ලෝන මත IHC සිදු කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 8).දත්ත පෙන්නුම් කළේ අවම වශයෙන් ක්ලෝන තුනක් (අංක 2002, අංක 2009 සහ අංක 2077) BBB සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කළ බවයි.මෙම BBB අන්තර්ක්‍රියාවේ ප්‍රතිඵලය වන්නේ CSF සමුච්චය වීමද නැතහොත් මෙම ක්ලෝන සෘජුවම BCSFB වෙත ගමන් කිරීමද යන්න තීරණය කිරීමට ඉතිරිව ඇත.වැදගත් ලෙස, අපි පෙන්නුම් කරන්නේ තෝරාගත් පෙප්ටයිඩ සංස්ලේෂණය කරන විට සහ ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩ සමඟ බැඳී ඇති විට ඒවායේ CSF ප්‍රවාහන ධාරිතාව රඳවා ගන්නා බවයි.N-terminal biotinylated peptides SA වෙත බන්ධනය කිරීම අත්‍යවශ්‍යයෙන්ම රුධිරයේ සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ අදාළ phage ක්ලෝන සමඟ ලබාගත් ප්‍රතිඵල පුනරාවර්තනය කරයි (රූපය 3e).අවසාන වශයෙන්, අපි පෙන්වන්නේ ඊයම් පෙප්ටයිඩ #2077 SA සමඟ සංයෝජිත BACE1 හි biotinylated peptide inhibitor හි මොළයේ ක්‍රියාකාරිත්වය ප්‍රවර්ධනය කිරීමට සමත් වන අතර, CSF හි Abeta40 මට්ටම් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කිරීමෙන් CNS හි උච්චාරණ ඖෂධීය බලපෑම් ඇති කරයි (රූපය 4).සියලුම පහරවල්වල පෙප්ටයිඩ අනුක්‍රමික සමලිංගික සෙවීමක් සිදු කිරීමෙන් අපට දත්ත සමුදායේ කිසිදු සමලිංගිකයක් හඳුනා ගැනීමට නොහැකි විය.T7 පුස්තකාලයේ ප්‍රමාණය දළ වශයෙන් 109ක් වන අතර, 12-mers සඳහා න්‍යායාත්මක පුස්තකාල ප්‍රමාණය 4 x 1015 වන බව සැලකිල්ලට ගැනීම වැදගත්ය. එම නිසා, අපි 12-mer පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ විවිධත්ව අවකාශයේ කුඩා කොටසක් පමණක් තෝරා ගත්තෙමු, එයින් අදහස් වන්නේ මෙම ideevas හි ප්‍රශස්ත ලෙස හඳුනා ගත හැකි ඉඩ ප්‍රශස්ත ලෙස හඳුනාගත හැකි බවයි.උපකල්පිත ලෙස, මෙම පෙප්ටයිඩවල ස්වභාවික සමජාතීය කිසිවක් අප විසින් සොයා නොගැනීමට එක් හේතුවක් වන්නේ මොළයට ඇතැම් පෙප්ටයිඩ මෝස්තර පාලනයකින් තොරව ඇතුල් වීම වැළැක්වීම සඳහා පරිණාමය අතරතුර පරිණාමය වීම විය හැකිය.
එකට ගත් විට, අපගේ ප්‍රතිඵල මගින් මස්තිෂ්ක වාහිනී බාධකයේ ප්‍රවාහන පද්ධති වඩාත් විස්තරාත්මකව හඳුනා ගැනීමට සහ සංලක්ෂිත කිරීමට අනාගත කටයුතු සඳහා පදනමක් සපයයි.මෙම ක්‍රමයේ මූලික සැකසුම පදනම් වී ඇත්තේ මස්තිෂ්ක සනාල බන්ධන ගුණාංග සහිත ක්ලෝන හඳුනා ගැනීම පමණක් නොව, CNS මැදිරිය තුළට ජීව විද්‍යාත්මක බාධක තරණය කිරීමට සාර්ථක ක්ලෝනවලට ආවේණික ක්‍රියාකාරකම් ඇති තීරණාත්මක පියවරක් ද ඇතුළත් වන ක්‍රියාකාරී තේරීම් උපාය මාර්ගයක් මත ය.මෙම පෙප්ටයිඩ ප්‍රවාහනය කිරීමේ යාන්ත්‍රණය සහ මොළයේ කලාපයට විශේෂිත වූ ක්ෂුද්‍ර වාහිනී වලට බැඳීම සඳහා ඔවුන්ගේ මනාපය පැහැදිලි කිරීමයි.මෙය BBB සහ ප්රතිග්රාහක ප්රවාහනය සඳහා නව මාර්ග සොයා ගැනීමට හේතු විය හැක.හඳුනාගත් පෙප්ටයිඩ සෘජුවම මස්තිෂ්ක වාහිනී ප්‍රතිග්‍රාහකවලට හෝ BBB හෝ BCSFB හරහා ප්‍රවාහනය කරන සංසරණ ලිංගේන්ද්‍රවලට බන්ධනය විය හැකි බව අපි අපේක්ෂා කරමු.මෙම කාර්යයේදී සොයාගත් CSF ප්‍රවාහන ක්‍රියාකාරකම් සහිත පෙප්ටයිඩ දෛශික තවදුරටත් විමර්ශනය කරනු ඇත.BBB සහ/හෝ BCSFB තරණය කිරීමට ඇති හැකියාව සඳහා මෙම පෙප්ටයිඩවල මොළයේ විශේෂත්වය අපි දැනට විමර්ශනය කරමින් සිටිමු.මෙම නව පෙප්ටයිඩ නව ප්‍රතිග්‍රාහක හෝ මාර්ග සොයා ගැනීමට සහ ජීව විද්‍යාව වැනි සාර්ව අණු මොළයට ලබා දීම සඳහා නව ඉහළ කාර්යක්‍ෂම වේදිකා සංවර්ධනය සඳහා අතිශය වටිනා මෙවලම් වනු ඇත.
කලින් විස්තර කරන ලද ක්‍රමයේ වෙනස් කිරීමක් භාවිතා කරමින් විශාල cisterna (CM) කැනුලේට් කරන්න.නිර්වින්දනය කරන ලද විස්ටාර් මීයන් (ග්‍රෑම් 200-350) ස්ටීරියෝටැක්සික් උපකරණයක් මත සවි කර ඇති අතර හිස් කබල නිරාවරණය කිරීම සඳහා රැවුල කපන ලද සහ නොගැලපෙන ලෙස සකස් කරන ලද හිස්කබල මත මධ්‍ය කැපීමක් කරන ලදී.ඉහළ තට්ටුවේ ප්‍රදේශයේ සිදුරු දෙකක් විදින අතර සිදුරුවල සවි කරන ඉස්කුරුප්පු සවි කරන්න.CM තුළට මල නොබැඳෙන වානේ කැනියුලාවේ ඒකාකෘතික මග පෙන්වීම සඳහා පාර්ශ්වීය ඔක්සිපිටල් ලාංඡනයේ අමතර සිදුරක් විදින ලදී.කැනියුලාව වටා දන්ත සිමෙන්ති යොදන්න සහ ඉස්කුරුප්පු වලින් ආරක්ෂා කරන්න.ඡායාරූප-සුවකිරීමෙන් සහ සිමෙන්ති ඝන වීමෙන් පසුව, සමේ තුවාලය 4/0 supramid මැහුම් වලින් වසා ඇත.මස්තිෂ්ක තරලය (CSF) ස්වයංසිද්ධව කාන්දු වීම මගින් කැනියුලා නිසි ලෙස ස්ථානගත කිරීම තහවුරු වේ.මීයා ස්ටීරියෝටැක්සික් උපකරණයෙන් ඉවත් කරන්න, සුදුසු පශ්චාත් ශල්‍ය ප්‍රතිකාර සහ වේදනා කළමනාකරණය ලබා ගන්න, මස්තිෂ්ක තරලයේ රුධිරයේ සලකුණු දක්නට ලැබෙන තෙක් අවම වශයෙන් සතියක්වත් එය යථා තත්ත්වයට පත් කිරීමට ඉඩ දෙන්න.Wistar මීයන් (Crl:WI/Han) චාල්ස් ගඟෙන් (ප්‍රංශය) ලබා ගන්නා ලදී.සියලුම මීයන් විශේෂිත රෝගකාරක-නිදහස් තත්වයන් යටතේ තබා ඇත.සියලුම සත්ව අත්හදා බැලීම් ස්විට්සර්ලන්තයේ බාසල් නගරයේ පශු වෛද්‍ය කාර්යාලය විසින් අනුමත කරන ලද අතර, සත්ව බලපත්‍ර අංක 2474 (මස්තිෂ්ක තරලයේ සහ මීයාගේ මොළයේ චිකිත්සක අපේක්ෂකයින්ගේ මට්ටම් මැනීමෙන් ක්‍රියාකාරී මොළය ප්‍රවාහනය තක්සේරු කිරීම) අනුව සිදු කරන ලදී.
CM කැනියුලාව අතේ තබාගෙන මීයාව මෘදු ලෙස තබා ගන්න.කැනියුලාවෙන් Datura ඉවත් කර ස්වයංසිද්ධව ගලා යන මස්තිෂ්ක තරල 10 µl එකතු කරන්න.කැනියුලාවේ පේටන්ට් බලපත්‍රය අවසානයේ සම්මුතියට පත් වූ බැවින්, මෙම අධ්‍යයනයට ඇතුළත් කර ඇත්තේ රුධිරය දූෂණය වීම හෝ දුර්වර්ණ වීම පිළිබඳ කිසිදු සාක්ෂියක් නොමැති පැහැදිලි මස්තිෂ්ක තරල සාම්පල පමණි.සමාන්තරව, දළ වශයෙන් 10-20 μl රුධිර ප්‍රමාණයක් වලිගයේ කෙළවරේ ඇති කුඩා කැපුමකින් හෙපරීන් (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) සහිත නලවලට ගන්නා ලදී.T7 phage එන්නත් කිරීමෙන් පසු CSF සහ රුධිරය විවිධ වේලාවන්හිදී එකතු කරන ලදී.එක් එක් CSF නියැදිය එකතු කිරීමට පෙර දළ වශයෙන් 5-10 μl තරලයක් ඉවත දමන ලදී, එය කැතීටරයේ මිය ගිය පරිමාවට අනුරූප වේ.
T7Select පද්ධති අත්පොතෙහි විස්තර කර ඇති පරිදි T7Select 10-3b දෛශිකය භාවිතයෙන් පුස්තකාල ජනනය කරන ලදී (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).කෙටියෙන්, අහඹු 12-mer DNA ඇතුළු කිරීමක් පහත ආකෘතියෙන් සංස්ලේෂණය කරන ලදී:
එන්එන්කේ කෝඩෝනය ද්විත්ව නැවතුම් කෝඩෝන සහ ඇතුළු කිරීමේදී ඇමයිනෝ අම්ල අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම වැළැක්වීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.N යනු එක් එක් නියුක්ලියෝටයිඩයේ අතින් මිශ්‍ර equimolar අනුපාතයක් වන අතර K යනු ඇඩිනීන් සහ සයිටොසීන් නියුක්ලියෝටයිඩවල අතින් මිශ්‍ර සමමූල අනුපාතයකි.Clenow buffer (New England Biolabs) හි 37°C දී පැය 3ක් dNTP (Novagen) සහ Klenow එන්සයිම (New England Biolabs) සමඟ තව දුරටත් ඉන්කියුබේෂන් කිරීම මගින් තනි තනි කලාප ද්විත්ව කෙඳි DNA බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.ප්‍රතික්‍රියාවෙන් පසුව, EtOH වර්ෂාපතනය මගින් ද්විත්ව නූල් DNA නැවත ලබා ගන්නා ලදී.එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ඩීඑන්ඒ සීමා කිරීමේ එන්සයිම EcoRI සහ HindIII (දෙකම Roche වෙතින්) සමඟ ජීර්ණය විය.10B කැප්සිඩ් ජානයේ ඇමයිනෝ අම්ල 348 ට පසුව වෙන් කරන ලද සහ පිරිසිදු කරන ලද (QIAquick, Qiagen) ඇතුළු කිරීම (T4 ligase, New England Biolabs) පසුව පෙර-ඛණ්ඩනය කරන ලද T7 දෛශිකයකට රාමුව තුළ බන්ධනය කරන ලදී.බන්ධන ප්‍රතික්‍රියා සෙල්සියස් අංශක 16 ට පැය 18 කට පෙර අභ්‍යන්තර ඇසුරුම්කරණයට පෙරාතුව.T7Select 10-3b ක්ලෝනීකරණ කට්ටලය (Novagen) සමඟ සපයා ඇති උපදෙස් අනුව Phage packaging in vitro සිදු කරන ලද අතර Escherichia coli (BLT5615, Novagen) භාවිතයෙන් ලයිසිස් සඳහා ඇසුරුම් ද්‍රාවණය වරක් විස්තාරණය කරන ලදී.ග්ලිසරෝල් තොග ද්‍රාවණයක් ලෙස ලයිසේට් කේන්ද්‍රාපසාරී, ටයිටේට් කර -80 ° C. හි ශීත කළ.
හිමිකාර 454/Roche-amplicon විලයන ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් සුප් හොද්ද හෝ පිඟානේ විස්තාරණය කරන ලද ෆේජ් විචල්‍ය කලාපවල සෘජු PCR විස්තාරණය කිරීම.ඉදිරි විලයන ප්‍රාථමිකයේ විචල්‍ය කලාපය (NNK) 12 (සැකිල්ල-විශේෂිත), GS FLX Titanium Adapter A, සහ හතර-පාදක පුස්තකාල යතුරු අනුපිළිවෙලක් (TCAG) (පරිපූරක රූපය 1a):
ප්‍රතිලෝම විලයන ප්‍රයිමරයේ පබළු ග්‍රහණය කිරීම සඳහා අමුණා ඇති බයෝටින් සහ ඉමල්ෂන් PCR අතරතුර ක්ලෝන විස්තාරණය සඳහා අවශ්‍ය GS FLX Titanium Adapter B ද අඩංගු වේ:
පසුව 454 GS-FLX Titanium ප්‍රොටෝකෝලය අනුව ඇම්ප්ලිකන් 454/Roche pyrosequencing වලට ලක් කරන ලදී.අතින් සැන්ගර් අනුක්‍රමණය සඳහා (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA විශ්ලේෂකය), T7 phage DNA PCR මගින් විස්තාරණය කරන ලද අතර පහත සඳහන් ප්‍රාථමික යුගල සමඟ අනුක්‍රමණය කරන ලදී:
රොචේ ෆාස්ට් ස්ටාට් ඩීඑන්ඒ පොලිමරේස් කට්ටලය (නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව) භාවිතයෙන් තනි පුවරු වලින් ඇතුළු කිරීම් PCR විස්තාරණයට ලක් කරන ලදී.උණුසුම් ආරම්භයක් (95 °C දී මිනිත්තු 10) සහ බූස්ට් චක්‍ර 35 ක් (95 °C දී තත්පර 50 ක්, 50 °C දී විනාඩි 1 ක් සහ 72 °C දී විනාඩි 1 ක්) සිදු කරන්න.
පුස්තකාලවලින් ෆේජ්, වල්-වර්ගයේ ෆේජ්, CSF සහ රුධිරයෙන් ගලවා ගත් phage, හෝ තනි ක්ලෝන Escherichia coli BL5615 හි TB සුප් හොද්ද (Sigma Aldrich) හෝ 500 cm2 දීසි (Thermo Scientific) තුළ 37 ° C දී පැය 4 ක් සඳහා විස්තාරණය කරන ලදී.ට්‍රිස්-ඊඩීටීඒ බෆරය (ෆ්ලූකා ඇනලිටිකල්) සමඟ තහඩු සේදීමෙන් හෝ වඳ පයිපෙට් ඉඟි සහිත සමරු ඵලක එකතු කිරීමෙන් ෆේජ් තහඩු වලින් නිස්සාරණය කර ඇත.ෆේජ්, පොලිඑතිලීන් ග්ලයිකෝල් (PEG 8000) වර්ෂාපතනය (Promega) එක් වටයක් සමඟින් සංස්කෘතික අධි ප්‍රවාහක හෝ නිස්සාරණ බෆරයෙන් හුදකලා කර ට්‍රිස්-ඊඩීටීඒ බෆරයේ නැවත ලබා දෙන ලදී.
අභ්‍යන්තර (IV) එන්නත් කිරීමට පෙර (500 μl/සත්ව) ඇම්ප්ලිෆයිඩ් ෆේජ් එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීමේ පබළු (මිල්ටෙනියි බයෝටෙක්) භාවිතයෙන් එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීමේ වට 2-3කට භාජනය කරන ලදී.පළමු වටයේදී, 2×1012 phages හඳුන්වා දෙන ලදී;දෙවන, 2×1010 phages;තුන්වන සහ සිව්වන තේරීම් වට වලදී, එක් සතෙකුට 2×109 phages.CSF සහ රුධිර සාම්පලවල ෆේජ් අන්තර්ගතය නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව (T7Select පද්ධති අත්පොත) අනුව සමරු ඵලක ගණනය කිරීම මගින් තීරණය කරන ලදී.ෆේජ් තෝරා ගැනීම සිදු කරනු ලැබුවේ වලිග නහර තුළට පිරිසිදු කරන ලද පුස්තකාල එන්නත් කිරීම හෝ පෙර තේරීම් වටයෙන් CSF වෙතින් ලබාගත් ෆේජ් නැවත එන්නත් කිරීමෙනි, පසුව අස්වැන්න මිනිත්තු 10, මිනිත්තු 30, 60, මිනිත්තු 60, මිනිත්තු 90, මිනිත්තු 120, සහ මිනිත්තු 18040 බැගින් රුධිර සාම්පල සිදු කරන ලදී.පළමු වට තුනේදී තෝරාගත් ශාඛා දෙක වෙන වෙනම ගබඩා කර විශ්ලේෂණය කරන ලද in vivo panning වට හතරක් පවත්වන ලදී.පළමු තේරීම් වට දෙකෙන් CSF වෙතින් උපුටා ගත් සියලුම phage ඇතුළු කිරීම් 454/Roche pyrosequencing වලට යටත් කරන ලද අතර, අවසාන තේරීම් වට දෙකෙන් CSF වෙතින් ලබාගත් සියලුම ක්ලෝන අතින් අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලදී.තෝරා ගැනීමේ පළමු වටයේ සියලුම රුධිර ෆේජ් 454/Roche pyrosequencing වලටද ලක් කරන ලදී.Phage ක්ලෝන එන්නත් කිරීම සඳහා, තෝරාගත් phages E. coli (BL5615) හි 500 cm2 තහඩු මත 37 ° C දී පැය 4 ක් වර්ධක කර ඇත.තනි තනිව තෝරාගත් සහ අතින් අනුක්‍රමණය කරන ලද ක්ලෝන ක්ෂය රෝග මාධ්‍යයෙන් ප්‍රචාරණය කරන ලදී.ෆේජ් නිස්සාරණයෙන් පසුව, එන්ඩොටොක්සින් (ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි) පිරිසිදු කිරීම සහ ඉවත් කිරීම, 300 μl හි 2×1010 phages/සතුන් එක් වලිග නහරයකට එන්නත් කරන ලදී.
අනුක්‍රමික දත්ත පෙර සැකසීම සහ ගුණාත්මක පෙරීම.Raw 454/Roche දත්ත ද්විමය සම්මත ප්‍රවාහ සිතියම් ආකෘතියෙන් (sff) වෙළෙන්දා මෘදුකාංග භාවිතයෙන් Pearson මානව කියවිය හැකි ආකෘතියකට (fasta) පරිවර්තනය කරන ලදී.පහත විස්තර කර ඇති පරිදි හිමිකාර C වැඩසටහන් සහ ස්ක්‍රිප්ට් (නිදහස් නොකළ මෘදුකාංග පැකේජය) භාවිතයෙන් නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රමය තවදුරටත් සැකසීම සිදු කරන ලදී.ප්‍රාථමික දත්ත විශ්ලේෂණයට දැඩි බහු-අදියර පෙරීමේ ක්‍රියා පටිපාටි ඇතුළත් වේ.වලංගු 12mer ඇතුළත් DNA අනුක්‍රමයක් අඩංගු නොවන කියවීම් පෙරීමට, කියවීම් අනුපිළිවෙලින් ආරම්භක ලේබලය (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), නැවතුම් ලේබලය (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) සහ ගෝලීය පරීක්‍ෂණය භාවිතා කරමින් (CCCTGCAGGGATATCGGTCGGTATCGGTCGGTCGLEMAN භාවිතා කරමින් පසුබිම් පරීක්ෂණය)පෙළගැස්මකට අනනුකූලතා 2ක් දක්වා ඉඩ සලසා දීම31.එබැවින්, ආරම්භක සහ නැවතුම් ටැග් නොමැතිව කියවීම් සහ පසුබිම් ඇතුළු කිරීම් අඩංගු කියවීම්, එනම් අවසර ලත් නොගැලපීම් ගණන ඉක්මවන පෙළගැස්වීම් පුස්තකාලයෙන් ඉවත් කරන ලදී.ඉතිරි කියවීම් සඳහා, N-mer DNA අනුක්‍රමය ආරම්භක සලකුණෙන් දිගු වන අතර නැවතුම් ලකුණට පෙර අවසන් වන අතර එය මුල් කියවීමේ අනුපිළිවෙලින් ඉවත් කර තවදුරටත් සකසන ලදී (මෙතැන් සිට "ඇතුළු කරන්න" ලෙස හැඳින්වේ).ඇතුළු කිරීම පරිවර්තනය කිරීමෙන් පසු, ප්‍රාථමිකයේ 5′ කෙළවරේ ඇති පළමු නැවතුම් කෝඩෝනයෙන් පසු කොටස ඇතුළු කිරීමෙන් ඉවත් කරනු ලැබේ.මීට අමතරව, ප්‍රාථමිකයේ 3′ අන්තයේ ඇති අසම්පූර්ණ කෝඩෝනවලට තුඩු දෙන නියුක්ලියෝටයිඩ ද ඉවත් කරන ලදී.පසුබිම් අනුපිළිවෙලවල් පමණක් අඩංගු ඇතුළු කිරීම් බැහැර කිරීම සඳහා, ඇමයිනෝ අම්ල රටාව "PAG" සමඟින් ආරම්භ වන පරිවර්තිත ඇතුළු කිරීම් ද ඉවත් කරන ලදී.ඇමයිනෝ අම්ල 3 ට වඩා අඩු පශ්චාත් පරිවර්තන දිගක් සහිත පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයෙන් ඉවත් කරන ලදී.අවසාන වශයෙන්, ඇතුළු කිරීමේ සංචිතයේ අතිරික්තය ඉවත් කර එක් එක් අද්විතීය ඇතුල් කිරීමේ වාර ගණන තීරණය කරන්න.මෙම විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵලවලට නියුක්ලියෝටයිඩ අනුපිළිවෙල (ඇතුළු කිරීම්) සහ ඒවායේ (කියවන) සංඛ්‍යාත ලැයිස්තුවක් (පරිපූරක රූප 1c සහ 2) ඇතුළත් විය.
අනුක්‍රමික සමානතාවය අනුව කණ්ඩායම් N-mer DNA ඇතුළු කිරීම්: 454/Roche-විශේෂිත අනුක්‍රමික දෝෂ ඉවත් කිරීම සඳහා (හෝමෝපොලිමර් දිගු අනුක්‍රමණය කිරීමේ ගැටළු වැනි) සහ අඩු වැදගත් අතිරික්තයන් ඉවත් කිරීම සඳහා, කලින් පෙරන ලද N-mer DNA අනුක්‍රමික ඇතුළු කිරීම් (ඇතුළු කිරීම්) සමානත්වය අනුව වර්ග කරනු ලැබේ.පහත පරිදි නිර්වචනය කර ඇති පුනරාවර්තන ඇල්ගොරිතමයක් භාවිතයෙන් ඇතුළත් කිරීම් (නොගැලපෙන පාද 2 ක් දක්වා ඉඩ දෙනු ලැබේ): ඇතුළත් කිරීම් පළමුව ඒවායේ සංඛ්‍යාතය (ඉහළ සිට පහළ දක්වා) අනුව වර්ග කරනු ලැබේ, සහ ඒවා සමාන නම්, ඒවායේ ද්විතියික වර්ගය දිග අනුව (දිගුම සිට කෙටිම දක්වා) ).මේ අනුව, වඩාත් නිරන්තර හා දිගුතම ඇතුළත් කිරීම් පළමු "කණ්ඩායම" නිර්වචනය කරයි.කණ්ඩායම් සංඛ්‍යාතය යතුරු සංඛ්‍යාතයට සකසා ඇත.පසුව, වර්ග කළ ලැයිස්තුවේ ඉතිරිව ඇති සෑම ඇතුල් කිරීමක්ම යුගල වශයෙන් Needleman-Wunsch පෙළගැස්ම මගින් කණ්ඩායමට එක් කිරීමට උත්සාහ කරන ලදී.පෙළගැස්මක නොගැලපීම්, ඇතුළත් කිරීම් හෝ මකාදැමීම් සංඛ්‍යාව 2 සීමාව ඉක්මවා නොයන්නේ නම්, කණ්ඩායමට ඇතුළත් කිරීමක් එකතු කරනු ලැබේ, සහ සමස්ත කණ්ඩායම් සංඛ්‍යාතය ඇතුළත් කිරීම කොපමණ වාරයක් එකතු වූවාද යන්නෙන් වැඩි වේ.සමූහයකට එකතු කරන ලද ඇතුළු කිරීම් භාවිතා කළ ලෙස සලකුණු කර වැඩිදුර සැකසීමෙන් බැහැර කරනු ලැබේ.ඇතුළත් කිරීමේ අනුපිළිවෙල දැනටමත් පවතින කණ්ඩායමකට එක් කළ නොහැකි නම්, ඇතුළත් කිරීමේ අනුක්‍රමය සුදුසු ඇතුළු කිරීමේ සංඛ්‍යාතය සහිත නව කණ්ඩායමක් නිර්මාණය කිරීමට සහ භාවිතා කළ ලෙස සලකුණු කිරීමට භාවිතා කරයි.එක් එක් ඇතුළත් කිරීමේ අනුපිළිවෙල නව කණ්ඩායමක් සෑදීමට භාවිතා කර ඇති විට හෝ දැනටමත් පවතින කණ්ඩායමකට ඇතුළත් කළ හැකි විට පුනරාවර්තනය අවසන් වේ.සියල්ලට පසු, නියුක්ලියෝටයිඩ වලින් සමන්විත කණ්ඩායම් ඇතුළු කිරීම් අවසානයේ පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් (පෙප්ටයිඩ පුස්තකාල) බවට පරිවර්තනය වේ.මෙම විශ්ලේෂනයේ ප්‍රතිඵලය වන්නේ අනුක්‍රමික කියවීම් සංඛ්‍යාව සෑදෙන ඇතුළත් කිරීම් සහ ඒවාට අනුරූප සංඛ්‍යාත සමූහයකි (පරිපූරක රූපය 2).
Motif Generation: අද්විතීය පෙප්ටයිඩ ලැයිස්තුවක් මත පදනම්ව, පහත දැක්වෙන පරිදි හැකි සියලුම ඇමයිනෝ අම්ල රටා (aa) අඩංගු පුස්තකාලයක් නිර්මාණය කරන ලදී.3 දිග විය හැකි සෑම රටාවක්ම පෙප්ටයිඩයෙන් උපුටා ගන්නා ලද අතර එහි ප්‍රතිලෝම රටාව සියලු රටා (ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ) අඩංගු පොදු මෝස්තර පුස්තකාලයක් සමඟ එක් කරන ලදී.ඉතා පුනරාවර්තන මෝස්තර සහිත පුස්තකාල අනුක්‍රමණය කර අතිරික්තය ඉවත් කරන ලදී.ඉන්පසුව, මෝටිෆ් පුස්තකාලයේ ඇති සෑම ට්‍රයිපෙප්ටයිඩයක් සඳහාම, අපි පරිගණක මෙවලම් භාවිතයෙන් පුස්තකාලයේ එහි තිබේදැයි පරීක්ෂා කළෙමු.මෙම අවස්ථාවෙහිදී, සොයාගත් මෝටිෆ් ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ අඩංගු පෙප්ටයිඩයේ සංඛ්‍යාතය එකතු කර මෝටිෆ් පුස්තකාලයේ ඇති මෝස්තරයට පවරනු ලැබේ ("මෝටිෆ් ගණන").මෝටිෆ් උත්පාදනයේ ප්‍රතිඵලය වන්නේ ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ (මෝටිෆ්) සහ ඒවායේ අදාළ අගයන් අඩංගු ද්විමාන අරාවකි, එනම් කියවීම් පෙරීම, සමූහගත කිරීම සහ පරිවර්තනය කරන විට අනුරූප චේතනාව ඇති කරන අනුක්‍රමික කියවීම් සංඛ්‍යාවයි.ඉහත විස්තරාත්මකව විස්තර කර ඇති ප්‍රමිතික.
මෝස්තර ගණන සහ ඊට අනුරූප විසිරුම් ප්‍රමාණය සාමාන්‍යකරණය කිරීම: එක් එක් නියැදිය සඳහා මෝස්තර ගණන සාමාන්‍යකරණය කර ඇත
මෙහි ni යනු මාතෘකාව අඩංගු කියවීම් සංඛ්‍යාවයි.මේ අනුව, vi මගින් නියැදියේ motif i අඩංගු කියවීම් (හෝ පෙප්ටයිඩ) ප්‍රතිශත සංඛ්‍යාතය නියෝජනය කරයි.ෆිෂර්ගේ නියම පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් සාමාන්‍යකරණය නොකළ මෝස්තර ගණන සඳහා P-අගය ගණනය කරන ලදී.චේතනා සංඛ්‍යාවේ සහසම්බන්ධතා සම්බන්ධයෙන්, ස්පියර්මන්ගේ සහසම්බන්ධතා ගණනය කරනු ලැබුවේ R සමඟ සාමාන්‍යකරණය කළ චේතනා ගණන භාවිතා කරමිනි.
පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ සෑම ස්ථානයකම ඇමයිනෝ අම්ලවල අන්තර්ගතය දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා, වෙබ් ලාංඡන 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) නිර්මාණය කරන ලදී.පළමුව, 12-mer පෙප්ටයිඩයේ සෑම ස්ථානයකම ඇමයිනෝ අම්ල අන්තර්ගතය 20×12 න්‍යාසයක ගබඩා වේ.ඉන්පසුව, සෑම ස්ථානයකම එකම සාපේක්ෂ ඇමයිනෝ අම්ල අන්තර්ගතය අඩංගු පෙප්ටයිඩ 1000 ක කට්ටලයක් වේගවත් අනුක්‍රමික ආකෘතියෙන් ජනනය කර වෙබ් ලාංඡනය 3 වෙත ආදානය ලෙස සපයනු ලැබේ, එමඟින් එක් එක් ස්ථානයේ සාපේක්ෂ ඇමයිනෝ අම්ල අන්තර්ගතයේ චිත්‍රක නිරූපණයක් ජනනය කරයි.ලබා දී ඇති පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයක් සඳහා.බහුමාන දත්ත කට්ටල දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා, R හි අභ්‍යන්තරව සංවර්ධිත මෙවලමක් භාවිතයෙන් තාප සිතියම් නිර්මාණය කරන ලදී (biosHeatmap, තවමත් නිකුත් කර නොමැති R පැකේජයක්).තාප සිතියම්වල ඉදිරිපත් කර ඇති ඩෙන්ඩ්‍රොග්‍රෑම් ගණනය කරනු ලැබුවේ යුක්ලීඩීය දුර මෙට්‍රික් සමඟ Ward හි ධුරාවලියේ පොකුරු ක්‍රමය භාවිතා කරමිනි.මෝටිෆ් ලකුණු දත්තවල සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සඳහා, ෆිෂර්ගේ නියම පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් සාමාන්‍යකරණය නොකළ ලකුණු සඳහා P අගයන් ගණනය කරන ලදී.අනෙකුත් දත්ත කට්ටල සඳහා P-අගය R හි ගණනය කරනු ලැබුවේ ශිෂ්‍යයාගේ t-test හෝ ANOVA භාවිතා කරමිනි.
තෝරාගත් ෆේජ් ක්ලෝන සහ ඇතුළු කිරීම් නොමැති ෆේජ් වලිග නහර හරහා අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී (2×1010 phages/සත්ව 300 μl PBS).පර්ෆියුෂන් සහ පසුව සවි කිරීමට මිනිත්තු දහයකට පෙර, එම සතුන්ට DyLight594-ලේබල් කරන ලද ලෙක්ටින් (Vector Laboratories Inc., DL-1177) 100 μl සමඟ අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී.ෆේජ් එන්නත් කිරීමෙන් මිනිත්තු 60 කට පසු, මීයන් 50 ml PBS සමඟ හදවත හරහා විසර්ජනය කරන ලද අතර පසුව 50 ml 4% PFA/PBS.මොළයේ සාම්පල අතිරේකව 4% PFA/PBS හි එක රැයකින් සවි කර 4 ° C දී 30% සුක්‍රෝස් එක රැයකින් පොඟවා ඇත.නියැදි OCT මිශ්‍රණයේ ෆ්ලෑෂ් ශීත කර ඇත.ශීත කළ සාම්පලවල ප්‍රතිශක්ති රසායනික විශ්ලේෂණය කාමර උෂ්ණත්වයේ දී 30 µm ක්‍රියෝසෙක්ෂන් මත 1% BSA සමඟ අවහිර කර T7 phage (Novus NB 600-376A) ට එරෙහිව පොලික්ලෝනල් FITC-ලේබල් කරන ලද ප්‍රතිදේහ සමඟ 4 °C දී සිදු කරන ලදී.එක රැයකින් ඉන්කියුබේට් කරන්න.අවසාන වශයෙන්, කොටස් PBS සමඟ 3 වතාවක් සෝදා, confocal ලේසර් අන්වීක්ෂයකින් (Leica TCS SP5) පරීක්ෂා කරන ලදී.
98% ක අවම සංශුද්ධතාවයක් සහිත සියලුම පෙප්ටයිඩ GenScript USA මගින් සංස්ලේෂණය කර, biotinylated සහ lyophilized.බයෝටින් N-terminus හි අතිරේක ත්‍රිත්ව ග්ලයිසීන් ස්පේසර් හරහා බැඳී ඇත.ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය භාවිතයෙන් සියලුම පෙප්ටයිඩ පරීක්ෂා කරන්න.
Streptavidin (Sigma S0677) biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, හෝ biotinylated BACE1 inhibitory peptide සහ BACE1 inhibitory Peptide සහ BACE1 inhibitory Peptined 5SO-10% peptin 5-ගුණයක සමමිතික අතිරික්තයක් (3:1 අනුපාතය) සමඟ මිශ්‍ර කර ඇත.එන්නත් කිරීමට පෙර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක්.මස්තිෂ්ක කුහරයක් සහිත මීයන්ගේ වලිග නහර වලට 10 mg/kg මාත්‍රාවකින් ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින්-සංයුජ පෙප්ටයිඩ අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී.
Streptavidin-peptide සංකීර්ණවල සාන්ද්‍රණය ELISA විසින් තක්සේරු කරන ලදී.Nunc Maxisorp microtiter තහඩු (Sigma) 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin ප්රතිදේහ (Thermo, MA1-20011) සමඟ 4 ° C දී එක රැයකින් ආලේප කරන ලදී.පැය 2 ක් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී අවහිර කිරීමෙන් පසු (අවහිර කරන බෆරය: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ජෙලටින්, 1% BSA), තහඩුව 0.05% Tween-20/PBS (වොෂ් බෆරය) සමඟ හොඳින් සෝදන්න. ma 1:10,000, CSF 1:115).පසුව තහඩුව හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිදේහ (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) සමඟ 4 ° C දී එක රැයකින් පුර්වගත කරන ලදී.සේදීමේ පියවර තුනකට පසුව, විනාඩි 20 ක් දක්වා TMB උපස්ථර ද්‍රාවණයේ (Roche) ඉන්කියුබේෂන් මගින් ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් අනාවරණය විය.1M H2SO4 සමඟ වර්ණ සංවර්ධනය නැවැත්වීමෙන් පසු, අවශෝෂණය 450 nm දී මැනිය.
නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය (Wako, 294-64701) අනුව Aβ(1-40) ELISA විසින් streptavidin-peptide-BACE1 නිෂේධක සංකීර්ණයේ ක්‍රියාකාරිත්වය තක්සේරු කරන ලදී.කෙටියෙන් කිවහොත්, CSF සාම්පල සම්මත තනුක (1:23) තුළ තනුක කර BNT77 ග්‍රහණ ප්‍රතිදේහයෙන් ආලේප කරන ලද ළිං 96 තහඩු වල 4 ° C දී එක රැයකින් පුර්වාගත කරන ලදී.සේදීමේ පියවර පහකට පසුව, HRP-සංයෝජිත BA27 ප්‍රතිදේහ එකතු කර පැය 2 ක් 4 ° C. ට ඉන්කිබියුට් කරන ලද අතර, පසුව සේදීමේ පියවර පහක් අනුගමනය කරන ලදී.Aβ(1-40) කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් සඳහා TMB ද්‍රාවණය තුළ පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම මගින් අනාවරණය විය.නැවතුම් ද්‍රාවණයෙන් වර්ණ සංවර්ධනය නැවැත්වූ පසු, අවශෝෂණය 450 nm දී මැනිය.Aβ(1-40) ELISA ට පෙර ප්ලාස්මා සාම්පල ඝන අදියර නිස්සාරණයට ලක් කරන ලදී.ප්ලාස්මා 96-ළිං තහඩු තුළ 0.2% DEA (සිග්මා) වෙත එකතු කරන ලද අතර විනාඩි 30 ක් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පුර්වගත කරන ලදී.SPE තහඩු (Oasis, 186000679) ජලය සහ 100% මෙතනෝල් සමඟ අනුක්‍රමිකව සේදීමෙන් පසු, ප්ලාස්මා සාම්පල SPE තහඩු වලට එකතු කර සියලුම ද්‍රව ඉවත් කරන ලදී.සාම්පල සෝදා (පළමුව 5% මෙතනෝල් සහ 30% මෙතනෝල්) සහ 2% NH4OH/90% මෙතනෝල් සමඟ ඉවත් කරන ලදී.නියත N2 ධාරාවකින් මිනිත්තු 99 ක් සඳහා eluate 55 ° C දී වියළීමකින් පසුව, සාම්පල සම්මත තනුක වලින් අඩු කර ඇති අතර Aβ (1-40) ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි මනිනු ලැබේ.
මෙම ලිපිය උපුටා දක්වන්නේ කෙසේද: Urich, E. et al.vivo තුළ හඳුනාගත් සංක්‍රමණ පෙප්ටයිඩ භාවිතයෙන් මොළයට භාණ්ඩ බෙදා හැරීම.විද්යාව.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB සහ Moos T. ඉලක්කගත චිකිත්සාව භාවිතයෙන් මොළයට සාර්ව අණුක ඖෂධ ලබා දීම.ස්නායු රසායන විද්‍යාව පිළිබඳ සඟරාව 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., සහ Martinez-Martinez, P. රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා පෙප්ටයිඩ සහ ප්‍රෝටීන් ඖෂධ බෙදා හැරීම.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM රුධිර-මොළයේ බාධකය: මොළයේ ඖෂධ වර්ධනයේ බාධාවකි.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, සහ Byrd, A. ඖෂධ බෙදා හැරීම වැඩිදියුණු කිරීම සහ choroid plexus-CSF මාර්ගය හරහා මොළයට ඉලක්ක කිරීම සඳහා අපේක්ෂාවන්.ඖෂධ පර්යේෂණ 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM මොළය බෙදා හැරීම සඳහා අණුක ට්‍රෝජන් අශ්වයන් සමඟ ජෛව ඖෂධ නවීකරණය.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා WM ප්රතිග්රාහක-මැදිහත් පෙප්ටයිඩ ප්රවාහනය.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.monovalent අණුක ෂටල භාවිතා කරමින් චිකිත්සක ප්රතිදේහවල මොළයට විනිවිද යාම සහ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කිරීම.නියුරෝන 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.ට්‍රාන්ස්ෆෙරින් ප්‍රතිග්‍රාහක (TfR) ප්‍රවාහනය මගින් TfR ප්‍රතිදේහවල අනුබද්ධ ප්‍රභේද මොළයට ගැනීම තීරණය කරයි.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).